包含白屈菜堿或其衍生物的藥物組合物的制作方法

專利名稱：包含白屈菜堿或其衍生物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含白屈菜堿或其衍生物和藥學可接受的載體的組合物。
背景技術：
心律失常是心臟介律異常，并導致心臟的抽吸效率降低。此時，心肌局部區域的電生化性質由于多種原因而發生變化，從而發生異常的心臟沖動形成或沖動傳播(www.americanheart.org/heart and stroke)。
心臟動作電位的形狀和持續時間隨記錄的心臟區域而變。這些區域差異一部分是由心肌內K+通道基因的差異表達造成的(Sanguinetti和Keating.Role of delayed rectifier potassium Channels in cardiacrepolarization and arrhythmias.News Physiol Sci 1997，12152-157)。
所有抗心律失常藥均影響心肌內的離子運動，從而表現出抗心律失常作用。因此，通常根據運動離子的種類將抗心律失常藥分成以下類別I(鈉通道阻滯劑)、II(β-腎上腺素能受體阻滯劑)、III(鉀通道阻滯劑)、IV(鈣通道阻滯劑)等(Katz AM.Selectivity and toxicity ofantiarrhythmic drugsmolecular interactions with ion channels.AM JMed 1998，104179-195)。廣泛使用藥物來控制心律失常的主要障礙是相對高的心外副作用發生率。隨著高度發展的藥物開發，可能開發由于改善的組織特異性而表現出顯著降低的心外副作用的藥物。但是，非常難以防止通常作為藥物的抗心律失常機理的直接結果的心臟副作用。抗心律失常藥的常見的心臟副作用包括抑制收縮性能、心動過緩、改變起搏效力和去纖顫裝置，以及發生新的心律失常或增加心律失常的發生(致心律失常)(Roden DM.Mechanism and managementof proarrhythmia.Am J Cardiol 1998，82491-571)。
已經研制出調節動作電位持續時間的抗心律失常藥，它在控制心率方面是重要的。但是，這些藥物還產生上述各種副作用，這限制了它們的臨床應用。
因此，具有較小副作用的理想的抗心律失常藥必須僅作用于表現異常興奮性的心肌細胞(或具有異常心率的細胞)，或者發生心律失常的組織(例如心房肌細胞、心室肌細胞、蒲肯野纖維等)。但是，仍未開發出滿足以上要求的藥物。為了開發幾乎沒有或完全沒有副作用的新藥物，必須兼有關于抗心律失常藥的靶(如離子通道)的分子生物學知識。例如，選擇性地在致心律失常組織中表達的離子通道是理想的抗心律失常藥的靶之一。因此，將分子生物學克隆技術和電-藥理學技術結合的方法將可能開發出新的理想的抗心律失常藥。
已知各種K+通道調節動作電位持續時間，而K+通道基因的差異表達取決于心臟的區域。
K+通道代表心臟中最多樣的離子通道種類。心肌中的K+電流可以分成兩類1)內向K+電流如IK1(內向整流K+電流)、IKach(乙酰膽堿激活的K+電流)和IKATP(ATP-敏感性K+電流)；和2)電壓門控K+(Kv)電流。內向K+電流調節靜息膜電位，而Kv電流控制動作電位持續時間。
心臟Kv電流根據它們的電生理學特征分為Ito、IKP、IKR、IKUR和IKS。Ito電流，一種瞬間外向K+電流，在膜去極化后立即激活，然后迅速失活。因此，Ito在動作電位的1相中是重要的。IKP電流，一種平臺期K+電流，僅在膜去極化期間激活，并且是一種具有中等激活速度的延時外向K+電流。IKR電流，一種快速激活的延時整流器K+電流，在動作電位的2相中是重要的。IKUR電流，一種超快速激活的延時整流器K+電流，在動作電位的2相中也是重要的。IKS電流，一種緩慢激活的延時整流器K+電流，在幾秒鐘內完全激活，并且在動作電位的3相的最后復極中是重要的(Roden和George，The cardiacion channelsrelevance to management of arrhythmias.Annu Rev Med1999，47138-148)。這些Kv通道有助于細胞復極，并調節動作電位持續時間。臨床上，已知受損組織中的復極障礙導致心律失常。因此，Kv通道成為治療心律失常的主要的靶。在實際應用中，已知抗心律失常藥如奎尼丁、異搏定、硝苯吡啶、索他洛爾、胺碘酮、氟卡尼和cropyrium與Kv通道相互作用(Katz AM.Selectivity and toxicityof antiarrhythmic drugsmolecular interactions with ion channel.Am JMed 1998，104174-195)。但是，已知這些藥物由于它們缺乏離子通道選擇性而具有各種副作用。因此，仍需要開發特異性地作用于特殊的超興奮組織的離子通道的新藥物。
