專利名稱：硫藤黃菌素二氧化物及其衍生物在制備用于治療cns疾病的藥物中的用途及其制備方法
技術領域：
本發明涉及硫藤黃菌素二氧化物及其衍生物在生產用于治療CNS疾病的藥物中的應用，涉及通過微生物擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)種ST100692，DSM 13834的發酵制備它們的方法，還涉及微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM 13834。
硫藤黃菌素是已知的天然化合物，可通過商業途徑得到(ApinChemical，UK；CMS Speciality Chemicals，UK；Ubichem plc，UK)。硫藤黃菌素二氧化物也是已知的化合物。制備硫藤黃菌素二氧化物的一個已知方法是用間氯過苯甲酸氧化硫藤黃菌素(產率為30％)，該方法在Schachtner等，J.Heterocycl.Chem.，1999，161-175中有描述。
以前已描述硫藤黃菌素二氧化物有藥用性質。WO 99/12543描述了將硫藤黃菌素二氧化物用作抗瘤藥物，WO 96/32396描述了將硫藤黃菌素二氧化物用作抗細菌和抗真菌的藥物。
現在令人驚訝的發現硫藤黃菌素二氧化物是溶神經素的有效抑制劑。溶神經素屬于含鋅的金屬蛋白酶家族。它可能扮演著使作為內源性抗精神病藥的神經降壓肽生理失活的角色。硫藤黃菌素二氧化物抑制溶神經素對神經降壓肽的失活作用，因此可用于治療神經變性疾病如帕金森癥和阿爾茨海默氏病。硫藤黃菌素二氧化物還具有選擇性，因為它不阻斷別的含鋅的金屬蛋白酶如腦啡肽酶或血管緊張肽轉化酶。
此外，現在已經發現微生物擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)種ST 100692，DSM 13834能相對高產地形成硫藤黃菌素二氧化物。
因此本發明涉及式1化合物以及其生理上可耐受的鹽在生產治療CNS疾病的藥物中的應用，
其中，R1，R2，R3獨立地選自H、烷基和酰基。
在優選的式1化合物以及其生理上可耐受的鹽中R1為酰基，R2為H且/或R3為烷基。
式1化合物中的酰基基團可有2到10個碳原子，優選為2到6個碳原子，且可以是直鏈或支鏈，飽和的或有一個或兩個不飽和鍵。
有兩個碳原子的酰基基團意味著，例如乙酰基。
飽和直鏈酰基基團的例子有乙酸殘基、丙酸殘基、丁酸殘基、戊酸殘基、己酸殘基、庚酸殘基、辛酸殘基、壬酸殘基和癸酸殘基。
有一個不飽和鍵的直鏈酰基基團的例子有丙烯酸殘基和巴豆酸殘基。
有兩個不飽和鍵的直鏈酰基基團的一個例子是山梨酸殘基。
式I化合物中的烷基可有1到6個碳原子，且可以是直鏈或支鏈的。此外，烷基基團包括飽和與不飽和基團，其中不飽和基團可含有一個或兩個雙鍵。含有1到6個碳原子的烷基基團的例子是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、所有這些基團的正異構體(n-isomer)、異丙基、異丁基、1-甲基丁基、異戊基、新戊基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基和異己基。
不飽和的烷基基團是，例如鏈烯基基團如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(＝烯丙基)、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、5-己烯基或1，3-戊二烯基。
在一個實施方案中，本發明涉及式II化合物
或其生理上可耐受的鹽在生產用于治療CNS疾病的藥物中的用途。
式I化合物可用于治療由高出循環正常水平的溶神經素引起的疾病。可用式I化合物治療的CNS疾病包括精神病如精神分裂癥和神經變性疾病如阿爾茨海默氏病和帕金森癥。
