化學修飾胰島素的肺部給藥的制作方法

專利名稱：化學修飾胰島素的肺部給藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過吸入傳送到肺部的具有生物活性的、親水聚合物修飾的胰島素衍生物。同時還提供了這些衍生物的制備和給藥方法。
背景技術(shù)：
胰島素是在正常(沒有患糖尿病的)受試對象的胰腺β-細胞中產(chǎn)生的一種多肽激素。人胰島素是一個51個氨基酸的多肽激素，分子量約為5800道爾頓。胰島素分子由兩條肽鏈組成(一條A鏈和一條B鏈)，含有一個亞基內(nèi)和兩個亞基間二硫鍵。A鏈由21個氨基酸組成，而B鏈由30個氨基酸組成。胰島素的兩條鏈形成了一種高度有序的結(jié)構(gòu)，在A鏈和B鏈中都有幾個α-螺旋區(qū)。有趣的是，孤立的胰島素鏈是沒有活性的。在溶液中，胰島素可以以單體、二聚體或六聚體的形式存在。在用于皮下治療的高濃度制劑中胰島素是六聚體，但是當它在體液中被稀釋后就變成單體形式了。胰島素對于調(diào)節(jié)碳水化合物代謝、降低血糖水平是必需的；胰島素的全身性缺陷引起糖尿病。糖尿病病人的生存依賴于頻繁地、長期地施用胰島素，以維持可以接受的血糖水平。
現(xiàn)有的胰島素制劑具有缺陷，在治療糖尿病時可導致嚴重的醫(yī)療并發(fā)癥。例如，糖尿病人最經(jīng)常使用的標準的鋅胰島素制劑是無活性的六聚體胰島素的微晶體懸浮液。微晶體的不溶性以及隨后六聚體解離為有活性的單體形式，會導致胰島素吸收到血流中的延遲和受試對象差異(F.Liu等，Bioconjugate Chem.，8，664-672(1997)；T.Uchio等，Adv.Drug Del.Rev.，35，289-306(1999)；K.Hinds等，BioconjugateChem.，11，195-201(2000))。胰島素的制劑還受到物理不穩(wěn)定性的困擾，因為胰島素趨于形成微絲和不溶性沉淀。對于打算在胰島素泵中使用的制劑來說，沉淀是特別重要的問題。配制的胰島素還傾向于化學降解，例如非酶促的脫氨作用，并形成高分子量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物如共價結(jié)合的胰島素二聚體(Brange.J.等，Pharm.Res.，9，715-726(1992)；Brange J.等，Pharm.Res.，9，727-734(1992))。已有重要的證據(jù)表明，對胰島素的免疫應答的發(fā)生可能是由于這些胰島素的共價聚合物的存在(Robbins，D.C.等，Diabetes，36，838-841(1987))。此外，即使是高度純化的人胰島素也具有輕微的免疫原性(Kim，同上)。
除了上面提到的制劑不穩(wěn)定問題之外，從給藥的觀點來看，現(xiàn)有的胰島素療法也有許多缺點。最常用的胰島素給藥方式是皮下注射，通常是在腹部或大腿。胰島素也可以通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)方式給藥。為了將血糖維持在可以接受的水平，通常需要每天注射一次或兩次胰島素，此外在需要時還要補充注射胰島素。糖尿病的積極治療可能需要更頻繁的注射，這時病人使用一個家庭診斷試劑盒嚴密地監(jiān)測血糖水平。出于多種考慮，以注射方式給藥胰島素是不受歡迎的。首先，許多病人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)維持可接受的血糖水平的需要而頻繁地給自己注射是相當困難和煩瑣的。事實上，許多II型病人由于害怕扎針而不愿長年連續(xù)使用胰島素。這種不情愿可能導致不遵醫(yī)囑，在最嚴重的情況下可能危及生命。此外，皮下注射的胰島素的全身吸收相當慢，即使是在使用快效胰島素制劑的情況下，通常也需要45到90分鐘。因此，提供一種替代的胰島素制劑和給藥途徑從而不需要自我注射，并能夠使胰島素快速、全身性地發(fā)揮效用，是長期以來的一個目標。
已經(jīng)探索了許多非注射的制劑，如口服或鼻吸制劑，但是，這些努力的結(jié)果尚未導致開發(fā)出商業(yè)可用的基于口服或鼻吸的胰島素給藥系統(tǒng)(Patton等，Adv.Drug Delivery Reviews，1，35(2-3)，235-247(1999))，這主要是由于生物有效度非常低并且易變(Hilsted，J.等，Diabetologia，38，680-684(1995))。盡管與吸收增強劑一起使用可以增加生物有效度，但這些藥劑可損傷粘膜。
但是，可吸入的胰島素制劑已被開發(fā)，在克服上面提到的許多問題方面表現(xiàn)得相當突出。例如，美國專利No.5,997,848(Patton等，InhaleTherapeutic Systems，Inc.(吸入治療系統(tǒng)公司))描述了胰島素的干粉制劑，其(1)在室溫下是化學和物理學穩(wěn)定的，并且(2)當吸入時，能夠通過肺泡區(qū)的上皮細胞快速吸收到血液循環(huán)中。其中描述的這種快效胰島素制劑和方法不需要煩瑣的自我注射，并且在一項為期三個月的人體功效研究中顯示，在I型和II型胰島素依賴型糖尿病人中，與皮下注射相比提供了同等的葡萄糖控制能力(Patton等，Adv.DrugDelivery Reviews，1，35(2-3)，235-247(1999))。Patton等描述的干粉胰島素制劑，在克服了制劑不穩(wěn)定和病人不遵醫(yī)囑的問題的同時，為了有效地控制葡萄糖水平，仍然需要頻繁地(例如在就餐時)吸入胰島素。此外，這種基于快效可吸入胰島素類型的制劑，對于I型和部分II型糖尿病人，其典型的胰島素用藥方式仍然需要在就寢時注射一次長效胰島素。因此，仍然需要一種有活性的、可溶的、穩(wěn)定的胰島素類型，它不需要頻繁地用藥，即是長效胰島素制劑，最好通過吸入方式給藥。
理想的長效胰島素制劑的特征是起效非常緩慢，但效力持久、峰值相對平緩?，F(xiàn)有的長效可注射胰島素制劑，例如ultralente(特慢的鋅胰島素懸浮液)和魚精蛋白鋅胰島素懸浮液，是非常不令人滿意的。這些制劑趨于出現(xiàn)高峰而不能提供低的基礎(chǔ)的胰島素濃度，并且不可預測，一般作用的持續(xù)時間不超過大約一天。ultralente胰島素具有長的半衰期，使得很難確定它最適的劑量范圍，而魚精蛋白鋅胰島素由于它的不可預測性及效力時間過長而很少使用(Goodman和Gilman，“The Pharmacological Basis of Therapeutics(治療學的藥理學基礎(chǔ))”，第9版，Hardman和Limbird編輯，1996，第1500頁)。其它已經(jīng)探索的不成功的長效可注射胰島素制劑包括白蛋白結(jié)合的胰島素和胰島素六聚體鈷制劑(Hoffman，A.，Ziv，E.，Clin.Pharmacokinet，33(4)285-301，(1997))。
許多長效肺部用胰島素制劑也已被探索。其中包括含有相對于胰島素大大過量的脂質(zhì)的脂質(zhì)體(Liu.F-Y等，Pharm.Res.10，228-232，(1983))、多孔的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)胰島素顆粒(Edwards，D.A.等，Science 276(5320)，1868-1871(1997))，霧化的PLGA納米球(Kawashima，Y.等，J.Controlled Release，62(1-2)279-287(1999))和磷脂/魚精蛋白胰島素制劑(Vanbever，R.等，Proc.Control Rel.Bioact.Mater.，25，261-262(1998))。不幸的是，所有這些制劑都已被證明是不令人滿意的，或是由于當施用于大鼠時生物有效度低，或是由于制劑不足。因此，長期以來仍存在對最適的長效胰島素制劑的需求，它們應該是具有生物活性的、物理學和化學穩(wěn)定的、水溶性的并且最好為單體。在理想情況下，這樣的制劑最好適合于肺部給藥。
發(fā)明概述從一方面來說，本發(fā)明建立在胰島素組合物的基礎(chǔ)之上，該胰島素組合物可用于通過肺部深處向全身血液循環(huán)給藥。具體來說，本發(fā)明的組合物包含了一種結(jié)合物，由胰島素共價結(jié)合到一個或多個非天然存在的親水聚合物分子上而形成。在一個優(yōu)選實施方案中，共價結(jié)合于胰島素上的非天然存在的親水聚合物是一種聚亞烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)，盡管在此提出的所有實施方案也可以同等地用于其它的非天然存在的親水聚合物。
一般來說，本發(fā)明的胰島素-聚合物結(jié)合物與天然胰島素相比將表現(xiàn)出改進的藥代動力學和藥效性質(zhì)，特別是在肺部給藥時。在一個實施方案中，在此提供的PEG-胰島素結(jié)合物在通過肺部和肺部深處給藥時，表現(xiàn)出良好的絕對的生物有效度。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物的特征在于其具有高于天然胰島素的絕對的肺部生物有效度。在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物的特征在于其具有高于天然胰島素至少1.5-2.0倍的絕對的肺部生物有效度。在更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物的特征在于其絕對的肺部生物有效度高出大約15％，更優(yōu)選情況下高出大約20％，或者在最優(yōu)選情況下高出大約30％。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物當通過肺部給藥時，其Tmax值(達到最大濃度所需的時間)表現(xiàn)出至少1.5倍于天然胰島素，或在更優(yōu)選情況下至少2或3倍于天然胰島素，或更優(yōu)選情況下至少5倍于天然胰島素。
本發(fā)明的結(jié)合物中使用的PEG可以具有幾個不同的特點。在本發(fā)明的一個實施方案中，在此描述的PEG-胰島素結(jié)合物的聚乙二醇部分在末端被一個惰性的或無反應性的末端基團所封閉，例如一個烷氧基、或更具體地說一個甲氧基。
在另一個實施方案中，結(jié)合物的聚乙二醇部分將具有一個特別適合于連接到胰島素上的結(jié)構(gòu)，包括線性的聚乙二醇和多枝化或支鏈的聚乙二醇。在另一個實施方案中，一個PEG-胰島素結(jié)合物可以含有兩個單官能衍生的胰島素分子，它們之間由一個雙活化的聚乙二醇連接起來(胰島素-PEG-胰島素)。此外，在這個“啞鈴”結(jié)構(gòu)中的一個胰島素分子還可以被其它的PEG所修飾。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的一個PEG-胰島素結(jié)合物含有一個分叉的聚乙二醇，在聚合物鏈的一端帶有一個分支部分，還有兩個連接到分支部分上的游離的反應基(或多組兩個基團)用于共價結(jié)合胰島素。在本發(fā)明的這個實施方案中，聚乙二醇的分支結(jié)構(gòu)使得聚合物鏈可以連接兩個或多個胰島素分子。
本發(fā)明的胰島素結(jié)合物的聚乙二醇部分可任選含有一個或多個可降解的連接。
一般來說，胰島素通過位于PEG末端的一個連接部分共價結(jié)合到PEG上。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選連接部分包括那些適合于與具有反應性的胰島素的氨基基團結(jié)合的部分，例如N-羥基琥珀酰亞胺活性酯、活性碳酸鹽、醛和縮醛。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合物中共價結(jié)合于胰島素上的PEG將含有從大約兩個到大約300個(OCH2CH2)亞基，在優(yōu)選情況下從大約4個到200個亞基，在更優(yōu)選情況下從大約10個到100個亞基。
在另一個實施方案中，共價結(jié)合于胰島素上的PEG將具有名義平均分子量從大約200到大約10,000道爾頓。在一個優(yōu)選實施方案中，PEG將具有名義平均分子量從大約200到大約5000道爾頓。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，PEG將具有名義平均分子量從大約200到大約2000道爾頓或從大約200到大約1000道爾頓。
在一個特定的實施方案中，結(jié)合物的胰島素部分含有天然的人胰島素。
在另一個實施方案中，本發(fā)明組合物中的結(jié)合物具有的純度大于大約90％(即在組合物的結(jié)合物部分中，有90％重量或以上為一種或多種PEG-胰島素)。也就是說，本發(fā)明的組合物其特征為含有高純度的結(jié)合的胰島素成分，即組合物中不存在可以檢測量的游離聚乙二醇物種和其它與PEG相關(guān)的雜質(zhì)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的一種組合物含有一種結(jié)合物，其中胰島素在其一個或多個氨基位點上與PEG共價結(jié)合。本發(fā)明的一種組合物中包含的胰島素可以是單取代的(即只有一個PEG共價結(jié)合到其上)。根據(jù)本發(fā)明，特定的單取代PEG-胰島素結(jié)合物含有一個共價結(jié)合到胰島素分子上的聚乙二醇部分，結(jié)合位置選自PheB1、GlyA1和LysB29。
在一個優(yōu)選實施方案中，PEG部分共價結(jié)合在胰島素的PheB1位點上。在一個實施方案中，胰島素上至少大約75％的B-1Phe位點與PEG共價結(jié)合。在另一個實施方案中，胰島素上至少大約90％的B-1Phe位點與PEG共價結(jié)合。
本發(fā)明的組合物也可以含有一種混合物，它由具有上述一個或多個特征的單結(jié)合和雙結(jié)合的PEG-胰島素組成。這樣的組合物還可以含有三結(jié)合的PEG-胰島素。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的一種PEG-胰島素結(jié)合物的特征在于其相對于非PEG化的或天然的胰島素，蛋白水解速率降低。
本發(fā)明的一種組合物還可以含有PEG-胰島素結(jié)合物與非化學修飾的或天然的胰島素的混合物。
此外，上述的組合物是霧化形式的。
本發(fā)明的組合物可以溶解或懸浮在液體中，或為干燥形式，此外也可以含有可藥用的賦形劑。
此外，在此還提供了一種生物活性的聚乙二醇-胰島素結(jié)合物，它適合于通過吸入給藥到肺部深處。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種將PEG-胰島素結(jié)合物傳送到需要它的哺乳動物受試對象中的方法，通過吸入前述的霧化形式的PEG-胰島素組合物而給藥。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一種方法，用于提供一種通過肺部給藥的基本上非免疫原性的胰島素組合物。該方法包括下列步驟如此所述將胰島素共價結(jié)合到一個或多個非天然存在的親水聚合物結(jié)合物的分子上，然后通過吸入將組合物給藥到受試對象的肺部，結(jié)果胰島素通過肺部進入到血液循環(huán)中。
在另一方面還提供了一種方法，用于提供一種可給藥到人類受試對象肺部的長效的胰島素組合物。該方法包括將胰島素共價結(jié)合到一個或多個非天然存在的親水聚合物上從而提供了一種含有胰島素-親水聚合物結(jié)合物的組合物，然后通過吸入將該組合物給藥到受試對象的肺部。在給藥步驟中，胰島素通過肺部進入血液循環(huán)，在給藥后血液中升高的胰島素水平可以維持至少8小時。
本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物，當霧化并通過吸入給藥后，可用于治療糖尿病(DM)。
當閱讀了下面的詳細描述后，本發(fā)明的這些和其它的目的和特點將會變得更加一目了然。
附圖簡述

