細胞移植的方法和試劑的制作方法

專利名稱：細胞移植的方法和試劑的制作方法
背景技術：
本發明涉及細胞移植領域。
人們已經提出骨髓可能是循環心肌細胞的祖細胞的體內來源。在一個實驗中，人們觀察到移植的骨髓來源的細胞分布在營養不良小鼠的心臟中。雖然還沒有鑒定這些細胞的分子特性，但它們在心臟組織中的位置表明這些細胞是心肌細胞。骨髓間充質干細胞(BMSC)具有在引入誘導劑，如5-氮胞苷后分化為搏動心肌細胞的能力。人們以這些發現為基礎，提出了將BMSC用于治療心臟疾病和心臟異常的細胞的來源。
盡管BMSC具有潛在的治療價值，但現在用于心臟組織的細胞移植法不適于臨床，這是因為移植物摻入到宿主組織中的速率較慢。例如，Orlic等(Nature 410701-705，2001)報道了只有40％接受BMSC移植物的小鼠顯示出一定程度的心肌修復。
因此，仍然需要一種細胞移植方法，它具有高速率的細胞摻入和細胞存活。
發明概述我們發現了一種方法，通過這種方法可對干細胞分化的誘導進行體外監測，然后收集用于移植的干細胞。
因此，本發明提供一種用于生產移植到哺乳動物(例如，人)心肌組織中的細胞的方法。該方法包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的骨髓干細胞群，(b)在誘導該細胞成為生心肌細胞(例如，心肌細胞的祖細胞)的條件下培養該細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，(d)當至少約10％和多至100％的細胞是生心肌細胞時，收集步驟(b)的細胞。所述細胞可以是，例如，人，豬，或狒狒的BMSC。在其中一個實施方案中，該方法進一步包括把步驟(d)的細胞移植到哺乳動物(例如，人)中的步驟(e)。移植可以是自體移植，即移植來源于所治療哺乳動物的細胞。優選，至少約15％，20％，30％，40％或50％的所收集細胞是生心肌細胞(例如，心肌細胞的祖細胞)。優選多至約60％，70％，80％，90％，95％或99％的所收集細胞是生心肌細胞。最優選當至少約50％和多至約80％的細胞是生心肌細胞時，收集所述細胞。
我們還發現了一種治療性的細胞移植法，其中血管和心肌組織在所治療的心肌區域中共同再生。
心肌梗塞后，由于供給受影響區域的血液減少，從而危害到內源心肌細胞的健康。為了提高所注射細胞的存活，希望宿主哺乳動物能夠生長出一張血管網，從而供給細胞存活所需的氧和營養物。
心肌的冠狀血管系統是由從心外膜遷移到心肌中的內皮和血管平滑肌祖細胞形成的，以此觀察為基礎，我們相信內皮和血管平滑肌祖細胞類型與心肌細胞或心肌細胞祖細胞的聯合給予可促進治療上有效的心肌細胞存活所必需的血管網形成。梗塞的心肌是通過聯合使用心肌細胞的祖細胞、內皮祖細胞和血管平滑肌祖細胞再生新的心肌細胞以及新的血管而修復的。在其中一個實施例中，祖細胞來源于離體干細胞。
因此，第二個方面，本發明還提供一種用于生產細胞的方法，所述細胞可受引發分化成內皮細胞，從而用于移植到哺乳動物(例如，人)的心肌組織中。該方法包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的干細胞群，(b)在誘導該細胞成為內皮細胞的條件下培養該細胞，(c)當至少約10％和多至100％的細胞是內皮祖細胞時，收集步驟(b)的細胞。
第三個方面，本發明還提供一種用于生產細胞的方法，所述細胞可受引發分化成血管平滑肌細胞，從而用于移植到哺乳動物(例如，人)的心肌組織中。該方法包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的干細胞群，(b)在誘導該細胞成為血管平滑肌細胞的條件下培養該細胞，(c)當至少約10％和多至100％的細胞是血管平滑肌祖細胞時，收集步驟(b)的細胞。
第四個方面，本發明提供一種治療被診斷患有以心功能不全為特征的病癥的哺乳動物(例如，人)的方法。該方法包括把下列三種類型的細胞引入到哺乳動物心肌組織中的步驟(1)心肌細胞或心肌細胞的祖細胞；(2)內皮細胞或內皮細胞的祖細胞；和(3)血管平滑肌細胞或血管平滑肌細胞的祖細胞，它們的量足以改善心功能。在其中一個實施例中，對于每次注射而言，一百萬個心肌細胞的祖細胞是與其它兩種細胞類型以大約10∶1∶1(心肌細胞的祖細胞∶內皮細胞的祖細胞∶平滑肌細胞的祖細胞)的比例一起注射到心肌中的。也可使用其它比例。例如，心肌細胞的祖細胞與內皮細胞的祖細胞或血管平滑肌細胞的祖細胞的比例單獨地在約1∶1-50∶1之間或更多(例如，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1，12∶1，15∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，或更多)。因此，在其中一個實施例中，心肌細胞的祖細胞∶內皮細胞的祖細胞∶平滑肌細胞的祖細胞的比例為10∶2∶1。在注射過程中，每種細胞類型可以是分層排列的(水平或垂直)，這樣內皮細胞的祖細胞靠近心內膜，血管平滑肌細胞的祖細胞位于中間，心肌細胞的祖細胞靠近心外膜。可選擇性地，在注射前，可按細胞數比混合細胞類型，例如10∶1∶1(心肌細胞的祖細胞∶內皮細胞的祖細胞∶平滑肌細胞的祖細胞)，并以混合物的形式給心肌注射。為了提高血管的產生，可把要注射的細胞與某些血管生成劑，如VEGF(例如，以1-10μM的濃度)混合。
誘導細胞成為生心肌細胞的很多方法都是本領域已知的。例如，可在培養基中培養BMSC，所述培養基含有生心肌細胞誘導量的BMP-2或bFGF。這些方法可用于實行本發明。
因為有絲分裂的細胞可能比分裂期后的細胞更容易整合到心肌中，因此希望至少約25％，50％，75％，90％，95％或更多的步驟(c)的移植細胞是有絲分裂的祖細胞(例如，心肌細胞的祖細胞，內皮細胞的祖細胞，或血管平滑肌細胞的祖細胞)。
另一方面，本發明提供一種藥物組合物，它在藥學上可接受的載體或賦形劑中含有干細胞來源的細胞群，其中至少約10％和多至100％的細胞是內皮細胞的祖細胞。
另一方面，本發明提供一種藥物組合物，它在藥學上可接受的載體或賦形劑中含有干細胞來源的細胞群，其中至少約10％和多至100％的細胞是血管平滑肌細胞的祖細胞。
另一方面，本發明還提供一種藥物組合物，它含有三種類型的細胞(1)心肌細胞或心肌細胞的祖細胞；(2)內皮細胞或內皮細胞的祖細胞；和(3)血管平滑肌細胞或血管平滑肌細胞的祖細胞，它們的量足以改善心功能。希望所述細胞來源于干細胞(例如，BMSC)。為了促進血管的產生，希望還含有血管生成劑(例如，1-10μM的VEGF)。此外，為了促進本發明移植細胞的存活，還可把抗凋亡劑，如caspase抑制劑(例如，zVADfmk)與所要注射的細胞聯合給予。
