制備用于組織修復的生物材料的方法

            文檔序號:876669閱讀:355來源:國知局
            專利名稱:制備用于組織修復的生物材料的方法
            背景技術
            發明領域本發明涉及制備用于組織修復的生物材料的方法,更具體而言,本發明涉及制備用于組織修復的生物材料的方法,其包括從哺乳動物獲得的基于膠原蛋白的組織的膠原蛋白交聯,對組織進行去細胞,并通過使用防凍液對不含細胞的組織進行冷凍干燥的步驟,還涉及由上述方法制備的用于組織修復的生物材料。
            現有技術的描述多種可注射材料已經被用作軟組織和皮膚組織的修復材料以治療多種皮膚病,諸如畸形臉,由于外傷引起的軟組織損傷或沉陷以及發育不全的軟組織。修復材料的代表性例子為液體硅酮,牛膠原蛋白,以及自身皮膚或者脂肪其中,在第二次世界大戰期間液體硅酮主要用在軍隊中。自從醫用級液體硅酮‘360’于1963年在美國開發為人用以來,由于其在人體內的長期效果,一直被有效用作早期移植的修復材料。但是,‘360’經證實不能令人滿意,因為‘360’引起發炎,硬化,變色,潰瘍,轉移,硅酮肉芽瘤等等(參見Klein A.W.,Rish D.C.,J.Dermatol.Surg.Oncol.,11337-339,1985;Nosanchuk J.S.,Arch.Surg.,97583-585,1968;Piechotta F.U.,Aesthetic Plast.Surg.,3347-355,1979;Spira M.,Rosen T.,Clin.Plast.Surg.,20181-188,1993),這阻止其成為用于移植的常用材料。
            此外,已知在移植之前牛膠原蛋白需要在受體的皮膚上作敏感性試驗。而且,即使在移植之前敏感性試驗檢測正常,大約3%的移植受體依然表現出超敏反應(參見Elson M.L.,J.Am.Acad.Dermatol.,18707-713,1998),且移植的持續時間相對較短,從3個月到6個月(參見Gromley D.E.,Eremia S.,J.Dermatol.Surg.Oncol.,161147-1151,1 990;Matti B.A.,Nicolle F.V.,Aesthetic Plast.Surg.,14227-234,1990)。另外,已經有報道移植后牛膠原蛋白引起多種瞬間副作用,例如紅斑,腫脹,皮膚的局部壞疽,以及膿腫(參見Cooperman L.S.等人,Aesthetic Plast.Surg.,9145-151,1985;Frank D.H.等人,Plast.Reconstr.Surg.,871080-1088,1991;Hanke C.W.等人,J.Am.Acad.Dermatol.,25319-326,1991;Matti B.A.等人,Aesthetic Plast.Surg.,14227-234,1990)。
            或者,自身的皮膚已被用于本領域,因為,自身皮膚相對安全且不需要敏感性試驗,而且移植的持續時間從1年到2年。但是,其缺點在于切除自身皮膚由于并發感染需要長時間恢復期,而且在皮膚切除的身體部位留下可見的傷疤。
            最后,隨著脂肪抽吸術的發展,自身脂肪的使用已有所提高,但是需要持續移植才能達到需要的治愈水平,因為自身脂肪的持續時間較牛膠原蛋白的持續時間短(參見Gromley D.E.,Eremia S.,J.Dermatol.Surg.Oncol.,161147-1151,1990)。
            上述的每種修復材料在一方面或者多方面都有用于組織修復的不同價值,但是沒有一種材料滿足用于軟組織的理想修復材料的需要。
