專利名稱：抗卵圓形糠秕孢子菌igy及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗卵圓形糠秕孢子菌(Pityrosporum ovale)的抗體和它的用途。更具體地，本發明提供一種生產該抗體的方法，該方法是通過從卵圓形糠秕孢子菌分離出特異蛋白質，采用該蛋白質使動物產生免疫，并從動物獲取抗卵圓形糠秕孢子菌的抗體；抗卵圓形糠秕孢子菌IgY用于預防或治療由卵圓形糠秕孢子菌引起的頭皮屑和脂溢性皮炎，卵圓形糠秕孢子菌是引起頭皮屑和脂溢性皮炎的原因。
背景技術：
卵圓形糠秕孢子菌是親脂性酵母菌，它是正常人體皮膚上，特別是頭皮上正常菌群的一員。卵圓形糠秕孢子菌涉及幾種皮膚病，特別是頭皮屑和脂溢性皮炎。如果卵圓形糠秕孢子菌對正常菌群的比例是74％或更大，隨著這一數量將表現出頭皮屑癥狀，并引起瘙癢。當比例達到83％或更大時，脂溢性皮炎將會發作(Shuster，S.Br，J.Dematol，3，235(1984)；McGinley，K.J.等J Invest.Dermatol.64，40(1975))。當頭皮屑為異常狀態的情況下，卵圓形糠秕孢子菌的形式是菌絲而不是菌孢子的形式，這使得治療更加困難。因此，頭皮屑病情變成慢性的(Mycos 199740 suppll29-32)。
為改進皮膚狀況，已經使用包括防頭皮屑的組分如酮康唑(Ketoconazole)、巰氧吡啶鋅(Zinc Pyrithion)、甘寶素(Climbazole)和其它產品。然而，這些產品的組分對卵圓形糠秕孢子菌的特異性較低，因此在殺死卵圓形糠秕孢子菌的同時也將有用的微生物殺死了。因此，非常可能的是在脂溢性狀態下，卵圓形糠秕孢子菌成為頭皮中的主要微生物。
先前有幾種采用抗體，特別是卵黃抗體除去病原微生物的例子。典型的例子是抗痤瘡細菌的抗體，和誘導牙齒腐蝕的細菌(韓國專利未決公開No.1997-73607)。此外，韓國專利未決公開No.2000-49499公開了使用保持抗幽門纏繞桿菌(Helicobacter pylori)抗體效價的主體卵黃液體和希望用于預防通常的微生物和酵母污染的發酵奶的制備方法。同樣，發酵奶是市售的(KOREA YAKURT Co.，韓國)。然而，迄今為止還沒有介紹與卵圓形糠秕孢子菌有關的產品或抗體。
發明內容
發明概述本發明提供一種抗卵圓形糠秕孢子菌IgY，一種IgY的生產方法，和抗卵圓形糠秕孢子菌IgY用于預防和治療由卵圓形糠秕孢子菌引起的頭皮屑或脂溢性皮炎的用途。通過從卵圓形糠秕孢子菌分離特異性蛋白質，采用特異蛋白質使產卵母雞產生免疫，然后從卵黃分離抗體而生產IgY。
發明詳述本發明涉及一種抗卵圓形糠秕孢子菌抗體，和它的用途。更具體地，本發明涉及使用該抗體以消除頭皮屑和治療脂溢性皮炎，其中該抗體的生產是通過從卵圓形糠秕孢子菌分離特異性蛋白質，采用該蛋白質使產卵母雞產生免疫，并在卵黃中獲得抗體。
與先前技術相比，本發明使用抗卵圓形糠秕孢子菌抗體的制備方法，用于抑制卵圓形糠秕孢子菌增殖或抑制一些卵圓形糠秕孢子菌分泌的酶，卵圓形糠秕孢子菌在皮膚或頭皮上，通常引起并惡化頭皮屑、脂溢性皮炎和特異反應性皮炎。由于抗體自身是從食用蛋分離的生物大分子，與化學抗真菌劑或激素相比不具有有害效果。因此，它是一種預防和治療頭皮屑、脂溢性皮炎和特異反應性皮炎的安全材料。
根據本發明，抗卵圓形糠秕孢子菌抗體的制備方法包括如下四個步驟1.制備抗卵圓形糠秕孢子菌的抗原；2.采用抗原使產卵母雞產生免疫以生產含有抗卵圓形糠秕孢子菌IgY的卵黃；3.分離IgY；和4.制備包括抗卵圓形糠秕孢子菌的IgY的組合物。
本發明的抗體的制備是通過采用抗原(如卵圓形糠秕孢子菌)使動物產生免疫，從動物的血液或卵獲得抗體。可用于本發明的動物包括哺乳動物(如兔子)，和家禽。優選使用雞、鴨和火雞，更優選產卵母雞。注射抗原和獲得抗體的方法對本發明涉及的相關領域中的技術人員是公知的。