本發明還提供一種用于生產移植到哺乳動物(例如，人)中的細胞的方法。該方法包括下列步驟(a)提供BMSC群，(b)在誘導該細胞采取血管平滑肌細胞，內皮細胞，心外膜細胞，脂肪細胞，破骨細胞，成骨細胞，巨噬細胞，神經元祖細胞，神經元，星形膠質細胞，骨骼肌細胞，平滑肌細胞，胰前體細胞，胰β-細胞，和肝細胞細胞類型的條件下培養該細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，(d)當至少約10％和多至100％的細胞表達可檢測量的、對所誘導細胞類型特異的蛋白時，收集步驟(b)的細胞。這里將描述適宜的標記。例如所述BMSC可以是人，豬、或狒狒的BMSC。在其中一個實施方案中，該方法包括把步驟(d)的細胞移植到哺乳動物(例如，人)中的步驟(e)。所述移植可以是自體移植，即，把細胞移植到產生骨髓干細胞的哺乳動物中。在另一實施方案中，所述培養和監測步驟(b)和(c)一直進行到至少約15％，20％，30％，40％，或50％和多至約60％，70％，80％，90％，95％，或99％的細胞表達可檢測量的、所需細胞系的標記。希望所述培養和監測步驟(b)和(c)一直進行到至少約50％和多至80％的細胞表達可檢測量的、所需細胞系的標記。
本發明還提供一種治療哺乳動物，特別是人以心功能不全為特征的病癥的方法。該方法包括下列步驟(a)分離所治療哺乳動物的骨髓干細胞，(b)在誘導該細胞分化成生心肌細胞的條件下培養該骨髓干細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，(d)當至少約10％和多至100％的細胞是生心肌細胞時，收集步驟(b)的細胞，(e)把所述生心肌細胞移植到哺乳動物中。
希望前述所有方法中的監測步驟(c)都是通過監測用報道基因構建體轉染的包被BMSC的分化狀態進行的。進行監測的BMSC對于所培養的BMSC而言可以是自體的，同源的，或異源的。
“干細胞”是指這樣一種細胞它能夠(i)自我更新，并(ii)產生多種分化的細胞類型，包括心肌細胞，內皮細胞，和血管平滑肌細胞中的一種。
“BMSC”是指來源于骨髓間充質的CD45-的干細胞。BMSC還被稱作“骨髓干細胞”和“骨髓多潛能祖細胞”。
此處所用“核酸”是指DNA或RNA。“核酸分子”可以是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。除非另有說明，單鏈核酸分子序列的左手方向是5’端，雙鏈核酸分子的左手方向被稱作5’方向。
“Csx/Nkx2.5”是指一種核酸或多肽，它基本上與小鼠或人的Csx/Nkx2.5 cDNA或Csx/Nkx2.5多肽相同，當在BMSC中表達時，可誘導細胞成為生心肌細胞。優選對于一段50個連續核苷酸的序列而言，所述核酸與小鼠或人Csx/Nkx2.5的同一性至少為80％，更優選至少為85％，更優選至少為90％或甚至95％。至多10％的空位可包括在一個或兩個序列中。優選對于一段25個連續氨基酸的序列而言，所述多肽與小鼠或人Csx/Nkx2.5的同一性至少為80％，更優選至少85％，更優選至少90％或甚至95％。另外，10％的空位可包括在一個或兩個序列中。
“治療”是指減少或緩解以心功能不全為特征的病癥的至少一個不利作用或癥狀。心臟疾病的不利作用或癥狀有很多，而且已經詳細描述過。心臟疾病的不利作用或癥狀的非限制性例子包括呼吸困難，胸痛，心悸，頭暈，暈厥，水腫，紫紺，蒼白，疲勞和死亡。各種心臟疾病的不利作用或癥狀的其它例子見Robbins，S.L.等(1984)疾病的病理學基礎(W.B.Saunders Company，Philadelphia)547-609；和Schroeder，S.A.等編輯.(1992)當前的醫療診斷和治療(Appleton & Lange，Connecticut)257-356。
“以心功能不全為特征的病癥”包括正常心臟功能的損害或缺乏或異常心臟功能的存在。異常的心臟功能可能是疾病，損傷，和/或衰老的結果。此處所用的異常心臟功能包括心肌細胞或心肌細胞群的形態和/或功能異常。形態和功能異常的非限制性例子包括心肌細胞的物理損耗和/或死亡，心肌細胞的異常生長模式，心肌細胞間的物理連接異常，心肌細胞所致的一種或多種物質產生不足或過量產生，心肌細胞不能產生它們通常產生的一種或多種物質，異常模式或異常時間的電脈沖傳輸，及上述其中一種異常導致的腔室壓改變。異常的心臟功能可在很多疾病中見到，包括，例如，缺血性心臟病，如，心絞痛，心肌梗塞，慢性缺血性心臟病，高血壓性心臟病，肺心病(肺原性心臟病)，心臟瓣膜病，如，風濕熱，二尖瓣脫垂，二尖瓣環鈣化，類癌心臟病，感染性心內膜炎，先天性心臟病，心肌病，如，心肌炎，心肌病，導致充血性心力衰竭的心臟疾病、和心臟腫瘤，如，原發性肉瘤和繼發性腫瘤。
“給予”，“引入”，和“移植”可互換使用，是指通過一種把細胞定位在預定位置的方法或途徑，而把本發明的生心肌細胞放到患者，如，人類患者中。
“啟動子”是指核酸的一個區，在翻譯起始密碼子上游，涉及RNA聚合酶及其它蛋白的識別和結合以引發轉錄。“人類啟動子”是一種能夠在人類細胞中引發轉錄的啟動子，可來源于人類細胞，也可不是。“Csx/Nkx2.5啟動子”來源于Csx/Nkx2.5基因的啟動子區，當與異源核酸分子可操作性連接時，能夠在心臟細胞中引發該分子的轉錄(當存在于能夠支持轉錄的轉錄介質中時)。
“增強子元件”或“增強子”是指這樣一種核酸序列，當其位置與啟動子鄰近，并存在于能夠支持轉錄的轉錄介質中時，與沒有增強子結構域存在條件下啟動子產生的轉錄活性相比，它可使轉錄活性增加。“Csx/Nkx2.5增強子”來源于Csx/Nkx2.5基因的啟動子區，當與異源核酸分子可操作性連接時，能夠在心臟細胞中引發該分子的轉錄(當存在于能夠支持轉錄的轉錄介質中時)。“Tie-2增強子”來源于Tie-2基因的啟動子區，當與異源核酸分子可操作性連接時，能夠在內皮細胞中引發該分子的轉錄(當存在于能夠支持轉錄的轉錄介質中時)。“Bves增強子”來源于Bves基因的啟動子區，當與異源核酸分子可操作連接時，能夠在血管平滑肌細胞中引發該分子的轉錄(當存在于能夠支持轉錄的轉錄介質中時)。
“可操作性連接”是指兩個或更多個核酸分子(如，轉錄的核酸分子，啟動子和增強子元件)以這種方式連接，從而使核酸分子在適宜的轉錄介質中轉錄。
“來源于”是指所述核酸分子是從第二種核酸分子制造或設計的，該衍生物保留制造或設計它的核酸分子的至少一個重要功能。
“表達構建體”是指支持轉錄的核酸分子。本發明的表達構建體至少包括，心特異性增強子元件和啟動子。如此處所述，還可包括其它元件如轉錄終止信號。
“載體”或“表達載體”是指一種表達系統，一種基于核酸的媒介物，一種適于核酸遞送的核酸分子，或一種自主的自我復制的環狀DNA(例如，一種質粒)。當載體維持在宿主細胞中時，該載體可在有絲分裂過程中，作為自主結構被細胞穩定復制，并摻入到宿主細胞的基因組內，或維持在宿主細胞的細胞核或胞質中。