            組織生物工程,包括生物材料技術,已經得到迅猛發展可以克服上述缺點,現有技術中一些技術已被使用和商業化。在不久的將來,可以產生理想的修復材料代替軟組織和皮膚組織。但是通過傳統技術不能解決上述修復材料的所有缺點,因此需要相關技術的持續發展。美國專利5,336,616公開了一種生產用于移植、基于膠原蛋白的非細胞組織的方法,其包括從組織移去誘導免疫排斥的抗原細胞,然后用防凍液處理組織以降低在冷凍干燥過程中膠原蛋白結構損傷的步驟。基于膠原蛋白的非細胞組織開始普及,因為它不誘導移植排斥,而且在使用前可以保存較長時間。但是上述方法在生產成本經濟及防污高度可行性方面不會令人滿意。此外,還發現了一個嚴重的問題,由于缺少在冷凍干燥前保護膠原蛋白組織結構的步驟,膠原蛋白組織在移植后將受到損傷和迅速降解。
            在現有條件下,有充分的理由開發和發展制備用于組織修復的新生物材料的簡單有效方法,所述新生物材料不會引起膠原蛋白組織結構的損傷。
            發明概述本發明的發明者致力于以簡單高效的方法生產用于組織修復的新型生物材料,其不會引起膠原蛋白組織結構的損傷,并且發現聚環氧化合物的處理通過交聯基于膠原蛋白的組織的方式穩定膠原蛋白組織的結構;可以在含有透明質酸的防凍液中進行冷凍干燥;融化后,加工的組織在體內成功移植。
            因此,本發明的主要目的就是提供制備用于組織修復的生物材料的方法。
            本發明的其他目的就是提供一種用于組織修復的生物材料,其包括來自哺乳動物基于膠原蛋白的生物組織的主要組分,所述生物材料通過上述方法進行制備。
            附圖簡述本發明的上述目的和特征根據下列描述連同附圖將更加明顯,其中

            圖1顯示在不同溫度下交聯指數的比較。
            圖2顯示在不同聚環氧化合物濃度下交聯指數的比較。
            圖3顯示在不同pH下交聯指數的比較。
            圖4顯示通過膠原酶降解皮層。
            圖5顯示通過多種研磨方法形成的粉末大小。
            圖6顯示根據用于組織修復的生物材料大小和注射濃度在小鼠下皮層中的持續時間。
            圖7a顯示皮下注射1周后皮膚組織的照片。
            圖7b顯示皮下注射1個月后皮膚組織的照片。
            圖7c顯示皮下注射1年后皮膚組織的照片。
            本發明的詳細描述本發明制備用于組織修復的生物材料的方法包括如下步驟從哺乳動物獲得基于膠原蛋白的生物組織;用聚環氧化合物處理生物組織獲得具有交聯膠原蛋白結構的生物組織;對獲得的生物組織去細胞產生不含細胞的組織;將不含細胞的組織浸入含有透明質酸的防凍液,并將上述組織冷凍干燥。基于膠原蛋白的組織包括但不限于,優選哺乳動物的筋膜,羊膜,胎盤或者皮膚。聚環氧化合物包括但不限于,優選聚甘油聚縮水甘油醚,聚乙二醇縮水甘油醚或者其它市售的聚環氧化合物。優選地,1-7%(w/v)的聚環氧化合物在pH 8-11、30-45℃的條件下處理生物組織10-20小時。另外,冷凍干燥的不含細胞組織優選通過物理方法進行研磨,例如,在研磨機中液氮環境下進行冷凍研磨,以保護組織免遭加工過程中生成的熱損傷。本發明的方法還包括在冷凍研磨前在液氮環境中將冷凍干燥的不含細胞組織研磨成較小組織的步驟,或者包括對冷凍干燥的不含細胞組織進行水合作用和切割水合組織的步驟。
            到目前為止,已經開發了多種交聯技術來穩定膠原蛋白的結構,同時保持膠原蛋白組織用于移植的機械強度和獨特特征。除了交聯技術,還一直積極進行了關于去細胞技術的研究以減少在移植過程中抗移植物的免疫排斥,從而在移植物中增殖細胞,并且發展用于組織工程的新型生物材料。很多有關戊二醛的研究已被開展用于提高組織結構的穩定性,研究發現了戊二醛在人體內具有強毒性的嚴重問題。基于這種考慮,現有技術中已經深入研究了膠原蛋白組織交聯的替代技術,其中之一就是利用聚環氧化合物的膠原蛋白組織的交聯技術。
            聚環氧化合物具有多種長度和官能團的骨架。市售DenacolTMEX-512(Nagase Chemical Company,日本)已經廣泛用于組織的交聯。
