基質金屬蛋白酶抑制劑的脂質體靶向的制作方法

專利名稱：基質金屬蛋白酶抑制劑的脂質體靶向的制作方法
技術領域：
本發明涉及靶向癌癥治療，而且具體涉及小基質金屬蛋白酶抑制劑在提高脂質體對癌細胞的靶向性，以及在增強其被所述細胞吸收的方面的用途。本發明從而提供了一種治療癌癥的方法，以及一種提高脂質體到腫瘤細胞的靶向性的方法，一種增強腫瘤細胞對脂質體的吸收的方法，一種利用脂質體選擇性運送化療試劑進入腫瘤細胞的方法。
背景技術：
基質金屬蛋白酶(MMP)構成了一個能降解基質膜和胞外基質(ECM)，從而有助于組織重塑和細胞遷移的酶家族(Koivunen等，1999；Shapiro，1997)。MMP可被分成亞群，其中之一由IV型膠原酶或明膠酶，MMP-2和MMP-9組成。正常細胞例如滋養層細胞、鋪骨細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞中明膠酶的表達被嚴格調控。與其它MMPs相似，明膠酶以失活方式被分泌(前MMP)，并且它們的激活需要蛋白水解切割。
明膠酶和其它MMP升高的或未加調控的表達可形成多種疾病的發病機理，包括腫瘤血管生成和轉移、風濕性關節炎、多重硬化癥和牙周炎。失活明膠酶的化合物因而可以為瘤和炎癥紊亂提供潛在的治療手段(Sorsa等，1994；Lauhio等，1991)。盡管許多MMP抑制劑被描述，明膠酶的特效抑制劑還不存在(Lauhio等，1991)。最近我們在隨機噬菌體肽文庫中篩選，目的是開發這種MMP亞群的選擇性抑制劑。得到的活性最高的肽，縮寫為CTT，發現能選擇性的抑制所研究的MMP家族成員中MMP-2和MMP-9的活性(Koivunen等，1999)。CTT還在體外抑制內皮細胞和腫瘤細胞的遷移，也在小鼠模型體內抑制腫瘤的發展，顯示了明膠酶在腫瘤入侵中的重要作用。
具有腫瘤異種移植物的小鼠中的實驗表明CTT-展示噬菌體在給受試小鼠靜脈注射后聚集在腫瘤的脈管系統中。噬菌體到腫瘤的靶向被CTT肽的共給藥抑制(Koivunen等，1999)。這些結果提示CTT除了本身通過阻止癌細胞轉移和血管生成，是有效的抗腫瘤試劑之外，還可用來將化療試劑靶向到腫瘤。
在化學療法中，只有很少一部分藥物到達癌細胞，而其余藥物就會損害正常組織。反作用可通過給予包囊在脂質體中的腫瘤藥物而減少(Lasic等，1995)。改良的脂質體化合物已有描述，用以增強其穩定性并延長其循環周期(Tardi等，1996)。靶向腫瘤細胞的脂質體體內體外研究進展已有報道(Northfelt等，1996；Adlakha-Hutcheon等，1999)。通過衍生出帶有識別靶細胞質膜抗原的特異抗體的脂質體可以達到增強的選擇性，從而增加脂質體被細胞的吸收(Storm和Crommelin，1998)。因為MMP-2(Toth等，1997)和MMP-9(Brooks等，1996)與細胞表面特異受體結合，這些酶代表了脂質體識別擴散細胞，如腫瘤細胞和血管生成內皮細胞的潛在受體。
此外，自從1984年Sears經由酰胺連接鍵偶聯了羧基PEG并純化了大豆磷酸脂乙酰胺(PE)(Sears，1984)以來，與單甲氧基聚乙二醇(PEG)配合的磷脂已經得到廣泛的應用。PEG添加到脂質體表面后吸引水層環繞該脂質體。該水層防止各種各樣的血漿蛋白(調理素)吸附于脂質體表面，所以脂質體不會被網狀內皮組織系統識別和吸收。
發明概述本發明是以某些MMP抑制肽提高脂質體到癌細胞的靶向性和增強其被所述細胞吸收的發現為基礎的。
因此，本發明指向了具有環狀基序C(X)yHWGFXXC(序列識別號1或3)的肽化合物或具有線性基序S(X)yHWGFXXS(序列識別號4或5)的肽化合物(其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3)，在提高脂質體到腫瘤細胞的靶向性，或者在增強脂質體被腫瘤細胞吸收方面的應用。
本發明進一步的目的是相應的方法，也就是一種提高脂質體到患者腫瘤細胞的靶向的方法，一種增強腫瘤細胞對脂質體的吸收的方法，其中將至少一種具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽化合物，或者一種具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽化合物(其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3)與脂質體混合，并將獲得的混合物給予患者。
本發明還有另一個目的是提供一種利用脂質體選擇性運送化療試劑進入患者腫瘤細胞的方法，其中將至少一種具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽化合物，或者一種具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽化合物(其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3)與脂質體混合，并將獲得的混合物給予患者。
本發明因而提供了一種治療患者癌癥的方法，其通過獲得攜帶至少一種化療試劑的脂質體，將該脂質體與至少一種選自具有環狀基序C(X)yWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物(其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3)混合，并將獲得的混合物給予患者。
在本發明進一步優選的具體實施方式
中，上述方法是通過在肽化合物與脂質體混合之前將聚乙二醇附著到脂質體上，優選附著在脂質體表面進行的。
本發明更進一步的目的是一種診斷方法，其中所述的肽化合物被用來將標記靶向到可疑腫瘤。可將放射性或磁性標記吸附于C(X)yHWGFXXC肽、或脂質體內部、或脂質體表面，它被C(X)yHWGFXXC肽靶向到腫瘤部位。腫瘤診斷是靜脈注射標記過的肽或肽脂質體，并用γ成像或放射自顯影檢測。
本發明另一個目的是診斷或成像組合物，包括脂質體、至少一種選自由具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽和具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽組成的組的肽化合物(其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3)，以及一種可檢測的標記。
可用于本發明目的的可檢測的標記是放射性標記、磁性粒子或熒光標記。
