作為中性白細胞存活和激活因子的中鏈長度的脂肪酸、甘油酯和類似物的制作方法

專利名稱：作為中性白細胞存活和激活因子的中鏈長度的脂肪酸、甘油酯和類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及中性白細胞減少的預防和/或治療方法。該方法包括治療與使用化療和放療有關的中性白細胞減少和治療因感染、血液病和營養缺乏導致的中性白細胞減少。本發明還一般涉及降低藥物毒性和提高藥物功效。本發明特別涉及中鏈長度的脂肪酸、諸如癸酸、辛酸或其鹽和甘油三酯或其甘油單酯和甘油二酯或其它類似物作為中性白細胞存活和激活因子或骨髓干細胞增殖因子的應用。
背景技術：
化療指的是諸如但不限于環磷酰胺、阿霉素、道諾紅菌素、長春花堿、長春花新堿、博來霉素、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、泰索帝、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他濱、順鉑、卡鉑或苯丁酸氮芥這樣的細胞毒性劑在根除癌細胞和腫瘤中的應用。然而，這些活性劑是非特異性的且它們特別在高劑量下對正常和快速分裂的細胞具有毒性。這一結果通常在進行化療和放療的患者中產生各種副作用。骨髓中血細胞產生嚴重下降的骨髓抑制是這類副作用之一。其特征在于白細胞減少、中性白細胞減少和血小板減少。重度慢性中性白細胞減少(惡性中性白細胞減少癥、周期性中性粒細胞減少癥癥和先天性中性白細胞減少癥)的特征還在于循環的中性白細胞數量選擇性下降且對細菌感染的敏感性增強。
使用化療藥治療癌癥的實質在于將細胞毒性機制與對宿主細胞中高度增殖的腫瘤細胞的選擇性機制合并。然而，對化療藥而言難以具有這類選擇性。化療劑的細胞毒性限制了給藥劑量、影響了治療周期且嚴重危害了腫瘤患者的生命質量。
盡管還可能對其它正常組織產生不良影響，但是骨髓對諸如化療和放療這樣的增殖特異性治療特別敏感。急性和慢性骨髓毒性是導致血細胞計數下降和貧血、白細胞減少、中性白細胞減少、粒細胞缺乏癥和血小板減少的癌癥療法中的常見副作用。這類副作用的一個原因是由細胞毒性劑和放射對造血細胞(例如多能干細胞和其它祖細胞)的致命作用和由多成熟髓室缺失誘導的負反饋機制引起的干細胞分化所導致的造血細胞數量下降。第二個原因是干細胞自我更新的能力下降，它還涉及直接(突變)和間接(干細胞群老化)作用。(Tubiana，M.等，《放療和腫瘤學》(Radiotherapy and Oncology)291-17，1993)。因此，癌癥的治療通常導致多形核中性粒細胞(PMN)或中性白細胞減少。PMN是防御侵入病原體的第一道防線且在急性炎癥過程中起關鍵作用，起主要功能是吞噬和殺傷感染病原體。為了完成這一作用，PMN脫離循環作為對趨化因子的反應進入受侵害區域以發揮其生物功能。在表現出正常血細胞計數的個體中，中性白細胞約占總白細胞的60％。(SI Units Conversion Guide，66-67(1992)，《新英格蘭藥物雜志書》(New England Journal of Medicine Books))。然而，多達三分之一的接受癌癥化療的患者可以患有中性白細胞減少。健康成年人的平均正常白細胞計數約為4400個細胞/μL，范圍在1800-7700個細胞/μL。計數為1,000個細胞-500個細胞/μL屬于中度白細胞減少，而計數為500個細胞/μL或500個細胞/μL以下屬于重度白細胞減少。處于骨髓抑制狀態的患者易受感染且通常患有血液凝固障礙而需要住院。中性白細胞和血小板缺乏是癌癥治療后發病率和死亡率的主要原因且導致癌癥療法的高成本。在上述這些情況中，能夠抑制中性白細胞編程性細胞死亡或刺激中性白細胞活化和轉移的任意活性劑的應用可能具有治療價值。化療后恢復患者免疫系統的努力包括使用造血生長因子刺激剩余的干細胞增殖并分化成成熟的抗感染細胞。
在骨髓移植過程中，利用稱作″轉移″的現象從外周血液中募集較大數量的干細胞/祖細胞。這種方法通常用于自體或同種異體骨髓移植。生長因子用于增加重度骨髓抑制療法和輸注先祖干細胞前募集的外周先祖干細胞的數量。
骨髓移植療法后也可能遇到中性白細胞減少。然而，這些治療需要10-15天的治療期，在此期間患者易受感染。能夠刺激骨髓干細胞的活性劑可以有利于和加速干細胞移入，由此縮短骨髓移植后的中性白細胞減少的時限。
盡管諸如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)這樣的造血生長因子可以發揮這類作用，但是其應用因它們必須通過重組技術產生而成本昂貴。這類治療后起改善作用的療法并非必不可少，條件是″化學保護″患者不受免疫抑制。
因此，對減少因化療和放療誘發的骨髓抑制狀態的不需要的副作用的新組合物和方法存在需求。
發明概述本發明通過提供刺激包括人的哺乳動物體內造血系統的新方法而滿足了對化學保護劑的需求。本發明還提供了化療和放療中的骨髓抑制作用的新治療方法，而在任意其它情況中，對造血系統的刺激可能具有價值，諸如、但不限于骨髓移植和慢性中性白細胞減少以及因感染、血液病和營養缺乏導致的中性白細胞減少。該方法有助于進行這類治療的患者的造血系統抵抗骨髓抑制、增加中性白細胞存活和活化。
按照本方法，對哺乳動物、特別是人給予在藥物上可接受載體中含有一種或多種中鏈長度脂肪酸、諸如癸酸、辛酸或其鹽或其甘油三酯或甘油單酯或甘油二酯或其它類似物的組合物，其用量可有效預防或治療中性白細胞減少，諸如減少化療和放療的副作用和治療因感染、血液病和營養缺乏導致的中性白細胞減少。
因此，本發明的一個目的是提供使用癸酸、辛酸、月桂酸或其金屬鹽(鈉、鉀、鈣、鎂)或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物生產化學保護藥物組合物作為單一活性劑或作為兩種或多種活性劑與和/或不與其它化療劑或誘發骨髓抑制狀態的這類藥物的組合的組合物。
本發明的另一個目的涉及癸酸、辛酸或其鈉鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或相關化合物作為造血刺激因子的應用。
此外，本發明包括含有癸酸、辛酸或其鈉鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物的組合物和這類化合物在治療骨髓抑制和隨后的免疫抑制中的應用。
本發明的一個目的還涉及癸酸、辛酸或其鈉鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物在治療患有重度慢性中性白細胞減少的患者中的應用。
本發明的另一個目的涉及癸酸、辛酸或其鈉鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物作為中性白細胞存活和激活因子的應用。
本發明還涉及癸酸、辛酸或其鈉鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物在中性白細胞轉移可以在諸如自體或同種異體骨髓移植中具有治療價值的疾病中的應用。
本發明的一個目的是對包括人的哺乳動物提供有效化學保護的方法。
本發明的另一個目的是提供有效增加對包括人的哺乳動物化療和放療的有效性的方法。
本發明的另一個目的是提供實現更好的治療有益效果而同時避免副作用增加所并必不可少的常用劑量、乃至增加劑量的化療組合物的使用方法。
本發明的另一個目的是提供有效減少或消除化療誘發的包括人的哺乳動物體內中性白細胞減少的方法。
本發明的另一個目的是提供用于因血液病、諸如慢性特發性中性白細胞減少癥、周期性中性粒細胞減少癥癥、懶惰白細胞綜合征、切迪阿克-東綜合征白血病和再生障礙性貧血而導致的中性白細胞減少的治療方法。
本發明的另一個目的是提供因感染、諸如病毒(例如HIV、麻疹、肝炎、黃熱病、單核細胞增多癥)和細菌(例如傷寒、副傷寒、布氏菌病)感染而導致的中性白細胞減少的治療方法。
最后，本發明的另一個目的是提供使接受者副作用減少到最低限度或沒有副作用的方法。
在綜述所公開實施方案的詳細描述和帶審權利要求后顯然可以得出本發明的這些和其它目的、特征和優點。
附圖簡述附

圖1表示MCT對PMN編程性細胞死亡的作用。
附圖2表示MCT對PMN吞噬的作用。
附圖3A和3B表示阿霉素對PMN編程性細胞死亡的作用。
附圖4A代表MCT對阿霉素治療的中性白細胞的時間過程反應。
附圖4B代表MCT對阿霉素治療的中性白細胞的時間過程反應。
附圖5表示MCT和三癸精對骨髓增殖的作用。
附圖6表示MCT對免疫抑制動物體內骨髓細胞計數的作用。
附圖7表示MCT免疫抑制動物體內脾細胞計數的作用。
附圖8表示MCT和GM-CSF對正常小鼠胸腺重量的作用。
附圖9表示MCT、辛酸鈉和癸酸鈉對免疫抑制動物體內骨髓細胞計數的作用。
附圖10代表MCT與亞治療濃度的阿霉素聯用在B16F10骨髓瘤模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。
附圖11代表MCT與亞治療濃度的環磷酰胺或泰索帝聯用在DA-3乳腺癌模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。
附圖12表示MCT與治療濃度的環磷酰胺或泰索帝聯用在DA-3乳腺癌模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。