            聚環氧化合物的交聯反應機理和戊二醛不同。聚環氧化合物的環氧基和多種諸如氨基,羧基,羥基,酚基和醇基的官能團高效反應,而戊二醛只和蛋白中賴氨酸殘基的ε-氨基反應。尤其是,含有17-25個碳以及4-5個環氧基的骨架的聚環氧化合物表現出諸如膠原蛋白的螺旋多肽分子的高效交聯。
            另外,聚環氧化合物的毒性比戊二醛的毒性低,在和諸如膠原蛋白的螺旋多肽分子反應的情況下,組織的抗原性或者免疫反應的誘導與反應時間成比例的降低。自然,它表現出相對較好的生物相容性(參見Lohre J.M.等人,Artif.Organs,16630-633,1992;Uematsu M.等人,Artif.Organs,22909-913,1998)。
            膠原纖維的結構決定了基于膠原蛋白的組織的物理化學和生物機械特征。膠原纖維含有由三種多肽組成的膠原蛋白,每種多肽彼此扭曲纏繞形成螺旋結構,并且通過共價鍵的交聯得以穩定。聚環氧化合物的一個分子和膠原蛋白的兩個或者多個氨基反應形成交聯連接,這對于可移植組織提供拉伸強度以及生物安全性。移植的基于膠原蛋白的組織通常通過受體的蛋白酶進行降解,但是交聯連接保護移植的基于膠原蛋白的組織免受蛋白酶的作用。
            基于理論知識,本發明的發明者添加了利用聚環氧化合物對膠原蛋白進行交聯的步驟以使膠原蛋白結構的損傷降低到最小,所述損傷是傳統方法生產用于移植的非細胞的基于膠原蛋白的組織的一個缺點(參見美國專利5,336,616)。即,在進行去細胞之前用聚環氧化合物處理基于膠原蛋白的組織,以在膠原纖維之間或者在膠原纖維中形成交聯連接,從而加強并穩定基于膠原蛋白的組織的結構。
            此外,已經對去細胞技術進行了積極的研究以從基于膠原蛋白的組織中完全去除誘導免疫排斥的細胞。去細胞技術的進行就是為了通過化學,酶或者機械方法將全細胞移去同時不損失胞外基質組分。該技術已被認為是發展用于組織修復的生物材料的重要步驟,因為通過細胞分裂再生靜脈以及重建移植材料在去細胞組織中更活躍,所述去細胞組織已經保持了其自身機械特征。在去細胞的步驟中,完全移去碎片以及細胞以避免移植后的免疫排斥是必要的。幾種方法已經用于該技術中,雖然去污劑優選用于組織的去細胞,但是例如諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)的離子去污劑,或者諸如表面活性劑Triton(Triton X-100),吐溫(吐溫20,吐溫80),以及NP(NP-10,NP-40)的非離子去污劑被用作去污劑。
            冷凍干燥(或者冷干)技術用于保護組織,使得組織或者細胞不受損傷。在冷凍干燥之前,組織首先浸入防凍液以保護組織免受冷凍損傷。防凍液由緩沖液和冷凍干燥保護劑組成,其中緩沖液在保持冷凍保護液的離子強度和滲透壓方面起作用,冷凍干燥保護劑保護組織在冷凍干燥過程中免受物理或者化學損傷。另外,冷凍干燥保護劑抑制在冷凍干燥過程中由冰晶重結晶誘導的組織塌陷,并且通過提高玻璃轉換溫度的方式增強組織的穩定性。在干燥步驟中,如果組織的溫度高于玻璃轉換溫度,通過重結晶冰晶變大,結果引起組織的損傷。但是,冷凍干燥保護劑不僅將對組織的損傷降低到最小,而且還縮短了組織的干燥時間,這是由于冷凍干燥保護劑提高了玻璃轉換溫度,導致玻璃狀冰晶或者立方冰晶的比例在冷凍組織中提高的緣故,所述玻璃狀冰晶或者立方冰晶比六方冰晶不穩定并且更小。
            作為冷凍干燥保護劑,根據它們的使用目的,諸如DMSO(二甲亞砜),葡聚糖,蔗糖,丙二醇,甘油,甘露醇,山梨醇,果糖,海藻糖,棉子糖,2,3-丁二醇,HES(羥乙基淀粉),PEG(聚乙二醇),PVP(聚乙烯吡咯烷酮),脯氨酸,羥乙基淀粉(hetastarch)和血清白蛋白的材料組合通常用于本領域中。這些材料被證明對人類是安全的。但是,已經顯示生產方法成本昂貴的缺點,因為組合條件非常復雜。
            根據本發明,透明質酸被用作冷凍保護劑以提高用于移植的不含細胞組織的穩定性以及移植以后的生物相容性。透明質酸是和水分子具有高效反應的多糖,還是由多束D-葡萄糖醛酸/N-乙酰-D-葡糖胺二糖單元形成的無支鏈的多糖,并且富含諸如皮膚或者軟骨的多種組織的細胞外基質。