本文下面將參照附圖更詳細的描述本發明。


圖1A.濃度各自在85μM的CTT、CLP、STT和CWL肽對MMP-2活性的抑制，由酪蛋白酶譜學(zymography)評估。結果顯示為消化的面積百分比，而未被抑制的MMP-2記作100％。誤差條代表3個單獨實驗的標準偏差。
圖1B.游離CTT(○)和結合到脂質體的CTT(●)對MMP-9的抑制，用材料和方法中所描述的熒光底物檢測。磷脂的總濃度為200μMPOPC/POPE(80/20mol/mol)。數據點代表三份實驗的平均值，條顯示標準偏差。
圖2.CTT(●)、CLP(■)及STT(▲)對eggPC單層的穿透，證據是將給定的肽加入水相后表面壓(Δπ)的增加。所示數據為初始表面壓(π0)的函數。
圖3A.CTT Trp殘基作為POPC/POPE(80/20mol/mol)濃度的函數的各向異性(r)。數據點代表5個測量值的平均數，誤差條給出標準偏差。為提高信噪比，取15秒的信號進行平均。CTT的濃度為在PBS中的5μM且溫度為37℃。
圖3B.游離CTT肽(○)及其脂質體復合物(●)的Trp發射強度利用I-作為水溶性碰撞淬滅劑進行測量。數據點代表兩個單獨的測量。
圖4A至4F.與PC/PE(80/20，摩爾比)脂質體(包囊熒光標記物以及靶向肽CTT)溫育的U937、CHO及HT1080細胞攝取若丹明B的熒光顯微影像，如圖所示。圖A和B表示U937細胞，其分別與含或不含CTT的脂質體溫育。圖C和D圖示的為HT1080細胞的相同實驗而圖E和F為CHO細胞的相同實驗(曝光時間延長10倍)。
圖5A.圖示肽對U937細胞吸收含若丹明B的脂質體(PC/PE，80/20摩爾比)的影響。總脂、若丹明B及肽濃度分別為200μM、2μM及100μM。數據通過比較若丹明熒光而標準化，所述若丹明熒光來自用添加了肽的脂質體溫育的細胞(I)和用不含肽的脂質體溫育的細胞(I0＝對照)。誤差條代表標準偏差(n＝3)。
圖5B.向包囊可溶性熒光標記物若丹明B的脂質體中加入CTT。測定HT1080細胞在與脂質體37℃或4℃溫育30分鐘后對這種熒光團的吸收。數據點是來自三份重復孔的平均值±SD。
圖6.圖示抗體對HT1080細胞吸收含若丹明B的脂質體(PC/PE，80/20摩爾比)的影響。結果顯示為用添加了CTT肽的脂質體溫育的細胞的若丹明熒光百分比，不含抗體的培養基中的記作100％。所用抗體為抗-MMP-2、抗-MMP-9，用抗-整聯蛋白β3胞漿結構域的抗體作對照抗體。圖示肽、阿霉素、抗體及脂質體(表示為總磷脂)的終濃度分別為85μM、0.2mM、20μg/ml及0.4μM。誤差條代表4個單獨實驗的標準偏差。
圖7.圖示明膠酶抑制劑對HT1080細胞吸收含若丹明B的脂質體(PC/PE，80/20摩爾比)的影響。結果顯示為用添加CTT肽的脂質體溫育的細胞的若丹明熒光百分比，不含抗體的培養基中的記作100％。這里所用的抑制劑為TIMP-2(10μg/ml)。Marimastat(50μM)是MMP家族抑制人工合成的藥物，EDTA為Zn2+螯合劑(500μM)，抑酶肽(1μg/ml)為絲氨酸蛋白酶抑制劑。圖示肽、若丹明及脂質體(表示為總磷脂)的終濃度分別為85μM、0.2mM及0.4μM。誤差條代表4個單獨實驗的標準偏差。
圖8.CTT、CLP、STT和CWL對含阿霉素的脂質體誘導U937細胞致死的影響的比較，通過EthD-1熒光評估。細胞與包囊在脂質體(200μM總磷脂，PC/PE＝80/20，摩爾比)中的阿霉素(200ng/ml)和圖示肽一起溫育。圖示肽、阿霉素及脂質體(表示為總磷脂)的終濃度分別為85μM、0.2mM及0.4μM。結果表示為RFI/RFI0，其中RFI0為無肽時與含阿霉素脂質體溫育的細胞的數值。肽的濃度為85μM。條表示標準偏差(n＝3)。
圖9.在短的誘導時間內，CTT-脂質體攝取與佛波酯的加入有關，它已知可刺激明膠酶表達，并通過該途徑將明膠酶表達于細胞表面。當誘導時間延長時，明膠酶也位于培養基中。培養基中游離明膠酶的量增加，導致脂質體攝取被抑制。
圖10.利用CTT-PEG-脂質體將細胞色素c靶向到HT1080細胞。細胞生存能力通過MTT試驗測試，并且以590nm時的相對熒光強度給出。“無添加”指沒有毒性藥物時的細胞生存能力。“無脂質體的藥物”指細胞色素c添加到不含脂質體的細胞上的情況。“未靶向的藥物脂質體”是不含CTT的PEG化脂質體，而“CTT-藥物脂質體”是CTT肽連接在PEG遠端的PEG化脂質體。
圖11A至11C.在裸鼠模型的KS腫瘤模型中，Tc99m-標記的CTT和/或脂質體到腫瘤的靶向。(A)有CTT的脂質體；(B)單獨的標記CTT；(C)I-125-標記的脂質體。

發明內容
縮寫CLP CLPGHWGFPSC(序列識別號7)CTT CTTHWGFTLC(序列識別號6)CWL CWLTFTHGTC(序列識別號9)DMEM Dulbecco′s改良的Eagle培養基DMSO 二甲亞砜DPPE 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺DPPRho1，2-雙十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-硫代氨甲酰
-N-6-四甲基若丹明ECM 胞外基質EGF 表皮生長因子eggPC 卵黃卵磷脂LUV 大單層囊泡MLV 多層囊泡MMP 基質金屬蛋白酶NBD-PE1-酰基-2-((7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基)十二烷酰-1-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺NHS N-羥基硫代琥珀酰亞胺PA磷脂酰酸PC卵磷脂PE磷脂酰乙醇胺PEG 聚乙二醇POPC 1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿POPE 1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺RFI 相對熒光強度SDS 十二烷基磺酸鈉STT STTHWGFTLS(序列識別號8)TIMP-2金屬蛋白酶-2的組織抑制劑明膠酶抑制肽。三種肽被選擇用于這個研究(表1)。CTT是近來描述的環狀膠原酶抑制劑，它已表明靶向腫瘤(Koivunen等，1999)。STT是CTT相應的線性序列，其中末端的半胱氨酸被絲氨酸替代。第三個肽是CTT的類似物CLP，是利用Blast 1.4.11程序在SWISS-PROT和EMBL數據庫中通過序列同源性查找發現的。