使用果蠅遺傳學和DNA操作技術獲得了第一個克隆的K+通道基因，Shaker。迄今所報道的哺乳動物Kv通道的cDNAs分成九個亞族，Kv1～Kv9。其中，Kv1亞族是最具多樣性的一種，并且包括至少八個亞類，Kv1.1～Kv1.8(Grissner S.Potassium channels still hot，TiPS1997，18347-350)。已經從心臟組織中克隆出Kv通道基因的Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2和Kv4.3(Deal等人，Molecularphysiology of cardiac potassium channels.Physiol Rev 1996，7649-67)。在人心臟中表達的主要Kv通道基因為hKv1.4、hKv1.5、hKv4.3和HERG基因。所有這些基因在心房和心室中都高度表達，特別地，hKv1.5基因優先在人心房中表達。已知hKv1.5具有與IKUR，一種人心房中的特異性電流相同的電生理學和藥理學性質(Fedid等人，The1997 Stevenson Award Lecture，Cardiac K+channel gatingcloneddelayed rectifier mechanisms and drug modulation.Can J PhysiolPharmacol 1998，7677-89)。開發hKv 1.5通道的高選擇性阻滯劑將導致用于治療心房纖顫的理想藥物。
本發明的發明人已經認真而深入地研究開發優先在人心房中表達的選擇性hKv1.5通道阻滯劑，結果發現，白屈菜堿及其衍生物抑制人心房肌細胞中的hKv1.5通道電流和IKuR電流。此外，他們還發現，動作電位持續時間的延長作用與心率成比例。
因此，本發明的目的是提供包含表現出極好的K+通道阻滯作用和抗心律失常作用的白屈菜堿或其衍生物和藥學可接受的載體的組合物。

發明內容
本發明涉及包含由下式1代表的白屈菜堿或其衍生物和藥學可接受的載體的組合物式1
其中，R1選自氫、羥基、具有1-5個碳原子的低級烷氧基、芐氧基、具有1-5個碳原子的低級烷基羰氧基、苯甲酰氧基、具有1-5個碳原子的低級烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2為氫或甲基；而R3、R4和R5各自獨立地為氫；或者R1與R2或R4形成雙鍵；或者R2與R3形成雙鍵；或者R5與相鄰的N原子形成雙鍵。
根據本發明優選的組合物包含白屈菜堿或其衍生物
其中，R1選自氫、羥基、甲氧基、芐氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、甲基磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2為氫或甲基；而R3、R4和R5各自獨立地為氫；或者R1與R2或R4形成雙鍵；或者R2與R3形成雙鍵；或者R5與相鄰的N原子形成雙鍵。
根據本發明更優選的組合物包含一種選自以下的化合物[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并(benzodioxolo)[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-6-甲氧基-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-6-芐氧基-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-乙酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-苯甲酸酯；(12bR)-13，14-二氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；(12bR)-7，12b，13，14-四氫-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯；
{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-5b，13-二甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；和13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶鎓。
上述化合物的結構式如以下表1所示表1


在本發明中用作有效成分的化合物1白屈菜堿主要存在于植物中。白屈菜堿幾乎沒有安全性和毒性問題。已知白屈菜堿表現出抗痙攣作用、對中樞多巴胺的抑制作用、鎮痛作用、解熱作用、抗癌作用和對氧化一氮、雞眼和疣的抑制作用。
本發明的組合物中包含的化合物8、9、11和12是新化合物。另一方面，除這些化合物之外的化合物已經公開在以下文獻中。
化合物1-Simanek，V.Benzophenanthridine alkaloids.InThe Alkaloids.Academic Press.1985，Vo1.4，185-240；化合物2-Nowicky，Wassili.Carcinostatic agents and their use.Patent1,191,837，1985，8，13，Canada；化合物3-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl和O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物4-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物5-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem 2001，36951-960；