發明詳述高劑量化療和放療破壞骨髓中的造血細胞，使患者中性白細胞和血小板嚴重缺失。在這類治療后，患者因中性白細胞減少而導致的感染和發熱而需要在重癥監護病房中進行幾周的加強護理。血小板減少導致凝血時間延長和需要輸血小板的出血疾患。骨髓抑制是癌癥治療中限制劑量的因素且中性白細胞和血小板缺乏是這些癌癥治療后發病率和死亡率的主要原因。
在骨髓移植中，可以使用兩種手段。在移植前，刺激骨髓可以增加外周先祖干細胞的數量。然而，新近移植的骨髓不含足夠成熟的中性白細胞或中性白細胞中間體以恢復患者的免疫系統。這使患者有一段時間對感染敏感性增加且凝血時間延長。包括中性白細胞刺激和激活的療法通過減少中性白細胞減少和血小板減少而增加了骨髓移植后的恢復。
本發明涉及促進受治療者中性白細胞存活和活化的方法。目前的方法涉及恢復受治療者造血系統。目前用于這類治療的造血生長因子是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干細胞因子(SCF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。G-CSF和GM-CSF可以縮短中性白細胞減少和血小板減少的總期限，而仍然會保留患者存在凝血缺陷且易受感染過程中的顯著時限。
還將骨髓移植過程中的″轉移″用于從外周血液中采集較高數量的干細胞/祖細胞。在用生長因子治療后骨髓中的造血干細胞遷移入血液。用于這類治療的生長因子包括白細胞介素-3(IL-3)、G-CSF、GM-CSF、SCF和具有IL-3和GM-CSF的活性部分的重組融合蛋白。隨后在用生長因子治療后移入的干細胞被采集且在下一周期的高劑量化療或放療后再輸入患者體內以恢復患者的中性白細胞和血小板。
中鏈甘油三酯(本文中也稱作″MCT″)由用帶有8(C8，辛酸)和10(C10，癸酸)碳鏈長度的脂肪酸酯化的甘油組成。MCT通常含有C8和C10脂肪酸甘油酯的混合物。然而，MCT也可以含有少量(各2±1％)的C6(己酸)和C12(十二烷酸或月桂酸)的甘油酯。CRODAMOLTM是商購自Croda Ltd.，Toronto(Canada)的MCT。正如實施例1中所示，CRODAMOLTM是含有不同比例的C8和C10脂肪酸甘油三酯的MCT。然而，CRODAMOLTM不含任何C6或C12脂肪酸酯。另一方面，長鏈甘油三酯(在本文中也稱作″LCT″)由用帶有12個以上的碳鏈長度的脂肪酸酯化的甘油組成。LCT中所含的典型脂肪酸包括棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)。不同于MCT，LCT是膳食脂肪的主要成分。實際上，MCT和LCT具有明顯不同的生物特性。MCT與LCT之間的某些生理差異描述在Harrison的《藥物內在機理》(Principles of Internal Medicine)，第8版，1520-1521(1977)，McGraw Hill Book Company；或第15版，1668-1669(2001)中。例如，與LCT相反，MCT不需要通過胰脂肪酶水解，這是因為它們可以被腸上皮細胞吸收。
MCT及其組成成分中鏈脂肪酸是用于食品和藥物工業的無毒性物質。例如K.A.Traul等在《食品與化學毒理學》(Food and ChemicalToxicology)3879-98(2000)中描述已經將MCT用于增加數量的食品和營養應用中，這是因為它們提供了許多超過LCT的優點。MCT還主要用作各種人和獸用藥物制劑和化妝品中的乳化劑。它們涉及大量支持MCT安全性的毒理學研究。例如，注意到已經在臨床試驗中證實了人膳食中消耗達1g/kg水平的MCT的安全性。C8和C10脂肪酸具有相似的安全性和應用。例如，在Merck Index第11版266(1989)中報導了辛酸具有的基本上無毒性的LD50(口服，大鼠)＝10.08g/kg。實際上，按照聯邦法規條例(Code of Federal Regulations(CFR))第184章的規定，美國聯邦藥品管理局(U.S.Federal Drug Agency)(FDA)已經批準了辛酸的GRAS(一般認為安全)結論。類似地，按照第172章(CFR)的規定，將游離脂肪酸(例如癸酸、辛酸)及其金屬鹽看作是用于食品的安全添加劑。正如D.Dimitrijevic等在《藥物學和藥理學雜志》(ournal of Pharmacy and Pharmacology)J 53149-154(2001)中注意到的，日本和瑞典將癸酸(鈉鹽)批準為人用直腸藥物產品的吸收促進劑。美國專利US 4,602,040(1986)中描述了將MCT用作藥物賦形劑。近來PCT申請WO 01/97799中描述了將中鏈脂肪酸、特別是辛酸和癸酸用作抗菌劑。
然而，截至到本文公開的意外發現為止，尚不了解中鏈脂肪酸、諸如癸酸、辛酸或其金屬鹽或其甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯(MCT)作為中性白細胞存活和激活因子的有效性。正如本文所述，MCT含有C8(辛酸)和C10(癸酸)脂肪酸甘油三酯，它們構成至少98％涉及刺激血細胞生成和中性白細胞成熟的活性。D.Waitzberg等在《營養》(Nutrition)13128-132(1997)中描述了脂類乳劑(LCT和MCT)僅適當減少中性白細胞殺菌功能且對單核細胞沒有作用。實際上，僅有一篇含糊地指出MCT可以影響中性白細胞減少的公開文獻描述了給予MCT與LCT和單獨給予LCT比較的臨床研究。沒有單獨使用MCT進行研究且由此對免疫功能的作用尚不明確。然而，由S.Demirer等在《臨床營養》(Clinical Nutrition)19253-258(2000)報導的結果教導了當將MCT與LCT聯用時和相對于LCT單獨使用，MCT使中性白細胞減少惡化。即提示MCT抑制中性白細胞功能和/或存活。作為對該意見的一定程度的支持，PCT公開號WO 95/30413斷言不飽和長鏈脂肪酸、諸如亞油酸(linolineic acid)以及飽和長鏈(C16或C16以上)脂肪酸可以起增強造血干細胞增殖的作用。
本發明涉及中鏈脂肪酸或其金屬鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT作為血細胞生成活化或生長因子和中性白細胞存活和激活因子的應用。當用于化療和放療時，在治療前、過程中和/或之后給予含有中鏈脂肪酸或其金屬鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT的組合物以縮短中性白細胞減少時限并加速造血系統的補充。此外，能夠在相對于使用化療和放療的多點治療時使用中鏈脂肪酸與其金屬鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物和/或MCT的組合(例如在使用MCT治療前后使用脂肪酸)。另一方面，能夠在使用化療和放療前、過程中和/或之后同時給予該組合。在重度中性白細胞減少中，將含有中鏈脂肪酸或其金屬鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT的組合物用作治療劑。在骨髓移植過程中，將中鏈脂肪酸或其金屬鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT用于增加強度放療或化療后移植用的外周干細胞數量。也可以在骨髓移植后使用中鏈脂肪酸或其金屬鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT以便刺激骨髓干細胞，由此縮短從中性白細胞減少中恢復的時間期限。
該方法由此用于刺激血細胞生成以治療因化療或放療導致的骨髓抑制、慢性或短暫中性白細胞減少、藥物誘發的中性白細胞減少和因血液病、營養缺乏、感染或放療導致的中性白細胞減少。短暫中性白細胞減少可能因船運動物或轉運人或動物產生的壓力所致。該方法還用于刺激血細胞生成以愈合患者傷口并誘導中性白細胞轉移以有利于患者骨髓移植。
本文所用的術語″一種″可以指一種或多種，這取決于上下文中使用的含義。
本文所用的″中鏈脂肪酸、諸如癸酸或辛酸或其金屬鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT組合物″指的是包括所述活性組分和一種或多種藥物上可接受的載體的組合物。
本文所用的術語″藥物上可接受的載體″指的是不干擾中鏈脂肪酸、諸如癸酸或辛酸或其金屬鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或類似物或MCT的生理作用且對包括人的哺乳動物而言無毒性的物質。
使用癸酸或辛酸或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT和藥物上可接受的載體、通過本領域中公知的方法配制本發明的癸酸或辛酸或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT組合物(MERCK INDEX，Merck & Co.，Rahway，NJ)。這些組合物包括單不限于液體、油劑、乳劑、氣溶膠、吸入劑、膠囊、丸劑、貼劑和栓劑。
所有方法均包括將所述活性組分混入構成一種或多種輔助組分的載體中的步驟。
本文所用的術語″化療″指的是使用細胞毒性劑殺傷增殖細胞的過程。術語″化療過程中″指的是所給予的細胞毒性劑持續作用的期限。另一方面，術語″化療后″用以覆蓋給予細胞毒性劑后給予組合物的所有情況而與任何預先給予的相同細胞毒性劑無關、也與所給予的細胞毒性劑的持久性無關。