因為我們的主要興趣是CTT的保守部分，我們的查詢序列是CXXHWGFTXC(序列識別號2)(Koivunen等，1999)。計算機查找顯示了9個類似物，其中序列CLP是人類層粘連蛋白β-1鏈(LMB1)中EGF-7結構域的一部分。其余8個類似物中的3個是來自其它物種的層粘連蛋白，1個是來自免疫球蛋白重鏈，而4個是來自人和其它物種的噻嗪類化合物敏感型氯化鈉協同運輸蛋白。因為后面的這組與CTT具有較少的表觀相似性，我們轉而聚焦于CLP，層粘連蛋白EGF-7結構域的CTT相似序列。值得注意的是，所有三種肽(CTT、CLP和STT)均抑制MMP-2的活性，如通過酪蛋白酶譜學所評估的(圖1)。在85μM CTT時抑制的程度接近70％。CLP也是一種強效的MMP-2抑制劑，在85μM肽時導致50％的抑制。線性CTT的類似物STT(85μM)使MMP-2的活性減少大約30％。類似的結果還可以從MMP-9得到。
與酪蛋白酶譜學的結果保持一致，當使用產熒光的肽作為底物通過明膠酶試驗進行研究的時候，游離CTT以及與脂質體復合的CTT也抑制MMP-9(圖1B)。CTT和CTT-脂質體的IC50值在兩種試驗中都是8μM。這些結果另外證明與CTT的一個表位相互作用的MMP-9結合到脂質膜后仍能與該酶相互作用。在這個試驗中MMP-9(5nM)的完全抑制通過100μMEDTA螯合催化反應所需的Zn2+而獲得。
與磷脂單層的相互作用。CTT的氨基酸組成自然的令人想到該肽是疏水的。因此有興趣研究CTT是否與脂質結合。作為比較我們還研究了CLP和STT。為了這個目的，我們利用了存在于氣/液界面上的磷脂單層，一種被廣泛用來研究脂-蛋白相互作用以及蛋白對脂質單層側向構造的影響的生物膜模型(Sderlund等，1999)。
注射于脂單層下的肽的穿透增加了表面壓π，而未插入脂單層的肽不會引起表面壓的變化。eggPC單層初始表面壓(π0)在10和40mN/m之間變化，測量由于肽(終濃度為200μM)加入面下相(subphase)而致的表面壓的增加(Δπ)(圖2)。所有三種肽很容易的滲入單層膜，并且Δπ對π0的斜率性質上相似。在CTT、STT和CLP初始的單層包裝壓分別超過38、31、和33mN/m時，這些肽的膜穿透消失。
與脂質體的相互作用。上文使用eggPC脂單層的實驗顯示CTT、CLP和STT結合到膜上。這通過在濃度增加的脂質體存在的條件下測量CTT的Trp熒光發射各向異性來證實(圖3A)。從而，脂質體不存在時r值為0.065，反映了溶液中所述肽的快速Brownian旋轉擴散。然而，增加脂質體的濃度會引起r的漸進性增高，在230μM磷脂時測量值高達0.349。大約在CTT/磷脂的摩爾比接近5∶90時有明顯的半數-最大效能。
固有的色氨酸熒光使得能夠評估所述肽與脂質體的結合導致該熒光團微環境中可能的變化。在PBS中測量CTT Trp殘基的I350/I330值為1.4，而LUV(0.5mM總磷脂)存在時，這個比率下降至1.00。因此在脂質體存在時Trp處于更加疏水的環境中，持續將CTT分配至脂質膜中。此外，I-對Trp的淬滅在脂質體存在時減少，并揭示CTT中的Trp只是部分的暴露于水溶性碰撞淬滅劑I-。在脂質體不存在和存在時的Stem-Volmer常數分別為0.0087和0.0034。
一些脂結合肽和蛋白可誘導脂質泡融合，為探討這種可能性，標記和未標記的LUV在肽不存在和存在時混合，并且如早先的描述測量脂混合。然而在15分鐘內，不僅CTT、STT而且CLP都沒有造成NBD-PE熒光發射強度的可測量的變化，揭示了脂混合的缺乏，從而揭示了囊泡的半融合及融合的缺乏(數據未顯示)。
對細胞吸收脂質體的影響。上面的資料顯示CTT與磷脂結合而且CTT不造成脂質體融合。因此有興趣研究CTT用于脂質體靶向的可能性。我們首先通過將熒光脂標記物DPPRho包容在如在材料和方法中描述的脂質體中來處理。隨后向這些脂質體中加入CTT，接著他們被加入到用作明膠酶表達細胞模型的U937白血病細胞中。5分鐘后洗這些細胞，細胞中的熒光用微量反應板閱讀器測量。CTT促進了脂質體與U937細胞的結合，而且在CTT存在時大概有超過3.7倍的熒光標記物DPPRho結合到細胞上(數據未顯示)。
然后我們繼續研究CTT增強U937、CHO、NRK52E、HT1080細胞吸收包囊在脂質體中的水溶性熒光標記物若丹明B的能力。不含CTT的相同脂質體用作對照。在有CTT的脂質體加入細胞5分鐘后，利用熒光顯微鏡可在細胞中觀察到可溶性若丹明標記。CTT增強U937和HT1080攝取若丹明，但不增強CHO細胞(圖4)。所有的U937和HT1080細胞都有熒光，但不同細胞的分布是不一樣的，所以有的細胞比其它的發射出更多的熒光。MMP-2的表達和MMP-9一樣對于脂質體吸收是必要的。因此，在我們的酶譜學分析中不表達明膠酶的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，在使HT1080和U937細胞的脂質體吸收明顯增強的條件下不表現出CTT-脂質體的吸收。
脂質體包囊的若丹明的吸收由熒光板閱讀器定量。較之于對缺乏所述肽的脂質體的吸收，U937細胞對脂質體包囊的若丹明的吸收被CTT增強3.6倍(圖5A)。STT和CLP僅觀察到較小的效果，而且與缺乏所述肽的脂質體比較起來信號太弱以至于沒有統計學意義。拼湊的(scrambled)環狀肽CWL在促進游離脂質體吸收方面也是無效的。相似的CTT對脂質體吸收的效果對于人HT1080纖維肉瘤和NRK52E大鼠腎上皮樣細胞很明顯(數據未顯示)。CTT不能促進游離若丹明B的吸收。CTT只有在37℃才明顯增強脂質體吸收而在4℃則不能，從而表明主動受體介導的細胞內吞作用牽涉其中(圖5B)。TPA對CTT-脂質體吸收的作用分兩個階段，在短暫的暴露時間(15分鐘)后脂質體的吸收增加，然而在延長溫育(75分鐘)后脂質體的吸收被抑制。這可以解釋為明膠酶在低濃度時主要結合在細胞表面，而在高濃度時過量的明膠酶分布在胞外空間(Toth等，1997)。
明膠酶作為CTT-脂質體復合體的靶。我們進一步研究細胞表面結合的明膠酶是否是含CTT脂質體的受體。清洗細胞以除去可溶形式的明膠酶，接著在加入脂質體前與MMP抑制劑或特異性抗體預溫育30分鐘。這些實驗表明HT1080細胞對CTT-脂質體復合體的內在化可部分的被MMP-9抗體有效阻止。特別的，兩種這樣的MMP-9抗體在一起使用時，完全阻止了脂質體包裹的熒光染料的內在化(圖6)。抗體對MMP-2的抑制只是部分抑制。抗整聯蛋白β1胞漿部分的抗體沒有作用。這些結果表明抗MMP-9和抗MMP-2抗體對脂質體吸收的特異性封鎖。