“心臟細胞”是指分化的心臟細胞(例如心肌細胞)或定型產生或分化為心臟細胞的細胞(例如，成心肌細胞或生心肌細胞)。
“心肌細胞”是指心臟中的肌細胞，它表達可檢測量的心臟標記(例如，α-肌球蛋白的重鏈，cTnI，MLC2v，α-心臟肌動蛋白，和體內Cx43)，可收縮，但不會增殖。
“成心肌細胞”是指一種表達可檢測量的心臟標記，可收縮，并增殖的細胞。
“生心肌細胞”是指這樣一種細胞，它表達可檢測量的Csx/Nkx2.5RNA或蛋白的細胞，它不顯示有組織的肌原纖維節結構或收縮，并且優選不表達可檢測量的肌球蛋白重鏈蛋白。
“心外膜細胞”是指表達可檢測量的Flk-1和/或ICAM-2，而且可成為內皮細胞的細胞。
“心內膜細胞”指表達可檢測量的Tie-2和/或馮維勒布蘭德因子的心臟細胞。
“內皮細胞”是指這樣一種細胞，它表達可檢測量的下列至少一種RNA或蛋白MUC18，VE-鈣粘著蛋白，N-鈣粘著蛋白，α-和β-連環蛋白，Flk-1，Tie-2，和CD34。
“使細胞受引發分化為內皮細胞”是指把還沒有無限增殖化的干細胞在誘導該細胞成為內皮細胞的條件下培養，其中至少約10％，25％，50％，75％，90％，95％，99％，或甚至100％的細胞是內皮細胞。
“使細胞受引發分化為血管平滑肌細胞”是指把還沒有無限增殖化的干細胞在誘導該細胞成為血管平滑肌細胞的條件下培養，其中至少約10％，25％，50％，75％，90％，95％，99％，或甚至100％的細胞是血管平滑肌細胞。
當涉及所培養BMSC的分化時，“特異性誘導一種細胞類型”是指一種培養物中至少50％的BMSC分化成所需的細胞類型(即，心肌細胞)。
蛋白的“可檢測量”是指蛋白的量可使用例如這里提供的方法，通過免疫細胞化學方法檢測。下面提供一種確定細胞是否用CsX/Nkx2.5或肌球蛋白的重鏈可檢測性標記的方法。在冰上用4％甲醛固定所培養的細胞20分鐘，然后在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的0.2％Triton X-100中孵育15分鐘。在PBS中洗滌三次后，在印跡溶液(在PBS中含有1％BSA和0.2％Tween 20)中孵育該細胞15分鐘。然后用下列抗體的一種處理樣品抗Csx(1∶100-1∶200，來源于S.Izumo，Harvard Medical School，Boston MA)，MF-20(1∶50-200，來源于Developmental Studies Hybridoma Bank，Universityof Iowa，Iowa City Iowa)，抗-結蛋白(1∶100-200，來源于Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis MO)，如果需要，還可使用它們相等濃度的同型對照(對于Csx而言，是標準兔血清；對于MF-20而言，是小鼠IgG2b；對于結蛋白而言，是小鼠IgG1)，在保濕室中4℃孵育過夜。然后用洗液(PBS中的0.5％Tween 20)洗滌樣品載玻片3次，按照供貨商提供的說明，用二級抗體(對于Csx而言，是驢抗兔IgG，對于MF-20和抗結蛋白而言，是驢抗小鼠IgG，全部來源于Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)孵育，然后洗滌3次。在熒光顯微鏡(例如，具有匹配熒光附件的Nikon TS100顯微鏡)下檢測，根據顯色給免疫標記評分。
“心臟特異性增強子元件”是指一種與啟動子可操作性連接的元件，它可指導基因在心臟細胞中的表達，但不能指導基因在所有組織或所有細胞類型中的表達。例如，某些來源于Csx/Nkx2.5的心臟特異性增強子元件可驅動基因在心臟細胞及舌和胚胎胃中表達。本發明的心臟特異性增強子可天然存在或非-天然存在。
“異源”是指核酸分子來自于外界來源或，如果來自于相同的來源，則對其原始形式修飾。因此，“異源啟動子”是這樣一種啟動子，它與本發明的重復增強子結構域通常不相關。同樣，異源核酸分子是從其原始形式修飾的，或來自于和衍生與其可操作性連接的啟動子的來源不同的來源。
“基本上純的核酸”是指不含所述基因的核酸，該基因在衍生本發明核酸的生物體天然存在的基因組中與核酸側面連接。因此該術語包括，例如，摻入到載體中的重組核酸；摻入到自主復制質粒或病毒中的重組核酸；或摻入到原核生物細胞或真核生物細胞中的基因組核酸；或作為獨立于其它序列的獨立分子(例如，通過PCR或限制性內切核酸酶消化產生的cDNA或基因組或cDNA片段)存在。它還包括這樣一種重組核酸，其是編碼附加多肽序列的雜種基因的一部分。
“轉基因”是指將核酸分子的任一片段(例如DNA)通過技術暫時或永久插入到細胞中，而且如果被整合到基因組中，或在染色體外維持，則可成為生物體的一部分。這種轉基因可包括與轉基因生物體部分或完全異源(即，外源性)的基因，或表示與生物體內源基因同源的基因。
“轉基因細胞”是含有轉基因的細胞。例如，用載體轉化的干細胞可用于產生表型特性改變的細胞群，其中所述載體含有與異源核酸分子可操作性連接的表達載體。來源于轉基因生物體的細胞也是一種轉基因細胞，只要該細胞含有轉基因。
本發明的其它特征和優點可從下列優選實施方案的描述以及權利要求很明顯地看出。
附圖簡述

圖1是來源于小鼠和狗的，分離、培養的骨髓干細胞相差顯微照片。
圖2是一組表示與小雞心肌細胞共培養14天后，小鼠BMSC的顯微照片。
圖3是一組顯微照片，表示利用對肌原纖維節肌球蛋白特異的MF-20抗體，或抗結蛋白抗體進行的小鼠心肌細胞，未分化BMSC，和分化BMSC的染色及形態學。
圖4是一組顯微照片，表示體外分化后，犬BMSC的形態學和Csx/Nkx2.5表達。
圖5是一組顯微照片，證實小鼠BMSC體外分化成了內皮細胞系。
圖6是一組顯微照片，表示移植15天后，移植的BMSC在梗塞狗心肌中的定位。
圖7A是一組顯微照片，表示在注射過細胞的區域中，利用DiI熒光檢測的移植BMSC和利用抗-MHCα/β熒光檢測的心肌細胞的共同定位。
圖7B是一張顯微照片，表示相對于未處理過的BMSC而言，使用caspase抑制劑可使移植BMSC的存活增加。
圖8是一組顯微照片，表示在離開注射位點的區域中，利用DiI熒光檢測的移植BMSC和利用抗-MHCα/β熒光檢測的心肌細胞的共同定位。
圖9是一組顯微照片，表示在離開注射位點的區域中，利用DiI熒光檢測的移植BMSC和利用抗-MHCα/β熒光檢測的心肌細胞的共同定位。
圖10是一組顯微照片，表示BMSC移植36天后，小鼠心肌梗塞的組織病理學。
圖11-14是表示移植36天后，BMSC整合到小鼠心肌組織中的顯微照片。
圖15是一對顯微照片，比較沒有(左側)或有(右側)誘導生心肌細胞分化的生長因子存在的條件下，hCsx-lacZ小鼠BMSC中的β-半乳糖苷酶活性。
圖16A表示一種代表性的包被細胞指示系統。在舉例說明中，把指示細胞2包在包被材料4，如藻酸鹽珠中。指示細胞2和包被材料4都包含在通透膜或篩網6中，并與細胞8在培養容器10中共培養。