當將本發明方法用于化療時，可以在化療前、過程中或化療后(即在給予細胞毒性劑之前、過程中或之后)給予癸酸或辛酸或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT。
所謂″細胞毒性劑″指的是高度殺傷增殖細胞、例如腫瘤細胞、病毒感染細胞或造血細胞的活性劑。可以用于本發明的細胞毒性劑的實例包括但不限于環磷酰胺、阿霉素、道諾紅菌素、長春花堿、長春花新堿、博來霉素、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、泰索帝、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他濱、順鉑、卡鉑或苯丁酸氮芥和上述化合物中任意一種的興奮劑。細胞毒性劑還可以是抗病毒劑，例如AZT(即3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷)或3TC/拉米夫定(即3-噻胞苷)。
本文所用的術語″白細胞減少″指的是血液中白細胞數量異常下降。
本文所用的術語″中性白細胞減少″指的是血液中存在異常少量的中性白細胞。
在一個優選的實施方案中，所述藥物組合物是任意適合于口服、舌下給藥或吸入(鼻部噴霧)、靜脈內、肌內、皮下的用于治療中性白細胞減少、血小板減少或作為中性白細胞存活和激活因子的組合物形式。
可以理解的是用于治療所需的本發明組合物用量隨給藥途徑、所治療疾病的性質、患者年齡和情況而改變且最終由參與的臨床醫師決定。所需劑量易于以單劑量或分次劑量存在，在適當間隔時服用，例如每天兩次、三次、四次或四次以上。
盡管為用于療法而能夠將癸酸或辛酸或其金屬鹽或甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT作為化學原料給藥，但是優選將所述活性組分制成藥物制劑。
在本發明的一個優選的實施方案中，給予活性組分的用量使得血藥濃度(游離和/或結合血清清蛋白)大于1μM。在一個特別優選的實施方案中，血藥濃度大于1mM。
在另一個實施方案中，所述藥物組合物是口服(包括舌下)或非腸道(包括肌內、皮下、直腸和靜脈內)給藥劑型。如果合適，可以將這些制劑制成離散劑型且可以通過制藥領域眾所周知的任意方法制備。所有方法均包括將活性化合物混入液體載體或固體載體細粉或它們兩者且如果必要隨后將產物形成所需制劑的步驟。如果需要，可以使用適合于使活性組分緩釋的上述制劑。
還可以將中鏈脂肪酸或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT與其它治療活性劑聯用，諸如抗癌細胞毒性劑或其它抗癌劑(免疫調制或調節藥或治療疫苗或抗血管生成藥等)；免疫抑制藥(包括消炎藥)；生長因子，諸如集落刺激因子(優選GM-CSF或G-CSF)；細胞因子，諸如白細胞介素2或白細胞介素15；或其組合。可以以單獨或組合的藥物制劑形式依次(之前或之后)或同時給予這類組合中的各個成分。上述組合易作為藥物劑型使用且由此本發明的另一個發明包括含有上述所定義的組合及其藥物上可接受載體的藥物制劑。
在根據治療需要刺激患者血細胞生成的方法的優選實施方案中，給予含有下列化合物中的一種或多種或其組合的藥物有效量的組合物 其中R1是直鏈或支鏈的飽和或不飽和C7-C11烷基；A和B獨立為氫或 且X是羥基、含有金屬一價或二價抗衡陽離子的負氧離子或含有直鏈或支鏈C2-C4烷基部分的烷氧基。
本領域技術人員可以理解在通式III中，術語″Z＝O″指的是可變的Z是可選的且可以不存在或被氫取代。
在可選的優選實施方案中，所述組合物含有由通式I所述至少兩種化合物的混合物，這些化合物是中鏈甘油三酯(MCTs)，其中A、B和R1相同且分別是直鏈或支鏈的飽和或不飽和C7和C9烷基。另一方面，該組合物含有兩種甘油三酯的混合物，其中第一種MCT由通式I所述，其中A、B和R1是CH3(CH2)6，而第二種MCT由通式I所述，其中A、B和R1是CH3(CH2)8。另一方面，該組合物進一步含有各自為0.1％-3％的由通式I所述第三種化合物、其中A、B和R1是CH3(CH2)4和由通式I所述第四種化合物、其中其中A、B和R1是CH3(CH2)10。另一方面，該組合物是含有由下列通式描述的C8和C10脂肪酸甘油三酯的4種幾何異構體的混合物 1234n＝6 6 6 8m＝6 6 8 8p＝6 8 8 8在另一個優選的實施方案中，所述組合物含有一種或多種由通式II或通式III描述的化合物，其中X是OH或X是含有諸如鈣、鎂、鉀和鈉這樣的金屬抗衡離子的負氧離子。
在一個更優選的實施方案中，所述組合物是辛酸、癸酸、癸酸鈉、辛酸鈉、辛酸鈣、癸酸鈣、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯。
本文所述組合物和方法包括下列類似物和化合物辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯的氮雜類似物，優選其中的氮雜類似物是1，2，3-O，N，O-三辛酰基絲氨醇或1，2，3-O，N，O-十三酰基絲氨醇；通式IV描述的化合物 通式V描述的化合物
通式VI描述的化合物 將這些化合物制成通過在體內降解以釋放上述活性物質的藥物制劑。
下列實施例進一步解釋本發明的實施方案，但并不用來限定本發明。可以理解的是對給予任意個體患者(人或動物)的中鏈脂肪酸、或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或MCT以及相關藥物制劑的劑量的選擇屬于參與的臨床醫師的決定范圍、按照相同方式開據適宜劑量的處方且取決于疾病階段等僅屬于參與的臨床醫師范圍的因素。
實施例1對CRODAMOLTM(MCT辛酸/癸酸甘油三酯)的分析通過氣相色譜法分析來自Croda Ltd.(Toronto，Canada)的CRODAMOLTMGTCC批號T1033-1299。GC FID-分析，梯度條件100℃-250℃，10分鐘內，然后在250℃下25分鐘；FID 250℃。觀察到4個峰22.04分鐘(26％)，25.07分鐘(43％)，29.16分鐘(25％)和34.75分鐘(5％)。
通過氣相色譜法分析獲自Sigm8-Aldrich批號079H1212的辛酸甘油三酯(三辛精)樣品。GC FID-分析，梯度條件100℃-250℃，10分鐘內，然后在250℃下25分鐘；FID 250℃。在22.31分鐘(98％)時觀察到一個主要的峰。
實施例2使用酰基氯和吡啶堿酰化醇
方法A吡啶，CH2Cl2方法BDMAP，CH2Cl2一般方法A(吡啶)在氮氣環境中將醇(～0.1M)溶于干CH2Cl2和吡啶(4∶1)所得到的溶液冷卻至0℃并用酰基氯(1.2當量)處理。將該反應體系緩慢溫至環境溫度并攪拌過夜。TLC分析(SiO2，EtOAc 1∶9己烷)顯示沒有剩余的醇。將該反應混合物用CH2C12稀釋并用飽和NH4Cl水溶液洗滌。將水相用CH2Cl2(x1)和己烷(x1)提取并用飽和NaCl水溶液洗滌合并的有機相、用Na2SO4干燥、過濾并在真空中蒸發至得到粗產物。
一般方法B(DMAP)在氮氣環境中將醇(～0.1M)溶于干CH2Cl2所得到的溶液冷卻至0℃并用DMAP(1.3當量)和酰基氯(1.2當量)處理。將該反應體系緩慢溫至環境溫度并攪拌過夜。TLC分析(SiO2，EtOAc 1∶9己烷)顯示沒有剩余的醇。將該反應混合物用CH2Cl2稀釋并用飽和NH4Cl水溶液洗滌。將水相用CH2Cl2(x1)和己烷(x1)提取并用飽和NaCl水溶液洗滌合并的有機相、用Na2SO4干燥、過濾并在真空中蒸發至得到粗產物。
實施例3壬酸甘油三酯用壬酰氯(751μl，4.16mmol)按照實施例2的一般方法A酰化甘油(120mg，1.30mmol)。通過柱層析法純化(IsoluteTMSiO2，用0-5％EtOAc的己烷溶液洗脫)而得到含有級分的兩種產物，在真空中蒸發至得到所需產物、為無色液體，純度分別為89％(127mg，19％) 和93％(475mg，71％)(GC/FID)。Rf0.46(SiO2，10％乙酸乙酯的己烷溶液)；
1HNMR(CDCl3，300MHz)δH＝5.27(m，1H)，4.29(dd，2H)，4.14(dd，2H)，2.31(m，6H)，1.61(m，6H)，1.27(m，30H)，0.88(t，9H)；MS(FAB+)m/z＝510(M-H+)；；GC FID-分析，條件10分鐘內梯度100℃-250℃，然后250℃下25分鐘；FID 250℃；27.25分鐘。
實施例4壬酸甘油二酯和壬酸甘油單酯 用一個當量的壬酰氯(205μl，1.09mmol)按照實施例2的一般方法A酰化甘油(100mg，1.09mmol)。通過BiotageTM純化(40S，SiO2，用10％乙酸乙酯的己烷-100％乙酸乙酯溶液洗脫)而得到含無色油狀物。得到兩種不同的化合物得到壬酸甘油二酯(73mg，18％)、為白色固體。mp 24-26℃；Rf0.52(用Et3N、30％乙酸乙酯的己烷溶液預處理的SiO2)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH＝4.17(m，5H)，2.35(t，4H)，1.63(m，4H)，1.27(m，20H)，0.88(t，6H)；MS(FAB+)m/z＝373(M+H+).