一組蛋白酶抑制劑的研究表明是MMP抑制劑而不是絲氨酸蛋白酶抑制劑阻止脂質體的吸收。MMP抑制劑TIMP-2和Marimastat、以及陽離子螯合劑EDTA每個都有相似的效果，造成脂質體到細胞的轉運被抑制約50％(圖7)。血清胰蛋白酶抑制劑或抑酶肽對于培養在10％胎牛血清中并已內在化脂質體的細胞沒有顯著的抑制效果。
阿霉素，一種廣泛應用的抗癌藥，已經被高效的包囊在脂質體中(Gokhale等，1996)。在U937培養物中研究CTT促進脂質體吸收和將該治療試劑靶向到腫瘤細胞中去的功效。將CTT加入到脂質體溶液中達到200μM濃度，相應于CTT/脂摩爾比為～1∶2。然后將該溶液加入到U937細胞中，得到CTT和阿霉素的終濃度分別為85μM和0.4μM。所述合成肽和脂質體在高達本研究所用的濃度時對細胞沒有毒性(數據未顯示)。未加入CTT的脂質體被用作對照，用EthD-1試驗來評估細胞死亡。24小時后，觀察到比無CTT的脂質體增加4.1倍的細胞死亡(p＜0.001)(圖8)。另外，抑制STT和CLP肽的明膠酶而非拼湊的CWL肽增強脂質體包囊的阿霉素的細胞致死效應，但程度低于CTT。因此，STT和CLP分別使死亡細胞數增加1.7和1.3倍(p＜0.01)。
PEG脂質體。我們還制備了PEG-脂質體，其中PEG-脂衍生物通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物連接在CTTHWGFTLC肽羧基末端(Grabarek和Gergely，1990)。DPPE與PEG(2000)通過一個氨基甲酸根連接，在其一個末端具有一個氨基基團。PEG-脂衍生物的應用延長了脂質體在體內的循環時間。它還把該肽錨定在脂質體表面，防止該肽與在血液循環中的脂質體結合。它可用于靶向腫瘤細胞、腫瘤血管、類風濕性關節炎和其他大量表達明膠酶的患病組織。最常用的PEG分子量是2,000和5,000，但是600到12,000范圍的PEG也可使用。偶聯物的脂類部分從飽和或不飽和PE到帶有短鏈(C8)、中鏈(C14)和長鏈(C20)脂肪酸的膽固醇和神經酰胺多樣化。在脂質一側可使用無窮多樣的脂質錨從PE到PA、心磷脂、膽固醇或神經酰胺。胺在這里作為功能團使用，但所有其它將肽或修飾肽連接到EG衍生物的反應基團同樣也能使用，例如生物素、馬來酰亞胺或羧基-NHS-酯。
CTT肽/脂質體被細胞吸收是以對加入佛波酯作出反應的方式進行的，已知加入佛波酯可刺激明膠酶表達(圖9)。這表明明膠酶的表達水平與CTT-脂質體的吸收有關。在我們的研究中使用了中國倉鼠卵巢細胞，其在我們的明膠酶譜學試驗中不表達高水平的明膠酶。我們的結果是在CHO細胞中不發生脂質體靶向。這令我們想到CTT-脂質體的吸收是依賴細胞類型的而且與該細胞類型的明膠酶表達水平有關。
脂質體靶向實驗使用了在脂質體表面具有CTT肽和在脂質體內部具有若丹明的脂質體，所述實驗揭示脂質體靶向在37℃能成功而在4℃不成功。這意味著在脂質體內在化時發生主動受體介導的內吞作用。
CTT-脂質體的吸收在短的誘導時間內與佛波酯的加入相關，已知加入佛波酯可刺激明膠酶表達，并通過該途徑將明膠酶表達于細胞表面。當誘導時間延長時，明膠酶也位于培養基中。培養基中游離明膠酶的量增加，而脂質體攝取被抑制(圖10)。
還進行了脂質體靶向的體內實驗。圖11A顯示了用放射性標記的CTT-肽脂質體處理過的裸鼠的γ成像。CTT用锝-99m標記，它螯合在兩個半胱胺酸殘基之間。在尾靜脈注射的30分鐘后進行γ成像。瘤的位置(植入KS1767卡波西肉瘤)用箭頭指示。圖11B顯示了沒有脂質體的CTT-肽的γ成像，而圖11C使用了沒有CTT-肽的脂質體，用放射性碘-125-標記的BSA，包囊在脂質體內部。
實驗材料和方法材料。卵黃卵磷脂(eggPC)、1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、阿霉素(亞德里亞霉素)、若丹明B及具有2.7mM KCl和0.137MNaCl、25℃時pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)購于Sigma，1-酰基-2-((7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基)十二烷酰-1-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(NBD-PE)和1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)購于Avanti(Birmingham，AL)。另一種熒光脂1，2-雙十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-硫代氨甲酰-N-6-四甲基若丹明(DPPRho)及熒光探針啡啶鎓5，5′[1，2-乙二基雙(亞氨基-3，1-丙二基)]雙(3，8-二氨基-6-苯基)-二氯化物、二氫氯化物(EthD-1)來自Molecular Probes(Leiden，荷蘭)。MMP-2購于BoehringerMannheim GmbH(德國)。Dulbecco′s改良Eagle培養基(DMEM)和含Glutamax-1的RPMI 1640細胞培養基來自Gibco Life Technologies(Paisley，蘇格蘭)。磷脂貯液在氯仿中制備。以氯仿/甲醇/水(65∶25∶4，體積比)為溶劑在硅酸包被板上經薄層色譜檢測脂純度。在碘染色后或合適時檢查板，熒光照明顯示沒有雜質。用高精度的電子稱(Cahn Instruments，Inc.，Cerritos，CA，美國)通過重量檢測無熒光的磷脂的濃度，而那些熒光磷脂類似物用分光光度法檢測，用甲醇做溶劑，DPPRho在540nm時摩爾消光系數為ε＝93,000而NBD-PE在463nm時的摩爾消光系數為ε＝21,000。抗人MMP-9和MMP-2由Dr.Timo Sorsa惠贈(芬蘭赫爾辛基大學醫學化學和牙周病學系)。Marimastat獲自British Biotech。TIMP-2以及MMP-2熒光底物MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg來自Calbiochem(La Jolla，CA，美國)。