圖1是一個示例的PEG-胰島素結(jié)合物(“750-2 PEG胰島素”)與一個未修飾的胰島素對照的酶解速率圖，在實施例6中詳細描述；圖2是靜脈內(nèi)給藥示例的PEG化的(5K PEG胰島素)與非PEG化的胰島素組合物后，血清中的平均胰島素濃度圖(在實施例7中詳細描述)；圖3是靜脈內(nèi)給藥示例性PEG化的(5K PEG胰島素)與非PEG化的胰島素組合物后的血糖濃度圖(在實施例7中詳細描述)；圖4是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(每只動物150μg 5K PEG胰島素)與非PEG化的人胰島素(每只動物40μg)后，血清中的平均胰島素濃度圖(實施例8)；圖5是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(每只動物150μg 5K PEG胰島素)與非PEG化的人胰島素(每只動物40μg)后的平均血葡萄糖濃度圖(實施例8)；
圖6是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-1 PEG胰島素)與非PEG化的人胰島素后，血清中的平均胰島素濃度圖(實施例9)；圖7是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-1 PEG胰島素)與非PEG化的人胰島素后的平均血糖濃度圖(實施例9)；圖8是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-1 PEG胰島素，每只動物80和160μg)與非PEG化的人胰島素(每只動物80μg)后，血清中的平均胰島素濃度圖(實施例10)；圖9是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-1 PEG胰島素，每只動物80和160μg)與非PEG化的人胰島素(每只動物80μg)后的平均血糖濃度圖(實施例10)；圖10是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-2 PEG胰島素，每只動物80μg)與非PEG化的人胰島素(每只動物80μg)后，血清中的平均胰島素濃度圖(實施例11)；圖11是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(750-1 PEG胰島素，每只動物80μg)與非PEG化的人胰島素(每只動物80μg)后的平均血糖濃度圖(實施例11)；圖12是在雄性大鼠氣管內(nèi)滴注PEG化的(2K PEG胰島素，每只動物300μg、600μg、900μg和1200μg)與非PEG化的人胰島素(每只動物80μg)后的平均血糖濃度圖(實施例12)；圖13是靜脈內(nèi)給藥示例性PEG化的(2K PEG胰島素)與非PEG化的胰島素組合物后，血清中的平均胰島素濃度圖(在實施例13中詳細描述)；以及圖14是靜脈內(nèi)給藥示例性PEG化的(2K PEG胰島素)與非PEG化的胰島素組合物后的平均血糖濃度圖(在實施例13中詳細描述)。
發(fā)明詳述為了通過肺部給藥到肺，各種代表性的PEG-胰島素結(jié)合物的設(shè)計、合成和表征已被最適化。盡管PEG-胰島素分子的制備在以前已有描述，但利用與PEG的共價結(jié)合來提供長效的可吸入的胰島素制劑，在以前尚未被證實。因此，本申請人所面對的挑戰(zhàn)，是提供PEG-胰島素結(jié)合物，其中共價結(jié)合在胰島素分子上的PEG鏈具有最適的均衡數(shù)目、位置、結(jié)構(gòu)和分子量，從而提供適合于給藥到全身循環(huán)系統(tǒng)中，最好是通過肺部深處給藥的胰島素組合物。從前面的描述可以看到，令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了某些PEG-修飾的胰島素制劑具有下述一個或多個特點(1)它們是生物活性的，即表現(xiàn)出至少大約5％的天然胰島素活性，或在優(yōu)選情況下其生物活性與天然胰島素相比至少或是基本維持或是僅僅略有減少，或者在更優(yōu)選情況下，其活性比天然胰島素高；(2)它們從肺部吸收進入血流(與“粘附”在肺部相反)；(3)它們是化學和物理學穩(wěn)定的；(4)它們在通過肺部給藥時，可以在給藥后將血液中的胰島素水平升高到基準值以上至少大約8個小時；(5)它們對胰島素降解酶的酶解攻擊具有抗性；并且(6)在通過吸入給藥時，它們表現(xiàn)出的半衰期長于非PEG化的胰島素。當閱讀了下面的描述后這些特點的詳細情況將變得明顯。
I、定義在此所用的下列術(shù)語具有指定的意義。
除非在上下文中有清楚的說明，在說明書和附錄的權(quán)利要求書中，單數(shù)形式均包括了復數(shù)的概念。
在此所用的“胰島素”其意義包括了前胰島素，并包含了任何具有天然胰島素的部分或全部一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象(也就是說連續(xù)的氨基酸殘基序列)和至少一種生物學性質(zhì)的純化的、分離的多肽?？偠灾?，術(shù)語“胰島素”其意義包括天然的和合成衍生的胰島素，包括其糖結(jié)合形式，以及其類似物，包括具有一個或多個氨基酸修飾(缺失、插入或替代)的多肽，只要它們基本上保留了全長胰島素(在用本文所述的親水的、非天然存在的聚合物進行化學修飾之前)的至少80％或以上的治療活性。本發(fā)明的胰島素可以通過任何標準的方式生產(chǎn)，包括但不限于胰腺提取、重組表達和體外多肽合成。天然或野生型胰島素是指其氨基酸序列與自然界中發(fā)現(xiàn)的胰島素的氨基酸序列相對應的胰島素。天然或野生型胰島素可以天然地(即從天然來源分離)或合成地生產(chǎn)。
“生理上可裂解的”或“可降解的”鍵是在生理條件下可以與水反應(即被水解)的弱鍵。在優(yōu)選情況下是指在pH8和25℃下水解半衰期少于大約30分鐘的鍵。一個鍵在水中水解的趨勢不僅依賴于連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且依賴于結(jié)合在這些中心原子上的取代基。合適的水解不穩(wěn)定的或弱的鍵包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基酯、亞胺、鄰位酯、肽和寡核苷酸。
“水解穩(wěn)定的”連接或鍵是指一個化學鍵，一般來說是共價鍵，它在水中基本穩(wěn)定，也就是說在生理條件下，在一段較長的時間內(nèi)，不會發(fā)生任何可以感覺到的水解。水解穩(wěn)定的鍵的例子包括但不限于下列的鍵碳-碳鍵(例如在脂族鏈中)、醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸乙酯等。一般來說，水解穩(wěn)定的鍵在生理條件下表現(xiàn)出的水解速率小于每天大約1-2％。代表性的化學鍵的水解速率可以在大多數(shù)標準化學教科書中找到。
在此所用的“PEG”或聚乙二醇其意義包括任何水溶性的聚環(huán)氧烷烴。在最典型的情況下，本發(fā)明中所用的PEG含有下列結(jié)構(gòu)“-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-”，其中末端基團或整個PEG部分的實際結(jié)構(gòu)可以變化。一種常用的PEG是末端封閉的PEG，其中PEG的一個末端被一個相對無活性的基團封閉，一般是烷氧基團如甲氧基(-OCH3)，而另一個末端是一個羥基基團，它易于進行隨后的化學修飾。用于制備本發(fā)明的胰島素結(jié)合物的特殊的PEG形式，如分支的、線性的、分叉的PEG等，將在后面更詳細地描述。
“PEG-胰島素結(jié)合物”是指一個胰島素分子(如前所定義)，其上共價地連接或結(jié)合了至少一個聚乙二醇部分，并具有任何可檢測程度的胰島素活性(例如天然胰島素大約2％到大約100％或以上的生物活性)。
在涉及到本發(fā)明親水的非天然存在的聚合物如PEG時，“名義平均分子量”是指聚合物的質(zhì)量平均分子量，一般由孔徑排阻層析、光散射或在1，2，4-三氯苯中的內(nèi)稟速度來確定。本發(fā)明的聚合物一般是多分散的，具有小于大約1.05的低的多分散性。
“親脂部分”是一個基團，當通過一個可降解的或不可降解的鍵與本發(fā)明的親水聚合物結(jié)合時，對于基本上改變聚合物及聚合物-胰島素結(jié)合物的親水特性是有效的。典型的親脂基團如脂肪酸可以含有大約12到22個碳原子。
本發(fā)明的“基本非免疫原性的”胰島素結(jié)合物與天然胰島素相比具有減少的免疫原性。免疫原性可以通過將PEG-胰島素結(jié)合物相對于未修飾的胰島素給藥小鼠，或最好是兔子后，測定抗體的滴度來進行評估。
“烷基”是指碳氫鏈，一般長度范圍為大約1個到15個原子。碳氫鏈最好但不必需是飽和的，可任選含有其它結(jié)合在其上的官能團。碳氫鏈可以是支鏈的也可以是直鏈的。烷基的例子包括乙基、丙基、1-甲基丁基、1-乙基丙基和3-甲基戊基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，含有一個烷基化的PEG，特別是一個線性的烷基化的PEG的結(jié)合物，是指具有一個不是脂肪酸或其它親脂部分的烷基部分的結(jié)合物。
“低級烷基”是指含有1到5個碳原子的的烷基基團，可以是直鏈的或是支鏈的，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基。
“絕對的肺部生物有效度”是傳送到哺乳動物肺部的藥物劑量(例如本發(fā)明PEG-胰島素結(jié)合物)與天然胰島素靜脈內(nèi)劑量相比被吸收和進入血液循環(huán)的百分數(shù)。用于測定絕對的肺部生物有效度的具有代表性的模型系統(tǒng)包括大鼠、狗、兔和猴。從一方面來說，本發(fā)明的可吸入的PEG-胰島素組合物，其特征為在血漿或血液中絕對的肺部生物有效度為至少大約20％，通常絕對的肺部生物有效度范圍從大約10％到30％或更高?？偟膩碚f，根據(jù)PEG-胰島素結(jié)合物的特定性質(zhì)，本發(fā)明的結(jié)合物具有至少大約下列之一的絕對的肺部生物有效度10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、30％、32％、35％或更高。絕對的肺部生物有效度可以通過測量PEG-胰島素結(jié)合物組合物被直接氣管內(nèi)給藥、滴注或吸入后產(chǎn)生的吸收值來進行估計。
在涉及PEG-胰島素結(jié)合物的半衰期時，“分配階段”是指胰島素開始快速從血漿中消失的階段。末端緩慢或清除階段半衰期是指胰島素從身體中被清除的緩慢階段。
“長效”胰島素是指效用(即在基準值以上的升高的血液中水平)持續(xù)時間至少大約6小時，在優(yōu)選情況下至少大約8小時的胰島素。
“被抑制的葡萄糖水平”是指被抑制在基準值或基本水平以下的血糖水平(例如在施用本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物后)。
“可藥用的鹽”包括但不限于氨基酸鹽，用無機酸制備的鹽，如氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、氫溴酸鹽和硝酸鹽，或用有機酸制備的鹽，如蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙基琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、對甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽和硬脂酸鹽、以及estolate、葡庚糖酸鹽(gluceptate)和乳糖酸鹽(lactobionate)。同樣地，含有可藥用的陽離子的鹽包括但不限于鈉、鉀、鈣、鎂、鋁、鋰和銨(包括取代的銨)鹽。
“氨基酸”是指任何同時含有一個氨基基團和一個羧酸基團的化合物。盡管氨基基團通常出現(xiàn)在與羧基官能團相鄰位置上，但它也可以位于分子內(nèi)任何位置。氨基酸也可以含有其它的官能基團，例如氨基、硫代基、羧基、氨甲酰基、咪唑基等。氨基酸可以被合成或天然形成，可以以消旋體或光學活性(D-或L-)的形式使用，包括含有各種比例的對映體。
“肽”由兩個或多個通過肽鍵連接起來的氨基酸組成。肽可以是同源的肽或異源的肽(即由相同的或不同的前述氨基酸殘基組成)，其長度可以在兩個氨基酸到幾百個氨基酸之間變化。
“干粉”是指一般含有不足大約10％水分的粉狀組合物。
“適合于肺部傳送的”組合物是指能夠被霧化并被受試對象吸入，從而使霧化微粒的一部分到達肺部并穿入到下呼吸道和肺泡中的組合物。這樣的組合物被認為是“可呼吸的”或“可吸入的”。
“霧化”微粒是懸浮于氣體中的液體或固體顆粒，一般是通過致動(或啟動)一個吸入裝置，如干粉吸入器、噴霧器、計量的吸入器或霧化器而產(chǎn)生。
“發(fā)射劑量”或“ED”為一個適當?shù)奈肫餮b置在啟動或分散事件后從中傳送的藥物制劑提供了指示。更具體地說，對于干粉制劑，ED是從一個單位劑量包中取出的與從吸入裝置的噴嘴中噴出的粉末的百分比的度量。ED被定義為吸入裝置傳送的劑量與額定劑量(即在啟動前放置在適當?shù)奈胙b置中的每個單位劑量的粉末質(zhì)量)的比率。ED是一個由實驗確定的參數(shù)，一般使用一個被設(shè)計用來模擬病人用藥的體外裝置來測定。為測定ED值，額定劑量的干粉，一般以單位劑量的形式被放置在一個適當?shù)母煞畚肫髦?例如在美國專利No.5,785,049中描述的吸入器，命名為吸入治療系統(tǒng))，然后啟動裝置發(fā)射粉末。接著通過真空將產(chǎn)生的煙霧云從此裝置中抽出，并被連接在裝置噴嘴上的一個配衡濾器捕捉。到達過濾器的粉末的量組成了發(fā)射劑量。例如，對于放置在吸入裝置中的含5mg干粉的劑量，如果粉末發(fā)射后在上述配衡濾器上回收了4mg粉末，那么干粉制劑的發(fā)射劑量是4mg(傳送的劑量)/5mg(額定劑量)×100％＝80％。對于非均質(zhì)的粉末，ED值為啟動后從一個吸入裝置傳送藥物而不是干粉提供了指示，其基于藥物的量而不是總粉末的重量。同樣地，對于MDI和霧化器傳送形式，ED對應于從傳送形式中取出的與從吸入裝置的噴嘴中噴出的藥物的百分比。
“細小顆粒劑量”或“FPD”被定義為氣動粒徑在3.3μm以下的粉末顆粒的質(zhì)量百分比，一般通過在Anderson階式碰撞采樣器中測量來確定。這個參數(shù)為具有最大潛力能夠到達病人肺部深處以全身地吸收藥物成分的顆粒的百分比提供了一個指示。
“可分散的”或“分散的”粉末是指ED值為至少大約30％，更優(yōu)選是40-50％，以及更優(yōu)選甚至是至少大約50-60％或更高的粉末。
“質(zhì)量中值粒徑”或“MMD”是平均粒徑的度量，這是由于本發(fā)明的粉劑一般是多分散的(即由一定范圍內(nèi)的粒徑組成)。盡管任何常用的技術(shù)都可用于測量平均粒徑(例如電子顯微鏡、光散射、激光衍射)，在此報告的MMD值是通過離心沉降測定的。
“質(zhì)量中值氣動粒徑”或“MMAD”是被發(fā)散顆粒的氣動粒徑的度量。氣動粒徑用于描述霧化粉末的沉降行為，是在空氣中與微粒具有同樣的沉降速度的單位密度球體的直徑。氣動粒徑含蓋了微粒的形狀、密度和微粒的物理大小。在此所用的MMAD，除非另有指明，是指通過階式碰撞采樣器確定的霧化粉末的氣動粒徑分布的中點或中值。
“可藥用的賦形劑或載體”是指可任選包含在本發(fā)明組合物中的賦形劑。用于吸入的組合物中優(yōu)選的賦形劑是那些能夠被帶入肺部，并且對受試對象，特別是受試對象的肺部沒有明顯毒副作用的賦形劑。
“藥物有效量”或“生理有效量”是為了在血流中提供預期的胰島素水平以達到目標血糖水平而需要的，在此描述的治療組合物中存在的PEG-胰島素結(jié)合物的量。準確的量依賴于許多因素，例如特定的PEG-胰島素、所用的傳送裝置、治療組合物的成分和物理性質(zhì)、預期的病人數(shù)量、病人的因素等等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)提供的信息容易地確定。