得到壬酸甘油單酯(85mg，34％)、為白色固體。mp 37-38.5℃；Rf0.08(用Et3N、30％乙酸乙酯的己烷溶液預處理的SiO2)；1HNMR(CDCl3，300MHz)δH＝4.18(m，2H)，3.94(m，1H)，3.69(m，1H)，3.62(m，1H)，2.36(t，2H)，1.62(m，2H)，1.28(m，10H)，0.88(t，3H)；MS(FAB+)m/z＝233(M+H+).
實施例51，2，3-O，N，O-十三酰基絲氨醇用十三酰氯(372μl，1.76mmol)按照實施例2的一般方法B酰化絲氨醇(51mg，0.56mmol)。通過MPLC純化(SiO2，用0、然后用10％EtOAc的己烷溶液洗脫)得到所需產物、為白色固體(301mg，97％).
mp 54℃；TLC，Rf0.85(SiO2，EtOAc 2∶3己烷)；1HNMR(CDCl3，300MHz)δH0.84(9H，t)，1.20-1.27(36H，m)，1.52-1.60(6H，m)，2.13(2H，t)，2.28(4H，t)，4.03(2H，2xA of 2xABX)，4.19(2H，2xB of 2xABX，)，4.41-4.46(1H，m)，5.70(1H，d)；對C33H63NO5計算的HRMS m/e 553.4706；測定值553.4713。GC FID-分析，條件10分鐘內梯度100℃-250℃，然后250℃下25分鐘；FID 250℃。在14.80分鐘(98％)時主要存在一個峰。
實施例61，3-O，O-二癸酰基絲氨醇 a)BOC-ON，Et3N；b)DMAP，CH2Cl2；c)HCl.
用三乙胺(3.60ml，25.9mmol)和BOC-ON(4.67gm，19.0mmol)處理絲氨醇(1.57gm，17.2mmol)溶于丙酮(17ml)和水(17ml)所得到的溶液并在氮氣環境中將該反應體系攪拌過夜。在真空中蒸發丙酮并使粗混合物分配在EtOAc與水之間。用EtOAc(x3)提取水相并用Na2SO4干燥合并的有機提取物、過濾并在真空中蒸發而得到黃色固體。通過MPLC(SiO2，用40-80％EtOAc的己烷溶液洗脫)而得到N-BOC-二醇中間體、為白色結晶固體(2.10gm，64％)。TLC，Rf0.15(SiO2，EtOAc 4∶1己烷)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH1.40(9H，s)，3.54-3.56(5H，m).
用癸酰氯(173μl，0.83mmol)按照一般方法B酰化N-BOC-二醇中間體(50mg，0.26mmol)。通過MPLC(SiO2，用0、然后10％EtOAc的己烷溶液洗脫)而得到N-BOC-二酰基中間體、為無色油狀物(115mg，88％)。TLC，Rf0.80(SiO2，EtOAc 2∶3己烷)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH0.87(6H，t)，1.23-1.30(24H，m)，1.44(9H，s)，1.56-1.70(4H，m)，2.31(4H，t)，4.04-4.21(4H，m)，4.77-4.80(1H，m)，6.73(1H，d).
將N-BOC-二酰基中間體(76mg，0.15mmol)溶于干CH2Cl2(1.5ml)所得到的溶液冷卻至0℃并用4.0M無水HCl溶于1，4-二噁烷(375μl，1.50mmol；終濃度0.8M)所得到的溶液處理。將該反應體系溫至室溫并在相同溫度下攪拌3小時。再加入部分4.0M無水HCl的1，4-二噁烷(375μl，1.50mmol)溶液并將該反應體系再攪拌2小時。蒸發溶劑得到所需產物、為白色固體(69mg，100％)。mp 101℃；TLC，Rf0.40(SiO2，EtOAc 2∶3己烷)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH0.88(6H，t)，1.20-1.29(24H，m)，1.55-1.65(4H，m)，2.45-2.52(4H，m)，3.72-3.80(1H，m)，4.30-4.51(2H，m)，8.6-9.0(3H，br m)；對(M-HCl)計算的HRMS m/e，C23H45NO4339.3348；測定值339.3340；GC FID-分析，梯度條件10分鐘內100℃-250℃，然后250℃下25分鐘；FID 250℃。在17.14分鐘(94％)時主要存在一個峰。
實施例7α-和β-1-O-甲基-2，3，4，-O，O，O-十三酰基-L-巖藻糖
a)DMAP，CH2Cl2.
按照Levene & Muskat(《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)105431-441，1934)的方法合成1-O-甲基-L-巖藻糖(593mg，3.33mmol)并用癸酰氯(2.90ml，14.0mmol)按照實施例2的一般方法B酰化。通過MPLC純化(SiO2，用0、然后5％EtOAc的己烷溶液洗脫)而得到α(1.18gm，55％)和β(0.52gm，24％)的所需產物、為無色油狀物。
α端基異構體數據TLC，Rf0.45(SiO2，EtOAc 1∶9己烷)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH0.87(9H，t)，1.14(3H，d)，1.20-1.35(36H，m)，1.52-1.68(4H，m)，2.18(2H，t)，2.29(1H，A of ABX2)，2.32(1H，B of ABX2)，2.41(2H，t)，3.38(3H，s)，4.13(1H，qd，J 6.5)，4.93(1H，d)，5.15(1H，dd，5.30(1H，dd)，5.36(1H，dd)；對(M-CH3O)C36H65O7計算的HRMS m/e609.4730；測定值609.4720。
β端基異構體數據TLC，Rf0.40(SiO2，EtOAc 1∶9己烷)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH0.87(9H，t，J 6.5Hz)，1.22(3H，d)，1.20-1.35(36H，m)，1.49-1.67(4H，m)，2.18(2H，t)，2.25(1H，A of ABX2)，2.29(1H，B of ABX2)，2.34(2H，t)，3.50(3H，s)，3.81(1H，qd)，4.35(1H，d)，5.03(1H，dd)，5.19(1H，dd)，5.24(1H，dd).
實施例8L-谷氨酸癸酰胺
a)EDCl，DMAP，iPr2EtN，CH2Cl2；b)HCl/1，4-二噁烷，CH2Cl2在氮氣環境中向癸酸(7.30mmol，1.26g)溶于干CH2Cl2(60ml)所得到的溶液中加入L-谷氨酸二叔丁酯HCl鹽(6.09mmol，1.80gm)、DMAP(1.8mmol，0.22g)、二異丙基乙胺(18mmol，3ml)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺HCl鹽(EDCI)(7.30mmol，1.40gm)。將所得的無色溶液在室溫下攪拌24小時。然后在減壓條件下除去溶劑而得到白色油狀殘余物。通過BiotageTM純化(40S SiO2，用5％乙酸乙酯的己烷溶液-30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫)而得到無色油狀物，為L-谷氨酸二叔丁酯癸酰胺(2.47gm，98％)。Rf0.56(SiO2，30％乙酸乙酯的己烷溶液)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH＝6.05(d，1H)，4.45(m，1H)，2.30(m，2H)，2.27(m，2H)，2.16(t，2H)，2.07(m，1H)，1.87(m，1H)，1.58(m，2H)，1.43(s，9H)，1.41(s，9H)，1.23(m，12H)，0.84(t，3H).