圖16B表示使用包被指示細胞監測培養物中的肌原性分化。所示為適于進行細胞包被的11μm和30μm尼龍篩網的顯微照片；還有表示β-半乳糖苷酶反應結果的顯微照片，所述β-半乳糖苷酶反應是用含有不同細胞數的hCsx-lacZ小鼠BMSC指示包囊進行的。
圖17-19表示在移植誘導的BMSC之前(左側)和之后(右側)，梗塞犬心臟的超聲心動圖。
圖20A表示代表性的三筒一針注射器簡圖。在這個例子中，各筒是同時、平均地注射到一個儲存連接體中，所述儲存連接體與單針相連以便精確部位注射。三個注射筒在頂部連接，并由單一的柱塞壓器控制。
圖20B是圖20A中三筒一針注射器的橫截面圖。
圖21A是代表性的三筒兩針注射器簡圖，該注射器具有一個用于注射一種細胞類型的更大的筒。兩個較小的筒與儲存連接體相連，儲存連接體則與一根針連接。較大的筒具有單獨的注射用針。希望加大與較大筒連接的針孔，從而維持較小筒的筒/針孔比例，由此維持所有三個筒中的注射壓相等。然而可選擇性地，三個筒的三角形排列可使兩根針緊挨著，并維持平行的注射角度。三個注射筒在頂部連接，并由單一的柱塞壓器控制，以均衡注射壓。
圖22A是圖21A三筒一針注射器的橫截面圖。
圖22B是一種代表性的三筒三針設計，其中每個注射器筒都有自己的注射用針。如果需要，三個筒的三角形排列使三根針緊挨著，并維持平行的注射角度。三個注射筒在頂部連接，并由單一的柱塞壓器控制，用于均衡注射壓。
圖22C是圖22A三筒一針注射器的橫截面圖。
發明詳述我們已經發現，移植發育定型但未分化的細胞可提高靶組織中移植物的存活，摻入，和適應。
在發育的脊椎動物中，早期的心臟區域是通過Csx/Nkx2.5基因的表達確定的。然而，在此發展階段，表達Csx/Nkx2.5的細胞仍然增殖。我們相信，移植仍然增殖的、表達Csx/Nkx2.5的細胞可導致心臟中摻入的功能性心肌細胞數增加。
我們還發現一種治療性的細胞移植方法，其中血管和心肌組織在所治療的心肌區域中共同再生。該方法包括移植未分化的細胞，其定型為三種細胞類型中的一種心肌細胞，內皮細胞，或血管平滑肌細胞。
希望能大量供給移植的細胞。因此，一方面，移植的細胞來源于干細胞。其中一種適宜的干細胞是BMSC，可從成人骨髓中分離出來。如下所述，一旦分離，可以用生長因子處理BMSC(這里稱為“引發”)，從而誘導該細胞成為心肌細胞系。可選擇性地，BMSC可被引發成內皮細胞系，或血管平滑肌細胞系。在其中一個實施方案中，使用關聯細胞類型-特異的指示系統監測BMSC的細胞系轉化，所述指示系統在引入此處作為參考的美國臨時申請系列號60/283,837中描述。為了產生細胞類型-特異的指示系統，使用基因構建體建立轉基因小鼠系，其中所述基因構建體包括細胞系-特異的增強子/啟動子-驅動的標記。例如，心肌細胞祖細胞的轉化可使用來源于hCsx-LacZ轉基因小鼠的包被BMSC監測。一旦在細胞群中檢測到足夠的標記基因表達，收集細胞，并把它們注射到宿主的心肌中。
在其中一個實施方案中，將心肌細胞的祖細胞，內皮祖細胞，和血管平滑肌細胞同時注射到宿主的心肌中。為了在預定區域適當分布各種細胞類型，可使用被設計用來注射多種細胞類型的多通道注射器。每根針的長度和它們之間的距離可根據所要修復的心肌中每種細胞類型的最佳位置而調節。
干細胞和干細胞衍生制品的優化對于成功的細胞移植至關重要。為了獲得最大效率的細胞移植，希望移植的細胞處于適當的定型和分化階段。目前，盡管很多動物細胞的定型和分化標記都是已知的，但不對這些標記的表達進行耗時分子生物學測定，仍然難以確定體外培養過程中收集細胞的適宜時間。我們已經發現一種生物活性指示系統，使用它可實時測定培養物中細胞的分化狀態。例如這種指示系統還可用于測定細胞生長或細胞死亡過程中蛋白的基因表達量。
大多數組織-特異性的基因表達都是在轉錄水平由增強子和阻抑序列控制。通常，為了產生嚴密調節的表達，增強子采用復雜的調節機理，需要多個轉錄因子的合作。這些轉錄因子的結合位點可能距離基因啟動子很多千堿基對(kb)，而且彼此相對分散。
當用于驅動小鼠中的轉基因表達時，來源于hCsx/Nkx2.5和mCsx/Nkx2.5的心臟增強子概括了內源性mCsx/Nkx2.5的表達模式(見，例如，美國專利申請公開號2002022259，其引入此處作為參考)。在迄今為止已知的哺乳動物心臟增強子中，其中一種增強子(7.5kb的增強子)是在所有四個心臟腔室中都有活性的最早期的增強子。此外，這種增強子不會異位表達。在這個7.5kb的片段內，兩個區(此處稱為同源結構域A1和同源結構域A2)彼此分離，當與hsp68啟動子-lacZ盒可操作性連接時，能一起以心臟特異性方式提高基因表達。這兩個區還可用于本發明的報道基因構建體中。
實施例1從BMSC誘導生心肌細胞從成年小鼠和狗中分離骨髓。分離BMSC，并在含有10％胎牛血清，100μM L-抗壞血酸-2-PO4，5-15ng/ml白血病抑制因子(LIF)，和20nM地塞米松(小鼠培養物使用小鼠的LIF，狗培養物使用人的LIF)的培養基中培養。這種體外環境可使BMSC維持它們的自我更新特性，并在不損失對諸如生長因子的分化劑的反應性的條件下，通過傳代擴展。此外，通過多次傳代培養的干細胞維持間充質的形態學和染色質組型(圖1)。在含生長因子(50ng/ml BMP2，100ng/ml bFGF)的培養物中14天后，大約80％的BMSC是Csx/Nkx2.5，MF-20(一種對肌原纖維節肌球蛋白特異的單克隆抗體)，和結蛋白抗體陽性染色，表明該細胞已經分化成心肌細胞(圖3和4)。
為了模擬移植BMSC遇到的成人心肌環境，使用共培養模型系統。在該系統中，把為進行鑒定而用熒光標記物標記(VybrantTM)的BMSC，和原代小雞胚心肌細胞以1∶40的比例共培養，培養是在涂有5ng/ml膠原的載玻片上進行的。這些混合培養物在有25ng/ml BMP2或25ng/ml bFGF存在的條件下單獨生長。隨后用Csx/Nkx2.5，MF-20(一種對肌原纖維節肌球蛋白特異的單克隆抗體)，和抗結蛋白抗體對細胞染色。開始后5天，在有BMP2或bFGF存在條件下生長的共培養物中，可檢測到一些(0.1-1％)肌球蛋白陽性細胞，而在沒有任何一種生長因子存在條件下生長的共培養物對于所有三種抗體都顯陰性。然而，在沒有生長因子存在的條件下共培養2周后，很多BMSC都是MF-20陽性的，表明它們已經轉化成肌原性細胞系(圖2)。因此，使用任何一種生長因子，如BMP2和bFGF，或通過與分化的心肌細胞共培養，BMSC都可被誘導沿著肌原性細胞系分化。