II、親水的非天然存在的聚合物-胰島素結(jié)合物根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)制備了幾種示例性的PEG-胰島素結(jié)合物。盡管在本發(fā)明的結(jié)合物中聚乙二醇是優(yōu)選的聚合物，但是其它水溶性的、親水的、非天然存在的聚合物也可以使用。其它適合于在本發(fā)明中使用的聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯?；鶈徇?、聚噁唑啉和聚氧乙基化多元醇如聚氧乙基化甘油、聚氧乙基化山梨醇和聚氧乙基化葡萄糖。也可以使用從上述水溶性聚合物中選擇的含有亞基或亞基嵌段的聚合物。此外，聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物也可以使用。在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的聚合物基本不含脂肪酸基團或其它親脂部分。
下文闡述了通過仔細地選擇一種或多種PEG部分、PEG化試劑、胰島素PEG化位點、PEG化條件及后續(xù)的結(jié)合物純化，可以獲得具有預期臨床性質(zhì)(改進的藥代動力學和/或藥效性質(zhì))的PEG-胰島素組合物?，F(xiàn)在將提供本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物的特殊特征。
A、聚合物和產(chǎn)生的結(jié)合物的結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物一般含有一個或多個PEG鏈，每個鏈的分子量從大約200到大約40,000道爾頓，在優(yōu)選情況下從大約200到大約10,000道爾頓。在優(yōu)選情況下，本發(fā)明中使用的PEG所具有的平均分子量將位于下列范圍之一從大約200到10,000道爾頓，從大約200到大約7,500道爾頓，從大約200到大約6,000道爾頓，從大約200到大約5,000道爾頓，從大約200到大約3000道爾頓，從大約200到大約2000道爾頓，以及從大約200到大約1000道爾頓。在實施例1-4中提供了用具有分子量為5,000道爾頓、2,000道爾頓和750道爾頓的PEG制備的結(jié)合物的例子。
優(yōu)選的給藥到肺部的PEG-胰島素將具有分子量小于大約5000道爾頓、優(yōu)選小于大約2000道爾頓、以及甚至小于大約1000道爾頓的PEG部分。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，PEG-胰島素結(jié)合物中的PEG部分具有下列平均分子量之一200、300、400、500、600、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或5000。在某些情況下，不傾向使用較高分子量的PEG，這是由于它們具有使胰島素分子失去活性或在肺部用藥時通過肺的有效性降低(實施例8)的潛在可能性。
由于較高的生物有效度傾向于選擇較低分子量的PEG，但高分子量的PEG鏈，例如平均分子量為5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000或40,000道爾頓或更高的PEG鏈，盡管一般認為減少了天然胰島素的生物有效度，但傾向于增加半衰期，特別是在可注射的制劑中。也就是說對于一個高分子量的PEG-胰島素(相對于天然胰島素而言)，藥代動力學參數(shù)如曲線下的面積(AUC)的顯著提高，可以補償它活性的損失。
至于亞基的數(shù)量，本發(fā)明使用的PEG一般含有的(OCH2CH2)亞基的數(shù)量在下列一個或多個范圍之內(nèi)2到大約900個亞基、從大約4個到大約200個亞基、從大約4個到大約170個亞基、從大約4個到大約140個亞基、從大約4個到大約100個亞基、從大約10個到大約100個亞基、從大約4個到大約70個亞基、從大約4個到大約45個亞基和從大約4個到大約25個亞基。
本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物可以是單取代的(也就是說，一個PEG結(jié)合到一個單一的具有反應性的胰島素位點上)、雙取代的(具有結(jié)合到兩個反應活性位點上的PEG部分)、三取代的或者，甚至有聚合物結(jié)合到胰島素分子上的三個以上的位點上。在此單取代、雙取代和三取代胰島素也分別指PEG單體、二聚體和三聚體。多取代的胰島素(指具有共價結(jié)合于兩個或多個胰島素位點上的PEG部分的胰島素)一般來說在每個反應活性位點上結(jié)合的PEG部分是相同的，盡管并不是必需這樣。也就是說，具有超過一種以上類型的結(jié)合到胰島素上的PEG部分的PEG-胰島素組合物是可以預期的。就本發(fā)明而言，優(yōu)選的組合物是那些主要含有單體和/或二聚體胰島素結(jié)合物的組合物。令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非位點特異的PEG-胰島素組合物(包括具有共價結(jié)合到一個以上的反應活性位點上的PEG的PEG-胰島素物種的混合物)具有高于天然胰島素的藥代動力學和藥效性質(zhì)，特別是當在肺部給藥時(實施例11)。
就PEG取代的位置而言，胰島素分子具有幾個位點適合于PEG化，一般來說更優(yōu)選氨基位點，但這不是必需的。適合于PEG化的特定的胰島素氨基基團包括兩個N-末端GlyA1和PheB1，以及LysB29。胰島素分子上的這些位點在本文中也分別被稱為A1、B1和B29。用于連接到胰島素上的反應性氨基基團上的親電活化的PEG包括mPEG2-ALD、mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸、mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸、mPEG-CM-HBA-NHA、mPEG-苯并三唑碳酸、mPEG-乙醛二乙縮醛等(Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的一種組合物可以主要含有(超過90％)單取代的胰島素，例如單A1胰島素、單B1胰島素或單B29胰島素。這樣的組合物可以含有1)單A1胰島素，2)單A1胰島素和單B1胰島素的混合物，或3)單A1胰島素、單B1胰島素和單B29胰島素的混合物。此外，本發(fā)明的組合物可以主要含有雙取代的胰島素，例如雙-A1，B1-胰島素或雙-A1，B29-胰島素或雙-B1，B29-胰島素或其任何不同的組合。
此外，本發(fā)明的組合物可以含有不同PEG-胰島素結(jié)合物的混合物(即PEG結(jié)合在可能的結(jié)合位點的任何一種組合上)。以胰島素上的氨基位點為例，本發(fā)明的組合物可以含有下列PEG-胰島素結(jié)合物中的任何一種或多種單A1-PEG胰島素、單B1-PEG胰島素、單B29-PEG胰島素、雙-A1，B1-胰島素、雙-A1，B29-胰島素、雙-B1，B29-胰島素或三-A1，B1，B29-胰島素。在一個實施方案中，優(yōu)選主要含有單體和二聚體的組合物。代表性的組合物可以包括含有至少大約75％組合的單體和二聚體、至少大約80％組合的單體和二聚體或至少大約85-90％組合的單體和二聚體的PEG-胰島素結(jié)合物混合物(如實施例5和6)。
PheB1是結(jié)合PEG進行化學修飾的特別優(yōu)選的位點。特別是在一個實施方案中，用于本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物組合物，具有這樣的特征不論在組合物中PEG-胰島素物種的總數(shù)如何，其中胰島素上至少大約70％的B-1位點被PEG共價結(jié)合(例如，表3A，實施例5)。其它的實施方案包括下列組合物，其中胰島素上至少大約75％的B-1位點被PEG共價結(jié)合或其中胰島素上至少大約80％的B-1位點被PEG共價結(jié)合或其中胰島素上至少大約90％的B-1位點被PEG共價結(jié)合。
令人吃驚的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PEG-胰島素的隨機混合物(通過隨機而不是定點的PEG化而制備)，當給藥到肺部時，使血液中升高的胰島素水平可以維持至少6小時，更典型的情況下為給藥后維持至少8小時或更長時間。這樣的混合物具有優(yōu)勢，不僅因為它們更好的藥代動力學和藥效性質(zhì)，而且因為它們的合成比相應的位點特異的方法更加簡單(不需要多個合成步驟，不需要使用保護基團，不需要多步純化等)。
在天然胰島素分子上可以通過共價結(jié)合PEG而進行化學修飾的其它位點包括2個C-末端、Arg22B、His10B、His5A、Glu4A、Glu17A、Glu13B和Glu21B。
除了天然胰島素，具有一個或多個氨基酸替代、插入或缺失的非天然胰島素也可以加以使用，以便其他位點可用于連接一個或多個PEG部分進行化學修飾。本發(fā)明的這個實施方案對于在胰島素分子內(nèi)引入其他定制的PEG化位點尤其有用，例如，用于形成對酶解有更高抗性的PEG-胰島素。這樣的方法提供了更高的靈活性，可用于設(shè)計具有所需均衡的活性、穩(wěn)定性、溶解性和藥物學性質(zhì)的最適化的胰島素結(jié)合物。盡管在胰島素分子內(nèi)任何數(shù)量的位點上都可以進行突變，即位點特異的誘變，但最優(yōu)選的胰島素突變體是B鏈上的前4個氨基酸中的任何一個被一個半胱氨酸殘基取代。這樣的半胱氨酸殘基然后可以與一個和巰基基團特異性反應的活化的PEG進行反應，例如在美國專利No.5,739,208和國際申請公開No.WO 01/62827中描述的N-順丁烯二酰亞胺基聚合物或其它衍生物。用在本發(fā)明的這個特定的實施方案中的巰基選擇性PEG包括mPEG-分支的順丁烯二酰亞胺(mPEG(MAL)2)、mPEG2-分支的順丁烯二酰亞胺(mPEG2(MAL)2)、mPEG-順丁烯二酰亞胺(mPEG-MAL)和mPEG2-順丁烯二酰亞胺(mPEG2-MAL)(Shearwater Corporation)。這些活化的PEG的結(jié)構(gòu)分別如下mPEG-CONHCH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]、mPEG2-賴氨酸-NH-CH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]2、mPEG-MAL和mPEG2-賴氨酸-NH-CH2CH2NHC(O)CH2CH2MAL。
如果需要，也可以使用天然胰島素序列的其它突變，以提高其生物學活性在PEG化后有所損失的PEG-胰島素結(jié)合物的生物活性。一個這樣的突變是8位的蘇氨酸變?yōu)榻M氨酸。其它的突變可以在例如Diabetes Care，13(9)，1990中找到，其內(nèi)容在此引為參考。
在本發(fā)明中使用的PEG可以具有不同的結(jié)構(gòu)線性的、分叉的、分支的、啞鈴狀的等等。一般來說，PEG用一個適當?shù)幕罨鶊F進行活化，以適合于結(jié)合在胰島素分子的一個或多個預期位點上?；罨腜EG在一端具有一個反應基以與胰島素反應。在此所用的術(shù)語“接頭”，其意義包括位于PEG末端與胰島素反應的活化基團，還可以進一步包括位于聚合物的PEG部分與末端的活化基團之間的其它(一般為惰性)原子，以使活化的PEG的制備簡便。接頭可以含有多種原子中的任何一種，但是，優(yōu)選的接頭含有介于PEG骨架和末端活化基團之間的亞甲基，例如在mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸和mPEG-丁酸中那樣。代表性的活化的PEG衍生物和將這些試劑與藥物如胰島素結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是廣為人知的，進一步的描述可以參見Zalipsky，S.等在“Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnical and BiomedicalApplications(聚乙二醇化學生物技術(shù)與生物醫(yī)學應用)”中的“Use ofFunctionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides(使用功能化的聚乙二醇進行多肽修飾)”，J.M.Harris編，Plenus出版社，New York(1992)，以及Advanced Drug Reviews，16157-182(1995)。
在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，結(jié)合物的PEG部分缺少對顯著修飾聚合物或聚合物-胰島素結(jié)合物的水溶性性質(zhì)有效的一個或多個親脂基團。也就是說，本發(fā)明的結(jié)合物的聚合物或非胰島素部分可以含有一組原子，與親水原子相比它們被認為是更親脂的(例如具有從大約2個到8-12個碳原子的碳鏈)，但是，如果這樣的一個或多個基團的存在對顯著改變聚合物或結(jié)合物的親水性質(zhì)無效，那么這樣的部分可以包含在本發(fā)明的結(jié)合物中。也就是說，本發(fā)明的胰島素結(jié)合物本身的特征是親水的，而不是親脂的或兩親的。一般來說，一個胰島素結(jié)合物的聚合物部分在結(jié)合到胰島素之前，不論是否含有親脂基團，總具有高的親水/親脂差額(HLB)數(shù)。HLB數(shù)是基于分子中每種類型基團(親水的或親脂的)的重量百分數(shù)，其值的范圍一般在大約1-40。用于本發(fā)明結(jié)合物的聚合物，總得來說其特征為親水的，不管是否存在一個或多個親脂取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，聚合物-胰島素結(jié)合物的聚合物部分，其特征為HLB數(shù)大于25，更優(yōu)選情況下大于30，或更優(yōu)選情況下甚至大于35。在本發(fā)明的某些實施方案中，親脂部分可以存在，但在優(yōu)選情況下此部分不位于PEG鏈的一個末端。
用于本發(fā)明的結(jié)合物中的分支的PEG包括在國際專利公開WO96/21469中描述的那些，以其全文內(nèi)容在此專門引為參考。一般來說，分支的PEG可以用通式R(PEG-OH)n來表示，其中R代表中央的“核心”分子，n代表臂的數(shù)目。分支的PEG具有一個中央的核心，從其上伸出兩個或多個PEG臂。在分支構(gòu)型中，分支的聚合物核心具有一個單一的反應活性部位以與胰島素結(jié)合。用于本發(fā)明的分支的PEG一般含有少于4個PEG臂，在更優(yōu)選情況下含有少于3個PEG臂。分支的PEG提供了一些優(yōu)點具有單一的反應活性部位，與它們的線性PEG對應物相比與更大的更濃密的聚合物云結(jié)合。一種特殊類型的分支PEG可以用(MeO-PEG-)pR-X表示，其中p等于2或3，R是其上連接有2或3個PEG臂的中央核心結(jié)構(gòu)如賴氨酸或甘油，以及X代表任何適當?shù)谋换罨幕蚰軌虮换罨囊赃B接胰島素的官能團。一個特別優(yōu)選的分支PEG是mPEG2-NHS(Shearwater Corporation，Alabama)，它具有mPEG-賴氨酸-琥珀酰亞胺的結(jié)構(gòu)。
在另一個分支結(jié)構(gòu)中，“懸垂PEG”的反應基可以將蛋白沿著PEG骨架定位結(jié)合，而不是象在前面的例子中那樣結(jié)合在PEG鏈的末端。從PEG骨架延伸出來用于結(jié)合胰島素的反應基可以是相同的，也可以是不同的。懸垂PEG結(jié)構(gòu)可能是有用的，但一般不傾向使用，特別是對于吸入組合物。
此外，PEG-胰島素結(jié)合物的PEG部分可以含有一個分叉的結(jié)構(gòu)，在聚合物鏈的一端帶有一個分支部分，還有兩個連接到分支部分上的游離的反應基(或任意2的倍數(shù))用于結(jié)合胰島素。分叉的PEG的例子在國際專利公開No.WO 99/45964中有描述，其內(nèi)容在此專門引為參考。分叉的聚乙二醇還可任選在聚合物鏈的相反末端包含一個烷基或“R”基團。更具體來說，本發(fā)明的分叉的PEG-胰島素結(jié)合物的通式為R-PEG-L(Y-胰島素)n，其中R是烷基，L是一個水解穩(wěn)定的分支點，以及Y是一個連接基團，其為分叉的聚合物與胰島素之間提供了化學連接，n是2的倍數(shù)。L可以代表一個單個的“核心”基團，例如“-CH-”，也可以含有更長的原子鏈。L基團的例子包括賴氨酸、甘油、季戊四醇或山梨醇。一般來說，分支部分中特定的分支原子是碳。