可通過在適當的條件下發酵微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM13834或其一種變種或突變株，分離至少一種化合物，并在適當時將其轉化為生理上可耐受的鹽、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的鹽而得到式I化合物。
本發明因此涉及式I化合物的生產方法，包括將微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM 13834或其突變株或變種在水性營養培養基中培養、分離并純化至少一種目標化合物并任選地將其轉化成生理上可耐受的鹽、衍生物或該衍生物的生理上可耐受的鹽。
除了產生硫藤黃菌素二氧化物，擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM 13834還在所述發酵條件下產生硫藤黃菌素。得到的硫藤黃菌素可用本領域技術人員已知的方法分離并轉化成硫藤黃菌素二氧化物。
因此，一個備選的生產本發明式I化合物的方法包括將微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM 13834或其突變株或變種在水性營養培養基中培養、分離并純化硫藤黃菌素、將硫藤黃菌素轉化成至少一種目標化合物并任選地進一步轉化成生理上可耐受的鹽、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的鹽。
根據布達佩斯條約將微生物擬諾卡氏菌種ST 100692于2000年11月13日保藏在德意志微生物保藏中心(Dertsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，Mascheroder weg 1b，D-38124Braunschweig)，保藏號是DSM 13834。
用氣相色譜分析脂肪酸對微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM 13834進行分類鑒定，發現其特征性酸為140異(iso)，150反異(anteiso)，150異，160，160異，170，170異，170反異和180。菌落顏色是鉻黃色，形成白色氣生菌絲體，尤其是在ISP 2(酵母-麥芽)和ISP 3(燕麥粉)培養基上的時候。
代替菌株DSM 13834也可以用其突變株和變種，只要它們能合成本發明的化合物。這些突變株可通過本身已知的物理方法如輻射，例如，甲磺酸乙酯(EMS)；2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-硝基胍(MNNG)產生。
可以通過測定培養液中積累的活性物質的生物活性，例如用下述方法檢測對溶神經素的抑制效果來篩選生產本發明化合物的突變株和變種。
適宜的且優選的需氧發酵的碳源為可同化的糖類和糖醇如葡萄糖、乳糖或D-甘露醇以及含糖的天然產物如麥芽汁。適宜的含氮營養物為氨基酸、肽和蛋白質以及它們的降解產物如蛋白胨或胰蛋白胨和肉膏，碾磨過的種子，如谷類、小麥、大豆或棉花植物的種子，來自制酒的蒸餾殘渣、肉粉或酵母抽提物，以及銨鹽和硝酸鹽。營養液中可含有的無機鹽為，例如，堿金屬或堿土金屬、鐵、鋅、鈷和錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。
例如在一種營養培養基中可特別好的形成硫藤黃菌素二氧化物，該培養基含有約0.5％到5％的葡萄糖(優選1％到2％)，0.5％到5％的大豆粉(優選1％到2％)，0.1％到1.5％的玉米漿(液體)(優選0.3％到0.8％)，0.05％到1.0％碳酸鈣(優選0.1％到0.5％)和0.05％到1％的氯化鈉(優選0.3％到0.8％)，在每種情況下都基于完整營養液的重量計。