由于前述結果，我們可通過調節培養細胞的環境而調節培養物中BMSC成為生心肌細胞的速率和量。按照本發明的移植方法，希望至少10％的移植細胞是生心肌細胞(即，表達Csx/Nkx2.5，但不顯示有組織的肌原纖維節結構或收縮的有絲分裂細胞，并優選不表達可檢測量的肌球蛋白重鏈RNA或蛋白的有絲分裂細胞)。更高比例的生心肌細胞可導致移植細胞的摻入增加。因此，希望至少10％，25％，50％，75％，85％，90％，或95％，或更多的細胞是生心肌細胞。定型的實時測量可使用下面實施例5所述的細胞指示系統進行。
實施例2來源于人和其它哺乳動物的BMSC前面的實施例是利用小鼠BMSC進行舉例說明。本領域已知人BMSC也能夠產生心臟細胞(Pittenger等，Science 284143-147，1999)。來源于其它哺乳動物的BMSC(例如，人源化的豬BMSC)也可用于本發明的方法中(Levy等，Transplantation 69272-280，2000)。
實施例3誘導BMSC成為生心肌細胞的方法如上所述，在有BMP2和/或bFGF存在的條件下，把BMSC與心肌細胞共培養在培養物中可誘導能夠分化為心肌細胞的生心肌細胞。各自調節BMSC與誘導性細胞的比例和生長因子的濃度可調節生心肌細胞誘導的速率和量。例如，BMSC與誘導性細胞的比例可約為1∶1-1∶1000或更高。BMP2的濃度可從約0.5ng/ml-約1μg/ml，而bFGF的濃度可從約1ng/ml-約5μg/ml。應當了解，可使用其它BMP/TGFβ和FGF家族的成員代替BMP2和/或bFGF。
其它誘導BMSC成為生心肌細胞的已知方法也可用于本發明中。并不是所有誘導心肌細胞的方法都可用于本發明。例如，5-氮胞苷可用作心肌細胞的誘導劑(Makino等，J.Clin.Invest.，103697-705，1999)，但不適于本發明的方法。因為5-氮胞苷可使基因組序列隨機脫甲基化(由此誘導正常的沉默基因)，用5-氮胞苷處理BMSC可產生除了心肌細胞(心臟肌鈣蛋白I陽性)之外的多種細胞類型(例如，肌細胞(MyoD陽性))，成骨細胞(骨鈣蛋白陽性)，和脂肪細胞(PPAR-γ陽性)(Wakitani等，Muscle Nerve，181417-1426，1995；Tomita等，Circulation，100 suppl II247-256，1999)。與5-氮胞苷接觸的BMSC已知迅速上調c-abl及白介素-6的轉錄物，而下調膠原I，一種主要基質蛋白的表達(Andrews等，Mol.Cell.Biol.，92748-2751，1989)。在本發明方法中，適宜的因子或條件是可特異性誘導一種細胞類型(例如，心肌細胞)的那些因子或條件。
實施例4其它細胞類型的誘導我們還希望能夠誘導其它細胞類型，如血管平滑肌細胞和內皮細胞(或它們的前體)，用于移植到心肌中，因為這些細胞可在移植的生心肌細胞周圍產生新的血管。所述細胞可單獨移植，但優選按這里所述和適宜的生心肌細胞一起移植。
血管平滑肌細胞的分化可使用Bves基因增強子測定(Reese等，Dev.Biol.209159-171，1999)。內皮細胞的分化可使用已經克隆的Tie-2或馮維勒布蘭德因子的增強子測定(分別見Schnurch和Risau，Development 119957-968，1993和Coffin等，Dev.Biol.14851-62，1991)。胚胎心外膜細胞(即，內皮細胞前體)的分化可使用Flk-1或ICAM-2增強子測定(分別見Shalaby等，Nature37662-66，1995和Tevosian等，Cell 101729-739，2000)。
如上所述分離BMSC，并在有生物因子存在的條件下培養，其中所述生物因子已知可在胚胎發育過程中產生內皮細胞系(2％FBS，20ng/ml VEGF，1ng/ml bFGF，和2ng/ml IGF-I)。Flk-1，一種內皮特異性受體酪氨酸激酶，在大約80％的培養BMSC中大量表達，培養14天后，顯示轉化成內皮細胞系(圖5)。
實施例5細胞指示系統如圖16A所示，指示系統包括三個組分指示細胞2，細胞包被系統(CES)4，和通透外膜或篩網6，它可幫助把指示細胞留在CES中，并從將移植的那些細胞8中分離指示細胞2。
在其中一個實施例中，指示系統用于測定干細胞(例如，BMCS)的細胞定型和分化狀態。如此處所述，希望引發人的BMSC，以便使大約5-100％(優選約80％)的細胞是生心肌細胞(利用Csx/Nkx2.5的表達，缺少有組織的肌原纖維節結構或收縮，并優選缺少肌球蛋白的重鏈RNA或蛋白來測定)。因此，需要一種非常快速的測定法，以便使采集細胞用于測定和移植的時間間隔最小。因此，快速測定法可確保測定結果代表最終被移植的、表達Csx/Nkx2.5的細胞。本發明就提供了這樣一種測定法。含有與報道基因可操作性連接的Csx增強子的轉基因小鼠BMSC用作指示細胞。例如引入此處作為參考的美國專利申請公開號2002022259中描述了適宜的Csx增強子。指示細胞或者包被在生物材料(例如，藻酸鹽，膠原，明膠，或殼聚糖)中，或者附著在生物可降解的聚合物(例如，聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，或聚交酯/乙交酯共聚物(PLGA)的無孔微球)上。然后用可滲透氧，營養物，和其它生物分子的膜把包被的或微球附著的細胞包裹起來。適宜膜的例子包括有孔的透明聚乙烯對苯二酸鹽(PET)膜，透明的尼龍篩網，透明的有孔尼龍膜，和有孔透明聚四氟乙烯(PTFE/Teflon)。
除了在包囊中留有指示細胞外，外膜還可為該系統提供物理完整性。在誘導人BMSC成為生心肌細胞的過程中，與Csx增強子(例如，人Csx增強子)可操作性連接的報道基因將在指示細胞中表達。報道基因表達的無毒檢測表明人細胞的分化狀態。適宜的報道基因包括，但不限制于，編碼綠色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶，和熒光素酶的那些報道基因。在確定細胞已經達到所希望的分化狀態后，除去整個指示系統(包括指示細胞，包被材料，及通透膜)。然后收集要種植的細胞，準備進行移植。如果需要，可把細胞冷凍貯藏，直到進行移植。
在本發明的細胞指示系統中，指示細胞可以是任何一種細胞類型，其中增強子元件/報道基因構建體進行細胞分化時是可操作的。在其中一個實施例中，使用報道基因構建體轉染的BMSC細胞。這些細胞可以是任何一種動物的BMSC或，可選擇性地，其它細胞類型，如用增強子元件/報道基因構建體轉染的ES細胞，或來源于增強子/報道基因轉基因動物的BMSC。
我們使用來源于hCsx-lacZ轉基因小鼠的鼠BMSC說明包被細胞指示系統的上述原理。我們已經發現，沒有被誘導沿著生心肌細胞系分化的BMSC染色較弱，或根本不能進行標準的β-半乳糖苷酶測定。(圖15)。相反，按照上述方法培養的BMSC，可誘導生心肌細胞的分化，產生強烈的陽性信號(圖15)。因此，作為一種可用于監測肌原性分化進展的系統鼠hCsx-lacZ BMSC對于包被而言是極好的候選物(圖16A和16B)。與確定細胞分化的傳統技術相比，這種指示系統具有很多優點。具體而言，可從培養基很容易地回收包囊，而且能夠快速可靠地進行測定。此外，因為包囊可被摻入并從每個培養容器中回收，因此可在逐個平板的基礎上進行監測。它無需為了進行監測而破壞整個培養物，而這種破壞則是傳統組織學技術所必須的。當使用來源于人類患者的BMSC時，這尤為重要，這是因為骨髓樣品很難獲得，而且很少有干細胞可用于培養和移植。