序列同源性搜索。通過BLASTP 1.4.11 MP用國家生物信息中心推薦的短肽策略(同一性矩陣、字數1、預期值1000)尋找CTT(CTTHWGFTLC)(序列識別號6)的同系物。其他參數為默認值。我們的查詢序列為CXXHWGFTXC(序列識別號2)。發現9個類似物，其中有人類層粘連蛋白β-1鏈前體的EGF-7結構域的一部分CLPGHWGFPSC(此處表示為CLP，序列識別號7)。還尋找了CLP的同系物，并與SWISS-PROT SIM程序比較。
合成肽。肽在Applied Biosystems 433 A(Foster City，CA，美國)自動合成儀上用Fmoc-化學反應合成。在含20％二甲亞砜(DMSO)的5％乙酸(pH6.0)中通過持續攪拌室溫過夜溫育形成二硫鍵(Domingo等，1995)。然后按1∶2的比例用0.1％三氟乙酸稀釋，將肽上樣到預先準備的反相HPLC柱進行乙腈梯度洗脫。用質譜法檢測肽的同一性。本研究中所用肽和他們的氨基酸序列、各自的縮寫匯編于表1表1.CTT、CLP、STT和CWL的氨基酸序列，保守殘基為粗體。分子量在括弧中。
CTTCys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys(1168)(序列識別號6)CLPCys-Leu-Pro-Gly-His-Trp-Gly-Phe-Pro-Ser-Cys(1203)(序列識別號7)STTSer-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Ser(1136)(序列識別號8)CWLCys-Trp-Leu-Thr-Phe-Thr-His-Gly-Thr-Cys(1168)(序列識別號9)明膠酶試驗。用酪蛋白酶譜學測量不同的合成肽對MMP-9和MMP-2的抑制(Halinen等，1996)。MMP-9如上所述純化(Sorsa等，1997)。隨后MMP-2(2.5μg)或MMP-9(2.5μg)在含有2mg/ml酪蛋白的10％ SDS-PAGE中電泳。凝膠先用含Triton X-100的緩沖液洗去SDS，然后切成5片，浸入含肽(CTT、CLP、CWL或STT)的溶液中(85μM)。37℃溫育48小時之后，凝膠用考馬斯藍染色、掃描，用圖象分析定量消化區域(Global Lab Image 3.2，Data Translation Inc.and Acuity Imaging Inc.，Marlboro，MA，美國)。
MMP-9活性還用熒光肽底物MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg(Calbiochem，San Diego，CA，美國)測量。更具體的，50ng MMP-9在沒有或有CTT或其脂質體復合物的情況下在PBS中室溫預溫育30分鐘。隨后熒光底物以終濃度0.1mM加入，繼續在37℃溫育15分鐘，而后用微量滴定板閱讀器以340nm激發光和390nm發射光來測量熒光強度。
肽與脂質單層的相互作用。肽穿過單分子脂質膜的情況使用磁力攪拌循環井測量(面下相體積400μl)。表面壓(π)用連接到微量天平(其與PentiumPC相連)的Wilhelmy導線測量(μTroughS，Kibron Inc.，Helsinki，芬蘭)。將脂質鋪在氯仿(大約1mg/ml)中的氣-液(PBS，pH7)界面上以達到不同的表面壓，并使其平衡15分鐘，然后將所示肽(4μl，水中10mg/ml并且CWL在DMSO中)加入面下相。π從加入肽后的初始表面壓力(π0)開始的增加在大約20分鐘內完成，將π0與肽結合到膜上后觀察到的數值的差記作Δπ。所有的測量均在室溫(～+24℃)進行。數據以Δπ對π0表示(Brockman，1999)。
脂質體的制備。脂質貯液在氯仿中混合得到所需組合物。溶劑在溫和的氮流下除去，脂質剩余物隨后減壓保持至少2小時。多層脂質體的形成是在室溫下將干脂質與含若丹明B(10μM)或阿霉素(1.8μM)的1ml PBS水合，從而把這些化合物包囊進脂質體中，得到1mM的脂質濃度。多層脂質體被反復凍/融5次以增強包囊性(Clifford等，1990)。用LiposoFastPneumatic氣壓操控的小體積攪拌器(Avestin，Ottawa，加拿大)19次擠壓MLV通過100nm孔徑的聚碳酸酯膜(Nucleapore，Pleasanton，CA，美國)得到大單層囊泡(LUV)。將囊泡經由過濾器擠出的壓力是25psi(～170kPa)。在指定的時間，將肽(2mg/ml，在PBS中，除了CWL在DMSO中外)與LUV混合，使脂質和肽的終濃度分別為1mM和0.5mg/ml。
PEG-脂質體的制備。DPPE與PEG(2000)通過一個氨基甲酸根連接，在其一個末端具有一個氨基基團。PEG-脂衍生物通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物連接在CTTHWGFTLC肽羧基末端(Grabarek和Gergely，1990)。CTT-PEG-PE通過凝膠過濾來純化。將4％CTT-PEG-PE加到16％POPE和80％POPC(mol/mol)中，同上面脂質體一樣制備熒光光譜術。通過熒光光譜術研究CTT、STT、CLP及CWL的色氨酸殘基在脂質體中的環境。在水中，Trp熒光峰的中心是在～350nm，而在疏水環境中的發射中心靠近330nm。因此，通過測量I350/I330(350nm和330nm時的發射比率)可以監測Trp微環境的變化(Lakowicz，1999)。用配有磁力攪拌、恒溫透明容器區室的Perkin Elmer LS 50 B分光光度計記錄色氨酸熒光。所有測量都是于37℃在5mM Hepes、0.1mM EDTA、pH7.4的緩沖液中進行的。激發帶通和發射帶通分別為10nm和10nm。激發波長為295nm，發射波譜在300到400nm范圍內記錄。CTT、STT、CLP和CWL的Trp發射波譜在有和無POPC/POPE(80/20，mol/mol)LUV的情況下記錄，如顯示的那樣產生最終的脂質濃度10μM和100μM。
利用在激發和發射光波束中旋轉的起偏鏡以10nm帶通測量作為濃度增加的脂質體的函數的CTT Trp殘基的熒光偏振現象。結果表示為發射各向異性(Lakowicz，1999)，計算如下
r＝(III-I⊥)/(III+2I⊥)在這個等式中I⊥和III分別表示與起偏鏡垂直和水平的發光強度。
用I-作為碰撞淬滅劑研究Trp暴露在水相的程度(Lakowicz，1999)。淬滅程度用下列等式計算F0/F＝1+k[Q]＝1+kqτ0[Q]其中F0和F為無或有淬滅劑Q時345nm處的Trp熒光強度，τ0為無該淬滅劑時的Trp熒光表現期，k是Stern-Volmer常數(將數據線性化后，由其斜率得到該常數)。CTT中(5μM)Trp及其淬滅劑的熒光在無和有POPC/POPE(80∶20，mol/mol)LUV(最終的脂濃度為0.5mM)的情況下測量。該結果根據PBS和脂質體引起的本底進行修正。