化合物6-Hanaoka，Miyoji；Yoshida，Shuji；Annen，Masami；Mukai，Chisato.，A novel and biomimetic synthesis of(±)-chelamine，(±)-chelidonine，sanguinarine，and dihydrosanguinarine from coptisinevia a common intermediate.Chem Lett.1986，5739-742；化合物7-Snatzke，Guenther；Hrbek，Jaroslav，Jr.；Hruben，Ladislav；Horeau，Alain；Santavy，Frantisek，Circular dichroism.XLII.Isolationand chemistry of the alkaloids from some plants of the genus Papaver.L.III.Absolute configuration and chiroptical properties of chelidonine andtetrahedroberberine alkaloids.Tetrahedron 1970，26(21)5013-5028；化合物10-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物13Takao，Narao A.Alkaloids of Papaveraceae.VI.Alkaloids ofCorydalis incisa.5.The structure of corynoline.Chem Pharm Bull.1963，11(10)1306-1312；化合物14Lenfield，J.Karoutil，M.Marsalek，E.Slavik，J.Preininger V.和Simanek.V.J Med Plant Res.1981，43161-165。
但是，沒有文獻教導或提示這些基于白屈菜堿的化合物具有K+通道阻滯作用和抗心律失常作用。
用于本發明的白屈菜堿或其衍生物可以商購或由以下方法制備。
根據Bary，D.K.等人的方法(The benzophenanthridine alkaloids.JNat Prod 1984，471-43)，用甲醇提取白屈菜(Chelidonium majus var.asiaticum)。然后用己烷、二氯甲烷、丁醇和水對提取物進行溶劑分餾。選擇己烷餾分作為活性餾分，并用硅膠柱色譜法純化(洗脫劑二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇)制備白屈菜堿或其衍生物。
另外，根據Takeo等人的方法(Chiroptische eigenschaften undabsolue konfiguration von (+)-14-epicorynolin，(+)-corynolin，(+)-chelidonine und verwandten verbindungen.Arch Pharm.(Weinheim)1984，317223-237)和Budabary等人的方法(The Merck Index，8th ed.Merck & Co.，1989，2038-2039)，使白屈菜堿與RCl反應(其中R代表烷基、苯基或被鹵素或低級烷基取代的苯基)、RCOCl(R代表烷基、苯基或被鹵素或低級烷基取代的苯基)和氯磺酰基異氰酸酯反應來制備白屈菜堿或其衍生物。
一些用于本發明的化合物還可以根據以下反應路線1-5制備。這些路線只是制備用于本發明的化合物的優選方法的例示。但是，這些路線是用于限制本發明的保護范圍。
路線1
通過用Dess-Martin Periodinane氧化劑處理白屈菜堿，將仲醇脫氫并氧化以制備化合物6。
路線2
在三乙胺的存在下，用甲磺酰氯處理白屈菜堿，得到甲磺酸酯化合物10。使如此獲得的化合物10與叔丁醇鉀進行消除反應，得到化合物7。在鈀催化劑的存在下，用氫還原化合物7中存在的雙鍵，以制備化合物6和8的混合物。
路線3
在作為堿的1，5-二氮雜二環[4，3，0]壬-5-烯的存在下，用二苯基磷酰基疊氮化物處理白屈菜堿，制備磷酸酯化合物9。此時，從反應物中回收原料。
路線4
在作為堿的三乙胺的存在下，用對甲苯磺酰氯處理白屈菜堿，以制備砜酯化合物11。
路線5
在作為堿的碳酸鈉的存在下，用氯磺酰基異氰酸酯處理白屈菜堿，然后水解，制備氨基甲酸酯化合物12。從反應物中回收原料。
根據本發明可以包含在該組合物中的藥學可接受的載體的實例包括賦形劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、包衣劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、穩定劑、吸收劑、注射用水、等滲劑等。根據本發明該組合物可以包含選自這些載體的至少一種載體。
本發明的組合物可以以用于口服給藥或注射的配方使用，優選用于口服給藥的配方。用于口服給藥的配方可以是顆粒劑、片劑、膠囊劑、溶液等的形式。
本發明的組合物的劑量可以隨已知因素，如患者的年齡、性別和體重而變。每日劑量范圍通常為10-5000mg，優選50-1000mg。
在對小鼠進行靜脈內給藥時，白屈菜堿的毒性為34.6±2.44mg/kg；而在對小鼠進行靜脈內給藥時，血根堿(化合物14)的毒性為15.9mg/kg，在進行皮下給藥時為102.0mg/kg。
本發明的組合物可以用作K+通道阻滯劑和抗心律失常藥，還用于治療溫血動物如小鼠、狗、兔、貓、家禽等。