在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，分叉的PEG與胰島素分子之間的連接(Y)是水解穩(wěn)定的。在一個優(yōu)選實施方案中，n是2。在與胰島素上的反應活性部位結(jié)合以前，適當?shù)腨部分包括但不限于活性酯、活性碳酸、醛、異氰酸、異硫氰酸、環(huán)氧化物、醇、順丁烯二酰亞胺、乙烯砜(vinylsulfone)、酰肼、二硫吡啶和碘乙酰胺。適當?shù)幕罨鶊F的選擇依賴于結(jié)合在胰島素分子上的目的位點，可以被本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員容易地確定。在產(chǎn)生的PEG-胰島素結(jié)合物中相應的Y基團，來自于活化的分叉聚合物與胰島素上的適當反應活性部位的反應。對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說，這樣的最終連接的特定身份是明顯的。例如，如果反應的分叉PEG含有活化的酯，如琥珀酰亞胺或順丁烯二酰亞胺酯，通過胰島素上的一個氨基位點的連接將產(chǎn)生相應的酰胺鍵。這些特別的分叉聚合物是特別有吸引力的，因為它們提供了胰島素與PEG的摩爾比為2∶1或更高的結(jié)合物。這樣的結(jié)合物不可能阻斷胰島素受體位點，同時仍然提供了設(shè)計上的靈活性，以保護胰島素免受例如胰島素降解酶的酶促降解。
在一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的分叉的PEG-胰島素結(jié)合物由通式R-[PEG-L(Y-胰島素)2]n表示。在這種情況下，R代表其上至少結(jié)合了一個PEG-雙-胰島素結(jié)合物的中央核心結(jié)構(gòu)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明這一方面，優(yōu)選那些分叉聚合物，其中n選自1、2、3、4、5和6。核心R結(jié)構(gòu)的例子也可以從賴氨酸、甘油、季戊四醇或山梨醇衍生而來。
在另一個實施方案中，在任何本文提供的代表性的結(jié)構(gòu)中，胰島素與聚合物分支點之間的化學鍵可以是可降解的(即水解不穩(wěn)定的)。此外，在聚合物骨架中可以含有一個或多個可降解的鍵，以便在體內(nèi)產(chǎn)生具有比開始給藥的結(jié)合物更短的PEG鏈的PEG-胰島素結(jié)合物。聚合物結(jié)合物的這種可選擇的特點，可以對結(jié)合物給藥后其最終的預期藥物學性質(zhì)提供附加的控制。例如，可以給藥一種大的和相對惰性的結(jié)合物(即結(jié)合物上連接有一個或多個高分子量的PEG鏈，例如一個或多個分子量大于大約10,000的PEG鏈，其中結(jié)合物基本不具有生物活性)，然后它或是在肺中或是在血流中被水解，產(chǎn)生了一種含有一部分最初存在的PEG鏈的生物活性的結(jié)合物。采用這種方式，可以在一定程度上更為有效地適合PEG-胰島素結(jié)合物的性質(zhì)。例如，起始的聚合物結(jié)合物，當最初通過最好是但不必需是吸入給藥時，它的吸收可能是慢的。當水解可降解的鍵在體內(nèi)裂解后，游離的胰島素(依賴于可降解的鍵的位置)或其上帶有一個小的聚乙烯標記的胰島素就被釋放，它們更容易通過肺部吸收和/或在血液中循環(huán)。
本發(fā)明的這個實施方案的一個特征是，水解前的完整的聚合物結(jié)合物，在給藥后降解很慢，以便可裂解的鍵的水解能夠有效地控制活性胰島素慢速地釋放到血流中，這與胰島素在其釋放到全身性循環(huán)中之前先酶促降解相反。
適合的在生理條件下可裂解的鍵包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基酯、縮醛和縮酮。這樣的結(jié)合物應該具有生理條件下可裂解的鍵，其在儲存和給藥時是穩(wěn)定的。例如，PEG-可裂解的鍵-胰島素結(jié)合物，在產(chǎn)生最后的藥物成分之時，如果使用了適當?shù)慕o藥媒介物在溶解在其中之時，以及不管途徑如何在給藥之時，都應該維持它的完整性。
如前面的一般性描述，更具體地說，用于本發(fā)明的具有可生物降解的鍵的PEG-胰島素結(jié)合物由下列結(jié)構(gòu)表示PEG1-W-PEG2-胰島素(其中PEG1和PEG2可以是相同的也可以是不同的)或PEG-W-胰島素，其中W代表一個弱的可生物降解的鍵。這些結(jié)合物含有可以在體內(nèi)除去的(即可裂解的)PEG臂或PEG臂的部分。這些特殊修飾的胰島素在完整時一般基本上無生物活性，這或是由于分子完整的PEG部分的大小或是由于PEG鏈對胰島素分子上的活性位點的空間位阻。但是，這樣的結(jié)合物在生理條件下被裂解，釋放出胰島素或能夠通過例如肺部吸收進入全身循環(huán)的具有生物活性的PEG-胰島素。在第一種示例結(jié)構(gòu)中，PEG1部分可以具有本文討論的多種不同結(jié)構(gòu)中的任何一種，一般分子量為至少大約10,000，以便結(jié)合物在給藥后不被快速吸收。分子的PEG2部分優(yōu)選分子量小于大約5000道爾頓，在更優(yōu)選情況下小于2000道爾頓，以及在更優(yōu)選情況下甚至小于1000道爾頓。引用第二個示例結(jié)構(gòu)PEG-W-胰島素，其PEG部分的分子量一般至少大約10,000道爾頓或更高。
在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，PEG-胰島素結(jié)合物具有一種啞鈴狀的結(jié)構(gòu)，其中兩個胰島素部分被一個中央的PEG相互連接起來。具體而言，這樣的結(jié)合物可以用“胰島素-Y-PEG-Z-胰島素”結(jié)構(gòu)來表示，其中Y和Z是水解穩(wěn)定的連接基團，用于將胰島素與PEG部分連接起來。在一個特定的實施方案中，Z在結(jié)合之前是一個活化的砜，適合于與胰島素上的巰基基團(例如半胱氨酸)反應。此外，Y和Z可以是任何適合于與胰島素共價結(jié)合的基團。其它的例子參見美國專利No.5,900,461，其內(nèi)容在此專門引為參考。
其它代表性的具有線性或分支結(jié)構(gòu)的用于制備本發(fā)明結(jié)合物的單或雙官能的PEG可以從Shearwater Corporation(Alabama)購買。圖例的結(jié)構(gòu)在Shearwater的2001年目錄中有描述，標題為“用于生物醫(yī)學應用的聚乙二醇及衍生物”，其內(nèi)容在此專門引為參考。
B、制備將PEG連接到胰島素上的反應條件依賴于所用的特定PEG衍生物、結(jié)合到胰島素上的位點和反應基的具體類型(即賴氨酸與半胱氨酸)、所需的PEG化程度等而變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。
在后面更詳細的例子中，本發(fā)明的結(jié)合物的合成可以是定點的(實施例1、2和4)，也可以是隨機的(實施例3)。適合與胰島素氨基基團(例如GlyA1、PheB1、Lys29B)反應的PEG活化基團是tresylate、醛、環(huán)氧化物、羰基咪唑、活性碳酸酯(例如琥珀酰亞胺碳酸酯)、縮醛和活性酯例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和NHS-衍生的PEG。其中反應性最強的是PEG羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS和琥珀酰亞胺基碳酸酯。其它用于結(jié)合胰島素的PEG試劑包括PEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸和丙酸。適用于本發(fā)明的PEG活性酯，例如具有單個丙酸或丁酸部分的PEG活性酯，在美國專利No.5,672,662中有描述，在此以其全部內(nèi)容引為參考。用于制備本發(fā)明的結(jié)合物的特定的活性酯包括mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸和mPEG-琥珀酰亞胺基丁酸(實施例1-4)。
對于一個特定結(jié)合物的最適實驗條件，一般來說可以通過常規(guī)的實驗，由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
為了結(jié)合到胰島素的巰基基團上，適合于活化PEG-聚合物的反應基包括乙烯砜、碘乙酰胺、順丁烯二酰亞胺和二巰基-鄰吡啶。特別優(yōu)選的試劑包括PEG乙烯砜和PEG-順丁烯二酰亞胺。其它用于本發(fā)明的代表性乙烯砜在美國專利No.5,739,208中有描述，其內(nèi)容在此專門引為參考。
在某些情況下，本發(fā)明的組合物選擇性含有PEG化的胰島素，即產(chǎn)生的結(jié)合物在位置和PEG化程度方面基本上是均質(zhì)的。也就是說，氨基基團的位點選擇性或定點PEG化可以產(chǎn)生一個胰島素結(jié)合物組合物，其中主要在預期靶位點，例如PheB1上結(jié)合了一個PEG部分。依賴于預期的PEG化位點，可能需要一種保護/去保護合成策略以防止胰島素分子內(nèi)非靶反應活性部位的PEG化，例如通過使用一個保護基團例如t-BOC(叔丁氧基羰基)或二-BOC(二丁氧基羰基)。其它適合的氨基保護基團包括芐氧羰基(CBZ)、三苯甲基衍生物例如三苯甲基(Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。其它的保護基團，例如環(huán)二?；鶊F或硝基苯基亞磺酰(Nps)也證實可用于保護氨基官能團。實施例1和2中提供了定點合成一種5K-PEG-胰島素組合物的例子。
這種用于提供本發(fā)明的胰島素結(jié)合物的定點結(jié)合化學可以產(chǎn)生在胰島素分子的特定反應活性部位上高度取代的組合物。然后，如果需要，這些組合物可以被進一步純化以提供基本上是純的單或雙官能的PEG-胰島素的組合物。
基本上純的PEG-胰島素組合物是指根據(jù)下列任何一種分析方法檢測到其中含有至少大約90％純度，在優(yōu)選情況下至少大約95％純度的PEG-胰島素結(jié)合物。就這點而言，純度是指PEG-胰島素結(jié)合物的含量。也就是說，至少大約90％純度的PEG-胰島素結(jié)合物含有至少大約90％重量的PEG-胰島素結(jié)合物物種，而其余近10％代表不是PEG-胰島素結(jié)合物的雜質(zhì)。本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物一般使用一種或多種純化技術(shù)進行純化，例如離子交換層析、孔徑排阻層析、親和層析、疏水相互作用層析和反相色譜。得到的PEG-胰島素的總體均一性(存在的胰島素-PEG形式的數(shù)量)可以通過使用一種或多種下列方法進行評估層析、電泳、質(zhì)譜以及特別是MALDI-MS和核磁共振光譜(NMR)。一種特別有用的識別胰島素修飾位點的方法是反相高壓液相色譜(RP-HPLC)肽作圖，偶聯(lián)有一個使用內(nèi)切蛋白酶Glu-C的人胰島素USP身份檢驗(實施例6)。
C、PEG-胰島素結(jié)合物的特性按照本發(fā)明的一個方面，提供了適合于肺部給藥的PEG-胰島素結(jié)合物組合物。通過實施例7-11的體內(nèi)數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物，當給藥到肺部時，具有比天然胰島素更高的藥代動力學和藥效性質(zhì)。已經(jīng)表明，可以用分子量高達5,000K到10,000K或更高的PEG來修飾胰島素，同時仍然可以維持活性。一個代表性的PEG-胰島素結(jié)合物5K-PEG-胰島素的活性在實施例7中描述。此外，從本文提供的實施例可以看出，具有平均分子量范圍從750道爾頓到2000道爾頓、到5000道爾頓的PEG鏈的示例性PEG-胰島素結(jié)合物，當通過靜脈和肺部給藥時，都具有生物活性，并且當肺部給藥時基本上不滯留在肺中，正如由可檢測到的血清胰島素水平所表明的那樣，并且能夠有效地產(chǎn)生對葡萄糖水平有大幅度的抑制(實施例7到11)，在某些情況下，這種抑制的持續(xù)時間明顯長于使用天然胰島素所觀察到的持續(xù)時間。此外，在此提供的PEG-胰島素結(jié)合物，當在肺部給藥時，生效很快(在給藥后1小時內(nèi))。表13提供了本發(fā)明的示例PEG-胰島素組合物的藥代動力學和藥效參數(shù)的概要。
一般來說，本發(fā)明的PEG-胰島素組合物將具有一種或多種下列的特性。本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物至少維持了可測量程度的比活性。也就是說，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物將具有天然胰島素從大約2％到大約100％或更多的比活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，PEG-胰島素結(jié)合物將具有未修飾的天然胰島素至少10％或更多的生物學活性，并且基本上非免疫原性。在優(yōu)選情況下，本發(fā)明結(jié)合物的生物活性為天然胰島素生物活性的大約5％到至少大約20％或更高。本發(fā)明結(jié)合物的生物活性的表征可以間接地例如通過監(jiān)測血液中的葡萄糖和胰島素水平來產(chǎn)生相應的藥代動力學和/或藥效數(shù)據(jù)，或通過RIA(放射免疫測定法)來進行。
至于在將PEG-胰島素結(jié)合物給藥到例如肺部后血清中的胰島素濃度，在此描述的結(jié)合物一般出峰(即達到最大濃度(Cmax)或濃度曲線的最高點)在給藥后大約2到8小時，更普遍的是在大約3到6小時左右。此外，本發(fā)明化學修飾的胰島素，特別是在此提供的長效胰島素制劑，與天然胰島素相比，在提供可測量到的葡萄糖降低效應和在較長的時期內(nèi)維持胰島素濃度兩個方面，都是有效的。更具體來說，通過肺部給藥時，PEG-胰島素結(jié)合物在給藥后將表現(xiàn)出升高的胰島素水平(高于基礎(chǔ)或基線水平)至少大約6小時，在優(yōu)選情況下至少8小時。在優(yōu)選情況下，通過肺部給藥時，PEG-胰島素結(jié)合物在給藥后將產(chǎn)生升高的血液胰島素水平超過至少9小時、10小時、12小時或至少14小時的延長期，其中在給藥后這樣的延長期內(nèi)在血流中可以檢測到高于基線水平的胰島素結(jié)合物。在實施例中提供了能夠表現(xiàn)這些特征的代表性組合物。
如前所述，本發(fā)明的胰島素結(jié)合物對于降低血糖水平是有效的。現(xiàn)在看看本發(fā)明的組合物抑制血糖的能力，通過例如肺部給藥時，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物在給藥后能夠?qū)⒀撬接行б种圃诨A(chǔ)水平以下至少6小時。在更特定的情況下，本發(fā)明的PEG-胰島素組合物在給藥后能夠?qū)⒀撬接行б种圃诨A(chǔ)水平以下至少8小時，優(yōu)選情況下至少10小時，或更優(yōu)選情況下至少12小時或更長時間。
此外，本發(fā)明的PEG-胰島素制劑表現(xiàn)出高于天然胰島素的絕對的肺部生物有效度。具體而言，在此提供的的PEG-胰島素制劑具有天然胰島素至少約1.2倍的絕對的肺部生物有效度，在優(yōu)選情況下至少大約1.5倍于天然胰島素，更優(yōu)選情況下至少比天然胰島素高出約2倍，或者在更優(yōu)選情況下至少高出約2.5倍或3倍。(表13提供了說明性的結(jié)果)。
III、制劑本發(fā)明的聚合物-胰島素結(jié)合物組合物可以單獨給藥，也可以以含有其它賦形劑、溶劑、穩(wěn)定劑等的治療/藥物組合物的形式給藥，這依賴于給藥的特殊方式和劑量形式。本結(jié)合物可以腸胃外或非腸胃外給藥。具體的給藥途徑包括口服、直腸、含服、局部、鼻、眼、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮和肺部。更優(yōu)選的是腸胃外和肺部途徑。