脂質混合試驗。CTT、CLP、STT和CWL肽引起脂質體融合的能力可以通過測量脂質混合來評估，如早先所述(Struck等，1981)。簡要的，將NBD-PE(X＝0.01)和DPPRho(X＝0.01)摻入脂質體(POPC/POPE，78/20，mol/mol)內。由于NBD-PE(供體)發射光譜和DPPRho(受體)吸收光譜的重疊，共振能在這些染料之間高效轉移。隨著含NBD-PE和DPPRho的脂質體與未標記的脂質體混合，觀察到融合，其表現為由探針的稀釋而引起的NBD-PE發射強度的增大。所用的NBD-PE激發波長和發射波長為430nm和530nm。所有的熒光測量在37℃進行。
細胞吸收脂質體的試驗。為了研究不同肽對細胞吸收脂質體的影響，將若丹明-標記的磷脂類似物(DPPRho)摻入脂質體內作為示蹤物，得到POPC/POPE/DPPRho(80∶19∶1，mol/mol)組合物。將所示肽與LUV混合，隨后加入到微孔板培養的細胞中。在38℃溫育5分鐘后，用冷PBS將細胞洗三次，除去沒有附著到細胞上的脂質體。與細胞結合的DPPRho的相對量用Tecan Spectrafluor Plus微量反應板閱讀器(Tecan，Hombrechtigon，瑞士)，以535nm激發波長，595nm發射波長進行測定。
在其他系列實驗中水溶性熒光標記物若丹明B被包囊進脂質體并測量其被細胞的吸收。用于若丹明B吸收的樣品如下制備將含10μM若丹明B的60μl POPC/POPE(80/20，mol/mol，1mM)脂質體與補充有10％胎牛血清、Glutamax I、青霉素100U/ml和鏈霉素0.1mg/ml的300μl DMEM培養基混合。然后加入終濃度為8.5μM的肽。10μl(105細胞)含有所示細胞的培養基與LUV混合。37℃或+4℃溫育15分鐘后，沒有附著在細胞上的脂質體用冷PBS沖洗三遍從96孔培養板上去掉。+4℃溫度是用來作為非細胞內吞性脂質體吸收的對照(Oess和Hildt，2000)。與細胞結合的若丹明B的相對量用微量反應板閱讀器測定，535nm為激發波長，595nm為發射波長。
我們還用佛波酯(TPA)(50nM)預溫育細胞。預溫育的時間從15到75分鐘不等。用佛波酯(TPA)處理細胞可以提高MMP-9的表達和分泌(Toth等，1997)。結果表示為RFI＝I/I0，這里RFI是相對熒光強度，I0是沒有肽的LUV中的2μM若丹明B(對照)的發射強度，I是被細胞吸收的肽-脂質體復合物中若丹明的發射光強度。所示抗體(αMMP-9和αMMP-2)和明膠酶抑制性復合物(TIMP-2，Marimastat及EDTA)對HT1080細胞吸收含若丹明B的脂質體(PC/PE，80/20摩爾比)的效果的實驗如上進行。M-17抑制MMP-9結合底物并且這種抑制預期是由濃度決定。還不知道是否兔多克隆抗體可封阻人的MMP-2(Murphy等，1994)。所示的肽、阿霉素、抗體和脂質體的終濃度分別為85μM、0.2mM、20μg/ml及0.4μM。
細胞培養和熒光顯微鏡檢。U937(ECACC 85011440)、HT1080(ECACC85111505)和CHO(ECACC 85050302)細胞用RPMI或DMEM培養基培養，培養基中補充10％胎牛血清、Glutamax I、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)。培養細胞對含若丹明B的脂質體的吸收用熒光顯微鏡來檢驗。所用的是一個倒置熒光顯微鏡(Zeiss IM 35)，它裝配有尼康特長工作距離物鏡(20x)和(40x)。樣品制備如若丹明吸收試驗所述，稍作更改。因此，不經清洗將U937、HT1080和CHO細胞以及含若丹明的脂質體和在細胞培養基中的上述細胞轉移到Nunclon 48孔板中。通過合適的波段濾波器(Melles-Griot)選擇激發和發射波長分別在535nm和＞600nm范圍傳播。熒光圖象用與電腦連接的Peltier-cooled數碼相機(C4742-95，Hamamatsu，日本)觀察，用由儀器制造商提供的軟件(Hipic 5.0)操作。
生存力試驗。包囊阿霉素的肽-脂質體復合物如上所述制備，使肽、脂和阿霉素的終濃度分別為85μM、0.2mM和0.4μM，隨后加入到10μl(105細胞)U937細胞樣品中。用EthD-1檢測細胞的死亡。這個熒光團是膜不滲透性的而且只有當結合到DNA上才能發光(Papadopoulos等，1994)。因此，EthD-1很容易進入死亡細胞并結合到他們的DNA上，其熒光強度與死亡細胞的數量有關。用微量反應板閱讀器測量EthD-1的發射，激發用495nm而發射用635nm。用Student’s t-檢驗評估統計學意義。
體內脂質體靶向實驗。BSA的碘化通過Iodogen 1，3，4，6-四氯-3，6-二苯基甘脲方法進行。簡要的，100μl(10mg/ml)BSA和125I(50MBg)在包被了Iodogen的小瓶中混合。為分離游離Iodogen，用PD-10凝膠柱過濾反應產物。脂質體POPC/POPE(80∶20 mol/mol)的形成和碘化BSA的包囊如早先所述制備。由來自赫爾辛基大學醫院的SL Karonen博士用99mTc標記CTT-肽。CTT和脂的注射濃度分別為8.5到85μM和0.2mM。由尾靜脈注射而且體積由50μl to 200μl不等。肽的最終血漿濃度為0.085μM至17μM。
注射30分鐘后進行γ成像。由連接到Odyssey計算機的Picker Prism1500XP單頭γ相機(Picker Intemational，Highland Heights，OH)進行顯微成像。重16到21g的25只NMRI裸鼠背部植入卡波西肉瘤。
序列列表獨立文本對于序列識別號1到序列識別號5可變氨基酸Xaa在位點2(3，4，8，9，10)可以是任何氨基酸。
參考文獻Adlakha-Hutcheon，G.，Bally，M.B.，Shew，C.R.，and Madden，T.D.Controlled destabilization of a liposomal drug delivery system enhancesmitoxantrone antitumor activity.Nature Biotechnol.17775-779，1999.