培養在有氧條件下進行，也就是說，例如，在搖瓶或發酵罐中振蕩或攪拌進行浸沒培養，適當時通入空氣或氧氣。發酵可在，例如各種體積的廣口瓶或圓底燒瓶，玻璃發酵罐或不銹鋼發酵罐中進行。發酵溫度范圍可以為約20到35℃，優選約25到30℃。pH應該在4到10之間，有利的是在6到8之間。該微生物在這些條件下一般發酵20到200小時，優選24到150小時。
培養有利地分為幾個階段，即最初在液體營養培養基中產生一個或多個預培養物，然后將其轉到真正的生產培養基——主要培養基中，例如以1∶10的體積比。通過例如將已形成孢子的菌絲體轉到營養溶液中生長約20到120小時，優選24到90小時后得到預培養物。已形成孢子的菌絲體可通過例如將菌株在固體或液體營養培養基如酵母-麥芽瓊脂或馬鈴薯-葡萄糖瓊脂上生長約1到40天，優選5到12天得到。
可根據本領域技術人員已知的方法，例如通過生物學鑒定法檢測生物活性或通過層析方法如薄層層析(TLC)或高效液相層析(HPLC)跟蹤發酵的進展和本發明化合物的形成。
式I化合物可在菌絲體和培養物濾液中存在，但主要的量通常在生物量(菌絲體)中出現。因此有利的是通過過濾或離心將菌絲體與培養物濾液分離。將濾液用不和水混溶的溶劑如1-丁醇，乙酸乙酯、氯仿等萃取。有利的是將菌絲體用甲醇或丙酮提取，但也可以用上面提到的不和水混溶的溶劑。
提取可在很寬的pH范圍中進行，但有利的是在中性介質中，優選pH在4到8之間進行。有機萃取物可例如真空濃縮并干燥。
一種純化的方法是在吸附樹脂如DiaionHP-20(Mitsubishi Casei.，Tokyo)，AmberliteXAD7(Rohm and Haas，USA)和AmberchromCG(Toso Haas，Philadelphia，USA)上進行層析。合適的還有各種反相載體，例如熟知的用在如高壓液相層析(HPLC)系統中的RP18。
式I化合物可用類似上述的方法或本領域技術人員已知的其他方法分離和純化。
上面式I也包括硫藤黃菌素二氧化物的衍生物。這些衍生物有和硫藤黃菌素二氧化物相同的功效或者可以在溫和條件下轉化成和硫藤黃菌素二氧化物有相同功效的化合物。這些衍生物可通過本領域技術人員熟知的方法制備。下面給出式I所覆蓋的硫藤黃菌素二氧化物衍生物中的一些的制備方法的實例1)通過酸或堿可將硫藤黃菌素二氧化物的乙酰基(外向環)切開，方法見文獻例如‘Protective Groups in Organic Synthesis’，第三版，T.Greene&P.Wuts，John Wiley&Sons，1999，pp 553-555中的描述。
2)可通過例如還原性烷基化將硫藤黃菌素二氧化物的游離氨基烷基化，方法在‘Advanced Organic Chemistry’，第四版，J.March，John Wiley&Sons，1992，PP 898-900中有描述。
3)可通過本領域技術人員熟知的標準步驟用例如酰氯或酸酐將硫藤黃菌素二氧化物的氨基酰化。
式I化合物的其他衍生物包括通過例如P.N.Rylander在文獻‘Hydrogenation Methods’，Academic Press，New York(1985)，第2章中所給的方法將式I化合物如硫藤黃菌素二氧化物中至少一個雙鍵還原或通過H.O.House在‘Modern Synthetic Reactions’，W.A.Benjymin，Inc.，NewYork(1972)，PP 446-452中所給的方法脫鹵化氫所得到的化合物。
本發明的化合物可轉化成藥學上可接受的鹽。這些鹽可用本領域技術人員已知的標準方法制備。