對于哺乳動物以及優(yōu)選是人的給藥來說，藥物制劑一般含有至少一種本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物及一種或多種可藥用的載體，特別是對肺部組合物而言，這將在后面更詳細描述。例如用于腸胃外給藥的本發(fā)明制劑，最普通的是液體溶液或懸浮液，而用于肺部給藥的可吸入制劑一般為液體或粉末，其中優(yōu)選情況下一般為粉劑。其它較少采用的本發(fā)明的化學修飾的胰島素組合物包括糖漿、乳膏、軟膏、片劑等。
胰島素的制劑和相應的劑量將隨著使用的胰島素的生物活性濃度而變化?？勺⑸涞囊葝u素以USP胰島素單位和USP胰島素人類單位(U)來計量；一個單位的胰島素等于在禁食的兔子中將血糖水平減少到45mg/dl(2.5mM)所需的胰島素量。典型的注射用胰島素制劑的濃度范圍為30到100單位/mL，大約為每毫升3.6mg胰島素。在病人中要達到預期生理效應所需的胰島素量不僅隨著病人及其疾病(例如I型與II型糖尿病)的具體情形而變化，而且隨著所用胰島素的強度和特殊類型而變化。例如，普通胰島素(快效型)的劑量范圍為每天每公斤體重使用從大約2到0.3U胰島素。從一方面說，本發(fā)明的組合物在經(jīng)歷治療的病人中，能夠有效地使禁食血糖水平達到大約90到140mg/dl之間，飯后的值低于大約250mg/dl。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，結(jié)合對特定的給藥途徑所用的確切胰島素結(jié)合物的藥代動力學和藥效學，可以確定精確的用藥劑量，并且可以根據(jù)周期性葡萄糖監(jiān)測的結(jié)果容易地進行調(diào)整。
可吸入胰島素結(jié)合物制劑的單劑量(在每吸入一次的基礎(chǔ)上)的范圍一般是從大約0.5mg到15mg胰島素結(jié)合物，其中一般在大約1到10次呼吸內(nèi)達到所需的總劑量，優(yōu)選情況下在大約1到4次呼吸內(nèi)。平均來說，每次用藥期通過吸入給藥的PEG胰島素總劑量為大約10U到大約400U，每個單劑量或單位劑量形式(對應于單次吸入)含有大約5U到400U。
A、化學修飾胰島素的可吸入制劑如上所述，本發(fā)明胰島素結(jié)合物的一種優(yōu)選給藥途徑是吸入到肺部?，F(xiàn)在將更充分地描述具體的制劑成分、性質(zhì)和給藥裝置。
制劑中胰島素結(jié)合物的量，是傳送每單位劑量的治療有效量的胰島素以達到至少一種天然胰島素的治療效果，即將血糖水平控制在接近正常血糖量的能力所必需的量。在實踐中，這將依賴于具體的胰島素結(jié)合物、它的活性、將要治療的糖尿病癥狀的嚴重程度、病人的種群、制劑的穩(wěn)定性等而廣泛變化。組合物一般含有從大約1％重量到大約99％重量的PEG-胰島素，典型的是含有從大約2％到大約95％重量的結(jié)合物，更典型的是含有從大約5％到85％重量的結(jié)合物，同時也依賴于組合物中包含的賦形劑/添加劑的相對量。更具體來說，組合物一般含有至少下面一種百分比的PEG-胰島素10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％重量或更高。在優(yōu)選情況下，粉末組合物將含有至少大約60％，例如從大約60％到100％重量的PEG-胰島素。應該明白，在此描述的制劑中可以摻入一種以上的胰島素，術(shù)語“藥劑”或“胰島素”的使用決非排除使用兩種或多種胰島素或胰島素與其它活性劑的組合。(例如，一種說明性的PEG-胰島素制劑還可以含有天然胰島素)。
A.1、賦形劑在大多數(shù)情況下，本發(fā)明的組合物將包括一種或多種賦形劑。優(yōu)選的是碳水化合物賦形劑，可以單獨使用也可以與其它賦形劑或添加劑結(jié)合使用。用于本發(fā)明組合物中的代表性碳水化合物包括糖、衍生糖例如糖醇、醛糖糖酸、酯化的糖和糖聚合物。適用于本發(fā)明的碳水化合物賦形劑的例子包括例如，單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。優(yōu)選的是非還原糖，與胰島素結(jié)合物混合時能形成基本上是干的無定形或玻璃相的糖，以及具有相對高的Tgs的糖(例如Tgs高于40℃，在優(yōu)選情況下高于50℃，更優(yōu)選情況下高于60℃，以及更優(yōu)選情況下高于70℃，最優(yōu)選情況下Tgs為80℃或更高)。
其它的賦形劑包括氨基酸、肽和特殊的含有2-9個氨基酸的寡聚體，優(yōu)選為2-5聚體，以及多肽，它們都可以是同種或異種的。代表性的氨基酸包括甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、纈氨酸(val)、亮氨酸(leu)、異亮氨酸(ile)、甲硫氨酸(met)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、賴氨酸(lys)、精氨酸(arg)、組氨酸(his)、正亮氨酸(nor)，以及它們的修飾形式。一個特別優(yōu)選的氨基酸是亮氨酸。
其它在可吸入組合物中優(yōu)選用作賦形劑的是含有兩個或多個亮氨酰殘基的二肽和三肽，這在Inhale Therapeutic System(吸入治療系統(tǒng)公司)的國際專利申請PCT/US00/09785中進行了描述，在此以其全文引為參考。
具有玻璃轉(zhuǎn)相溫度高于大約40℃、更優(yōu)選情況下高于50℃、更優(yōu)選情況下甚至高于60℃以及最優(yōu)選情況下高于70℃的二肽和三肽也是優(yōu)選的。
其它用于本發(fā)明的能夠增強穩(wěn)定性和氣霧劑性能的肽是含有上述氨基酸的任何組合的4聚體和5聚體，盡管由于它們在水中的溶解度有限而較少使用。在更優(yōu)選情況下，該4聚體或5聚體含有兩個或多個亮氨酸殘基。亮氨酸殘基可以占據(jù)肽中的任何位置，同時其它的(即非亮氨酰的)氨基酸位置被上述任何氨基酸占據(jù)，只要產(chǎn)生的4聚體或5聚體在水中的溶解度至少大約1mg/ml。在優(yōu)選情況下，4聚體或5聚體中的非亮氨酰氨基酸是親水氨基酸，例如賴氨酸，從而增加了肽在水中的溶解度。
多聚氨基酸，特別是含有任何在此描述的氨基酸的那些多聚氨基酸，也適合于用作穩(wěn)定劑。優(yōu)選的多聚氨基酸是例如多聚賴氨酸、多聚谷氨酸和多聚(賴氨酸，丙氨酸)。
其它可用于本組合物和方法的賦形劑和添加劑包括但不限于蛋白、非生物聚合物和生物聚合物，它們可以以單獨或組合的形式出現(xiàn)。適合的賦形劑在Inhale Therapeutic Systems的國際專利公開No.WO96/32096和No.WO 98/16205中提供。優(yōu)選的賦形劑具有玻璃轉(zhuǎn)相溫度(Tg)高于大約35℃，優(yōu)選情況下高于大約40℃，更優(yōu)選情況下高于大約45℃，最優(yōu)選情況下高于大約55℃。
蛋白賦形劑的例子包括白蛋白例如人血清白蛋白(HAS)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白、血紅蛋白等。組合物也可以含有緩沖液或pH調(diào)節(jié)劑，一般但不必需是有機酸或堿的鹽。代表性的緩沖液包括有機酸檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二甲酸的鹽。其它適合的緩沖液包括Tris、氨基丁三醇鹽酸(tromethamine hydrochloride)、硼酸、甘油磷酸和磷酸。氨基酸如甘氨酸也適用。
本發(fā)明的組合物還可以包含其它的聚合物賦形劑/添加劑，例如聚乙烯基吡咯烷酮、衍生的纖維素如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素，F(xiàn)icoll(一種多聚體糖)、羥乙基淀粉(HES)、dextrate(例如環(huán)糊精如2-羥基丙基-β-環(huán)糊精和磺基丁基醚-β-環(huán)糊精)，聚乙二醇和果膠。
組合物還可以包括增味劑、掩味劑、無機鹽(如氯化鈉)、抗菌劑(如苯扎氯銨(benzalkonium chloride))、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(如聚山梨酸酯如吐溫20和吐溫80，以及得自BASF的非離子型表面活性劑普盧蘭尼克(Pluronics)如F68和F88)、山梨聚糖醇酯、脂類(例如，磷脂如卵磷脂和其它的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺，盡管在優(yōu)選情況下不以脂質(zhì)體的形式)、脂肪酸和脂肪酯、甾體(如膽固醇)和螯合劑(如EDTA、鋅和其它這樣的適合的陽離子)。后面更詳細地描述了使用某些雙取代的磷脂酰膽堿來生產(chǎn)有孔的微型結(jié)構(gòu)(即中空有孔的微球)。其它適用于本發(fā)明的組合物的藥物賦形劑和/或添加劑在Remington的“The Science & Practice ofPharmacy(藥物科學與實踐)”第19版，Williams & Williams出版社，1995年和“Physician′s Desk Reference(醫(yī)生桌面參考)”第52版，MedicalEconomics出版社，Montvale，NJ(1998)中列出。
在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可以不含增透劑，它可能引起刺激，并且在高濃度時是有毒的，而這種高濃度通常是提供大幅度的吸收增強所必需的?？梢圆话诒景l(fā)明組合物中的具體的增強劑是去污劑類的增強劑如脫氧膽酸、月桂醇聚氧乙烯醚-9(Laureth-9)、DDPC、甘氨膽酸鹽和梭鏈孢酸(fusidate)。但是，某些增強劑，例如那些保護胰島素免受酶降解的增強劑，如蛋白酶和肽酶抑制劑如α-1抗蛋白酶劑、卡托普利(captropril)、thiorphan及HIV蛋白酶抑制劑，在本發(fā)明的某些實施方案中，可以包含在本發(fā)明的PEG-胰島素制劑中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的PEG-胰島素結(jié)合物可以不含脂質(zhì)體、脂類基質(zhì)和封裝劑。
通常，本發(fā)明的藥物組合物含有從大約1％到大約99％重量的賦形劑，在優(yōu)選情況下含有從大約5％到98％重量的賦形劑，在更優(yōu)選情況下含有從大約15％到95％重量的賦形劑。在更優(yōu)選情況下，噴霧干燥的組合物含有從0到50％重量的賦形劑，更優(yōu)選情況下，含有從0到40％重量的賦形劑。一般來說，希望在最終的藥物組合物中含有高的胰島素濃度。通常情況下，賦形劑/添加劑的最適量由實驗確定，即通過制備含有不同賦形劑量的組合物(范圍從低到高)，檢測PEG-胰島素的化學和物理穩(wěn)定性、藥物組合物的MMAD和可分散性，然后進一步探索獲得最適氣霧劑性能、同時對胰島素的穩(wěn)定性無明顯副作用的劑量范圍。
A.2、制備干粉本發(fā)明的含有PEG-胰島素結(jié)合物的干粉制劑可以通過任何一種干燥技術(shù)制備，優(yōu)選采用噴霧干燥的方法。制劑的噴霧干燥在例如“Spray Drying Handbook(噴霧干燥手冊)”第5版，K.Masters，JohnWiley & Sons出版社，NY，NY(1991)以及Platz，R.等的國際專利公開No.WO 97/41833(1997)和No.WO 96/32149(1996)中有一般性的描述，其內(nèi)容在此引為參考。
PEG-胰島素結(jié)合物的溶液在常規(guī)噴霧干燥器，例如那些從商業(yè)供應商如Niro A/S(Denmark)、Buchi(Switzerland)等處獲得的干燥器中進行噴霧干燥，得到一種可分散的干粉。PEG-胰島素溶液噴霧干燥的最適條件隨著制劑成分而變化，一般通過實驗確定。用于噴霧干燥材料的氣體一般是空氣，盡管惰性氣體如氮氣或氬氣也可適用。此外，用于干燥所噴霧材料的氣體的入口和出口的溫度以不引起被噴霧材料中的PEG-胰島素的降解為宜。這樣的溫度一般由實驗確定，盡管在通常情況下，入口的溫度范圍從大約50℃到大約200℃，而出口的溫度范圍從大約30℃到大約150℃。優(yōu)選的參數(shù)包括霧化壓力從大約20到150psi，在優(yōu)選情況下從大約30-40到100psi。一般所用的原子化壓力為下列之一(單位為psi)20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或更高。
具有本文描述的特征的可呼吸的PEG-胰島素組合物也可以按照WO 99/16419中描述的方法生產(chǎn)，對某些制劑成分進行干燥，從而形成有孔的微型結(jié)構(gòu)粉末，該專利的全部內(nèi)容在此引為參考。有孔的微型結(jié)構(gòu)粉末一般含有噴干的中空的微球，具有相對薄的孔壁，形成大的內(nèi)部空間。有孔的微型結(jié)構(gòu)粉末可以分散在一種選定的懸浮介質(zhì)中(例如非水的和/或用氟化的發(fā)泡劑)以在干燥前提供穩(wěn)定的分散作用。使用相對低密度的有孔的微型結(jié)構(gòu)或微型顆粒顯著地減少了微粒間的吸引力，從而降低了剪切力，增加了產(chǎn)生的粉末的流動性的分散性，以及減少了由絮凝作用、沉淀作用或其穩(wěn)定的分散體的分層所引起的降解。
此外，肺部給藥的PEG-胰島素組合物可以含有空氣動力學上輕的顆粒，如美國專利No.6,136,295中所描述的那樣。
本發(fā)明的粉末制劑還可以通過冷凍干燥、真空干燥、噴霧凍干、超臨界液體加工(如在Hanna等的美國專利No.6,063,138中所描述的那樣)、空氣干燥或其它形式的蒸發(fā)干燥方法來制備。
在另一種方法中，干粉的制備方法可以是將粉末成分凝聚、將材料篩分以獲得凝聚物、球化以提供更呈球狀的凝聚物以及篩分以獲得大小均一的產(chǎn)品，這種方法在例如Ahlneck，C.等的國際PCT公開No.WO 95/09616(1995)中有描述，在此引為參考。
干粉也可以通過對干粉形式的制劑成分進行混合、研磨、篩分或噴射研磨來制備。
干粉組合物一旦形成，在生產(chǎn)、加工和儲存過程中最好保持在于燥條件下(即相對低的濕度)。不論使用何種干燥工藝，最好將產(chǎn)生可吸入的高度可分散的顆粒，所述顆粒含有在此描述的化學修飾的胰島素。
A.3、干粉制劑的特征本發(fā)明的粉末還具有幾個特點，其中最顯著的是下面的一個或多個特征(1)始終如一的高度可分散性，即使在儲存后也可維持；(2)小的氣動粒度(MMADs)；(3)細小顆粒劑量值高，即粉末中粒度小于3.3微米MMAD的百分含量較高；這些特征都有助于提高粉末穿過下呼吸道的組織(即肺泡)傳送到全身循環(huán)中的能力。本發(fā)明的可吸入粉末的這些物理性質(zhì)，對于將這些粉末霧化傳送到肺部深處的效率最大化是非常重要的，將在下面更充分地描述。
本發(fā)明的干粉由能夠有效透入肺中的可霧化顆粒組成。本發(fā)明顆粒的質(zhì)量中值粒徑(MMD)小于大約20-30μm，或小于20μm，或小于大約10μm，優(yōu)選情況下小于大約7.5μm，以及更優(yōu)選情況下小于大約4μm，甚至小于大約3.5μm，通常粒徑是在0.1μm到5μm的范圍內(nèi)。優(yōu)選的粉末由MMD從大約0.2到4.0μm的微粒組成。在某些情況下，粉末也含有不可呼吸的載體微粒例如乳糖，這些不可呼吸的微粒大小一般大于大約40μm。
本發(fā)明的粉末還具有這樣的特征，其氣霧劑粒度分布的質(zhì)量中值氣動粒徑(MMAD)小于大約10μm，優(yōu)選情況下MMAD小于大約5μm，更優(yōu)選情況下小于4.0μm，在更優(yōu)選情況下甚至小于3.5μm，以及最優(yōu)選情況下小于3μm。粉末的質(zhì)量中值氣動粒徑范圍在特征上從大約0.1到10μm，優(yōu)選情況下MMAD從大約0.2到5μm，更優(yōu)選情況下MMAD從大約1.0到4.0μm，在更優(yōu)選情況下甚至從1.5到3.0μm。小的氣動粒徑一般可以通過將最適的噴霧干燥條件與賦形劑的選擇和濃度結(jié)合起來而獲得。
本發(fā)明的PEG-胰島素粉末其特征還在于它們的密度。用于吸入的粉狀組合物一般來說堆積密度從大約0.1到10g/立方厘米，優(yōu)選情況下從大約0.1到2g/立方厘米，更優(yōu)選情況下從大約0.15到1.5g/立方厘米。