在本發明的優選實施方案中，抗原可以是卵圓形糠秕孢子菌的粗提取物或純化的細胞壁組分。有報導，卵圓形糠秕孢子菌在細胞壁中含有獨特的37KD和67KD蛋白質，而在其它酵母菌中沒有發現這些蛋白質。試驗結果顯示抗獨特蛋白質的單克隆抗體與卵圓形糠秕孢子菌的結合活性為90％或更大(Zargari.A等，Clin Exp Allergy 1997，5月，2795；584-92頁)。因此，本發明的發明人使用卵圓形糠秕孢子菌的粗提取物和細胞壁的組分作為抗原。
在家禽的血液中，存在數量分別為5.0mg，1.25mg和0.61mg每ml血清，對應于哺乳動物IgG，IgM和IgA的免疫球蛋白。產卵家禽具有通過被動免疫向小雞轉移免疫組分的特性。結果是，抗體可以在卵中積累。三種免疫球蛋白中僅有IgG保留在卵黃中，因此它稱為IgY(免疫球蛋白卵黃)。IgY的濃度是約25mg每ml卵黃，它已知為優異的多克隆抗體。
與其它從哺乳動物獲得抗體的方法相比，從產卵母雞獲得特異抗體有很大的優點。即，單個卵可含有約90-100mg抗體，這與從兔子提取的血液中包含的數量相當。收集產生免疫的雞的卵比從哺乳動物抽取血液更容易，并且收集卵并不需要犧牲動物。此外，由于容易促進免疫雞的大規模飼養，可以生產更多的抗體。
特別地，可以采用約40kg每年的數量生產產卵母雞的IgY，該數量是用兔來生產的120倍。由于在家禽和哺乳動物之間的系統發育的差異，家禽的IgY并不需要與哺乳動物IgG交叉反應，它對于生產哺乳動物抗原特異的IgY是非常有用的。最重要的是，通過使用生產抗體的產卵母雞，可以重復生產穩定的活性抗體，因此使標準化制造工藝和研究開發產品成為可能。
本發明的特性在于使用含有抑制卵圓形糠秕孢子菌增殖的抗體的卵作為有效組分制備用于消除頭皮屑或脂溢性皮炎的組合物。
根據本發明的抗原可以由肌內、皮下、靜脈內、腹腔或口服給藥。其中，優選是肌內注射。按照抗原中的蛋白質含量，給藥抗原的劑量可以為10μg或1mg，同時還依賴于動物的條件或狀況。重復注入抗原直到抗體的數量達到最大值，該最大值可以由卵黃中特異抗體數量的轉變來檢驗，由ELISA(酶聯免疫吸附測定)方法檢驗。
根據本發明的抗體可以從上述卵中用分離抗體的通常方法分離。卵自身可以在干燥和粉末化之后用作抗體，它進一步包括整個卵粉、卵黃粉和水溶性卵黃蛋白質粉。可以從卵黃精制抗體。純化的抗體可用于制備藥物組合物，該藥物組合物用于預防和治療由卵圓形糠秕孢子菌引起的皮膚疾病，特別是防頭皮屑和脂溢性皮炎。
為檢驗抗卵圓形糠秕孢子菌抗體預防和治療頭皮屑、脂溢性皮炎和特異反應性皮炎的效果，采用香波和外用配方，將測試應用于具有皮膚疾病如頭皮屑或脂溢性皮炎和特異反應性皮炎的一些人。結果是，抗卵圓形糠秕孢子菌的卵黃抗體可以抑制糠秕孢子菌屬的生長和活性，用作預防和治療頭皮屑和脂溢性皮炎的有效組分。
以下實施例僅用于說明本發明而不限制由權利要求確定的本發明范圍。
具體實施例方式
實施例1卵圓形糠秕孢子菌的培養將卵圓形糠秕孢子菌在37℃下在布魯氏肉湯(Difco)中培養3-4天，其中加入抗生素(Skirrow’s補充物)和少量無菌油。
實施例2抗原的生產凍干卵圓形糠秕孢子菌從KCTC(Korean Collection for Type Cultures)購得用于制備抗原。將卵圓形糠秕孢子菌在布魯氏肉湯培養基(Difco)中培養，其中補充抗生素(Skirrow’s補充物)和少量無菌油。將培養的細胞在3000×g下離心分離，然后在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中再懸浮。在超聲波破碎細胞之后，在10,000×g下離心15分鐘除去沒破碎的細胞。然后，將上清液取出，在100,000×g下超離心沉淀30分鐘。將沉淀的細胞在蒸餾水中再懸浮，并用作下面試驗的抗原。