圖1a顯示白屈菜堿(化合物1)對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5電流的作用。用來自-80mV維持電位的+50mV去極化脈沖記錄電流圖；圖1b顯示血根堿(化合物14)對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5電流的作用。在不存在或存在多種濃度的血根堿的情況下用來自-80mV維持電位的+50mV去極化步長記錄電流圖；圖1c顯示乙酰白屈菜堿(化合物4)對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5電流的作用。在不存在和存在多種濃度的乙酰白屈菜堿的情況下，用來自-80mV維持電位的+50mV去極化步長記錄電流圖；圖1d顯示苯甲酰白屈菜堿(化合物5)對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5電流的作用。在不存在和存在多種濃度的苯甲酰白屈菜堿的情況下，用來自-80mV維持電位的+50mV去極化步長記錄電流圖；圖1e是分別由白屈菜堿(化合物1，○)、乙酰白屈菜堿(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜堿(化合物5，■)和血根堿(化合物14，●)導致的hKv1.5阻滯的濃度-反應關系。將在去極化脈沖末期所測的穩態電流相對于對照進行歸一化，以建立濃度-反應曲線；圖2顯示由白屈菜堿(化合物1，10μM)導致的在Ltk-細胞中表達的hKv1.5的電壓依賴性阻滯；圖3顯示由白屈菜堿(化合物1，10μM)導致的在Ltk-細胞中表達的hKv1.5的通道狀態依賴性阻滯；圖4a顯示白屈菜堿(化合物1，10μM)對人心房肌細胞的K+通道電流的作用的代表性K+電流圖。通過來自-80mV維持電位的+50mV去極化脈沖獲得K+電流；圖4b顯示在七個細胞中脈沖末端測定的在圖4a中獲得的平均電流；圖5a顯示在不存在白屈菜堿(1μM)的情況下，在多種刺激頻率下的代表性動作電位圖；圖5b顯示在存在白屈菜堿(化合物1，1μM)的情況下，在多種刺激頻率下的代表性動作電位圖；和圖5c顯示在多種刺激頻率下，分別由白屈菜堿(化合物1，○)、乙酰白屈菜堿(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜堿(化合物5，■)和血根堿(化合物14，●)導致的動作電位持續時間延長的平均APD90(90％復極時的動作電位持續時間)變化。
具體實施例方式
現在將更詳細地參照以下實施例描述本發明。但是，這些實施例以例示方式提供，而不起限定作用。
實施例1制備(12bR)-13，14-二氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物6)將Dess-Martin Periodinane(25mg，0.059mmol)溶于無水二氯甲烷(0.2ml)，然后在室溫下攪拌10分鐘。將在無水二氯甲烷(0.1ml)中的白屈菜堿(20mg，0.054mmol)溶液滴加到反應溶液中。攪拌30分鐘后，將二乙醚(0.9ml)加到反應溶液中。將反應溶液加到飽和碳酸鉀水溶液(0.56ml)和硫代硫酸鈉五水合物(0.1g)的混合物中，隨后攪拌15分鐘。用乙酸乙酯萃取反應溶液，洗滌，干燥并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)純化，制備6.6mg(37％)標題化合物(化合物6)。此時，回收9mg(45％)白屈菜堿。
Rf＝0.24(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.71(d，1H，J＝9.0Hz)，7.60(d，1H，J＝14Hz)，7.50(d，1H，J＝8.5Hz)，7.32(d，1H，J＝8.0Hz)，7.27(s，1H)，6.87(d，1H，J＝8.5Hz)，6.07(s，2H)，6.06(s，2H)，4.21(s，2H)，2.64(s，3H)。
實施例2制備(12bR)-7，12b，13，14-四氫-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物7)將在無水甲醇(0.3ml)中的化合物10(20mg，0.046mmol)的溶液于室溫下攪拌10分鐘，然后向其中加入叔丁醇鉀(15mg，0.138mmol)。將反應溶液于室溫下攪拌13小時。用乙酸乙酯萃取反應溶液，洗滌，干燥，并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)純化，制備10mg(64％)標題化合物(化合物7)。
Rf＝0.22(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.16(d，1H，J＝6.0Hz)，7.16(d，1H，J＝8.0Hz)，6.74(d，1H，J＝8.0Hz)，6.60(s，1H)，6.50-6.48(m，1H)，5.97(d，2H，J＝10Hz)，5.93(d，2H，J＝10Hz)，4.56-4.53(m，1H)，4.43(d，2H，J＝16.5Hz)，3.92(d，2H，J＝16.5Hz)，3.59-3.41(m，2H)，1.99(s，3H)。
實施例3制備[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物8)將10％鈀(1mg)加到在無水甲醇(0.3ml)中的化合物7(10mg，0.030mmol)中，并在室溫下攪拌10分鐘。加入氫，同時將反應溶液攪拌1小時。用C鹽濾墊過濾反應溶液，減壓濃縮，并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)純化，制備2mg(20％)標題化合物8和1.8mg(18％)化合物6的混合物。