鼠hCsx-lacZ BMSC可包被在任何適宜的材料中，它們的性質描述見上文。例如有效的包囊可通過把細胞包埋在藻酸鹽中，且用11μm或30μm尼龍篩網容納藻酸鹽包埋的細胞而制造，所述尼龍篩網來源于例如Millipore Corp.(Bedford，MA)，不但耐用而且可滲透培養基和生長因子，氧，及用于β-半乳糖苷酶測定法中的化學試劑。使用上述方法，希望在每毫升含有至少約106個hCsx-lacZ BMSC的溶液中形成包囊；然而，更希望使用每毫升含有至少約107個細胞的溶液。當然，隨著條件的改變，普通技術人員能夠確定包囊系統中指示細胞的適宜濃度。
用于制造本發明包被監測系統的特定指示細胞不一定必須是鼠細胞。指示細胞對移植物的受體來講可以是異源的或自體的。在BMSC相對豐富的情況下，優選用報道分子構建體，如上面所述的其中一種來轉染宿主BMSC的亞組。然后把這些自體BMSC包被，并用于監測。可選擇性地，在BMSC供給有限的情況下，可使用非自體(同源或異源的)指示BMSC。
實施例6移植的方法本發明涉及通過移植自體或異源心臟細胞而治療受試者以心功能不全為特征的病癥的方法。該方法包括給予受試者在這里詳細描述的，本發明來源于干細胞的心肌祖細胞，內皮祖細胞，和血管平滑肌祖細胞。把本發明的細胞移植到患有心臟疾病的受試者的心臟中，從而替換損耗或無功能(“冬眠”)的心肌細胞。把所述細胞以適于替換損耗或無功能心肌細胞的量引入到患有心臟疾病的受試者中，以便至少部分減輕或緩解心臟疾病的至少一個不利作用或癥狀。細胞可通過任何適宜的途徑給予受試者，從而把細胞遞送到患者的預定位置，其中至少一部分細胞仍然保持活性。在給予患者之后，優選至少約5％，至少約10％，更優選至少約20％，至少約30％，至少約40％，最優選至少約50％，或更多的細胞仍然保持活性。輸入患者后的細胞存活周期可以短至幾小時，例如24小時，到幾天，長至幾周到幾個月。其中一種把本發明的細胞遞送給受試者的方法是把細胞直接注射到受試者的心室肌中(例如，Soonpaa等，Science 26498-101，1994；Koh等，Am.J.Physiol.33H1727-1733，1993)。所述細胞可在生理相容的載體，如緩沖的鹽溶液中給予。為了治療人類受試者的以心功能不全為特征的病癥，可把約104-109個細胞引入到人，例如心肌中。
為了完成這些輸注方法，可把本發明的細胞插入到遞送裝置中，通過把細胞注射或種植到患者中而促進引入。這種遞送裝置包括管，例如導管道，用于把細胞和流體注射到受體患者的身體中。在優選實施方案中，管道還具有一根或幾根針，通過針把本發明的細胞引入到患者需要的位置。還希望在注射過程中，把每種細胞類型維持在不同的條件組中(如不同的培養基中)。在這種情況下，可使用具有一根，兩根或三根針的多筒注射器進行注射(圖20A，20B，21A，21B，22A，和22B)。如果使用三筒/兩針注射器，優選在注射過程中混合內皮細胞的祖細胞和平滑肌細胞的祖細胞。
本發明的細胞可以不同形式插入到這種遞送裝置中。例如，當包含在這種遞送裝置中時，所述細胞可被混懸在溶液中或包埋在支持基質中。優選所述溶液含有藥學上可接受的載體或稀釋劑，本發明的細胞在其中仍然保持活性。藥學上可接受的載體和稀釋劑包括鹽水，含水緩沖溶液，溶劑和/或分散介質。這種載體和稀釋劑的使用是本領域熟知的。所述溶液優選無菌的流體。優選所述溶液在制造和貯存條件下穩定，并使用例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗壞血酸或硫汞撒來防止微生物，如細菌和真菌的污染。本發明的溶液可通過把這里所述的細胞摻入到藥學上可接受的載體或稀釋劑中制備，如果需要，還可摻入到其它成分。
摻入或包埋本發明細胞的支持基質包括受體相容性基質，而且其可降解為對受體無害的產物。這種基質的例子是天然和/或合成的生物可降解基質。天然的生物可降解基質包括，例如，膠原基質和藻酸鹽珠。合成的生物可降解基質包括合成的聚合物，如聚酐，聚原酸酯，和聚乳酸。這些基質可為體內細胞提供支持和保護。
在引入到患者中之前，可對細胞進行修飾從而抑制免疫排斥。例如，為了抑制對移植細胞的排斥，并在移植物受體中獲得免疫非反應性，本發明的方法可包括在引入到患者中之前，改變細胞表面上的免疫原性抗原。改變細胞上一個或多個免疫原性抗原的步驟可單獨進行，或與抑制受試者T細胞活性的藥劑聯合給藥。可選擇性地，移植細胞排斥的抑制可在沒有預先改變移植細胞表面上的免疫原性抗原的條件下，通過給予受試者一種可抑制受試者T細胞活性的藥劑而實現。抑制T細胞活性的藥劑被定義為除去(例如，螯合)或破壞受試者的T細胞，或抑制受試者T細胞功能的藥劑。T細胞可能仍然存在于患者中，但處于非功能性狀態，所以它們不能增殖或引發或執行效應子功能(例如，細胞因子的產生，細胞毒性等)。抑制T細胞活性的藥劑還可抑制未成熟T細胞(例如，胸腺細胞)的成熟或活性。抑制受體受試者T細胞活性的優選藥劑是一種免疫抑制藥物，它可抑制或干擾正常的免疫功能。優選的免疫抑制藥物是環孢菌素A。可用的其它免疫抑制藥物包括，例如，FK506和RS-61443。在其中一個實施方案中，所述免疫抑制藥物與至少一種其它的治療劑聯合給藥。可給予的其它治療劑包括類固醇(例如，糖皮質激素，如強的松，甲基強的松龍，和地塞米松)和化療劑(例如，硫唑嘌呤和環磷酰胺)。在另一實施方案中，免疫抑制藥物與類固醇和化療劑聯合給藥。適宜的免疫抑制藥物可以買到。
除了用于治療與心臟有關的疾病外，細胞移植療法還適用于各種疾病和病癥(例如，帕金森氏病，糖尿病，脊髓損傷，多發性硬化)。隨著移植到心肌中，有能力而且接受所需細胞命運的有絲分裂細胞的移植很可能有助于移植細胞的整合，使更多的所需細胞摻入并在宿主組織中存活。用于檢測細胞系分化，定型，或能力的增強子在下面的表1中描述。
表1細胞類型標記 參考文獻血管平滑肌細胞 BvesReese等，Dev.Biol.209159-171，1999內皮細胞Tie-2Schnurch和Risau，Development119957-968，1993von Willebrand Coffin等，Dev Biol.14851-62，1991心外膜細胞 Flk-1Shalaby等，Nature 37662-66，1995ICAM-2 Tevosian等，Cell 101729-39，2000脂肪細胞PPAR-g2 Zhu等，PNAS 927921-7925，1995破骨細胞TRAP Reddy，J.Bone Miner.Res.