實施例3細胞壁組分的純化在獲得根據實施例1在布魯氏肉湯培養基中培養的細胞之后，將細胞在普通鹽水溶液中清洗三到五次，然后在鹽水溶液中懸浮。將細胞用超聲波完全破碎。然后，將細胞液采用多孔纖維素或尼龍網過濾以分離細胞壁的不溶性組分，或采用實施例2中的離心方法沉淀。濾液或沉淀物用作下面試驗的抗原。
實施例4制備含有抗體的卵黃已經開始產卵的21周齡的母雞(Hy-Line Brown)用于抗體的生產。將在實施例2和3中獲得的抗原與弗氏完全佐劑(Sigma chemical Co.)以相同數量混合，然后乳化。將1ml乳化抗原肌內注入母雞腿中，然后在六周內再注射3次。收集免疫的卵用于測試免疫效價和與抗原的結合親合力。
實施例5IgY結合活性的測試為確定生產的卵黃抗體的效應，使用ELISA方法。由如下方法純化要使用的卵黃抗體(IgY)。
將5ml卵黃液體與5ml蒸餾水混合和加入20ml的0.15％λ紅藻膠(Carageenan)，在室溫下放置30分鐘。然后，將溶液在20℃，3,000×g下離心15分鐘，取出上清液。向上清液中加入15％硫酸鈉(約3g)，攪拌，在室溫下放置40分鐘，在10,000×g下離心15分鐘生產沉淀物。將沉淀物在磷酸鹽緩沖溶液中再懸浮以獲得抗體。
將1×109細胞/ml卵圓形糠秕孢子菌倒入五個10ml管中，將兩種類型的抗體以12.5，25，50，和100mg/ml的數量加入到五個管的四個中。沒有抗體的管用作對照物。將細胞搖動，在37℃下培養2小時。然后，將1ml培養物溶液取出，在60℃下加熱30分鐘，然后冷存。
抗體反應的結果由ELISA滴定方法測量并示于表1。
如表1所示，采用細胞壁組分生產的IgY具有更高的結合活性。證明用于降低細胞數目一半的抗體濃度是25mg/ml。
表1在各種IgY濃度下的卵圓形糠秕孢子菌細胞數目ELISA滴定方法按照如下步驟進行(1)采用包被緩沖劑稀釋每組中的卵圓形糠秕孢子菌直到蛋白質濃度達到5μg/ml，每孔100μl溶液，在每個孔注入稀釋的卵圓形糠秕孢子菌，并在4℃下保持48小時；(2)將100μl封閉緩沖劑加入到溶液中并在37℃下反應2小時；(3)采用洗滌溶液清洗3次；(4)采用封閉緩沖劑稀釋從卵黃精制的IgY到100μg/ml，每孔注入100μl，在4℃下保持過夜或在37℃下孵化2小時；(5)采用洗滌溶液清洗5次；(6)采用封閉緩沖劑以1∶1000的比例稀釋山羊抗-小雞IgY-AP結合物，每孔注入100μl，在37℃下孵化2小時；(7)每孔加入100μl的底物，并在暗室中在30℃下反應；(8)采用洗滌溶液清洗6次；(9)加入100μl終止液；和(10)由ELISA讀出器(450nm)讀出。
實施例6純化從卵黃生產的IgY收集含有抗卵圓形糠秕孢子菌的抗體的免疫卵。從卵中分離5ml的卵黃與5ml蒸餾水和20ml的0.15％λ紅藻膠(Carageenan)混合，在室溫下放置三十分鐘。在20℃下，3,000×g離心十五分鐘之后，取出上清液。將硫酸鈉加入到上清液中達到19％的最終濃度，然后在室溫下放置四分鐘。然后，將溶液在10,000×g下離心十五分鐘獲得沉淀物，將溶液采用磷酸鹽緩沖溶液增溶以生產抗體。采用BCA蛋白質測試試劑盒(Pierce)測量總的蛋白質濃度。將在280nm下測量的吸光度除以IgY的吸收系數1.33，用小雞IgY的標準曲線(Promega)校正，而獲得IgY濃度。
實施例7純化的卵黃防頭皮屑效果的測試由皮膚盤擴散方法(Skin Disc Diffusion Method)測試防頭皮屑效果。首先，將卵圓形糠秕孢子菌接種到瓊脂平板中，然后在37℃，需氧條件下培養兩天。將圓形紙片(disc paper)采用70％乙醇消毒，用酮康唑、巰氧吡啶鋅、甘寶素、水楊酸和防頭皮屑IgY在不同濃度下處理，并放置在瓊脂平板上。在37℃下孵化48小時之后，測量3次抑制區的尺寸，平均尺寸見表2，其中抑制區為包括紙片尺寸(1.2cm)的無菌區域。