Rf＝0.27(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ6.93(s，1H)，6.75(d，1H，J＝8.5Hz)，6.72(d，1H，J＝8.5Hz)，6.56(s，1H)，5.94(d，2H，J＝1 5Hz)，5.92(d，2H，J＝3Hz)，3.94(d，1H，J＝16.5Hz)，3.61(d，1H，J＝4.0Hz)，3.48(d，1H，J＝16Hz)，3.07-3.04(m，1H)，2.79-2.67(m，2H)，2.40(s，3H)，1.91-1.88(m，1H)。
實施例4制備{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯(化合物9)將1，5-二氮雜二環[4，3，0]壬-5-炔(30μl，0.243mmol)加到在無水氯仿(0.4ml)中的白屈菜堿(30mg，0.081mmol)的溶液中，并在室溫下攪拌30分鐘。將二苯基磷酰基疊氮化物(27μl，0.122mmol)加到溶液中，并攪拌12小時。用乙酸乙酯萃取所得的反應溶液，洗滌，干燥，并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)純化，制備20mg(42％)標題化合物(化合物9)。此時，回收11mg(37％)白屈菜堿。
Rf＝0.31(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.41-7.35(m，5H)，7.31-7.19(m，7H)，6.59(d，1H，J＝8.5Hz)，6.37(s，1H)，5.90(s，2H)，5.88(d，2H，J＝23Hz)，5.11-5.05(m，1H)，4.10(d，2H，J＝5.0Hz)，3.70(d，2H，J＝17.5Hz)，3.66(bs，1H)，3.44(d，2H，J＝17Hz)，2.99(1H，dd，J＝11，15Hz)，2.87(1H，dd，J＝5，15.5Hz)，2.53(s，3H)。
實施例5制備{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯(化合物10)將白屈菜堿(18mg，0.048mmol)溶于無水二氯甲烷(0.5ml)，然后在0℃下攪拌10分鐘。將無水三乙胺(8μl，0.058mmol)和甲磺酰氯(6μl，0.073mmol)加到溶液中，并在室溫下攪拌6小時。用乙酸乙酯萃取所得的反應溶液，洗滌，干燥，并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)純化，制備16mg(77％)標題化合物(化合物10)。
Rf＝0.39(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21(d，1H，J＝8.0Hz)，7.18(s，1H)，6.69(d，1H，J＝8.5Hz)，6.42(s，1H)，5.90(d，2H，J＝5.0Hz)，5.88(d，2H，J＝15.5Hz)，5.18-5.16(m，1H)，4.13-4.11(m，1H)，3.75(s，1H)，3.73(d，2H，J＝12Hz)，3.45(d，2H，J＝17Hz)，3.14-3.08(m，1H)，3.05(s，3H)，2.94(1H，dd，J＝5.0，15Hz)，2.54(s，3H)。
實施例6制備{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯(化合物11)將白屈菜堿(10mg，0.027mmol)在無水二氯甲烷(0.3ml)中的溶液于0℃下攪拌10分鐘。將無水三乙胺(5μl，0.032mmol)和對甲苯磺酰氯(8μl，0.040mmol)加到溶液中，并在室溫下攪拌12小時。用乙酸乙酯萃取所得的反應溶液，洗滌，干燥，并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)純化，制備8.6mg(63％)標題化合物(化合物11)。
Rf＝0.36(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.86(d，2H，J＝8.5Hz)，7.37(d，2H，J＝8.5Hz)，7.30-7.26(m，1H)，7.20(s，1H)，6.66(d，2H，J＝8.0Hz)，6.33(s，1H)，5.89(d，2H，J＝3.5Hz)，5.87(d，2H，J＝18Hz)，4.96-4.92(m，1H)，4.03(d，1H，J＝5.0Hz)，3.67(d，2H，J＝17.5Hz)，3.60(bs，1H)，3.42(d，2H，J＝17.5Hz)，2.98(1H，dd，J＝11.5，15Hz)，2.68(1H，dd，J＝5.0，15.5Hz)，2.51(s，3H)，2.47(s，3H)。
實施例7制備{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯(化合物12)將碳酸鈉(10mg，0.097mmol)和氯磺酰基異氰酸酯(6μl，0.065mmol)在無水二氯甲烷(0.4ml)中的溶液于-78℃下攪拌10分鐘。將白屈菜堿(20mg，0.054mmol)在無水二氯甲烷(0.14ml)中的溶液滴加到反應溶液中。將所得的反應溶液攪拌1小時后并緩慢加熱到0℃后，用水終止反應。用3N氫氧化鈉水溶液使反應溶液變為pH＞7。然后用乙酸乙酯萃取反應溶液，洗滌，干燥并用柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)純化，制備5.4mg(20％)標題化合物(化合物12)。此時，回收4mg(40％)白屈菜堿。