            透明質酸的主要功能包括填充間隙,穩定結構,細胞包被以及細胞保護。透明質酸和纖維蛋白在細胞外基質形成整體系統,以提供具有彈性,粘性,保護,潤滑和穩定特征的基質。此外,透明質酸的高度流動性在細胞外基質的水合作用中具有重要作用,并且使得代謝產物以相對的濃度迅速擴散。
            在本發明中,發現透明質酸由于其自身多糖結構用作冷凍保護劑,因此,移植后在受體內提高了不含細胞組織的生物相容性。
            本發明進一步描述在下列實施例中,但是下列實施例并不限制本實施例1確定聚環氧化合物的處理條件收集的豬皮保存在4℃、含50ng/ml兩性霉素B(A-9528,Sigma,USA)和1mM EDTA的RPMI-1640(13200-076,Gibco-BRL,USA)培養基中。然后,豬皮切割成1×2cm2小塊制備試驗樣品。將樣品溫育在330mM EDTA溶液中2小時以后,外皮層脫落。然后,用PBS清洗皮層多次。清洗后的樣品用不同濃度的DenacolTMEX-512(NagaseChemical Company,Japan)在不同溫度和pH下進行處理,然后測定樣品的交聯指數并且彼此比較。
            實施例1-1在不同溫度測定交聯指數試驗樣品在25℃或者37℃溫育在50ml、pH9.5的4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中,同時以30±5rpm進行振蕩。溫育3,6,9,12,15,18或者24小時以后,利用水合茚三酮分析方法測定游離氨基的含量。水合茚三酮和膠原蛋白的氨基酸反應形成藍紫色。非交聯的樣品用作對照。
            在上述溫育時間獲得的樣品在100℃和水合茚三酮反應20分鐘,并在570nm用分光光度計(Biomate 3,Thermo Spectronix)測定吸光度。不同濃度的N-δ-乙酰賴氨酸用作標準曲線的校準值,樣品中膠原蛋白的摩爾濃度與游離氨基摩爾濃度成對照的值視為游離氨基。根據下列公式計算交聯指數(參見圖1)。
            交聯指數=100×{1-(水合茚三酮的計算值)樣品÷(水合茚三酮的計算值)對照}圖1顯示不同溫度交聯指數的比較。如圖1所示,其說明交聯指數隨著反應時間的延長而成比例增加直到9小時,9小時以后輕微增加;15小時以后,觀察到交聯形成;并且,隨著溫度的增加,交聯指數開始增加。
            實施例1-2在不同聚環氧化合物濃度下測定交聯指數試驗樣品在37℃溫育在50ml、pH 9.5的0.5、1和4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中,同時以30±5rpm進行振蕩。溫育3,6,9,12,15,18和24小時以后,參照實施例1-1測定游離氨基的含量,并計算交聯指數(參見圖2)。圖2顯示聚環氧化合物不同濃度下交聯指數的比較。如圖2所示,交聯指數隨著聚環氧化合物濃度而成比例增加。
            實施例1-3在不同pH下測定交聯指數試驗樣品37℃下溫育在50ml的pH 8.5、9.5和10.5的4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中,同時以30±5rpm進行振蕩。溫育3,6,9,12,15,18,和24小時以后,參照實施例1-1測定游離氨基的含量,并計算交聯指數(參見圖3)。圖3顯示不同pH下交聯指數的比較。如圖3所示,發現隨著pH值的增加交聯指數開始增加。
            從上述結果可以清楚地表明,樣品的交聯在4%(w/v)聚環氧化合物,pH 9.5和37℃的條件下最優化。