式I化合物的生理上可耐受的鹽是指在Remington’s PharmaceuticalSciences(第17版，1418頁(1985))中描述的其有機和無機鹽。鹽比如鈉鹽和鉀鹽可通過例如將本發明化合物用適宜的鈉或鉀的械處理而制備。
本發明的另外一個方面是式I化合物的前體藥物的應用。這種前體藥物可在體內被代謝成式I化合物，如硫藤黃菌素二氧化物。這些前體藥物本身可有活性或沒有活性。
式I化合物可以以各種多形性(polymorphous)的形態如無定型的和結晶多形性的形態存在。式I化合物的所有多形性形態都落在本發明范圍內且是本發明的另外一個方面。
本發明的化合物及其藥學上可接受的鹽和衍生物可本身或以相互混合物的形式作為藥物施用于動物，優選哺乳動物，特別是人類。
因此適宜的藥物組合物包含一種或多種式I或II化合物或者其藥學上可接受的鹽的有效量以及藥學上可接受的載體。
根據本發明的化合物可口服、肌內、靜脈內或用其他方式給藥。含有這些化合物或其藥學上可接受的鹽或衍生物以及任選地還含有其他具有藥物活性的物質的藥物組合物可通過將這些活性化合物和一種或多種藥學上可耐受的助劑和/或賦形劑混合進行制備。然后，該混合物可轉化成適宜的藥物形式，如片劑、包衣的片劑、膠囊、粒劑、粉劑、乳劑、混懸液或溶液。
可以提到的助劑和/或賦形劑的實例為填充劑、乳化劑、潤滑劑、掩蔽調味劑、著色劑和緩沖物質黃蓍膠、乳糖、滑石、瓊脂、聚乙二醇、乙醇和水。合適的且優選的胃腸外用藥形式為水懸浮液或水溶液。還可以不加賦形劑或稀釋劑將這些活性物質就此以合適的形式如以膠囊的形式給藥。
生產合適的藥物的一種方法包括將至少一種根據本發明的化合物與藥學上合適的且生理上可耐受的載體以及適當時其他合適的活性物質、添加劑或賦形劑轉化成合適的劑型。
通常，適用于特定病例的蓋倫(galenic)制劑和給藥方法以及劑量范圍取決于要治療的物種和各自病癥或疾病的狀況，且可用本領域已知的方法進行優化。使用固體劑型如片劑或膠囊，每日給藥可以最多500mg，優選0.1到250mg。對于胃腸外給藥，日劑量可以最多300mg，優選0.5到150mg。
下面是本發明的舉例說明性實例，但不是對本發明范圍的限制。
實施例1生產菌株擬諾卡氏菌種DSM 13834的孢子懸浮液的制備取100ml營養溶液(4g/l酵母抽提物，15g/l可溶性淀粉，1g/l K2HPO4，0.5g/l MgSO4×7H2O溶于1000ml水中，滅菌前pH為7.0)置于300ml無菌錐形瓶中，接種菌株擬諾卡氏菌種DSM 13834并在旋轉搖床上以180rpm于28℃孵育5天。然后，1.5ml該培養物用1.5ml 99％的甘油稀釋并保存在-20℃。
實施例2在錐形瓶中制備生產菌株的培養物或預培養物在含有100ml營養溶液(15g/l大豆粉，15g/l葡萄糖、5g/l玉米漿液，5g/l NaCl和2g/l CaCO3)的滅菌錐形瓶中接種在斜面管(同樣的營養溶液但加入2％瓊脂)上生長的培養物或1ml甘油培養物(見實施例1)，在搖床上以180rpm于25℃孵育。約96小時后達到最大的硫藤黃菌素二氧化物產量。以約5％進行接種，72小時的浸沒培養物(根據搖瓶培養的方法產生但使用了下面的培養基15g/l葡萄糖，15g/l大豆粉，5g/l玉米漿，2g/l CaCO3和5g/l NaCl，pH7.5)足夠接種10到100l的發酵罐。
實施例3硫藤黃菌素二氧化物的生產將一個200l的發酵罐按照下面的條件操作營養培養基大豆粉15g/l葡萄糖15g/l玉米漿5g/lNaCl 5g/lCaCO32g/lpH7.2(滅菌前)孵育時間60-80小時孵育溫度28℃攪拌速度50rpm通氣150l/min通過反復加入幾滴1到2ml的多元醇的乙醇溶液抑制泡沫的產生。69小時后達到最大的產量。