Rf＝0.31(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.26(d，1H，J＝8.5Hz)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.5Hz)，6.45(s，1H)，5.92(d，2H，J＝5.5Hz)，5.90(d，2H，J＝14.5Hz)，5.11-5.07(m，1H)，4.78(bs，2H)，4.15(bs，1H)，3.83(bs，1H)，3.75-3.80(m，1H)，3.50-3.43(m，1H)，3.09-3.08(m，1H)，3.02(dd，1H，J＝5.0，15Hz)，2.59(s，3H)。
實驗例1白屈菜堿及其衍生物對hKv1.5通道電流的作用1)制備表達特定離子通道的細胞系根據在論文中所述的方法(Yang等人，Inhibition of cardiacpotassium currents by the vesnarinone analog OPC-18790comparisonwith quinidine and dofetilide.J Pharmacol Exp Ther.1997，2801170-1175；Kwak等人，Phosphorylation is required for alteration ofKv1.5K+channel function by the Kvbeta 1.3 subunit.J Biol Chem 1999，27425355-25361)制備選擇性地表達特定心臟K+通道基因的細胞系。
首先，將人心臟K+通道基因，如hKv1.5和HERG的cDNAs亞克隆至pMSVneo，所述pMSVneo含有控制插入的cDNA轉錄的可地塞米松誘導的鼠乳房腫瘤病毒啟動子和賦予由SV40早期啟動子驅動的新霉素耐受性的基因。用lipofectamine將含有cDNA的表達載體轉染到小鼠Ltk-細胞中。24小時后，用0.5μg/ml的G418進行細胞選擇，持續2周或直至形成不連續的焦點。分離單個焦點，保持在0.25μg/ml G418中，并通過Norhtern分析和電生理分析進行篩選。在5％CO2下，在補充有10％馬血清和0.25μg/ml的G418的極限必需培養基(Dulbeco′s modified Eagle medium，DMEM)中培養轉染的細胞。與穩定細胞系不同的是，在僅補充有10％馬血清的DMEM中培養瞬間轉染的細胞。
2)電記錄使用高阻抗封接膜片鉗技術(Kwak等人，Phosphorylation isrequired for alteration of Kv1.5 K+channel function by the Kvbeta 1.3subunit.J Biol Chem 1999，27425355-25361)的全細胞結構記錄人心房肌細胞和細胞系中的電流。首先，用膜片鉗放大器(AxonInstruments，Axopatch-1D，Foster，USA)放大電信號。通過信號轉換器(Digidata 1200，Axon Instruments)將電流數字化，并存貯在計算機硬盤上。用2步移液管拉出器(Narishige，PP-83)拉出電阻為1～2MΩ的微移液管(Kimax-51，1.5-1.8×10mm)用于電流記錄。全細胞模式的細胞內移液管填充溶液含有100mM KCl、10mM HEPES、5mMK4BAPTA、5mM K2ATP和1mM MgCl2(pH7.2)。細胞外溶液含有130mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES和10mM葡萄糖(pH7.35)。
用來自-80mV維持電位的+50mV去極化脈沖，然后用Ltk-細胞中的-50mV去極化脈沖記錄電流圖。為了觀察由每種化合物導致的hKv1.5通道電流的濃度依賴性阻滯，將在+50mV去極化脈沖末端測得的穩態電流相對于不存在每種化合物時獲得的對照進行歸一化。
圖1a-1d顯示白屈菜堿(化合物1)、血根堿(化合物14)、乙酰白屈菜堿(化合物4)和苯甲酰白屈菜堿(化合物5)對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5通道電流的濃度依賴性抑制作用。圖1e是顯示在去極化脈沖的末期獲得的相對穩態電流對每種化合物濃度的濃度-反應曲線。數據用希爾方程擬合。
圖1a-1e證實，這些化合物表現出對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5通道電流的濃度依賴性抑制作用，而該抑制作用在一定程度上隨衍生物的類型而變。具體而言，白屈菜堿(化合物1)和乙酰白屈菜堿(化合物4)主要阻滯開放離子通道。相反，血根堿(化合物14)減緩通道激活，而苯甲酰白屈菜堿(化合物5)表現出激勵性阻滯作用。
測定化合物1～14對hKv1.5通道電流的IC50值(50％抑制濃度，μM)，并使用希爾方程由各化合物的濃度-反應曲線計算希爾值。這些結果列在表2中。
表2白屈菜堿及其衍生物的IC50和希爾值

實驗例2白屈菜堿導致的在Ltk-細胞中表達的hKv1.5通道電流的電壓依賴性阻滯作用于離子通道的藥物的電壓依賴性有時在藥物的臨床應用評價中非常有用。
為了對白屈菜堿(化合物1)的電壓依賴性阻滯進行定量，將相對穩態電流，I白屈菜堿/I對照作為膜電位的函數制圖(圖2)。在250ms去極化脈沖末期得到穩態電流，同時以10mV的增幅將膜電壓從-80增加到+60mV。點線表示在Ltk-細胞中表達的hKv1.5通道電流的激活曲線。