            實施例2聚環氧化合物和透明質酸處理對于膠原蛋白結構降解的抑制效果收集的豬皮保存在4℃以下,含5μg/ml慶大霉素(G-1397,Sigma,USA),50ng/ml兩性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培養基中。然后,將豬皮的真皮面向下放入24.5×24.5cm2的生物測定皿(Nalgene,USA)中,并將豬皮的一角切開以辨別表皮面和真皮面。然后豬皮切割成6×10cm2的長方形制備試驗樣品。將樣品轉入無菌平皿(每個平皿三個樣品)中,并將50ml含330mM EDTA的0.5%魚精蛋白溶液倒入每個平皿中,并在室溫下溫育2小時,同時以45±5rpm振蕩。隨后,利用小鑷子將表皮層和真皮層分開。用PBS多次清洗真皮層,然后分成三個實驗組第一組(PE+HA)在37℃下溫育在50ml含1%(w/v)Tween 20的4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中15小時,同時以30±5rpm振蕩并用PBS清洗。樣品在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。去除透明質酸溶液以后,用PBS清洗樣品,并且再次在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。
            第二組(PE)用和第一組類似的方式進行處理,除了不用透明質酸處理。
            第三組(無PE和HA)在室溫下溫育在50ml的0.5%(w/v)SDS溶液中12小時,并用PBS清洗。然后,樣品在室溫下溫育在50ml的10%(v/v)甘油中2小時。
            在上述實驗組溫育之后,將樣品的真皮面向上放入生物測定皿中。生物測定皿放入冷凍干燥器(Ultra 35 super LE,Virtis,USA)中,所述冷凍干燥器的架子溫度最低為-50℃,冷凝器溫度最低為-60℃。然后樣品以每分鐘-2.5℃的降低速率將架子溫度迅速降低到-40℃,并保持10分鐘。然后,在真空條件下非常緩慢提高架子的溫度達到30℃,歷時30到40小時,目的是干燥樣品。干燥樣品的最終濕度低于5%(w/w)。干燥后,生物測定皿轉入層流罩,其中干燥的真皮通過真空包裝的方法進行包裝,并保存在4℃。
            每個實驗組冷凍干燥的樣品被切割成1×3cm2的小塊,在37℃下溫育在含膠原酶(1U/ml)的10 mM CaCl2溶液中25小時,并且每隔1小時進行收集。把這樣收集的樣品稱重,并且和膠原酶處理之前的重量進行比較以分析樣品的降解水平(參見圖4)。圖4顯示膠原酶降解皮層。如圖4所示,發現聚環氧化合物和透明質酸的處理有效降低了膠原酶的降解。
            結果,可以清晰的發現,由聚環氧化合物和透明質酸處理的皮層較傳統處理方法有更穩定的膠原蛋白結構。
            實施例3利用牛胎盤制備用于組織修復的生物材料收集的牛胎盤組織立即放入含有5μg/ml慶大霉素,50ng/ml兩性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培養基中,并且轉入冰包被容器,以保持溫度低于4℃,直到傳送到超凈臺。送來的胎盤組織浸入含有5μg/ml慶大霉素的Dulbecco氏磷酸緩沖鹽(21600-010,GIBCO-BRL,USA)中。將血液和碎片去除后,從胎盤組織分離羊膜。將羊膜的基質面向下放入生物測定皿(Nalgene,USA)中,組織的一角切開以辨別表皮面和真皮面。然后羊膜被切割成6×10cm2的長方形小塊,制備試驗樣品。樣品轉入平皿(每個平皿三個樣品),并將50ml含330mM EDTA的0.5%魚精蛋白溶液倒入每個平皿中,并在室溫下溫育2小時,同時以45±5rpm振蕩。在37℃下將樣品溫育在50ml含0.5%(w/v)SDS的4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中15小時,同時以30±5rpm振蕩,并再次用PBS清洗。樣品在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。將透明質酸溶液去除后,樣品用PBS清洗并且再次在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。如實施例2所述,上述樣品真皮面向上放入生物測定皿中并且進行冷凍干燥。