實施例4硫藤黃菌素二氧化物的分離將實施例3所得的3l培養物溶液凍干，然后將凍干物用甲醇(2-3l)提取。甲醇提取物真空減縮并用含10％甲醇的水稀釋。稀釋后的提取物加到裝有吸附樹脂CHP-20P的容積為1l的柱子上。用從水到乙腈的溶劑梯度洗脫。以每部分30ml進行過柱流動(30ml/min)，并收集含有所需化合物的部分，真空濃縮并凍干得到約30mg黃褐色粉末。所得粉末加到填有LUNA10 uC18(2)的柱子(寬×高＝21mm×250mm)上并用溶于0.1％醋酸銨/水的10％到60％的乙腈梯度洗脫。洗脫介質的流速為25ml/min且柱子的流出液以每部分25ml收集。發現硫藤黃菌素二氧化物位于第15和16部分中。將所述部分凍干得到1.8mg純度＞95％的硫藤黃菌素二氧化物。
硫藤黃菌素二氧化物的理化和光譜性質可概述于下分子式C8H8N2O4S2分子量260.3UV-Maxima230，302，388nm1H-和13-C NMR見表1表11H-和13-C NMR300K時DMSO中硫藤黃菌素二氧化物的化學位移
實施例5硫藤黃菌素二氧化物用作溶神經素抑制劑在384孔平板格式的CyBio移液系統上進行試驗，最終試驗體積為16μl。
簡單的說，將4μl適當稀釋的微生物提取物(在50mM pH7.5的Tris緩沖液中稀釋)分配到測試板中(Greiner，白色的384小體積孔的板)。之后向每個孔中加入4μl溶神經素(預稀釋1∶5，360ng蛋白)。在室溫下對樣品和酶進行10分鐘預孵育后，通過加入8μl溶于Tris緩沖液的底物(Mcc-Pro-Leu-Gly-D-Lys(Dnp)-OH，CALBIOCHEM)起始反應。底物的最終試驗濃度為4μM。
移液后，將板立即置于熒光計(SpectraFluorplus，SLT)中并讀出最初熒光量(λex360nm/λem 405nm)。然后將反應繼續在30℃進行30 min，記下最終的熒光讀數。
讀數最先用空白校正，然后從每個30min后的值中減去時間為0時的值，樣品抑制活力表示為100-(化合物的凈強度/對照的凈強度)×100(％)每一個試驗板含有合理數量的陽性對照和空白(用緩沖液代替酶)。
發現硫藤黃菌素二氧化物的IC50為0.6μM。
權利要求
1.式I化合物及其生理上可耐受的鹽和衍生物在生產治療CNS疾病的藥物中的用途， 其中，R1、R2和R3獨立地選自H、烷基和酰基。
2.權利要求1的式I化合物的用途，其中R1為酰基，R2為H，R3為烷基。
3.權利要求1的用途，其中所述化合物為式II所示硫藤黃菌素二氧化物
4.生產式I化合物的方法，包括將微生物擬諾卡氏菌種ST100692，DSM 13834或其突變株或變種在有氧條件下于含有碳源和氮源的營養培養基中培養直到在營養培養基中出現至少一種式I化合物，以及分離和純化該化合物。
5.生產式I化合物的方法，包括將微生物擬諾卡氏菌種ST100692，DSM 13834或其突變株或變種在有氧條件下于含有碳源和氮源的營養培養基中培養直到在營養培養基中出現硫藤黃菌素，分離硫藤黃菌素，并將其轉化成至少一種式I化合物。
6.根據權利要求4或5的方法，其還包括將所述式I化合物轉化成生理上可耐受的鹽、衍生物或此衍生物的生理上可耐受的鹽。
7.擬諾卡氏菌種ST 100692(DSM 13834)。
全文摘要
本發明公開了硫藤黃菌素二氧化物及其衍生物在生產藥物中的應用，以及制備它們的方法。本發明涉及硫藤黃菌素二氧化物及其衍生物在生產治療CNS疾病的藥物中的應用，還涉及通過發酵微生物擬諾卡氏菌種ST 100692，DSM13834生產其的方法，并且涉及微生物擬諾卡氏菌種ST100692，DSM 13834。
文檔編號A61P43/00GK1501800SQ02807949
公開日2004年6月2日 申請日期2002年2月23日 優先權日2001年3月9日
發明者C·埃德, M·庫爾茨, J·溫克, C 埃德 申請人:安萬特醫藥德國有限公司