Brockman，H.Lipid monolayerswhy use half a membrane to characterizeproteinmembrane interactions？Curr.Opin.Struct.Biol. 9425-427，1999.
Brooks，P.C.，Stromblad，S.Sanders，L.C.，von Schalscha，T.L.Aimes，R.T.Stetler Stevenson，W.G.Quigley，J.P.，and Cheresh，D.A.Localization ofmetalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction withintegrin av s3.Cell 85683-693，1996.
Clifford，C.J.，Warren，E.L.Richard，T. W.，and Pfeiffer，D.R.Factorsaffecting solute entrapment in phospholipid vesicles prepared by the freeze-thawextrusion methoda possible general method for improving the efficiency ofentrapment.Chem.Phys.Lipids 5573-83，1990.
Domingo，G.J.，Leatherbarrow，R.J.，Freeman，N.，Patel，S.，and Weir，M.Synthesis of a mixture of cyclic peptides based on the Bowman-Birk reactive siteloop to screen for serine protease inhibitors.Int.J.peptide Protein Res.4679-87，1995.
Gokhale，P.C.，Radhakrishnan，B.，Husain，S.R.，Abernethy，D.R.，Sacher，R.，Dritschilo，A.，and Rahman，A.An improved method of encapsulation ofdoxorubicin in liposomalspharmacological，toxicological and therapeuticevaluation.Br.J.Cancer 7443-48，1996.
Grabarek，Z.and Gergerly，J.Zero-length crosslinking procedure with theuse ofactive esters.Anal.Biochem.185，131-135，1990.
Halinen，S.，Sorsa，T.，Ding，Y.，Ingman，T.，Salo，T.，Konttinen，Y.T.，andSaari，H.
Characterization of metalloproteinase(MMP-8 and-9)activities in the salivaand in gingival crevicular fluid of children with Down′s syndrome.J.Periodontology 67748-754，1996.
Koivunen，E.，Arap，W，.Valtanen，H.，Raininsalo，A.，Penate Medina，O.，Heikkila，P.，Kantor，C.，Gahmberg，C.G.，Salo，T.，Konttinen，Y.T.，Sorsa，T.，Ruoslahti，E.，and Pasqualini，R.Cancer therapy with a novel tumor-targetinggelatinase inhibitors selected by phage peptide display.Nature Biotechnol.17768-774，1999.
Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy.Plenum Press，New York and London，Ch 5，pp.111-153，1999.
Lasic，D.D.，Ceh，B.，Stuart，M.C.，Guo，L.，Frederik，P.M.，and Barenholz，Y.Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicleslessons fordrug delivery.Biochim.Biophys.Acta 1239145-156，1995.
Lauhio，A.，Leirisalo-Repo，M.，Lahdevirta，J.，Saikku，P.，and Repo，H.Doubleblind，placebo-controlled study of the three month treatment withlymecyclinein reactive arthritis，with special reference to Chlamydia arthritis.Arthritis Rheum.246-14，1991.
Murphy，G.，Nguyen，Q.，Cockett，M.，Atkinson，S.，Allan，J.，Knight，C.，Willenbrock，F.，Docherty，A.Assessment of the role of the fibronectin-likedomain of gelatinase A by analysis of a deletion mutant.J.Biol.Chem.2696632-6636，1994.
Northfelt，D.W.，Martin，F.J.，Working，P.，Volberding，P.A.，Russell，J.，Newman，M.，Amantea，M.A.，and Kaplan，L.D.Doxorubicin encapsulated inliposomals containing surface-bound polyethylene glycolpharmacokinetics，tumor localization，and safety in patients with AIDS-related Kaposi′s sarcoma.J.Clin.Pharmacol.3655-63，1996.
Oess，S.，and Hildt，E.Novel cell permeable motif derived from thePreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens.Gene Therapy.7750-758，2000.
Papadopoulos，N.G.，Dedoussis，G.V.，Spanakos，G.，Gritzapis，A.D.，Baxevanis，C.N.，and Papamichail，M.An improved fluorescence assay for thedetermination of lymphocyte-mediated cytotoxity using flow cytomethry.J.Immunol.Meth.177101，1994.
Sears，B.D.(1984).Synthetic Phospholipid Compounds.US Patent4,426,330.
Shapiro，S.D.Mighty micetransgenic technologY″knocks out″questions ofmetalloproteinase function.Matrix Biol.15527-533，1997.
Sorsa，T.，Ding，Y.，Salo，T.，Lauhio，A.，Teronen，O.，Ingman，T.，Ohtani，H.，Andoh，N.，Takeha，S.，and Konttinen，Y.T.Effects of tetracyclines on neutrophil，gingival，and salivary collagenases.A functional and western-blot assessmentwith special reference to their cellular sources in periodontal diseases.Ann.N.Y.Acad.Sci.732112-131，1994.
Sorsa，T.，Salo，T.，Koivunen，E.，Tyynela，J.，Konttinen，Y.T.，Bergmann，U.，Tuuttila，A.，Niemi，E.，Teronen，O.，Heikkila，P.，Tschesche，H.，Leinonen，J.，Osman，S.，and Stenman.Activation of type IV procollagenases by humantumor-associated trypsin-2.J.Biol.Chem.27221067-21074，1997.
Storm，G.，and Crommelin，D.J.A.liposomalsquo vadis？Pharm.Sci.&Tech.Today 119-31，1998.
Struck，D.K.，Hoekstra，D.，and Pagano，R.E.Use of resonance energytransfer to monitor membrane fusion.Biochemistry 204093-4099，1981.