            實施例4分析根據研磨方法所得的粉末大小的分布使用兩種研磨方法研磨在實施例3中制備的用于組織修復的生物材料,獲得精細的可注射粉末第一種方法就是在液氮的環境下通過安裝在研磨機上鋸齒的機械轉動來研磨5g冷凍干燥的用于組織修復的生物材料;以及第二種方法就是在封閉容器中傾入5g冷凍干燥的用于組織修復的生物材料,并用安裝在冷凍研磨機(Freezer mill 6850,Spex CertiPrep,USA)中容器的沖擊器研磨,同時向機器內通氮氣。將上述兩種方法研磨的生物材料的粉末大小彼此比較(參加圖5)。圖5顯示由上述兩種研磨方法研磨的粉末大小。如圖5所示,顯示利用冷凍研磨機通過控制沖擊器沖擊數目的方式研磨可以獲得大于70%、尺寸為100-500μm的生物材料粉末,而利用轉動速率不可控制的鋸齒進行研磨可以獲得超過60%、尺寸大于500μm的生物材料粉末。
            實施例5確定用于移植的生物材料的最佳濃度對8周齡的雄性小鼠(Joongang Laboratory Animals CO.LTD.,Korea),進行皮下移植以優化實施例3制備的生物材料粉末的移植量。
            在超凈臺上將生物材料粉末注射到由乙醚麻醉的小鼠腹部皮膚,其中實驗組根據粉末大小分成三個實驗組,即100μm>,100-500μm,500μm<,然后根據粉末濃度分成三個實驗組,即250mg/ml,350mg/ml,450mg/ml。
            用于組織修復的可注射生物材料通過將每種含量的上述粉末和1ml的PBS在leur-lok注射器中混合進行制備。0.5ml的混合物利用26號針頭皮下注射到腹部。在24周內以固定間隔(即1,2,4,8,12,16,20和24周)用肉眼監控移植生物材料的持續時間(參見圖6)。圖6顯示根據用于組織修復的生物材料的大小以及注射濃度在小鼠皮下層中的持續時間。如圖6所示,檢測發現生物材料的持續時間不考慮粉末大小在450mg/ml時最長,而尺寸為100-500μm表現出最長的持續時間。
            因此,可以很清楚地表明,為了在移植以后使生物材料的持續時間最長,粉末的最佳大小為100-500μm,而粉末的最佳濃度為450mg/ml。
            實施例6利用豬皮制備用于組織修復的生物材料和移植收集的豬皮保存在4℃以下的含5μg/ml慶大霉素,50ng/ml兩性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培養基中。然后,將豬皮的真皮面向下放入生物測定皿中,并將豬皮的一角切開以辨別表皮面和真皮面。然后豬皮切割成6×10cm2的長方形小塊制備試驗樣品。將樣品轉入無菌平皿(每個平皿三個樣品),并將50ml含330mMEDTA的的0.5%魚精蛋白溶液倒入每個平皿中,以及在室溫下溫育2小時,同時以45±5rpm振蕩。隨后,利用小鑷子將表皮層和真皮層分開。用PBS清洗皮層,并且在37℃下溫育在50ml含1%(w/v)Tween20的4%(w/v)DenacolTMEX-512溶液中15小時,同時以30±5rpm振蕩,并再次用PBS清洗。清洗后的皮層在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。將透明質酸去除后,用PBS清洗,皮層再次在37℃下溫育在50ml的0.5%透明質酸中1小時,同時以30±5rpm振蕩。上述皮層如實施例2所述進行冷凍干燥。4g的冷凍干燥生物材料如實施例4所述在冷凍研磨機中研磨成400μm大小的粉末。可注射的生物材料以和實施例5類似的方式進行制備,除了使用1.5ml的1%(v/v)利多卡因溶液代替1ml的PBS。