如圖2所示，白屈菜堿(化合物1)在-30mV和0mV之間表現出強烈的電壓依賴性，但在0mV和+60mV之間表現出弱電壓依賴性。當用Woodhull方程計算時，0mV和+60mV之間的δ值為0.16+0.01(n＝7)。
實驗例3由白屈菜堿導致的hKv1.5阻滯的通道狀態依賴性我們測試了由白屈菜堿導致的hKv1.5阻滯的通道狀態依賴性(圖3)。
圖3顯示在對照條件下和在白屈菜堿(10μM)存在下，用來自-80mV維持電位的+50mV去極化脈沖，然后用-50mV去極化脈沖獲得的尾電流的疊加。
在對照條件下，尾電流快速失活。在白屈菜堿的存在下，最初的尾電流振幅降低，但隨后的尾電流衰減比在對照條件下的緩慢，從而導致“交叉”現象。這表明白屈菜堿作為一種開放通道阻滯劑作用于hKv1.5通道。也就是說，白屈菜堿對開放狀態的hKv1.5通道比對關閉狀態的表現出更強的抑制作用。
實驗例4白屈菜堿對人心房肌細胞K+電流的作用用Wang等人的方法(Effects of flecainide，quinidine，and4-aminopyridine on transient outward and ultrarapid delayed rectifiercurrents in human myocytes.J Pharmacol Exp Ther 1995，272184-196)進行人心房肌細胞的分離。從經歷心肺轉流手術的患者的心臟獲得人右心房旁支樣本。用于獲得組織的方法得到患者的允許。將所得的樣品快速浸泡在不含Ca2+的Krebs Henseleit (KH)溶液中。切割心肌樣本，并將其放置在含有10ml無Ca2+的KH溶液的三角燒瓶中，然后攪拌5分鐘。除去上清液后，將組織再懸浮在10ml含有200U/ml膠原酶和4U/ml蛋白酶的溶液中，并培養45分鐘。除去上清液后，將組織再懸浮在10ml含酶溶液(在三角燒瓶中)中。為了測定分離的細胞的數量和質量，在倒置顯微鏡下每隔15分鐘檢查培養基。培養組織直至產量似乎最大。在培養之后，將組織轉染到儲備溶液中。用移液管分離細胞，并在250g下離心5分鐘。將沉淀再懸浮在儲備溶液中[組成20mM KCl、10mM KH2PO4、10mM葡萄糖、70mM谷氨酸、10mM β-羥基丁酸、10mM牛磺酸、10mM EGTA和0.1％清蛋白，用KOH將pH調節到7.4，并保存用于電流記錄。
我們研究了白屈菜堿對hKv1.5通道電流的抑制作用是否也類似地顯示于人心房肌細胞的K+通道電流，已知人心房肌細胞高度表達hKv1.5通道。從經歷心肺轉流手術的不患有任何類型的心律失常的患者的心臟分離人心房肌細胞。圖4a顯示由來自-80mV維持電位的+50mV去極化脈沖，然后復極至-50mV引起的電流圖。圖4b表示在去極化脈沖末端獲得的平均穩態電流。
人心房肌細胞中的外向整流K+電流由快速激活和快速失活電流和延時整流電流組成，如圖4a所示。白屈菜堿(化合物1，10μM)降低人心房肌細胞中外向K+電流的峰振幅并加速失活過程，導致穩態電流降低。圖4b顯示與對照相比，10μM白屈菜堿在+50mV去極化脈沖末期將穩態電流抑制41±5％(n＝7)。因此，證實了白屈菜堿對在Ltk-細胞中表達的hKv1.5的抑制作用也顯示于人心房肌細胞中。
實驗例5白屈菜堿及其衍生物對兔心房組織的動作電位的頻率依賴性作用根據Kwak等人的論文所述的方法(A newly synthesizedbenzopyran derivatives，activates the cardiac ATP-sensitive K+channel.J Pharmacol Exp Ther 1995，275807-812)記錄兔心房組織中的動作電位。
擊打重約2kg的雄性新西蘭白兔的頭部使其暈倒，快速切除心臟，并轉移到填充了用97％O2和3％CO2氣體混合物飽和的Tyrode溶液的解剖浴中，將每個切除的組織水平地包埋在組織室的狹窄通道中，并在37℃下連續地用Tyrode溶液傾注。通過刺激器用矩形脈沖(1～5Hz，1-ms持續時間，20-30％以上閾電壓)刺激心房細胞而引起動作電位。用與放大器(KS-700，WPI，Sarasota，FL，USA)連接的填充3M KCl的微電極(10-20兆歐)記錄動作電位，并顯示在示波器(Dual beam storage 5113，Tektronix，Beaverton，OR，USA)上。在35-mm膠片上將示波器屏幕上的圖照相，并記錄在生理儀(RS 3400，Gould，Cleveland，OH)上。將APD90用于比較動作電位持續時間。APD90代表相對于最大100％去極化時的動作電位持續時間，在90％復極時的動作電位持續時間。用Polaroid照相機拍攝示波器上的圖像。
我們測試了白屈菜堿對兔心房肌細胞的動作電位的作用是否是頻率依賴性的。
圖5a(對照)和5b分別顯示在多種頻率下，在不存在(圖5a)或存在(圖5b)白屈菜堿(化合物1)的情況下的代表性動作電位圖。圖5c顯示分別由白屈菜堿(化合物1，○)、乙酰白屈菜堿(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜堿(化合物5，■)和血根堿(化合物14，●)導致的動作電位持續時間延長的平均APD90(在90％復極時的動作電位持續時間)隨刺激頻率的變化。將在不存在白屈菜堿的條件下，在各種頻率下的相對動作電位持續時間歸一化為APD90值。在刺激頻率為1、2、3、4和5Hz下，1μM白屈菜堿將各頻率下的不存在白屈菜堿的對照的APD90增加13.0±8.1％(n＝5)、14.5±7.9％(n＝5)、16.5±2.2％(n＝5)、28.2±0.4％(n＝5)或33.0±0.31％(n＝5)。乙酰白屈菜堿(化合物4)、苯甲酰白屈菜堿(化合物5)和血根堿(化合物14)也以與白屈菜堿類似的方式增加動作電位持續時間，但與白屈菜堿相比程度較小(參見圖5c)。