粉末的水分含量一般低于大約20％重量，通常低于大約10％重量，以及在優(yōu)選情況下低于大約5％重量。本發(fā)明優(yōu)選的粉末的水分含量低于大約下列重量百分比中的一個或多個15％、10％、7％、5％或3％。這樣的低水分含量的固體在包裝和儲存時傾向于表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。
此外，在此描述的噴霧干燥方法和穩(wěn)定劑能夠有效地提供高度可分散的PEG-胰島素制劑。對于粉劑來說，這些粉末的發(fā)射劑量(ED)一般大于30％，通常大于40％。在更優(yōu)選情況下，本發(fā)明粉末的ED大于50％，并且經(jīng)常大于60％。
在此描述的組合物還具有良好的穩(wěn)定性，包括化學穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性兩方面，即經(jīng)過長時間后的氣霧劑性能。一般而言，在化學穩(wěn)定性方面，經(jīng)過噴霧干燥后，制劑中包含的PEG-胰島素結(jié)合物的降解一般不超過大約15％。也就是說，粉末將含有至少大約85％的完整的PEG-胰島素結(jié)合物，在優(yōu)選情況下至少大約90％或95％的完整的結(jié)合物，在更優(yōu)選情況下甚至含有至少大約97％或更多的完整的PEG-胰島素。在優(yōu)選情況下，噴霧干燥過程產(chǎn)生的粉末含有少于大約10％的總蛋白聚合物，也就是說，大于90％重量的化學修飾的胰島素是單體形式。
在氣霧劑性能方面，本發(fā)明的組合物其特征為，當在環(huán)境條件下儲存3個月后，發(fā)射劑量的降低一般不超過大約20％，在優(yōu)選情況下不超過大約15％，以及更優(yōu)選情況下不超過大約10％。
A.4、組合物的給藥在此描述的PEG-胰島素制劑的傳送可以使用任何合適的干粉吸入器(DPI)，即利用病人的吸氣作為運載工具將干粉藥物輸送到肺部的吸入裝置。其中優(yōu)選的是吸入Inhale Therapeutic System的干粉吸入裝置，如在Patton，J.S.等的美國專利No.5,458,135，1995年10月17日、Smith，A.E.等的美國專利No.5,740,794，1998年4月21日和Smith，A.E.等的美國專利No.5,785,049，1998年7月28日中所描述，在此引為參考。當通過這種類型的裝置給藥時，粉狀藥劑被放置在一個接受器中，該接受器具有一個可刺穿的蓋或其它可進入的表面，優(yōu)選情況下是硬質(zhì)泡沫料襯墊的包裝或盒，在接受器中可以含有單個劑量單位或多個劑量單位。在例如Parks，D.J.等的國際專利公開WO 97/41031，1997年11月6日中描述了將計量劑量的干粉藥劑填入大量空腔(即單位劑量包裝)的便利的方法，在此引為參考。
其它用于干粉肺部給藥的干粉分散裝置包括在例如Newell，R.E.等的歐洲專利No.EP 129985，1988年9月7日、Hodson，P.D.等的歐洲專利No.EP472598，1996年7月3日、Cocozza，S.等的歐洲專利No.EP467172，1994年4月6日和Lioyd，L.J.等的美國專利No.5,522,385，1996年6月4日中描述的那些，在此引為參考。其它適合于傳送PEG-胰島素干粉的吸入裝置例如Astra-Draco的“TURBUHALER”。這種類型的裝置在Virtanen，R.的美國專利No.4,668,218，1987年5月26日、Wetterlin，K.等的美國專利No.4,667,668，1987年5月26日和Wetterlin，K.等的美國專利No.4,805,811，1989年2月21日中被詳細描述，在此全部引為參考。其它適合的裝置包括干粉吸入器如Rotahaler(Glaxo)、Discus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(DuraPharmaceuticals)和Spinhaler(Fisons)。其它合適的裝置使用了一個活塞來提供空氣，既可用于夾常粉末藥劑、將空氣通過載體篩網(wǎng)從篩網(wǎng)上揚起藥劑，也可在一個混合室中將空氣與粉末藥劑混合，然后通過裝置的噴嘴將粉末導入病人，例如在Mulhauser，P.等的美國專利No.5,388,572，1997年9月30日中所描述，在此引為參考。
可吸入的PEG-胰島素組合物也可以使用一種加壓的計量劑量吸入器(MDI)來給藥，例如Ventolin計量劑量吸入器，它含有的藥物溶解或懸浮在藥物學上惰性的液體推進劑中，例如氯氟烴或氟烴，如在Laube等的美國專利No.5,320,094，1994年6月14日和Rubsamen，R.M.等的美國專利No.5,672,581(1994)中所描述，在此均引為參考。
此外，在此描述的PEG-胰島素可以溶解或懸浮在溶劑，如水或鹽水中，然后通過霧化給藥。傳送霧化溶液的噴霧器包括AERxTM(Aradigm)、Ultravent(Mallinkrodt)、Pari LC PlusTM或Pari LC StarTM(Pari GmbH，Germany)、De Vilbiss Pulmo-Aide、和Acorn II(MarquestMedical Products)。
如前所述，在此描述的PEG-胰島素結(jié)合物也可以通過靜脈內(nèi)注射，或較少情況下通過肌內(nèi)或皮下注射而腸胃外給藥。這些制劑的精確成分可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。適合于腸胃外給藥的制劑類型包括備注射的溶液、使用前與溶劑混合的干粉、備注射的懸浮液、使用前與介質(zhì)混合的不溶性干組合物、給藥前需要稀釋的乳劑或液體濃縮物。例如，本發(fā)明PEG-胰島素組合物的可注射溶液可以包括溶解于水性介質(zhì)如氯化鈉水溶液、任氏液、葡萄糖注射液、乳酸化的任氏液等中的組合物，并可以包含一種或多種上述的可藥用的相容性賦形劑或添加劑。
IV、用途本發(fā)明的組合物，當通過任何適當?shù)慕o藥途徑，優(yōu)選為吸入或注射，以治療有效量給藥到哺乳動物受試對象時，可用于治療糖尿病，特別是I型或II型糖尿病。
所有在此參考的文章、書籍、專利和其它出版物都以其全文引為參考。
下面的實施例舉例說明了本發(fā)明的范圍，但決不是打算對本發(fā)明的范圍進行限制。
實施例材料與方法聚乙二醇試劑得自Shearwater公司(Huntsville，Alabama)。
人胰島素得自Diosynthm Inc。
實施例1雙-NαA1，NεB29-t-Boc-胰島素的合成主要由單PEG化的胰島素組成的組合物按照實施例1和2所述的位點特異性方式，使用示例性線性的5,000道爾頓的聚乙二醇制備。
雙保護的胰島素首先如下述方法制備。602mg人胰島素(0.103mmol)溶解于含有166μL三乙胺的3.0mL無水二甲亞砜(DMSO)中。在胰島素溶液中加入50μL二-叔丁基-碳酸氫鹽(0.215mmol)。室溫放置60分鐘后，反應液倒入240mL丙酮中，然后加入3滴6M的HCl以起始絮凝作用。沉淀通過過濾分離，并在真空中干燥。反應產(chǎn)物使用制備型HPLC純化，使用Waters 25×100mm C18柱(平均粒度15μm，孔徑100A)。乙腈和0.1％TFA的去離子水混合物用作洗脫液，洗脫速度3.0mL/min。收集產(chǎn)物，蒸餾以除去乙腈，然后冷凍干燥。產(chǎn)量為164.8mg(26.7％，通過MALDI測定分子量約為6000)。
實施例2單PEG-化的mPEG-5K-SPA-PheB1-胰島素結(jié)合物NαB1-甲氧基聚乙二醇5K-胰島素(mPEG5K-PheB1-胰島素)的合成150mg(約0.025mmol)從實施例1得到的新純化的雙-NαA1，NεB29-t-Boc-胰島素溶解于含有95μL三乙胺的4mL DMSO中。在胰島素溶液中加入169mg(0.032mmol)mPEG-SPA-5000(m-PEG-琥珀酰亞胺基丙酸，mPEG-O-CH2CH2C(O)O-琥珀酰亞胺，分子量5000)。在室溫保溫過夜(29小時)后，得到的mPEG-胰島素衍生物用去離子水稀釋到100mL，對去離子水透析4小時，然后冷凍干燥。冷凍干燥的產(chǎn)品重新溶解在4mL無水TFA中，并在氮氣中0℃下維持1.5小時以除去Boc保護基團。去保護的mPEG-胰島素用去離子水稀釋到50mL，對0.1％NH4HCO3和去離子水透析過夜。將產(chǎn)物冷凍干燥得到白色粉末。產(chǎn)量為117.6mg(41.6％，通過MALDI測定分子量約為11311.6)。
基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)，單結(jié)合的胰島素的含量約為90％，證實了這種合成方法的位點特異性質(zhì)。其它的特征數(shù)據(jù)在實施例5中提供。得到的產(chǎn)物的胰島素含量為51.3％。為便于引用，NαB1-甲氧基聚乙二醇5K-丙酰胺基-胰島素或mPEG5K-PheB1-胰島素在本文中將被稱為“5KPEG胰島素”。
實施例3mPEG-2K-SPA-胰島素結(jié)合物的合成下列方法用于制備以非位點特異性(即隨機)方式PEG化的胰島素，使用了分子量為大約2,000道爾頓的示例的線性聚乙二醇。0.1012g胰島素(分子量5826道爾頓，0.01737mmol)溶于0.5mL無水DMSO，然后用50μL三乙胺(0.3587mmol，20倍過量的克分子數(shù))處理。在上述反應混合物中加入52mg m-SPA-2000(mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸，Shearwater公司，分子量約為2000道爾頓，0.02605mmol，1.5倍過量的克分子數(shù))?；旌衔镌谑覝睾偷獨庀聰嚢璐蠹s17小時。然后將反應混合物溶解于0.1％的TFA中，使總體積達到5.5mL，然后通過反相HPLC純化，使用C-18柱，乙腈/0.1％TFA為洗脫液。反相HPLC顯示了含有單-(結(jié)合了一個PEG)和雙-PEG化(結(jié)合了兩個PEG)的產(chǎn)物的混合物，這種組合物在本文中稱為“2K PEG胰島素”。
產(chǎn)量68mg通過RP-HPLC分析的胰島素含量50.5mg實施例4
mPEG-750Da-SPA-胰島素結(jié)合物的合成以位點特異的方式制備主要由在B1位點PEG化的胰島素組成的組合物，使用一種具有代表性的聚乙二醇改性劑，即具有適合于共價結(jié)合到胰島素上琥珀酰亞胺基丙酸末端的線性的750道爾頓的聚乙二醇。
4A、雙-NA1，NB29-t-Boc-胰島素的合成雙保護的胰島素制備如下。602mg人胰島素(0.103mmol)溶解于含有166μL三乙胺的3.0mL無水二甲亞砜(DMSO)中。在胰島素溶液中加入50μL二-叔丁基-碳酸氫鹽(0.215mmol)。室溫放置60分鐘后，反應液倒入240mL丙酮中，然后加入3滴6M的HCl以起始絮凝作用。沉淀通過過濾分離，在真空中干燥。反應產(chǎn)物使用制備型HPLC純化，使用Waters 25×100mm C18柱(平均粒度15μm，孔徑100A)。乙腈和0.1％TFA的去離子水的混合物用作洗脫液，洗脫速度3.0mL/min。收集產(chǎn)物，蒸餾以除去乙腈，然后冷凍干燥。產(chǎn)量為164.8mg(26.7％，通過MALDI測定分子量約為6000)。
4B、mPEG-750Da-SPA-PheB1-胰島素結(jié)合物的合成63.4mg(約0.01056mmol)從實施例4A得到的新純化的雙-NA1，NB29-t-Boc-胰島素溶解于含有200μL三乙胺的0.5mL DMSO中。在胰島素溶液中加入33mg(0.03137mmol，mSPA750分子量大約為1040道爾頓)mPEG-SPA-750(m-PEG-琥珀酰亞胺基丙酸，mPEG-O-CH2CH2C(O)O-琥珀酰亞胺，PEG MW 750)。室溫下保溫過夜(29小時)后，在反應混合物中加入300μL TFA，得到的mPEG-胰島素衍生物在100mL乙醚中沉淀，然后真空干燥。產(chǎn)量為大約28.5mg，通過反相HPLC測定的胰島素含量為21.3mg(33.6％，通過MALDI測定的分子量約為6639.3道爾頓)。為了簡化，該組合物在本文中稱為“750PEG胰島素”。
對這種物質(zhì)進行了兩次不同的合成，均利用前述的合成方法，只有一點例外一個合成所用的mPEG-SPA-750與胰島素的克分子比率為7∶1，而另一個合成所用的mPEG-SPA-750與胰島素的克分子比率為3∶1。從這兩種制備得到的產(chǎn)物組合物在本文中稱為“750-1 PEG胰島素”(PEG試劑與胰島素的克分子比率為7∶1)和“750-2 PEG胰島素”(PEG試劑與胰島素的克分子比率為3∶1)。
實施例5示例性PEG-胰島素組合物的鑒定使用各種分析技術(shù)對上述的PEG化的胰島素結(jié)合物組合物的性質(zhì)進行了進一步研究。
使用質(zhì)譜法根據(jù)相對峰面積對每種組合物中存在的單、雙和三-結(jié)合的胰島素(也稱為PEG胰島素單體、二聚體和三聚體)的相對量進行了評估。結(jié)果見下面的表1。
表1、根據(jù)質(zhì)譜獲得的單、雙和三-結(jié)合的胰島素的相對量
對上述的750-1、750-2和2K PEG-胰島素組合物進行孔徑排阻層析(SEC)，在Waters 2690 HPLC系統(tǒng)上使用兩個串聯(lián)裝配的ShodexSEC柱(部件號KW-802.5)。流動相由22％冰醋酸和33％乙腈(v/v)的水組成。層析數(shù)據(jù)被用作另一種確定這些組合物中每種含有的單、雙和三-結(jié)合的胰島素的相對量的方法。結(jié)果見下面的表2。對表1和表2中的數(shù)據(jù)進行比較可以看出，這兩種不同的方法在組合物中存在的每種類型結(jié)合物的相對量方面提供了近乎一致的結(jié)果。
表2、根據(jù)HP-SEC獲得的單、雙和三-結(jié)合的胰島素的相對量
進行了其它的研究來確定這三種示例組合物的每種中不同位置結(jié)合物的分布，即三個可能的結(jié)合位點A-1 Gly、B-1 PheH或B-29 Lys中的每個位置取代的程度。二硫蘇糖醇(DTT，Sigma)被用來還原胰島素樣品中的二硫鍵，致使胰島素A鏈和B鏈之間的共價結(jié)合被打破。
為進行還原反應，將PEG-胰島素樣品溶解在含有0.4M碳酸氫銨的8M尿素中，使每種結(jié)合物物種中相當?shù)囊葝u素質(zhì)量達到大約0.2mg/mL。將DTT溶解于水中(7mg/mL)形成DTT水溶液。然后在5份的每種胰島素溶液中加入1份DTT溶液，還原反應在50℃進行15分鐘。使用碘乙酰胺(Sigma)將還原的750 PEG胰島素組合物烷基化。在層析和酶解前將6份PEG-胰島素溶液與1份100mM碘乙酰胺進行反應。然后用HPLC分析反應產(chǎn)物。根據(jù)在對照樣品之后洗脫下來的胰島素A鏈或B鏈的量(歸因于和聚乙二醇結(jié)合)估計與胰島素A鏈或B鏈結(jié)合的百分數(shù)。因此對于對照而言，這些后洗脫下來的峰在預期的保留時間不會出現(xiàn)。相對峰面積被用來對聚乙二醇與胰島素A鏈或B鏈結(jié)合的百分數(shù)提供指示。
為了進一步研究PEG結(jié)合到B-29 LyS和B-1 Phe上的相對量，從上述DTT還原反應得到的還原和烷基化的750-1和750-2 PEG胰島素組合物的A鏈和B鏈被進一步使用測序級的酶——內(nèi)切蛋白酶Glu-C(Sigma)進行消化。制備含有0.125μg/μL酶的碳酸氫銨水溶液。在加入酶液之前，每種還原反應混合物在含有0.4M碳酸氫銨的8M尿素中的胰島素濃度為0.05μg/μL。然后在40份胰島素溶液中加入1份酶液。用內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化后產(chǎn)生A1-A4、A5-A17、A18-A21、B1-B13、B14-B21和B22-B30的胰島素肽段。
酶法消化750-1和750-2 PEG胰島素組合物的A鏈和B鏈得到的片段用HPLC分析以評估這些組合物每種中PEG結(jié)合到胰島素上的位點的總體分布。相對于對照沒有出現(xiàn)的峰的百分數(shù)為結(jié)合到PEG上的片段的量提供了一種評估，這是因為那個片段在層析圖上別處被洗脫下來。