Sderlund，T.，Lehtonen，J.Y.A.，and Kinnunen，P.K.J.Interactions ofcyclosporin A with phospholipid membraneseffect of cholesterol.Mol.Pharm.5532-38，1999.
Tardi，P.G.，Boman，N.L.，and Cullis，P.R.liposomal doxorubicin.J.DrugTarget.4129140，1996.
Toth，M.，Gervasi，D.C.，and Fridman，R.Phorbol ester-induced cellsurface association of matrix metalloproteinase-9 in human MCF10A breastepithelial cells.Cancer Res.573159-3167.1997.
序列表<110>利森蒂亞有限公司(Licentia Oy)<120>基質金屬蛋白酶抑制劑的脂質體靶向<130>37868<140>
<141>
<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位點<222>(2)<223>可變氨基酸，在位點2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(3)<223>可變氨基酸，在位點3的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(8)<223>可變氨基酸，在位點8的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(9)<223>可變氨基酸，在位點9的Xaa可以是任意氨基酸<400>1Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位點<222>(2)<223>可變氨基酸，在位點2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(3)<223>可變氨基酸，在位點3的Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<221>位點<222>(9)<223>可變氨基酸，在位點9的Xaa可以是任意氨基酸<400>2Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Thr Xaa Cys1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位點<222>(2)<223>可變氨基酸，在位點2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(3)<223>可變氨基酸，在位點3的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(4)<223>可變氨基酸，在位點4的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(9)<223>可變氨基酸，在位點9的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(10)<223>可變氨基酸，在位點10的Xaa可以是任意氨基酸<400>3Cys Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位點<222>(2)<223>可變氨基酸，在位點2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(3)<223>可變氨基酸，在位點3的Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<221>位點<222>(8)<223>可變氨基酸，在位點8的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(9)<223>可變氨基酸，在位點9的Xaa可以是任意氨基酸<400>4Ser Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位點<222>(2)<223>可變氨基酸，在位點2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(3)<223>可變氨基酸，在位點3的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(4)<223>可變氨基酸，在位點4的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(9)<223>可變氨基酸，在位點9的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位點<222>(10)<223>可變氨基酸，在位點10的Xaa可以是任意氨基酸<400>5Ser Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>未知生物描述未知<400>6
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys1 5 10<210>7<211>11<212>PRT<213>未知生物<400>7Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>未知生物<400>8Ser Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys1 5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工<400>9Cys Trp Leu Thr Phe Thr His Gly Thr Cys1 5 10
權利要求
1.肽化合物用于促進脂質體靶向腫瘤細胞的用途，所述肽化合物包含選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽的結構，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3。
2.肽化合物用于促進脂質體被腫瘤細胞吸收的用途，所述肽化合物包含選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽的結構，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，。
3.根據權利要求1或2的用途，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
4.根據權利要求1到3中任何一項的用途，其中的腫瘤細胞是表達基質金屬蛋白酶的腫瘤細胞。
5.一種促進脂質體靶向患者腫瘤細胞的方法，包含步驟(a)使該脂質體與至少一種肽化合物混合，所述肽化合物選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和(b)將得到的混合物給予患者。
6.一種促進脂質體被患者腫瘤細胞吸收的方法，包含步驟(a)使該脂質體與至少一種肽化合物混合，所述肽化合物選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和(b)將得到的混合物給予患者。
7.根據權利要求5或6的方法，其中脂質體攜帶至少一種化療試劑。
8.一種利用脂質體將化療試劑選擇性運送到患者腫瘤細胞的方法，包括步驟(a)使攜帶至少一種化療試劑的脂質體與至少一種肽化合物混合，所述肽化合物選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和(b)將得到的混合物給予患者。
9.根據權利要求7或8的方法，其中化療試劑是阿霉素。
10.根據權利要求5到9中任何一項的方法，進一步包括將聚乙二醇(PEG)加入脂質體的步驟。
11.根據權利要求5到10中任何一項的方法，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
12.根據權利要求5到11中任何一項的方法，其中的腫瘤細胞是表達基質金屬蛋白酶的腫瘤細胞。
13.一種治療患者癌癥的方法，包括步驟(a)獲取攜帶至少一種化療試劑的脂質體，(b)將該脂質體與至少一種肽化合物混合，所述肽化合物選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和(c)將得到的混合物給予患者。
14.根據權利要求13的方法，進一步包括一個將聚乙二醇(PEG)加入脂質體的步驟。
15.根據權利要求13或14的方法，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC(序列識別號6)、CLPGHWGFPSC(序列識別號7)或STTHWGFTLS(序列識別號8)。
16.根據權利要求13到15中任何一項的方法，其中的化療試劑是阿霉素。
17.一種檢查患者疑似腫瘤的診斷方法，包括步驟(a)將該脂質體與至少一種肽化合物混合，所述肽化合物選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，(b)向混合物加入可檢測的標記，(c)將標記的混合物給予患者，和(d)利用放射自顯影成像或γ成像來檢測所述標記。
18.根據權利要求17的方法，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
19.根據權利要求17的方法，其中的可檢測的標記是放射性標記、磁性粒子或熒光標記。
20.一種用于實施權利要求17的方法的診斷或成像檢測試劑盒，包括-脂質體，-至少一種選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和-一種可檢測的標記。
21.根據權利要求20的診斷或成像檢測試劑盒，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
22.根據權利要求20的診斷或成像檢測試劑盒，其中可檢測的標記是放射性標記、磁性粒子或熒光標記。
23.一種診斷或成像組合物，包括-脂質體，-至少一種選自具有環狀基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有線性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物，其中X為任何氨基酸殘基，y為整數2或3，和-一種可檢測的標記。
24.根據權利要求23的診斷或成像組合物，其中的肽化合物選自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
25.根據權利要求23的診斷或成像合成物，其中可檢測的標記是放射性標記、磁性粒子或熒光標記。
全文摘要
本發明涉及靶向腫瘤治療，而且具體涉及小基質金屬蛋白酶抑制劑在提高脂質體對癌細胞的靶向性，和增強其被所述的細胞吸收方面的用途。本發明從而提供了一種治療腫瘤的方法，以及一種提高脂質體到腫瘤細胞的靶向性的方法，一種增強腫瘤細胞對脂質體的吸收的方法，一種脂質體選擇性的運送化療試劑進入腫瘤細胞的方法。
文檔編號A61K9/127GK1531439SQ02807311
公開日2004年9月22日 申請日期2002年3月26日 優先權日2001年3月26日
發明者奧拉·佩納特梅迪納, 厄爾基·科伊武南, 帕沃·金努南, 科伊武南, 奧拉 佩納特梅迪納, 金努南 申請人:Ctt癌癥靶向技術公司