通過在0℃下向所述二叔丁酯衍生物(5.75mmol，2.38gm)溶于CH2Cl2(35ml)所得到的溶液中緩慢加入4.0MHCl的1，4-二噁烷(23ml)溶液使BOC基脫保護。將該無色溶液溫至室溫并再攪拌20小時。然后在減壓條件下除去溶劑并將所得白色固體干燥至得到L-谷氨酸癸酰胺(1.71gm，99％)。
1HNMR(CD3OD，300MHz)δH＝4.39(m，1H)，3.27(d，1H)，2.36(t，2H)，2.20(t，2H)，2.13(m，1H)，1.90(m，1H)，1.58(m，2H)，1.27(m 12H)，0.86(t，3H)；MS(ES+)m/z＝324(M+Na+)，302(M+H+)；MS(ES-)m/z＝300(M-H+)；HPLC分析，條件10分鐘內梯度0.01％TFA的10％-70％乙腈溶液；流速1.0ml/分鐘；210nm；8.93分鐘。
實施例9癸酸N，N-二甲基乙酰胺酯在氮氣環境中向癸酸(8.7mmol，1.5g)溶于無水DMF(80ml)所得到的溶液中加入碘化鈉(0.87mmol，130mg)，隨后加入二甲基氯乙酰胺(9.6mmol，985μl)。然后加入碳酸鉀(9.6mmol，1.3g)并將所得混懸液在90℃下攪拌5天。將該反應體系冷卻至室溫且然與蒸餾水混合。用乙酸乙酯(x3)提取產物。用NaHCO3水溶液洗滌合并的有機相、用Na2SO4干燥、過濾并在減壓條件下濃縮。通過BiotageTM純化所得的黃色液體(40M，SiO2，用25％乙酸乙酯的己烷溶液-50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫)。得到癸酸N，N-二甲基乙酰胺酯(2.03gm，92％)、為白色粉末。mp 42-42.5℃；Rf0.55(SiO2，乙酸乙酯)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δH＝4.64(s，2H)，2.92(s，3H)，2.91(s，3H)，2.38(t，2H)，162(qt，2H)，1.22(m，12H)，0.83(t，3H)；MS(ES+)m/z＝537(2M+Na+)，280(M+Na+)，258(M+H+).
實施例10中性白細胞編程性細胞死亡和存活的體外試驗如Lagraoui和Gagnon所述測定中性白細胞存活率(《細胞分子生物學》(Cell.Mol.Biol.)43313-318，1997)。中性白細胞獲自健康志愿者的外周血液。使血液與多淋巴細胞(lympholyte-poly)(Cedarlane，Hornby，Canada)一起進行梯度離心，隨后對污染的紅細胞進行低滲裂解。使細胞懸浮于補充了10％FBS(Hyclone，Logan USA)的RPMI(Gibco，Burlington，Canada)中。最終的細胞制品由＞95％的中性白細胞組成，正如Wright Giemsa染色所測定的。正如臺盤藍排除法所測定的，存活率大于97％。多形核白細胞(PMN)具有短半衰期且快速進行以編程性細胞死亡為特征的特征化改變。按照Nicoletti等在《免疫學方法雜志》(J.Immunol.Meth.)139271-279(1991)中所述方法評價編程性細胞死亡。簡單的說，將新近分離的中性白細胞與不同濃度的MCT在37℃下孵育24小時。孵育后用碘化丙錠(PI，Sigma)染色細胞并使用XL流式細胞儀(Coulter)分析編程性細胞死亡。然后將數據表示為編程性細胞死亡百分比。
附圖1代表幾次實驗的匯總，其中在沒有(對照組)或有不同濃度的MCT存在的情況下測定中性白細胞的編程性細胞死亡值。結果表明在體外有MCT存在的情況下，中性白細胞的編程性細胞死亡受到達90％的抑制且這種抑制作用是劑量依賴性的。因此，MCT可以增加中性白細胞存活率且可以用作中性白細胞存活因子。
實施例11PMN吞噬作用的體外試驗在37℃下和5％CO2和95％濕度條件下將中性白細胞(2×106/ml)與不同濃度的MCT一起孵育24小時。24小時后通過臺盤藍排除法測定存活率并用含有2mM葡萄糖、1mM MgCl2和1mM Cacl2的PBS洗滌3次。然后將細胞濃度調整至1×106個細胞/ml且然后與fluoresbrite carboxylate微球體(1/10稀釋)一起孵育。孵育30分鐘后，洗滌中性白細胞并固定在2％低聚甲醛中。使用XL流式細胞儀(Coulter)分析固定的中性白細胞微球體攝取情值。然后將數據表示為吞噬細胞百分比。
附圖2代表在沒有(對照組)或有不同濃度的MCT存在的情況下測定PMN吞噬活性的幾次實驗的匯總。結果表明MCT增強了人PMN的吞噬活性。這種吞噬活性最高為對照組數值的2-3倍且刺激程度取決于供體免疫狀態。
實施例12阿霉素對中性白細胞編程性細胞死亡的作用如實施例10所述分離PMN。在37℃下和5％CO2和95％濕度條件下以及有不同濃度的化療劑阿霉素存在的情況下將細胞(2×106/ml)孵育4小時。如實施例10所述估計編程性細胞死亡的細胞。將數據表示為編程性細胞死亡百分比。附圖3A和3B表示阿霉素誘導PMN編程性細胞死亡。
實施例13MCT挽救阿霉素誘導的中性白細胞編程性細胞死亡如實施例10所述分離PMN。在37℃下和5％CO2和95％濕度中以及有不同濃度的阿霉素存在的情況下將細胞(2×106/ml)與或不與MCT(2.5％和5.0％)一起孵育4小時。如實施例10所述估計編程性細胞死亡的細胞。將數據表示為編程性細胞死亡百分比。
表1代表測定MCT對PMN的化學保護作用的兩次實驗。將結果表示為在有或沒有阿霉素存在情況下與或不與MCT一起孵育4小時后編程性細胞死亡細胞的百分比。正如實施例12中所述，阿霉素誘導體外PMN編程性細胞死亡。然而，在有MCT存在的情況下，阿霉素在2.5％和5％(v/v)濃度下的編程性細胞死亡作用受到抑制。因此，MCT對PMN發揮了抗編程性細胞死亡作用。還使用膜聯蛋白V-FITC/PI(碘化丙錠)方法、按照制造商Biosources的建議(Apotarget Annexin-VFITCApoptosis Kit#PHN 1018)研究編程性細胞死亡。膜聯蛋白V結合早期至晚期編程性細胞死亡過程中由膜內轉移至膜外的磷脂酰絲氨酸。簡單的說，在有或沒有不同濃度阿霉素和MCT存在的情況下孵育中性白細胞。24小時后，用PBS洗滌中性白細胞并用2μl膜聯蛋白V-FITC和10μl的PI(Sigma，1mg/ml)染色20分鐘。孵育后將染色的細胞固定在低聚甲醛(1％)中并使用XL流式細胞儀(Coulter)分析編程性細胞死亡。然后將數據表示為編程性細胞死亡細胞百分比。
附圖4A代表MCT對阿霉素治療的中性白細胞的時間過程反應。在阿霉素誘導的(5×10-6M)編程性細胞死亡之后(孵育時間為0)0、30分鐘、1小時、2小時和4小時評價的MCT時間過程/反應。MCT以時間依賴和劑量依賴性方式挽救了阿霉素誘導的人中性白細胞的編程性細胞死亡。
附圖4B代表MCT對阿霉素治療的中性白細胞的時間過程反應。在導入毒性劑(阿霉素)前達4小時，MCT以劑量依賴性方式防止了中性白細胞的阿霉素誘導的編程性細胞死亡。
表1MCT對阿霉素誘導的中性白細胞編程性細胞死亡的保護作用
實施例14MCT挽救阿霉素誘導的中性白細胞編程性細胞死亡與GM-CSF比較表2代表GM-CSF、MCT和三辛精對阿霉素誘導的人中性白細胞編程性細胞死亡的作用。GM-CSF和MCT能夠挽救人中性白細胞的阿霉素誘導的編程性細胞死亡或保護人中性白細胞不受其影響。三辛精挽救了阿霉素誘導的編程性細胞死亡且進一步增強了人中性白細胞的存活力，其強化程度高于在未治療的中性白細胞(對照組，不使用阿霉素)中觀察到的程度。
表2MCT和GM-CSF對阿霉素誘導的中性白細編程性細胞死亡的保護作用
實施例15MCT和三癸精體外增加鼠骨髓增殖骨髓細胞獲自雌性C57BL/6小鼠(6-8周齡)股骨。沖洗細胞并用PBS洗滌。離心采集的細胞并以2×106個細胞/ml重新懸浮。在有或沒有MCT或三癸精存在的情況下將100μl的細胞(2×105個細胞)在96-孔微量滴定板上孵育48小時。孵育后用1μCi的[3H]-胸苷脈沖細胞6小時。將平板收集在Tomteck上并在Microbetaβ-計數器上計數。在DNA中摻入[3H]-胸苷是細胞增殖的直接指征。
附圖5代表MCT和三癸精對骨髓增殖作用進行的典型實驗。MCT和三癸精將骨髓增殖比對照組增加了3-5倍。