表3A、示例性PEG-胰島素制劑中PEG結(jié)合位點的分布
*只是還原回收而沒有消化的數(shù)據(jù)表3A的數(shù)字是基于每個位點被百分之百結(jié)合的概率。例如，每個單結(jié)合物種有三種可能的構(gòu)型(單-A1、單-B1和單-B-29)，每個雙結(jié)合物也有三種構(gòu)型(雙-A1，B-1、雙-A1，B-29和雙-B1，B29)。查看表3A中的數(shù)據(jù)，例如，對于PEG-750-1，在組合物中存在的所有可能的物種中，95％的PEG-胰島素結(jié)合物具有一個共價結(jié)合在B-1位點上的聚乙二醇。
表3B、各種可能的結(jié)合物物種
實施例6
酶法消化750-2 PEG胰島素與未修飾胰島素速率的比較對750-2 PEG胰島素與胰島素被胰凝乳蛋白酶酶法消化的速率進行了比較。
制備1mg/mL胰島素對照和PEG 750胰島素-2組合物的pH7.8的磷酸鹽緩沖液。制備1mg/mL胰凝乳蛋白酶的1mM鹽酸溶液。在20份胰島素溶液中加入1份酶液。大約每個小時從混合液中取出少量等份樣品。
開發(fā)了一種RP(反相)-HPLC方法，使用C-18柱，流動相含有高氯酸鈉、磷酸和乙腈。使用乙腈梯度來分級洗脫PEG化的胰島素物種，在214nm處檢測得到一組略微可分辨的峰。這組峰被手動積分為一個峰并標記為PEG胰島素。在消化的進程中，將完整的PEG胰島素和胰島素的減少作圖(圖1)。它們在存在胰凝乳蛋白酶時的半衰期得以估算。
酶法消化一半濃度的750-2 PEG胰島素組合物的主要成分所需的時間是未修飾的胰島素所需時間的5倍長。也就是說，與常規(guī)的胰島素相比，用胰凝乳蛋白酶消化一半濃度的圖示的PEG化的胰島素要花5倍長的時間。這些結(jié)果表明，與未修飾胰島素相比，由于增強了對蛋白水解作用的抗性，PEG胰島素結(jié)合物在肺泡中具有延長駐留時間的潛力。
實施例7在大鼠中靜脈內(nèi)給藥5K PEG胰島素后血清葡萄糖和胰島素濃度的評估(P-2001-015)實施這個研究是為了確定5K PEG胰島素組合物中的胰島素在經(jīng)過用示例的5K聚乙二醇鏈進行化學修飾后，其活性是否還予以保留，同時為了探索這些組合物在靜脈內(nèi)給藥時的劑量和葡萄糖反應曲線。
露出頸背、皮下有螺紋接入口的預插導管的(位于頸/股骨靜脈[JVC/FVC])雄性Sprague Dawley大鼠由Hilltop Lab Animal Inc.提供(P.O.Box 183，Scottdale，PA15683)。頸靜脈插管用藥物級的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-分子量40000)、生理鹽水和肝素鈉的溶液(管腔填充物)填充以保持開放。在研究當天，取出密封插管的尼龍纖維塞，用Monoiect鈍導管23Gx1(VWR#53498-484)代替。試驗系統(tǒng)包括1只隨機選取的雄性大鼠用于安慰劑組，2只隨機選取的雄性大鼠用于非PEG化的組，以及4只隨機選取的雄性大鼠用于PEG-胰島素組。用于本研究的PEG化胰島素來自實施例2的5K PEG胰島素。劑量通過靜脈內(nèi)給藥。
動物的數(shù)量/性別第一天對于安慰劑組1，每組1只雄性大鼠對于組2，每組2只雄性大鼠；對于組3-5，每組4只雄性大鼠在開始研究前，動物被禁食12-18小時。人胰島素(Diosynth)在使用前儲存于-20℃。5K PEG胰島素(實施例2)在使用前儲存于-20℃。制備兩種不同的用于給藥的溶液用于靜脈內(nèi)給藥的溶液非PEG化的人胰島素(1.0mg/mL儲液)在1.0mL PBS中加入1.0mg胰島素粉末。
5K PEG胰島素(1.0mg/mL人胰島素，濃度基于胰島素而不是結(jié)合物)在6.0mL PBS中加入11.7mg 5K PEG胰島素粉末。
通過吸入異氟烷(isoflurane)麻醉動物。通過FVC給予靜脈內(nèi)劑量(每只動物300μL)，然后將導管結(jié)扎以消除與抽取血液的交叉污染。所有的血樣通過JVC抽取。磷酸鹽緩沖液(PBS)以300μL的劑量靜脈內(nèi)給藥到組1。非PEG化的人胰島素以每只動物20μg的劑量靜脈內(nèi)給藥到組2。PEG化的人胰島素以每只動物20μg的劑量靜脈內(nèi)給藥到組3，以每只動物40μg的劑量靜脈內(nèi)給藥到組4，以及以每只動物30μg的劑量靜脈內(nèi)給藥到組5。在給藥前(給藥前2到2.5小時)、給藥后10、15、30、60、120和180分鐘從JVC收集血樣(約500μL)。將少量血液置于葡萄糖試紙上，通過Glucometer Elite葡萄糖檢測儀(Bayer Corp.，Elkart，IN)測定血糖。將剩余的樣品放入血清分離管中，置于離心機中分離血液。然后將血清倒入另一個試管中，通過放射免疫分析方法(RIA)進行分析。使用MicrosoftExcel 2000計算平均值和標準偏差(SD)。
表4、體內(nèi)實驗概要下面是實際的給藥劑量和每組實際使用的動物數(shù)。研究在一天內(nèi)完成。
結(jié)果表明5K PEG胰島素組合物具有生物活性，即胰島素分子經(jīng)過聚乙二醇修飾后保留了活性，這從它降低血糖的能力可以看出。靜脈內(nèi)給藥PEG化的胰島素后，血清中的平均胰島素濃度是劑量依賴的，同時也觀察到了劑量依賴性的葡萄糖水平的降低。結(jié)果總結(jié)于圖2和圖3中。圖2是靜脈內(nèi)給藥圖示的PEG化與非PEG化的胰島素的組合物后血清中的平均胰島素濃度圖；圖3是靜脈內(nèi)給藥上述的組合物后的血糖濃度圖。
實施例85K PEG胰島素的肺部給藥(P-2001-017)通過氣管內(nèi)給藥，將一種示例的PEG化的胰島素——5K PEG胰島素給藥至大鼠，以確定(1)當給藥到肺部后它的活性是否還維持，以及(2)如果有的話，當直接給藥到肺部時它對血清胰島素和血糖濃度的影響。
儲存液非PEG化的胰島素將1mL PBS加到1.0mg胰島素粉末中以制備1mg/mL儲存液。胰島素(對照)的儲存液在研究開始的當天配制。
5K PEG胰島素將4.0mL PBS加到7.8mg 5K PEG胰島素粉末中以制備1mg/mL(基于胰島素)的儲存液。
用藥溶液每只動物40μg胰島素在用藥2小時內(nèi)，將667μg胰島素儲存液加到4.33mL PBS中。
每只動物150μg胰島素B-1在用藥2小時內(nèi)，將2.5mL 5K PEG胰島素儲存液加到2.5mL PBS中。
氣管內(nèi)滴注在一個樹脂玻璃麻醉室中令大鼠吸入與氧氣混合的3.0-5.0％異氟烷(Abbott Laboratories)大約5分鐘以將大鼠輕微麻醉。將安裝在1mL注射器上的灌食針(Popper & Sons Inc.；18×3”W2-1/4mm ball，NewHyde Park，NY 11040)插入大鼠的嘴中，向下達到剛好位于主龍骨突上方的氣管以完成給藥。在將灌食針插入氣管時，使用灌食針的球通過感覺咽喉皮膚下的軟骨環(huán)的粗糙程度來確定插入是否合適。利用這種方法將劑量給藥到肺中，然后拔出灌食針。
在這項研究中使用了14只(每組7只)內(nèi)部帶有頸靜脈導管(JVC)的禁食的雄性大鼠(Hilltop Lab Animal，Scottsdale，PA(300-350g))。非PEG化的人胰島素以40μg/300μL的劑量氣管內(nèi)給藥到組1。PEG化的人胰島素制劑以150μg/300μL的劑量氣管內(nèi)給藥到組2。在給藥前(給藥前2到0.25小時)、給藥后15、30、60、120、240、360、480和720分鐘收集血樣(約500μL)。將少量血液置于葡萄糖試紙上，通過Glucometer Elite葡萄糖檢測儀(Bayer Corp.，Elkart，IN)測定血糖。將剩余的樣品放入血清分離管中，通過放射免疫分析方法進行分析。使用MicrosoftExcel 2000計算平均值和標準偏差(SD)。由于導管堵塞，動物2和3從研究中舍棄。
表5、大鼠體內(nèi)實驗總結(jié)下面是實際的給藥劑量和每組實際使用的動物數(shù)。
表6、體內(nèi)劑量水平
對氣管內(nèi)給藥后胰島素和5K PEG胰島素在血清和血液中的平均濃度進行作圖，分別顯示在圖4和圖5中。結(jié)果表明本發(fā)明的PEG化的胰島素組合物在傳送肺部和留在肺中時具有活性。藥代動力學數(shù)據(jù)進一步證明，PEG化的胰島素不僅通過肺進入了血液循環(huán)，而且同時維持了活性，正如在血清中可檢測到的對應于非內(nèi)源胰島素的胰島素水平所表明的那樣。根據(jù)在氣管內(nèi)給藥后大約1小時內(nèi)觀察到的血液中的胰島素水平判斷，似乎PEG化的胰島素基本上不在肺中停留，在給藥后很短的時間內(nèi)就穿過肺部進入血流。結(jié)果還表明，PEG化的胰島素，當通過肺部給藥時，能有效降低血糖。然而，在本實施例中，PEG化的胰島素與非PEG化的胰島素相比，在所給藥的劑量在降低血糖方面似乎有效性較低。氣管內(nèi)給藥PEG化的胰島素的藥代動力學和藥效學反應曲線與非PEG化的胰島素有某種程度的相似之處，盡管根據(jù)圖4的曲線，PEG-胰島素的作用時間顯得比非PEG化的胰島素長?；谠诖颂峁┑闹笇г瓌t，并根據(jù)一個特定化學修飾的胰島素產(chǎn)物的用藥需求、目標病人的種群、要治療的病癥等，一個本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地完成對用藥劑量和具體的聚乙二醇修飾劑的進一步優(yōu)化。
實施例9750-1 PEG胰島素的肺部給藥(P-2001-025)通過氣管內(nèi)給藥，將一種代表性的PEG化胰島素——750-1-PEG胰島素給藥至大鼠。開展本研究部分是為了研究共價結(jié)合了一個或多個分子量大約為1000道爾頓或以下的聚乙二醇鏈的胰島素組合物當其傳送至肺部時的效果。
大鼠的體內(nèi)研究基本上如前面實施例8中所述的那樣進行。其后精確的用藥方案和給藥劑量在下面的表中概述。
表7
表8
對胰島素和750-1 PEG胰島素在大鼠中氣管內(nèi)給藥后的血清胰島素和血糖濃度進行作圖，分別顯示在圖6和圖7中。從圖6中的平均血清胰島素濃度圖可以看到，天然或非PEG化的胰島素在大約15分鐘時達到最高的血清濃度，而PEG化的胰島素組合物在大約6小時(每只動物100μg)和8小時(每只動物300μg)達到最高的血清濃度，證明了這些組合物在通過吸入給藥到肺部時的長效性質(zhì)。從圖6可以看出，未修飾的胰島素在給藥后大約6小時回到基線，而PEG化的胰島素在6小時時的胰島素水平仍顯著高于基線(高于基線值大約3到7倍或更高)。此外，氣管內(nèi)給藥PEG化的胰島素使全身的胰島素水平甚至在給藥后12個小時仍然維持而不回到基線。事實上，PEG化胰島素的胰島素水平在8小時和12小時時是基線值(即未修飾胰島素的值)的3倍以上。這些結(jié)果的圖在圖6中顯示。
總而言之，當肺部給藥時，750-1 PEG胰島素與未修飾的胰島素相比產(chǎn)生了更高的全身性胰島素水平。此外，PEG化的胰島素組的全身性胰島素水平即使在12小時時仍然顯著高于基線。也就是說，PEG化的胰島素組升高的胰島素水平的維持時間至少2倍長于未修飾胰島素。這個數(shù)據(jù)進一步證明PEG化的胰島素穿過肺部后仍具有生物活性，并且與未修飾胰島素相比提供了時間延長的全身胰島素水平。
圖7提供了氣管內(nèi)給藥非PEG化和750-1 PEG化的胰島素后平均血糖濃度圖。對于PEG化胰島素組來說，血糖反應水平與血清胰島素水平關(guān)聯(lián)性很好。(也就是說，在血清胰島素水平升高時，同時也觀察到相應的血糖的抑制/降低。)從圖7可以看出，本發(fā)明的PEG化胰島素化合物當口服給藥到肺部時，與天然胰島素相比表現(xiàn)出快速的起效，而不是許多緩釋制劑通常表現(xiàn)的延遲的起效。也就是說，對葡萄糖的抑制在給藥后很快發(fā)生。此外，天然或非PEG化的胰島素在大約2小時內(nèi)達到最大的葡萄糖降低，而PEG化的胰島素在使用500μg、100μg和300μg劑量后達到最大的葡萄糖降低的時間分別延長到至少4小時、6小時和8小時。所以，PEG化胰島素當肺部給藥時，達到最大葡萄糖降低的時間比非PEG化的胰島素延長了2到4倍?？偟膩碚f，750-1 PEG胰島素與未修飾胰島素相比，其葡萄糖抑制顯著地增加了超過12個小時的時間。在8小時時，未修飾胰島素組的葡萄糖水平已經(jīng)基本上恢復正常，而PEG胰島素組的葡萄糖水平比未修飾胰島素組低1.3到3倍。PEG化的胰島素組的葡萄糖水平甚至在12小時時仍未恢復到基線，這進一步表明本發(fā)明的化學衍生的胰島素組合物具有延長的葡萄糖抑制能力。
實施例10750-1 PEG胰島素的肺部給藥(P-2002-001)在與上述實施例9相似的研究中，以比實施例9中使用的劑量低的劑量通過氣管內(nèi)給藥方式將750-1 PEG胰島素給藥至大鼠。
體內(nèi)氣管內(nèi)大鼠的研究基本上如前面實施例8中所述的那樣進行。精確的用藥方案和給藥劑量在下面的表中概述。
表9
表10
對未修飾胰島素和750-1 PEG胰島素在大鼠中氣管內(nèi)給藥后的血清胰島素和血糖濃度進行作圖，結(jié)果分別顯示在圖8和圖9中。從圖8中的平均血清胰島素濃度圖可以看到，天然或非PEG化的胰島素在大約15分鐘時達到最高的血清濃度，而PEG化的胰島素組合物在2小時(每只動物80μg)和6小時(每只動物160μg)達到最高的血清濃度。也就是說，當通過肺部給藥到全身循環(huán)中時，PEG修飾的胰島素達到最大血清胰島素濃度的時間比天然或非PEG化胰島素延長了8到24小時。從圖8可以看出，未修飾的胰島素在給藥后大約12小時回到基線，而PEG化的胰島素組在同樣的12小時時間點其胰島素水平是基線值的2.5到3.5倍。PEG化胰島素組的胰島素水平直到大約25小時才回到基線，這意味著與未修飾胰島素組相比，PEG化胰島素組回到基線要花兩倍長的時間。對于PEG花胰島素組，全身的胰島素水平維持的時間大約為未修飾胰島素組的兩倍(25小時對12小時)。在長達大約6小時時間點，兩個PEG化胰島素組的胰島素水平與給藥的劑量基本相對應(也就是說，每只動物160μg的組的胰島素濃度大約為每只動物80μg的組的兩倍)。
圖9提供了氣管內(nèi)給藥非PEG化和750-1 PEG化的胰島素后平均血糖濃度圖。在給藥后25小時時，兩個PEG化胰島素組的葡萄糖抑制仍然沒有回到基線，這與未修飾胰島素組相反。與實施例9的結(jié)果相似，PEG化胰島素組的總體情況證明葡萄糖抑制的持續(xù)時間延長到25小時以上。在8小時時，未修飾胰島素組的葡萄糖水平已經(jīng)接近恢復正常，而PEG胰島素組的葡萄糖水平比未修飾胰島素組低大約1.5倍。這些結(jié)果進一步表明具有一個或多個聚乙二醇部分的修飾的胰島素產(chǎn)生了穿過肺部的良好的生物有效度，以及延長的全身性胰島素水平和葡萄糖抑制。
實施例11肺部給藥750-2 PEG胰島素(P-2002-003)
通過氣管內(nèi)給藥，將一種代表性的PEG化的胰島素組合物——750-2-PEG胰島素給藥至大鼠。進行本研究是為了進一步探索不同劑量的PEG化與非PEG化的胰島素當直接肺部給藥時的效果。PEG化和非PEG化形式的胰島素以每只動物80μg胰島素的劑量給藥動物。體內(nèi)大鼠的研究基本上如前面實施例8中所述的那樣進行。其后精確的用藥方案和給藥劑量在下面的表中概述。
表11
表12
圖10顯示了非PEG化胰島素和750-2 PEG胰島素以每只動物80μg的劑量氣管內(nèi)滴注后平均血清胰島素濃度圖。圖11顯示了非PEG化胰島素和750-2 PEG胰島素以每只動物80μg的劑量氣管內(nèi)滴注后平均的血糖濃度圖。結(jié)果與實施例9和10中獲得的結(jié)果相似。
下面提供了實施例10和11的藥代動力學參數(shù)列表。生物有效度是絕對生物有效度(即與靜脈內(nèi)給藥胰島素相比)。
表13、平均血清胰島素藥代動力學
*異常值沒有從數(shù)據(jù)組中除去。
**相對于靜脈內(nèi)每只動物20μg的劑量。除去異常值后的值為22％***相對于靜脈內(nèi)每只動物30μg的劑量。除去異常值后的值沒有變化絕對生物有效度計算如下
實施例12肺部給藥2K PEG胰島素(P-2002-010)通過氣管內(nèi)給藥，將另一種示例性PEG化胰島素組合物——2KPEG胰島素給藥至大鼠。用于本研究的2K PEG胰島素的制備在實施例3中描述。非PEG化胰島素以每只動物80μg胰島素的劑量給藥動物。2K PEG胰島素以每只動物300μg、600μg、900μg、1200μg胰島素的劑量給藥動物。體內(nèi)大鼠的研究基本上如前面實施例8中所述的那樣進行。其后精確的用藥方案和給藥劑量在下面的表中概述。