10601-606，1995成骨細胞骨鈣蛋白 Kcsterson，Mol Endocrinol.
7462-467，1993巨噬細胞CD11bDziennis等，Blood.85319-329，1995神經元祖細胞Ncstin Yamaguchi等，Neuroreport111991-1996，2000神經元 神經絲 Leconte等，J Mol Neurosci
5273-295，1994星形膠質細胞 GFAPNolte等，Glia 3372-86，2001骨骼肌細胞MyoDGoldhammer等，Science 256538-42，1992平滑肌細胞SMHCZilbcrman等，Circ Res 199882566-575，1998胰前體細胞Pdx-1 Marshak等，Mol.Cell.Biol.
207583-7590，2000胰β細胞 葡糖激酶 Jetton等，JBC 2693641-3654，1993肝細胞 甲胎蛋白 Ghebranious，Dev 421-6，1995上述每篇參考文獻都引入此處作為參考。
實施例7心肌梗塞的犬模型把在體外定型為心原性細胞系的BMSC移植到梗塞的狗心肌組織中。狗心肌梗塞是通過左冠狀動脈的永久閉塞而建造的。在移植BMSC之前，使梗塞至少穩定兩個月。為了防止移植物免疫排斥，按照下面所述收集骨髓并準備各移植受體狗的BMSC。結扎后大約4周，在使用超聲心動圖證實心肌梗塞后，對髂骨穿刺，吸出骨髓。立即把骨髓與肝素混合，冷凍，并在干冰中轉移到組織培養設備上，37℃解凍骨髓，微擾，用常規DMEM洗滌一次，接種在含有培養基(10％胎牛血清，100μML-抗壞血酸-2-PO4，5-15ng/ml LIF，和20nM地塞米松)的組織培養瓶中。采集時，用DiI，一種紅色的熒光標記，標記BMSC，從而在移植后追蹤細胞的存活和進展。然后在有100ng/ml bFGF存在的條件下培養標記的BMSC 4-7天。收集細胞(1.5-250百萬)，注射到心臟梗塞區域中。
移植后的BMSC存活是利用死后DiI熒光的顯色來確定。在移植15天后的心肌中觀察到的大片的DiI-陽性細胞，表明BMSC的長期存活(圖6)。具體而言，DiI-標記的干細胞在含有MF-20陽性心肌細胞的心肌區域內和沒有MF-20陽性心肌細胞的梗塞區域內觀察到的(圖6)。此外，梗塞區域的邊緣區域含有DiI陽性干細胞，它們也表達心肌特異性標記MHCα/β(圖7-9)。總之，這些數據證實，按照所述方法體外處理的移植BMSC存活了，并摻入到宿主心肌中，表達心臟分化的標記特征。
實施例8BMSC移植減小梗塞的面積使用實施例7描述的犬心肌梗塞模型，通過超聲心動圖(ECG)體內確定BMSC移植的修復作用。ECG是在BMSC移植后3.5，4.5，和5周進行的(分別為圖19、17和18)，并與移植前的ECG進行比較。在每只動物中，梗塞區域變得與心肌鄰近區域的收縮更加同步。因此，ECG結果證實了實施例7的組織學結果，并證實受刺激的培養BMSC的移植可導致梗塞后心臟組織的部分修復。
實施例9心肌梗塞的鼠模型還可使用小鼠心肌梗塞模型系統研究移植BMSC的長期存活。為了防止免疫排斥，從小鼠的骨髓中分離BMSC，該小鼠與移植所用的那些小鼠等基因。如上所述，在有100ng/ml bFGF存在的條件下培養BMSC4-7天，然后用DiI熒光標記并采集。通過左冠狀動脈結扎建立梗塞。然后如下所述，把處理過的BMSC注射到梗塞區域中。使用具有匹配29G或30G Hamilton針的50微升Hamilton注射器以傾斜的方式把BMSC(10μl PBS或HBSS中含有100,000-500,000個)注射到前間隔LV心肌中。在手術過程中，將小鼠放置在定做的熱床上，使用反饋溫度控制器使溫度維持在37℃，使用小鼠呼吸器(設定體積200微升，速率110/分鐘)輔助呼吸。移植36天后，分析梗塞區域中DiI-標記細胞的存在和心肌細胞的存活。正如在犬模型中觀察到的，標記的BMSC被摻入到鼠心肌梗塞區域內。此外，存在于心肌中的DiI-標記細胞顯示出心肌細胞的形態學特征。該區的蘇木精和曙紅染色顯示出條紋狀，螺旋形的細胞核，及伸長的纖維，而這正是梗塞區內心肌的特征(圖10)。我們還觀察了與心肌梗塞區域鄰近的DiI陽性細胞。使用α-MHC，MF-20，和心臟肌鈣蛋白抗體進行染色的心肌細胞的顯色證實，DiI標記的細胞(移植的BMSC)完全位于心臟肌原纖維內(圖11，12和14)。移植的BMSC還可摻入到心肌的鄰近區域中(圖13)。因此，移植的受刺激BMSC完全整合到正常和梗塞的心臟組織中，并繼續分化成心肌細胞；這一過程在移植前體外刺激過程中開始。
實施例10誘導干細胞成為內皮祖細胞的方法為了產生受引發的內皮祖細胞，使用VEGF(10ng/ml)，bFGF(1ng/ml)，和IGF-I(2ng/ml)引發分離的干細胞(例如，人的BMSC)4-7天(Shi等，Blood 92362-367，1998)。作為細胞指示系統中的轉化指示劑，可使用含有與報道基因可操作性連接的Tie增強子的干細胞(Schlaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 943058-3063，1997)。
實施例11誘導干細胞成為血管平滑肌祖細胞的方法為了產生受引發的血管平滑肌祖細胞，使用PDGF(1-10ng/ml)和TGF-β(1-10ng/ml)引發分離的干細胞(例如，人的BMSC)4-7天(Hirschi等，J.Cell Biol.141805-814，2000)。作為細胞指示系統中的轉化指示劑，可使用含有與報道基因可操作性連接的Bves增強子的干細胞(Reese等，Dev.Biol.209159-171，1999)。
其它實施方案本說明書中引證的所有公開出版物和專利申請都引入此處作為參考，就好像每篇公開出版物或專利申請都具體而且單獨引入作為參考。雖然已經通過舉例說明和用于闡明理解目的的實施例詳細描述了上述發明，但在不背離權利要求的精神或范圍的前提下，根據本發明的教導可以進行某些改變和改進，這對于本領域的那些普通技術人員而言是顯而易見的。
權利要求
1.一種用于生產移植到哺乳動物心肌組織中的細胞的方法，包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的骨髓干細胞，(b)在誘導所述細胞分化成生心肌細胞的條件下培養所述骨髓干細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，和(d)當至少約10％和多至100％所述細胞是生心肌細胞時，收集步驟(b)的細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括下列步驟(e)把所述生心肌細胞移植到所述哺乳動物中。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述骨髓干細胞來源于所述哺乳動物。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