實施例16化學保護研究MCT體內誘導免疫細胞增殖或保護通過在第0天時用靜脈內給予80mg 5-氟尿嘧啶(5-FU)或100-200mg環磷酰胺(CY)或12mg泰索帝(TX)治療使6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠受到免疫抑制。為了檢驗MCT或其它化合物的免疫保護作用，在前3天、前2天和前1天時口服測試化合物預治療小鼠或在第0天用測試化合物靜脈內治療。在第5天時通過心臟穿刺和脫頸椎處死小鼠。然后如下由胸腺、脾和骨髓制備細胞混懸液。
將組織在PBS緩沖液中破碎并使污染的紅細胞在ACK緩沖液(155mM NH4Cl，12mM NaHCO3，0.1mM EDTA，pH7.3)中裂解5分鐘。然后通過離心收集細胞并在PBS中洗滌3次且重新懸浮于組織培養基中。在血細胞計數器上對細胞計數。
結果表明與單獨載體相比，MCT顯著增加了正常和免疫抑制動物的免疫組織中的細胞數量，正如下表和附圖中所示。隨實驗和小鼠免疫狀態的不同，MCT可以增加骨髓細胞和/或脾細胞和/或胸腺細胞計數。
附圖6表示MCT對免疫抑制動物體內骨髓細胞計數的作用。與對照組(無細胞毒性治療)相比，僅CY和5-FU降低了骨髓細胞計數。在小鼠中，泰索帝治療對骨髓細胞計數沒有顯著作用。在受到抑制的骨髓中，在前3天、前2天和前1天時給予MCT(6.25μMole/小鼠)顯著增加了骨髓細胞計數。
附圖7代表MCT對接受MCT/口服的免疫抑制小鼠體內脾細胞計數的作用。與對照組相比，所有細胞毒性藥物(CY、5-FU和TX)均顯著減少了脾細胞減少。在前3天、前2天和前1天時給予MCT(6.25μMole/小鼠)顯著增加了骨髓細胞計數，其中就CY、5-FU和TX而言″P″分別小于0.0017、0.009和0.0036。
此外，MCT在第0天給予時顯著增加了正常小鼠的骨髓細胞計數(表3)。然而，一次靜脈內注射MCT不足以改善正常和免疫抑制小鼠體內的脾細胞計數。
表3環磷酰胺(CY)和CY+MCT對骨髓和脾細胞的作用(正常小鼠)
實施例17化學保護研究在前3天、前2天和前1天對正常小鼠給藥時MCT誘導免疫細胞增殖的體內劑量反應通過實施例16中所述方案評價MCT誘導正常小鼠體內免疫細胞增殖的體內劑量反應。
表4代表在前3天、前2天和前1天對正常小鼠口服給予MCT治療的劑量反應。MCT顯著增加了骨髓和脾細胞計數。
表4MCT對正常小鼠的作用
實施例18化學保護研究免疫細胞增殖或保護的體內誘導MCT與GM-CSF作用的比較按照實施例16所述方案進行對誘導免疫細胞增殖/再生或保護的體內比較。對正常和免疫抑制動物進行MCT和GM-CSF的比較研究。與MCT相比，GM-CSF對免疫抑制動物體內的骨髓和脾細胞計數不具有顯著活性。僅觀察到了GM-CSF對正常小鼠胸腺重量的顯著作用(附圖8)。在這種情況中，MCT顯示出與GM-CSF相似的作用。
實施例19化學保護研究通過實施例16中所述方案評價辛酸和癸酸對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。正如表5中所示，僅癸酸顯著增加了骨髓細胞計數。與環磷酰胺治療的小鼠相比，證實對脾細胞計數沒有顯著作用。
表5環磷酰胺(CY)、CY+辛酸和CY+癸酸對骨髓和脾細胞的作用
實施例20化學保護研究通過實施例16中所述方案評價三辛精和三癸精對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
三辛精和三癸精均在使CY-治療的小鼠骨髓細胞計數增殖或保護它們方面有效(表6)。與環磷酰胺治療的小鼠相比，沒有觀察到對脾細胞計數的顯著作用。
表6環磷酰胺(CY)、CY+三辛精和CY+三癸精對骨髓和脾細胞的作用
實施例21化學保護研究通過實施例16中所述方案評價壬酸和月桂酸對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
在CY-治療的小鼠中使用月桂酸預治療觀察到對骨髓和脾細胞計數的增殖或保護作用顯著增加。然而，與環磷酰胺治療的小鼠相比，壬酸對免疫細胞計數表現出弱(不顯著)活性(表7)。
表7環磷酰胺(CY)、CY+壬酸和CY+月桂酸對骨髓和脾細胞的作用
實施例22化學保護研究通過實施例16中所述方案評價三月桂精和三肉豆蔻精對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
三月桂精和三肉豆蔻精對CY-免疫抑制小鼠的骨髓和脾細胞計數具有弱(不顯著)的活性(表8)。
表8環磷酰胺(CY)、CY+三月桂精和CY+三肉豆蔻精對骨髓和脾細胞的作用
實施例23化學保護研究通過實施例16中所述方案評價三己精和己酸鈉對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
三己精和己酸鈉對CY-免疫抑制小鼠的骨髓和脾細胞計數具有弱(不顯著)的活性(表9)。
表9環磷酰胺(CY)、CY+三己精和CY+己酸鈉對骨髓和脾細胞的作用
實施例24化學保護研究通過實施例16中所述方案評價辛酸鈉和癸酸鈉對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
在CY-治療小鼠中使用辛酸鈉和癸酸鈉預治療觀察到對骨髓和脾細胞計數的增殖或保護作用顯著增加(附圖9)。
實施例25化學保護研究治療后的方案如實施例16所述進行化學保護研究，但在第1、2、3和4天用MCT、辛酸鈉、癸酸鈉或癸酸口服(后)-治療小鼠。
在CY-治療的小鼠中使用MCT、辛酸鈉和癸酸鈉后治療觀察到骨髓細胞計數顯著增加(表10)。當用作后治療時，癸酸誘導脾細胞計數顯著增加和骨髓細胞計數弱幅度增加(表11)。
表10環磷酰胺(CY)、CY+MCT、CY+辛酸鈉和CY+癸酸鈉對骨髓和脾細胞后治療的作用
表11環磷酰胺(CY)、CY+癸酸對骨髓和脾細胞后治療的作用
實施例26化學保護研究免疫表型分型試驗使用不同濃度的MCT在前3天、前2天和前1天每天口服或在第0天靜脈內預治療雌性6-8周齡C57BL/6小鼠。還對免疫抑制小鼠進行免疫表型分型。使用80mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU)或100-200mg/kg的環磷酰胺(CY)或12mg/kg的泰索帝(TX)在第0天時進行靜脈內注射實現免疫抑制。在第5天時通過心臟穿刺處死小鼠。采集血液和脾臟并制備細胞混懸液且使紅細胞在ACK緩沖液(155mM NH4Cl，12mMNaHCO3，0.1mM EDTA，pH7.3)中裂解5分鐘。將細胞在pH..4的PBS中洗滌3次并重新懸浮于組織培養基中。然后將細胞在冰上與綴合了細胞表面標記的異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅素(PE)、按照制造商(Gibco/BRL，Cedarlane，Boehringer Mannheim)的建議一起孵育45分鐘。然后將在細胞PBS中洗滌、用1％低聚甲醛固定并使用CoulterXL流式細胞儀分析。通過測定如下的標準細胞表面標記對細胞亞群進行分析TCR(T-細胞受體)；CD4(T輔助細胞)；CD8(T細胞毒性/抑制因子)；CD11b(巨噬細胞)；NK(NK細胞)；和Ly5(B-細胞)。如實施例15所述得到骨髓細胞。通過對FITC或PE綴合的細胞表面標記按照制造商的建議孵育45分鐘對細胞染色。然后將細胞在PBS中洗滌、用1％低聚甲醛固定并使用Coulter XL流式細胞儀分析。通過測定如下的標準細胞表面標記對細胞亞群進行分析CD34(造血祖細胞)；CD41(血小板、巨核細胞)；CD13(骨髓單核干細胞、髓細胞、幼單核細胞)；和CD38(淋巴干細胞、pro-B、pre-B)。
表12代表MCT對正常小鼠血液和脾免疫表型分型的作用。在血液免疫表型分型時，MCT增加CD8+和LY5+細胞亞群。在一些實驗中，MCT弱幅度地增加LY5-TCR-亞群(數據未顯示)。在脾免疫表型分型時，MCT顯著增加LY5+TCR+和CD4+細胞的相對百分比。LY5-TCR-是可以代表中性白細胞的B-非T-細胞。
當對免疫抑制小鼠給藥時，與單獨使用環磷酰胺相比，MCT增加血液和脾免疫表型分型時LY5-TCR-(可能是中性白細胞)和CD11+(巨噬細胞)細胞的相對百分比。這些細胞亞群來源于髓樣細胞前體(表13)。
表12MCT對正常小鼠血液和脾免疫表型分型的作用
表13MCT對環磷酰胺(CY，200mg/kg)免疫抑制小鼠血液和脾免疫表型分型的作用
實施例27化學保護研究免疫表型分型試驗按照實施例26中所述對三肉豆蔻精、三月桂精、癸酸和己酸鈉進行免疫表型分型。