根據表2，抗卵圓形糠秕孢子菌抗體的無菌區域的直徑大于已知化合物。然而，與已知化合物相比，給出的IgY的摩爾濃度和擴散速率較低，IgY可能更為有效。
表2皮膚盤擴散方法的結果(n＝3)實施例8-11包括卵黃抗體的防頭皮屑香波制造包含抗卵圓形糠秕孢子菌抗體的香波，并測試防頭皮屑效果。
將pytoctoneamine、巰氧吡啶鋅或IgY溶于蒸餾水，按表3所示的數量加入十二烷基硫酸鈉，聚氧乙烯十二烷基醚硫酸鈉(SodiumPolyoxyethylenelauryl ether sulfate)，二乙醇十二烷基酰胺(diethanollaurylamide)和丙二醇，加熱到60℃。然后，將溶液冷卻到40℃，與顏料，對苯甲酸酯，香料和檸檬酸混合，冷卻到室溫以生產香波。
*注卵黃抗體為根據實施例6通過純化而生產的。
表3香波配方(單位重量百分比)對比例1-3包含卵黃抗體的防頭皮屑香波為比較使用抗卵圓形糠秕孢子菌的卵黃抗體的防頭皮屑香波的效果，包含已知化合物的香波組合物見表3。
試驗1防頭皮屑效果的臨床測試由實施例8-11和對比例1-3的方法制備的香波的防頭皮屑和瘙癢效果測試如下。
將香波用于到四十九名有頭皮屑問題一個月的男性和女性志愿者。在志愿者采用通常使用的香波產品洗頭之后，將在三天內積累的頭皮屑收集并稱重。相同的志愿者采用表2所示的香波產品每隔一天洗頭一次持續1個月，將在三天內積累的頭皮屑收集并稱重。由真空吸入設備從頭皮收集積累的頭皮屑。
頭皮屑的降低率計算如下。
頭皮屑降低率(％)＝(在試驗之前的頭皮屑重量(mg)-在1個月之后的頭皮屑重量(mg))/在試驗之前的頭皮屑重量(mg)×100測試結果見表4。
表4試驗2防頭皮屑效果的微生物學試驗將表3中的香波材料加入到分別含有5.00、1.00、0.50、0.10、0.05、0.01和0.005％(wt)玉米油的Ym肉湯中以生產培養介質。將105-106CFU(菌落形成單元)/ml的卵圓形糠秕孢子菌在培養介質中接種并培養兩天。從培養物獲得最小抑制濃度(MIC)。測試結果見表5。
表5如從以上實施例所示，本發明提供包括抗卵圓形糠秕孢子菌抗體的防頭皮屑組合物，該抗體通過采用作為抗原的卵圓形糠秕孢子菌使產卵母雞產生免疫而生產，具有抑制卵圓形糠秕孢子菌增殖的活性。
權利要求
1.一種抗卵圓形糠秕孢子菌的抗體，通過采用卵圓形糠秕孢子菌作為抗原使動物產生免疫，然后從動物的干燥的血液或卵黃分離抗體而生產該抗體。
2.根據權利要求1的抗體，其中動物是兔子或產卵的母雞。
3.根據權利要求1的抗體，其中抗原是卵圓形糠秕孢子菌的粗提取物或細胞壁組分。
4.根據權利要求1的抗體，其中抗原是37kD蛋白質或67kD蛋白質，該蛋白質對卵圓形糠秕孢子菌是特異的，存在于卵圓形糠秕孢子菌細胞壁的表面上。
5.一種預防頭皮屑的組合物，包括作為有效劑的權利要求1～4任意一項的抗卵圓形糠秕孢子菌的抗體。
6.一種治療脂溢性皮炎的組合物，包括作為有效劑的權利要求1～4任意一項的抗卵圓形糠秕孢子菌的抗體。
全文摘要
本發明涉及一種卵圓形糠秕孢子菌的抗體和它的用途。更具體地，本發明提供對卵圓形糠秕孢子菌的抗卵圓形糠秕孢子菌IgY，以及制備抗卵圓形糠秕孢子菌IgY的方法是通過超聲波破碎卵圓形糠秕孢子菌以生產抗原，用該抗原使產卵母雞免疫以生產IgY，并分離IgY。本發明還提供抑制頭皮屑和改善脂溢性皮炎的組合物。
文檔編號A61K39/395GK1524091SQ02808231
公開日2004年8月25日 申請日期2002年4月15日 優先權日2001年4月14日
發明者李鐘和, 司空貞, 張東逸, 俞昶善, 張基浩, 全真姬 申請人:高臺株式會社, 李&曺生物技術株式會社