5.根據權利要求1所述的方法，其中當至少約50％和多至80％的所述步驟(b)的細胞為生心肌細胞時，進行所述收集步驟(d)。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述培養步驟(b)包括的培養條件是培養基含有BMP-2和bFGF中的至少一種，其量足以誘導所述細胞分化成生心肌細胞。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括測定與所述步驟(b)的骨髓干細胞共培養的自體骨髓干細胞的分化狀態，其中所述自體骨髓干細胞的分化狀態與所述步驟(b)的骨髓干細胞的分化狀態有關。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括確定與所述步驟(b)的骨髓干細胞共培養的同源或異源骨髓干細胞的分化狀態，其中所述同源或異源骨髓干細胞的分化狀態與所述步驟(b)的骨髓干細胞的分化狀態有關。
9.一種用于生產移植到哺乳動物中的細胞的方法，包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的骨髓干細胞，(b)在誘導所述細胞分化成血管平滑肌細胞，內皮細胞，心外膜細胞，脂肪細胞，破骨細胞，成骨細胞，心臟成纖維細胞，巨噬細胞，神經元祖細胞，神經元，星形膠質細胞，骨骼肌細胞，平滑肌細胞，胰前體細胞，胰β-細胞，或肝細胞的條件下培養所述骨髓干細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，和(d)當至少約10％和多至100％的所述細胞表達可檢測量的、對所述細胞類型特異的蛋白時，收集步驟(b)的細胞。
10.根據權利要求9所述的方法，進一步包括下列步驟(e)把步驟(d)所述的細胞移植到所述哺乳動物中。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述骨髓干細胞來源于所述哺乳動物。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
13.根據權利要求9所述的方法，其中當至少約50％和多至80％的所述步驟(b)的細胞分化成所述細胞類型時，進行所述收集步驟(d)。
14.根據權利要求9所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括確定與所述步驟(b)的骨髓干細胞共培養的自體骨髓干細胞的分化狀態，其中所述自體骨髓干細胞的分化狀態與所述步驟(b)的骨髓干細胞的分化狀態有關。
15.根據權利要求9所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括確定與所述步驟(b)的骨髓干細胞共培養的同源或異源骨髓干細胞的分化狀態，其中所述同源或異源骨髓干細胞的分化狀態與所述步驟(b)的骨髓干細胞的分化狀態有關。
16.一種治療哺乳動物以心功能不全為特征的病癥的方法，該方法包括下列步驟(a)分離所述哺乳動物的骨髓干細胞，(b)在誘導所述細胞分化成生心肌細胞的條件下培養所述骨髓干細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，(d)當至少約10％和多至100％所述細胞是生心肌細胞時，收集步驟(b)的細胞，和(e)把所述生心肌細胞移植到所述哺乳動物中。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
18.根據權利要求16所述的方法，其中當至少約50％和多至80％的所述步驟(b)的細胞分化成所述細胞類型時，進行所述收集步驟(d)。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括確定自體骨髓干細胞的分化狀態。
20.根據權利要求16所述的方法，其中所述監測步驟(c)包括確定同源或異源骨髓干細胞的分化狀態。
21.一種用于生產細胞的方法，所述細胞在移植到哺乳動物中后受引發分化成內皮細胞，該方法包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的干細胞群，(b)在誘導所述細胞分化成內皮祖細胞的條件下培養所述步驟(a)的細胞；和(c)當至少約10％和多至100％的細胞是內皮祖細胞時，收集步驟(b)的細胞，其中所述細胞在移植到哺乳動物中后受引發分化成內皮細胞。
22.根據權利要求21所述的方法，在步驟(b)和(c)之間進一步包括監測步驟(b)細胞的分化狀態的步驟。
23.一種用于生產細胞的方法，所述細胞在移植到哺乳動物中后受引發分化成血管平滑肌細胞，該方法包括下列步驟(a)提供還沒有無限增殖化的骨髓干細胞群，(b)在誘導所述細胞分化成血管平滑肌祖細胞的條件下培養所述步驟(a)的細胞；和(c)當至少約10％和多至100％的細胞是血管平滑肌祖細胞時，收集步驟(b)的細胞，其中所述細胞在移植到哺乳動物中后受引發分化成血管平滑肌細胞。
24.根據權利要求23所述的方法，在步驟(b)和(c)之間，進一步包括監測步驟(b)細胞的分化狀態的步驟。
25.一種治療被診斷為患有以心功能不全為特征的病癥的哺乳動物的方法，該方法包括把下列細胞引入到所述哺乳動物的心肌組織中(a)心肌細胞或心肌細胞的祖細胞；(b)內皮細胞或內皮細胞的祖細胞；和(c)血管平滑肌細胞或血管平滑肌細胞的祖細胞，其中引入所述細胞的量足以改善心功能。
26.根據權利要求25所述的方法，其中把至少一百萬個心肌細胞的祖細胞與其它兩種細胞類型注射到所述心肌中，心肌細胞的祖細胞內皮細胞的祖細胞血管平滑肌細胞的祖細胞的比值約為10∶1∶1。
27.根據權利要求25所述的方法，進一步包括把caspase抑制劑引入到所述心肌中。
28.根據權利要求25所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
29.一種藥物組合物，含有(a)心肌細胞或心肌細胞的祖細胞；(b)內皮細胞或內皮細胞的祖細胞；和(c)血管平滑肌細胞或血管平滑肌細胞的祖細胞，其中所述細胞的量足以在引入人體后改善心功能。
全文摘要
本發明提供用于生產移植到哺乳動物(例如，人)心肌組織中的細胞的方法。該方法包括下列步驟(a)提供骨髓干細胞群，(b)在誘導該細胞成為生心肌細胞的條件下培養該細胞，(c)監測步驟(b)的細胞的分化狀態，(d)當至少約10％和多至100％的細胞是生心肌細胞時，收集步驟(b)的細胞。所述骨髓干細胞可以是，例如，人的骨髓干細胞。在其中一個實施方案中，所述方法包括把分化的干細胞移植到哺乳動物(例如，人)中的步驟。
文檔編號A61K35/28GK1533431SQ02811735
公開日2004年9月29日 申請日期2002年4月12日 優先權日2001年4月13日
發明者I·W·李, G·劉, J·哈姆佩, J·D·克羅伊斯桑特, I W 李, 克羅伊斯桑特, 放 申請人:安特羅根有限公司