表14代表這些MCT類似物對血液和脾免疫表型分型的作用。與單獨使用環磷酰胺相比，三肉豆蔻精和三月桂精對血液沒有顯著作用。然而，三肉豆蔻精和三月桂精可增加脾CD11+的相對百分比。此外，三月桂精誘導LY5-TCR-和NK+細胞亞群顯著增加。有意義的是癸酸和己酸鈉顯著增加血液LY5-TCR-的相對百分比。與單獨使用環磷酰胺相比，癸酸對脾沒有顯著作用。
表14三肉豆蔻精、三月桂精、癸酸和己酸鈉對環磷酰胺(CY，200mg/kg)免疫抑制小鼠血液和脾免疫表型分型的作用
實施例28化學保護研究骨髓免疫表型分型按照實施例26中所述方案評價MCT、辛酸鈉、癸酸鈉對骨髓免疫表型分型的作用。
用環磷酰胺治療誘導所有研究亞群(CD34+、CD13+、CD41+和CD38+)顯著增加。添加MCT和辛酸鈉或癸酸鈉擴大了屬于骨髓單核干細胞、髓細胞和幼單核細胞的CD13+系的數量。這種CD13+相對百分比的增加與單獨使用環磷酰胺相比是顯著的。結果清楚地證實MCT和其它相關化合物誘導骨髓細胞數量顯著增加(如上述實施例所示例)且進一步增加吞噬細胞(PMN和單核細胞)前體的相對百分比。這一結果可以導致從細胞毒性治療中更好地恢復或預防感染病原體(表15)。
表15MCT、辛酸鈉和癸酸鈉對環磷酰胺(CY，200mg/kg)免疫抑制小鼠骨髓免疫表型分型的作用
實施例29化學保護研究通過實施例16中所述方案評價三癸酰基絲氨醇和二癸酰基絲氨醇對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
正如表16中所示，三癸酰基絲氨醇顯著增加了脾細胞計數。證實對骨髓細胞計數沒有顯著作用。
表16環磷酰胺(CY)、CY+三癸酰基絲氨醇和CY+二癸酰基絲氨醇對骨髓和脾細胞的作用
實施例30化學保護研究通過實施例16中所述方案評價α-甲基三癸酰基-L-巖藻糖和β-甲基三癸酰基-L-巖藻糖對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
正如表17中所示，與環磷酰胺治療的小鼠相比，β-甲基三癸酰基-L-巖藻糖對骨髓細胞計數表現出弱(不顯著)的活性。根據已知的α-烷基吡喃糖苷的不穩定性預計α-甲基端基異構體缺乏活性。
表17環磷酰胺(CY)、CY+α-甲基三癸酰基-L-巖藻糖和CY+β-甲基三癸酰基-L-巖藻糖對骨髓的作用
實施例31化學保護研究通過實施例16中所述方案評價癸酸乙酯和癸酸N，N-二甲基乙酰胺酯對體內誘導免疫細胞增殖或保護的作用。
正如表18中所示，僅癸酸N，N-二甲基乙酰胺顯著增加骨髓細胞計數。經證實對脾細胞沒有顯著作用。
表18環磷酰胺(CY)、CY+癸酸乙酯和CY+癸酸N，N-二甲基乙酰胺對骨髓的作用
實施例32抗腫瘤活性在第0天給雌性6-8-周齡C57BL/6小鼠靜脈內注射購自ATCC(細胞培養物來源，Dr.I.J.Fidler)的1×105B 16F 10黑素瘤細胞。然后在第7、9、14和16天給動物通過靜脈內注射或不注射MCT(25μMole/小鼠)并在第10和第17天靜脈內注射10mg/kg阿霉素。在第22天處死小鼠。記錄體重和腫瘤體積。通過使用測徑器進行二維參數測定、使用公式0.4(a×b2)獲得連續腫瘤體積，其中″a″是大腫瘤直徑且″b″是短垂徑。
進行本實驗以驗證MCT是使非免疫細胞的癌細胞不惡化還是預防癌細胞。
附圖10代表MCT與亞治療濃度的阿霉素聯用在B16F10黑素瘤模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。單獨使用，MCT與亞治療濃度的阿霉素(T/C約下降25％)同樣誘導腫瘤體積輕度下降(T/C約20％)。當將MCT與阿霉素聯用時，觀察到作用增加(T/C約45-50％)。這些結果表明當將MCT與亞治療濃度的細胞毒性藥物聯用時能夠獲得治療活性。
實施例33抗腫瘤活性雌性BALB/c小鼠中同系基因型腫瘤DMBA3(DA-3，乳腺癌模型)產生自用7，12-二甲基苯并蒽治療的腫瘤前損害。在塑料燒瓶內的含有0.1mM非必需氨基酸、0.1μM丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺和100μg/ml硫酸慶大霉素的RPMI1640中，DA-3細胞作為單層培養物生長。給該培養基進一步補充50μM 2-巰基乙醇和10％胎牛血清。通過給6-8周齡BALB/c小鼠皮下接種5×105個活腫瘤細胞使DA-3腫瘤產生局限化腫瘤而在體內連續傳代。然后通過手工觸摸連續監測動物證實存在腫瘤。通過使用測徑器進行二維參數測定、使用公式0.4(a×b2)獲得連續腫瘤體積，其中″a″是大腫瘤直徑且″b″是短垂徑。一般在接種后7-10天可觸摸到腫瘤。
將兩種治療方案用于MCT與環磷酰胺(CY，100mg/kg)和泰索帝(TX，20mg/kg)聯用在DA-3腫瘤模型中的抗腫瘤功效和保護性評價。在第0天給BABL/c小鼠注射腫瘤細胞。在第6、7和8天、第13、14和15天、第20、21和23天口服MCT進行治療，隨后在第9天和第16天給予CY或TX靜脈內快速濃注進行治療。從第4天開始到第23天監測體重和腫瘤體積。在第23天時，處死全部動物。將％T/C(治療組比對照組)計算為治療組中終止日時的腫瘤體積除以對照組中相應的體積乘以100得到的比例。根據NCI標準，如果T/C≤40％，則認為產品有效。
進行本實驗以驗證MCT是使非免疫細胞的癌細胞不惡化還是預防癌細胞。附圖11表示MCT與亞治療濃度的CY和TX聯用在DA-3乳腺癌模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。與對照組相比，MCT誘導腫瘤體積輕度下降(T/C約18％)。當MCT與CY或TX聯用時，沒有觀察到腫瘤體積增大。然而，當與CY聯用時，觀察到了治療反應(T/C＝39.4％)。這些結果表明當MCT與亞治療濃度的CY聯用時可以獲得治療活性。這種作用可能是由于MCT-治療的動物中免疫細胞功效總體增加所致(附圖11和表19)。
表19MCT與亞治療濃度的環磷酰胺(CY，100mg/kg)和泰索帝(TX，20mg/kg)聯用對腫瘤體積的作用
實施例34抗腫瘤活性通過實施例30中所述方案評價抗腫瘤和化學保護功效，但使用治療濃度的細胞毒性藥(環磷酰胺，200mg/kg；泰索帝，30mg/kg)。
進行本實驗以驗證MCT是使非免疫細胞的癌細胞不惡化還是預防癌細胞。附圖12表示MCT與治療濃度的CY和TX聯用在DA-3乳腺癌模型中的化學保護作用和抗腫瘤功效。與對照組相比，MCT誘導腫瘤體積輕度下降。當MCT與CY或TX聯用時，沒有觀察到腫瘤體積增大。當使用CY或CY+MCT治療時，觀察到腫瘤體積明顯減小。此外，使用MCT與TX聯用治療與和對照組相比單獨使用沒有顯著效果(p＝0.1211)的TX比較獲得了腫瘤體積下降的顯著反應(p＜0.0327)(表20)。這些結果表明當MCT與非顯著治療濃度的TX聯用時可以獲得治療活性。這種作用可能是由于MCT-治療的動物中免疫細胞功效總體增加所致。
表20MCT與治療濃度的環磷酰胺(CY，100mg/kg)和泰索帝(TX，30mg/kg)聯用對腫瘤體積的作用
將本文獻中引述的所有參考文獻的全部內容引入本文作為參考。
本領域技術人員顯然可以根據上述描述對本文所述組合物和方法作出修改和改變。這類修改和改變屬于待批權利要求的范圍。
權利要求
1.根據治療需要刺激患者血細胞生成的方法，所述方法包括對所述患者給予藥物有效量的組合物的步驟，該組合物包括一種或多種通式I描述的化合物、一種或多種通式II描述的化合物、一種或多種通式III描述的化合物或其組合 其中R1是直鏈或支鏈的飽和或不飽和C7-C11烷基；A和B獨立為氫或 且A不必與B相同；且X是羥基、含有金屬一價或二價抗衡陽離子的負氧離子或含有直鏈或支鏈C1-C4烷基部分的烷氧基。
2.權利要求1所述方法，其中所述組合物包括至少兩種由通式I描述的化合物的混合物，這些化合物是中鏈甘油三酯(MCTs)，其中A＝B＝R1分別是直鏈或支鏈的飽和或不飽和C7和C9烷基。
3.權利要求2所述方法，其中所述混合物由兩種甘油三酯組成，其中第一種MCT由通式I描述且A＝B＝R1＝CH3(CH2)6-，而第二種MCT由通式I描述且A＝B＝R1＝CH3(CH2)8-。
4.權利要求2所述方法，其中所述組合物進一步包括各自為0.1％-3％的由通式I描述且A＝B＝R1＝CH3(CH2)4-的第三種化合物和由通式I描述且A＝B＝R1＝CH3(CH2)10-的第四種化合物。
5.權利要求2所述方法，其中所述混合物包括由下列通式描述的C8和C10脂肪酸甘油三酯的4種幾何異構體 1234n＝6 6 6 8m＝6 6 8 8p＝6 8 8 8