表14
表15
圖12顯示了氣管內(nèi)給藥后平均的血糖濃度圖。PEG化胰島素組合物在肺部給藥時觀察到良好的劑量反應(即較高的2K PEG胰島素劑量導致血糖濃度降低得更多)。盡管對于PEG化和非PEG化的組合物來說，曲線中達到最大葡萄糖抑制的時間點都顯示為大約3小時，但PEG化與非PEG化胰島素的圖形在葡萄糖抑制的持續(xù)時間方面有顯著差異。具體來說，對于大約6小時以后的時間點，在三個較高的2K PEG化胰島素劑量(每只動物600μg、900μg和1200μg)處，葡萄糖水平受到抑制，顯著低于非PEG化胰島素。這些結(jié)果進一步證明，通過肺部給藥PEG化的胰島素可以達到延長的全身性效果。
實施例13大鼠中靜脈內(nèi)給藥2K PEG胰島素后血清葡萄糖和胰島素濃度的評估(P-2002-009)進行本研究是為了進一步探索在一個示例2K PEG胰島素組合物中胰島素的活性，以及為了確定能夠?qū)⒀怯行Ы档偷酱蠹s30到40mg/dL濃度的PEG化人胰島素(PEG 2K-1)的靜脈內(nèi)(i.v.)使用劑量。
使用下表中概括的組合物、動物組和劑量，按照與實施例7中描述的相似的步驟進行實驗。
表16
表15
圖13顯示了以每只動物20μg(非PEG化胰島素)和每只動物20、30和40μg(2K PEG胰島素)劑量將非PEG化的胰島素和2K PEG胰島素靜脈內(nèi)給藥后平均血清胰島素濃度圖。圖14顯示了以上述劑量將非PEG化的胰島素和2K PEG胰島素靜脈內(nèi)給藥后平均的血糖濃度圖。
權(quán)利要求
1.一種用于肺部給藥的胰島素組合物，所述組合物含有胰島素與一個或多個非天然存在的親水聚合物的分子共價結(jié)合所形成的結(jié)合物。
2.權(quán)利要求1所述的胰島素組合物，其中所述結(jié)合物不含親脂部分。
3.權(quán)利要求1中的胰島素組合物，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚亞烷基二醇。
4.權(quán)利要求1中的胰島素組合物，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚乙二醇。
5.權(quán)利要求2中的胰島素組合物，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚乙二醇。
6.權(quán)利要求4所述的組合物，其特征為絕對肺部生物有效度高于天然胰島素。
7.權(quán)利要求6所述的組合物，其特征為絕對肺部生物有效度為天然胰島素的至少兩倍。
8.權(quán)利要求4所述的組合物，其特征為絕對肺部生物有效度大于15％。
9.權(quán)利要求8所述的組合物，其特征為絕對肺部生物有效度大于30％。
10.權(quán)利要求4所述的組合物，當給藥到肺部時，其特征為Tmax至少為天然胰島素的3倍。
11.權(quán)利要求10所述的組合物，當給藥到肺部時，其特征為Tmax至少為天然胰島素的5倍。
12.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述聚乙二醇是末端封閉的。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述聚乙二醇被一個烷氧基團末端封閉。
14.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述聚乙二醇選自線性聚乙二醇、分支聚乙二醇、分叉聚乙二醇和啞鈴狀聚乙二醇。
15.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述聚乙二醇含有一個可生物降解的鍵。
16.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述聚乙二醇含有(OCH2CH2)亞基的數(shù)量選自從大約2到300個亞基、從大約4到200個亞基以及從大約10到100個亞基。
17.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約10,000道爾頓。
18.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述聚乙二醇是線性的。
19.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約5,000道爾頓。
20.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約2,000道爾頓。
21.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約1,000道爾頓。
22.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述胰島素是天然胰島素。
23.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述結(jié)合物的純度大于90％。
24.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述胰島素在其一個或多個氨基位點上與聚乙二醇共價結(jié)合。
25.權(quán)利要求24所述的組合物，其中胰島素上至少大約75％的B-1 Phe位點與聚乙二醇共價結(jié)合。
26.權(quán)利要求25所述的組合物，其中胰島素上至少大約90％的B-1 Phe位點與聚乙二醇共價結(jié)合。
27.權(quán)利要求24所述的組合物，其含有單體和二聚體胰島素結(jié)合物的混合物。
28.權(quán)利要求27所述的組合物，其還含有三聚體胰島素結(jié)合物。
29.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述胰島素通過位于聚乙二醇一端的連接部分與所述聚乙二醇共價結(jié)合。
30.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述聚乙二醇在與胰島素結(jié)合前，在其一端具有適合與胰島素共價結(jié)合的活化的連接部分。
31.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述活化的連接部分適合與反應性胰島素氨基基團結(jié)合。
32.權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述活化的連接部分含有的反應性官能團選自N-羥基琥珀酰亞胺活性酯、活性碳酸酯、醛和縮醛。
33.權(quán)利要求29所述的組合物，其中胰島素通過一個酰胺鍵與聚乙二醇共價結(jié)合。
34.權(quán)利要求4所述的組合物，以霧化形式存在。
35.權(quán)利要求4所述的組合物，以液體或干燥形式存在。
36.權(quán)利要求4所述的組合物，進一步含有可藥用的賦形劑。
37.權(quán)利要求4所述的組合物，以噴霧干燥的形式存在。
38.一種將胰島素傳送到需要它的哺乳動物受試對象中的方法，所述方法包括將權(quán)利要求4所述的胰島素組合物霧化，以及通過吸入給藥所述霧化的胰島素組合物，用于沉積在所述受試對象的肺部并通過肺部吸收。
39.一種提供基本上非免疫原性的胰島素組合物的方法，所述組合物用于給藥到需要它的受試對象的肺部，所述方法包括將胰島素與一個或多個非天然存在的親水聚合物的分子共價結(jié)合以提供含有胰島素-親水聚合物結(jié)合物的組合物，以及通過吸入將所述組合物給藥到需要它的受試對象的肺部，所述給藥的結(jié)果是所述胰島素通過肺部進入到血液循環(huán)中。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚亞烷基二醇。
41.一種用于提供長效胰島素組合物的方法，所述組合物用于給藥到需要它的受試對象的肺部，所述方法包括將胰島素與一個或多個非天然存在的親水聚合物的分子共價結(jié)合以提供含有胰島素-親水聚合物結(jié)合物的組合物，通過吸入將所述組合物給藥到需要它的受試對象的肺部，所述給藥的結(jié)果是(1)所述胰島素通過肺部進入到血液循環(huán)中，以及(2)血液中胰島素水平的升高在給藥后維持至少8小時。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚亞烷基二醇。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述非天然存在的親水聚合物是聚乙二醇。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中胰島素水平的升高在給藥后維持至少10小時。
45.權(quán)利要求43所述的方法，其中胰島素水平的升高在給藥后維持至少12小時。
46.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述給藥的結(jié)果還有所述受試對象中的葡萄糖水平在給藥后被抑制至少10小時。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述給藥的結(jié)果還有所述受試對象中的葡萄糖水平在給藥后被抑制至少12小時。
48.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述給藥步驟包括以霧化形式給藥所述組合物。
49.權(quán)利要求43所述的方法，還包括在給藥前霧化所述組合物的步驟。
50.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合步驟包括以位點特異的方式將胰島素與聚乙二醇共價結(jié)合。
51.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合步驟包括以隨機的方式將胰島素與聚乙二醇共價結(jié)合。
52.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合物在肺部給藥時，其特征還在于其絕對生物有效度高于天然胰島素。
53.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合步驟包括將胰島素與一個或多個末端封閉的聚乙二醇分子共價結(jié)合。
54.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合步驟包括將胰島素與一個或多個聚乙二醇的分子共價結(jié)合，所述聚乙二醇選自線性、分支、分叉和啞鈴狀的聚乙二醇。
55.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合物不含親脂部分。
56.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述組合物不含親脂成分。
57.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合步驟包括將胰島素與一個或多個含有可生物降解的鍵的聚乙二醇的分子共價結(jié)合。
58.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇含有的(OCH2CH2)亞基的數(shù)量選自從大約2到300個亞基、從大約4到200個亞基以及從大約10到100個亞基。
59.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約10,000道爾頓。
60.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約5,000道爾頓。
61.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約2,000道爾頓。
62.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇具有的名義平均分子量為從大約200到大約1,000道爾頓。
63.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合包括將聚乙二醇結(jié)合到胰島素的一個或多個反應性氨基位點上。
64.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述聚乙二醇通過選自酰胺、氨基甲酸乙酯和亞甲基氨基的鍵結(jié)合到胰島素的一個或多個反應性氨基位點上。
65.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述結(jié)合包括將具有選自N-羥基琥珀酰亞胺活性酯、活性碳酸酯、醛和縮醛的末端反應基的聚乙二醇與胰島素上的一個或多個反應性氨基位點進行反應。
66.權(quán)利要求43所述的方法，其中在所述結(jié)合產(chǎn)生的組合物中胰島素上至少大約75％的B-1 Phe位點與聚乙二醇共價結(jié)合。
67.權(quán)利要求43所述的方法，其中在所述結(jié)合產(chǎn)生的組合物中胰島素上至少大約90％的B-1 Phe位點與聚乙二醇共價結(jié)合。
68.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述結(jié)合產(chǎn)生的組合物含有單體和二聚體胰島素結(jié)合物的混合物。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述結(jié)合產(chǎn)生的組合物還含有三聚體胰島素的結(jié)合物。
70.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述聚乙二醇在一端含有適合與胰島素共價結(jié)合的活化的連接部分。
71.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述活化的連接部分含有選自N-羥基琥珀酰亞胺活性酯、活性碳酸酯、醛和縮醛的反應性官能團。
72.權(quán)利要求70所述的方法，其中所述結(jié)合部分的長度從大約2個到大約20個原子。
73.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述給藥步驟包括通過干粉吸入器給藥所述組合物。
74.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述給藥步驟包括通過計量的劑量吸入器給藥所述組合物。
75.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述給藥步驟包括通過噴霧器給藥所述組合物。
76.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述組合物還包括可藥用的賦形劑。
77.權(quán)利要求43所述的方法，其中給藥所述結(jié)合物組合物的結(jié)果是，在給藥后1小時內(nèi)，血清中的胰島素水平就達到比基礎(chǔ)水平高至少2倍。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有活性的親水聚合物修飾的胰島素衍生物。本發(fā)明的胰島素衍生物，從一方面說，適合于傳送到肺部，并且與天然胰島素相比，表現(xiàn)出顯著改進的藥代動力學和/或藥效特性。
文檔編號A61K38/28GK1582171SQ02810355
公開日2005年2月16日 申請日期2002年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月21日
發(fā)明者約翰·S·巴頓, 郭美彰, J·米爾頓·哈里斯, 切斯特·利奇, 金佰利·佩爾金斯, 布萊因·比歇 申請人:耐科塔醫(yī)藥公司, 阿拉巴馬耐科塔醫(yī)藥公司