            這樣制備的可注射生物材料如實施例5所述注射到雄性小鼠的皮下層。1周,1個月,和12個月以后,從注射區收集皮下組織,并用溶血毒素和伊紅(H&E)染色后進行觀察檢查小鼠細胞的滲透和分裂(參見圖7a,7b和7c)。圖7a,7b,和7c分別為顯示皮下注射1周,1個月和1年以后皮組織的照片。如圖7a所示,移植1周以后在注射區邊緣有很多小鼠細胞被滲透和分裂,而中間有少數細胞開始分裂;在圖7b中,移植1個月以后,雖然移植生物材料和小鼠組織的邊緣明顯,小鼠細胞在注射區的中間以及邊緣分裂活躍,而且移植的生物材料開始自身組織發生;在圖7c中,在移植12個月以后,小鼠細胞填充了注射區,邊緣消失,完成自身組織發生。
            如上所示和所述,本發明提供了制備用于組織修復的方法,其包括從哺乳動物獲得的基于膠原蛋白的組織膠原蛋白的交聯,對組織進行去細胞,并通過使用防凍液對不含細胞的組織進行冷凍干燥的步驟,還提供了由上述方法制備的用于組織修復的生物材料。本發明制備用于組織修復的生物材料的方法包括下列步驟從哺乳動物獲得基于膠原蛋白的生物組織;用聚環氧化合物處理生物組織從而獲得具有交聯膠原蛋白結構的生物組織;對獲得的生物組織去細胞產生不含細胞的組織;以及將不含細胞組織浸入含有透明質酸的冷凍保護液并將上述組織冷凍干燥。根據本發明,具有更穩定的膠原蛋白結構用于組織修復的生物材料可以通過較現有技術更簡單的方法進行制備,這使得經濟制備多種用于組織修復的生物材料成為可能。
            權利要求
            1.一種制備用于組織修復的生物材料的方法,其包括如下步驟(i)從哺乳動物獲得基于膠原蛋白的生物組織;(ii)用聚環氧化合物處理生物組織從而獲得具有交聯膠原蛋白結構的生物組織;(iii)將上述獲得的生物組織去細胞產生不含細胞的組織;以及(iv)使不含細胞組織浸入含有透明質酸的冷凍保護液并將上述組織冷凍干燥。
            2.權利要求1所述的制備用于組織修復的生物材料的方法,其中基于膠原蛋白的生物組織為哺乳動物的筋膜,羊膜,胎盤或者皮膚。
            3.權利要求1所述的制備用于組織修復的生物材料的方法,其中聚環氧化合物為聚甘油聚縮水甘油醚或聚乙二醇縮水甘油醚。
            4.權利要求1所述的制備用于組織修復的生物材料的方法,其中生物組織用1-7%(w/v)的聚環氧化合物在pH8-11和30-45℃的條件下處理10-20小時。
            5.權利要求1所述的制備用于組織修復的生物材料的方法,進一步包括在液氮環境中在研磨機中冷凍研磨冷凍干燥的不含細胞組織的步驟。
            6.權利要求1所述的制備用于組織修復的生物材料的方法,進一步包括對冷凍干燥的不含細胞組織進行水合作用并且切割水合組織的步驟。
            7.一種用于組織修復的生物材料,包括來自哺乳動物基于膠原蛋白的生物組織的主要成分,其通過權利要求1所述的方法進行制備。
            全文摘要
            本發明涉及一種制備用于組織修復的生物材料的方法,其包括下列步驟將從哺乳動物獲得的基于膠原蛋白的組織的膠原蛋白交聯,對組織進行去細胞,并通過使用防凍液對不含細胞的組織進行冷凍干燥,還涉及由上述方法制備的用于組織修復的生物材料。本發明制備用于組織修復的生物材料的方法包括下列步驟從哺乳動物獲得基于膠原蛋白的生物組織;用聚環氧化合物處理生物組織從而獲得具有交聯膠原蛋白結構的生物組織;使上述獲得的生物組織去細胞產生不含細胞組織;把不含細胞組織浸入含有透明質酸的冷凍保護液并將上述組織冷凍干燥。根據本發明,可以通過較現有技術更簡單的方法制備具有更穩定膠原蛋白結構用于組織修復的生物材料,這使得經濟制備多種用于組織修復的生物材料成為可能。
            文檔編號A61L27/60GK1556715SQ02811948
            公開日2004年12月22日 申請日期2002年9月5日 優先權日2001年9月5日
            發明者金泰運, 樸成榮, 黃鎬燦 申請人:韓士生科有限公司
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