6.權利要求1所述方法，其中所述組合物包括由通式II描述且X是OH的一種或多種化合物，它是中鏈脂肪酸。
7.權利要求1所述方法，其中所述組合物包括由通式III描述且X是OH的一種或多種化合物。
8.權利要求1所述方法，其中所述組合物包括由通式II描述且X是含有金屬抗衡離子的負氧離子的一種或多種化合物，所述金屬抗衡離子選自鈣、鎂、鉀和鈉。
9.權利要求1所述方法，其中所述組合物包括由通式III描述且X是含有金屬抗衡離子的負氧離子的一種或多種化合物，所述金屬抗衡離子選自鈣、鎂、鉀和鈉。
10.權利要求6所述方法，其中所述一種或多種化合物是辛酸或癸酸。
11.權利要求8所述方法，其中所述一種或多種化合物是辛酸鈉或癸酸鈉。
12.權利要求8所述方法，其中所述一種或多種化合物是辛酸鈣或癸酸鈣。
13.權利要求1所述方法，其中所述一種或多種化合物是辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯。
14.權利要求1所述方法，其中所述一種或多種化合物具有大于1μM的血藥濃度。
15.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因所述患者化療導致的骨髓抑制。
16.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因所述患者放療導致的骨髓抑制。
17.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內的慢性中性白細胞減少。
18.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內的短暫中性白細胞減少。
19.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因血液病導致所述患者體內的中性白細胞減少。
20.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內藥物誘發的中性白細胞減少。
21.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因營養缺乏導致所述患者體內的中性白細胞減少。
22.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因感染導致所述患者體內的中性白細胞減少。
23.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因放療導致所述患者體內的中性白細胞減少。
24.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可使所述患者傷口愈合。
25.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可誘導中性白細胞轉移以有利于所述患者的骨髓移植。
26.權利要求1所述方法，進一步包括給予藥物有效量的人集落刺激因子的步驟，其中所述藥物有效量在有一種或多種化合物存在的情況下得到降低。
27.權利要求26所述方法，其中所述集落刺激因子是G-CSF或GM-CSF。
28.權利要求1所述方法，進一步包括在給予一種或多種化合物之前和/或之后單獨給予藥物有效量的人集落刺激因子的步驟，但不同時給藥。
29.權利要求28所述方法，其中所述集落刺激因子是G-CSF或GM-CSF。
30.權利要求1所述方法，進一步包括同時給予藥物有效量的人細胞因子的步驟。
31.權利要求30所述方法，其中所述細胞因子是白細胞介素2或白細胞介素15。
32.含有辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯氮雜類似物的化合物，其中氮雜類似物是1，2，3-O，N，O-三辛酰基絲氨醇或1，2，3-O，N，O-十三酰基絲氨醇。
33.混有一種或多種任選的稀釋劑、載體和/或賦形劑且用量或劑量足以制成藥物制劑的由通式IV描述的化合物
34.混有一種或多種任選的稀釋劑、載體和/或賦形劑且用量或劑量足以制成藥物制劑的由通式V描述的化合物
35.混有一種或多種任選的稀釋劑、載體和/或賦形劑且用量或劑量足以制成通過在體內降解而釋放權利要求1所述藥物的藥物制劑的由通式VI描述的化合物
36.根據患者對治療的需要刺激其體內血細胞生成的方法，所述方法包括給予藥物有效量的權利要求32-35中任意一項的一種或多種化合物的步驟。
37.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因所述患者化療導致的骨髓抑制。
38.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因所述患者放療導致的骨髓抑制。
39.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內的慢性中性白細胞減少。
40.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內的短暫中性白細胞減少。
41.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因血液病導致所述患者體內的中性白細胞減少。
42.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療所述患者體內藥物誘發的中性白細胞減少。
43.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因營養缺乏導致所述患者體內的中性白細胞減少。
44.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因感染導致所述患者體內的中性白細胞減少。
45.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因放療導致所述患者體內的中性白細胞減少。
46.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可使所述患者傷口愈合。
47.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可誘導中性白細胞轉移以有利于所述患者體內的骨髓移植。
48.權利要求36所述方法，進一步包括同時給予藥物有效量的人集落刺激因子的步驟，其中所述藥物有效量在有一種或多種化合物存在的情況下得到降低。
49.權利要求48所述方法，其中所述集落刺激因子是G-CSF或GM-CSF。
50.權利要求36所述方法，進一步包括在給予一種或多種化合物之前和/或之后單獨給予藥物有效量的人集落刺激因子的步驟，但不同時給藥。
51.權利要求50所述方法，其中所述集落刺激因子是G-CSF或GM-CSF。
52.權利要求36所述方法，進一步包括同時給予藥物有效量的人細胞因子的步驟。
53.權利要求52所述方法，其中所述細胞因子是白細胞介素2或白細胞介素15。
54.一種或多種化合物在制備用于刺激血細胞生成的藥物中的用途，所述一種或多種化合物選自由通式I、II、III描述的化合物及其組合 其中R1是直鏈或支鏈的飽和或不飽和C7-C11烷基；A和B獨立為氫或 且A不必與B相同；且X是羥基、含有金屬一價或二價抗衡陽離子的負氧離子或含有直鏈或支鏈C1-C4烷基部分的烷氧基。
55.權利要求1所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因船運或運輸產生的壓力所致的動物體內短暫中性白細胞減少。
56.權利要求36所述方法，其中刺激血細胞生成可治療因船運或運輸產生的壓力而所致的動物體內短暫中性白細胞減少。
全文摘要
本發明提供了用于促進中性白細胞存活和活化的組合物和方法，諸如作為化療和放療的不需要的副作用產生的中性白細胞減少的治療方法。根據人和動物的治療需要對其給予足以減少和消除中性白細胞減少用量的組合物，該組合物含有諸如癸酸和辛酸這樣的中鏈脂肪酸或其鹽或其甘油三酯或其甘油單酯或甘油二酯或其它類似物或中鏈甘油三酯(MCT)。給予有效治療該病用量的所述組合物。該方法還用于處理骨髓移植和治療各種中性白細胞減少性疾病。
文檔編號A61P17/02GK1633286SQ02809426
公開日2005年6月29日 申請日期2002年4月18日 優先權日2001年4月18日
發明者L·加尼翁, J·巴拉比, P·勞林, C·彭尼, B·扎卡里 申請人:普羅米蒂克生物科學公司