圖5證實了白屈菜堿及其衍生物在低心率時表現出較小的抗心律失常活性，但在高心率時表現出較大的抗心律失常活性。因此，預期白屈菜堿及其衍生物用作具有較小副作用的理想的抗心律失常藥。
制備例1片劑根據常規方法將由以下組分組成的組合物配方成片劑。
片劑組成白屈菜堿 500.0mg乳糖 500.0mg滑石 5.0mg硬脂酸鎂 1.0mg制備例2膠囊劑根據以下方法將由以下組分組成的組合物配方成膠囊劑首先，將過篩的白屈菜堿與賦形劑混合。通過用該混合物填充明膠膠囊而制備膠囊劑。
膠囊組成白屈菜堿 500.0mg淀粉1500 10.0mg硬脂酸鎂 100.0mg
制備例3散劑根據常規方法混合以下組分。將混合物填充在被膜中，并密封制備散劑。
散劑組成白屈菜堿 50.0mg乳糖 100.0mg滑石 5.0mg制備例4注射劑根據常規方法將由以下組分組成的組合物配方成注射劑。例如，通過用該組合物填充2.0ml安瓿并將其消毒而制備注射劑。
注射劑組成白屈菜堿 50.0mg抗氧化劑 1.0mgTween801.0mg注射用蒸餾水 加至2.0ml工業實用性根據本發明的組合物幾乎沒有安全性和毒性問題。此外，本發明的組合物可以選擇性地阻滯在人心房肌細胞中表達的K+通道，并在低心率下表現出較小的抗心律失常活性，但在高心率下表現出較大的活性。因此，本發明的組合物用作K+通道阻滯劑和抗心律失常藥。
權利要求
1.包含由下式1代表的白屈菜堿或其衍生物和藥學可接受的載體的組合物 其中，R1選自氫、羥基、具有1-5個碳原子的低級烷氧基、芐氧基、具有1-5個碳原子的低級烷基羰氧基、苯甲酰氧基、具有1-5個碳原子的低級烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2為氫或甲基；而R3、R4和R5各自獨立地為氫；或者R1與R2或R4形成雙鍵；或者R2與R3形成雙鍵；或者R5與相鄰的N原子形成雙鍵。
2.權利要求1的組合物，其中R1選自氫、羥基、甲氧基、芐氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、甲基磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；而R2為氫或甲基；且R3、R4和R5各自獨立地為氫；或者R1與R2或R4形成雙鍵；或者R2與R3形成雙鍵；或者R5與相鄰的N原子形成雙鍵。
3.權利要求1的組合物，其中該白屈菜堿或其衍生物選自[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-6-甲氧基-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-6-芐氧基-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-乙酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-苯甲酸酯；(12bR)-13，14-二氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；(12bR)-7，12b，13，14-四氫-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氫-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯；[5bR-(5bα，6β，12bα)-5b，6，7，12b，13，14-六氫-5b，13-二甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；和13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶鎓。
4.權利要求1的組合物，其中該藥學可接受的載體包括選自以下的至少一種賦形劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、包衣劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、穩定劑、吸收劑、注射用水和等滲劑。
5.權利要求1的組合物，其中該組合物配方成口服給藥形式或注射給藥形式。
6.權利要求1的組合物，其中該組合物為抗心律失常藥。
7.權利要求1的組合物，其中該組合物為K+通道阻滯劑。
8.權利要求7的組合物，其中該組合物為hKv 1.5通道阻滯劑。
9.用于預防或治療心律失常的方法，所述方法包括給予權利要求1的組合物。
10.用于預防或治療K+通道介導的疾病的方法，所述方法包括給予權利要求1的組合物。
11.權利要求1-3之任一項的組合物在生產預防或治療心律失常的藥物中的應用。
12.權利要求1-3之任一項的組合物在生產預防或治療K+通道介導的疾病的藥物中的應用，其中所述藥物對K+通道具有抑制作用。
全文摘要
本發明涉及包含白屈菜堿或其衍生物和藥學可接受的載體的藥物組合物。本發明的組合物可以選擇性地阻滯優先在人心房肌細胞中表達的hKv 1.5通道，因而用作K
文檔編號A61P9/00GK1516583SQ02812045
公開日2004年7月28日 申請日期2002年5月9日 優先權日2001年5月11日
發明者殷載淳, 郭湧根, 金大根, 蔡洙完 申請人:殷載淳, 郭湧根, 金大根, 蔡洙完, 鄭英薰, 池玉杓