造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑的制作方法

專利名稱：造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及以一種肌動蛋白結合蛋白質，Cofilin及其類似物為有效成分的造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化促進劑和該促進劑的新用途。本發明的造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化促進劑可作為造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化不足引發的疾病的治療藥物，尤其是各型血細胞減少癥和/或造血功能低下相關疾病的治療藥物。本發明的造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑可用于體外擴增造血干細胞，且此方法對造血干細胞移植和基因治療以及再生治療都有用。
現有技術血細胞生成由具有自我更新能力的造血干細胞、源自造血干細胞并已確定分化方向的造血前體細胞、介于前后二者之間的處于不同分化階段的細胞同圍繞在這些細胞周圍形成造血微環境的基質細胞之間的直接相互作用來調節，或者由所述第一組細胞和基質細胞分泌的體液造血調節因子之間的間接相互作用調節。已知造血干細胞經過造血前體細胞，增殖和/或分化為各種成熟血細胞的過程有多種細胞因子參與。
隨著遺傳工程的進步，可以克隆得到這些細胞因子的基因，通過基因重組技術其工業生產也成為可能。基因重組型造血因子中包括粒細胞集落刺激因子(以下稱為“G-CSF”)和巨噬細胞集落刺激因子(以下稱“M-CSF”)可以作為治療放療和化療等造成的造血功能低下(中性粒細胞減少癥等)的藥物，及紅細胞生成素(以下稱“EPO”)，已作為腎性貧血等的治療藥物在臨床中獲得應用。不過，采用這些造血因子進行治療，只導致成熟血細胞的暫時性恢復。
因此，從根本上改善造血功能的治療手段是進行造血干細胞的自體或者同源移植。最近，外周造血干細胞移植迅速普及，另外臍帶血造血干細胞移植也非常引人著目。可是，它們仍然存在很多問題，尤其是血細胞中造血干細胞數量稀少，對供體和/或接受者都造成很大負擔。因此，有必要建立造血干細胞的體外擴增方法。現在正在對不能有效治療的致死性遺傳性疾病和某些惡性腫瘤、及愛滋病患者進行缺陷或者變異基因的互補性基因治療嘗試(大橋十也，試驗醫學，12333，1994)。
能長期存活的造血干細胞，被認為是上述基因治療的最適靶細胞。可是，為了能夠有效轉染或者感染整合有目的基因的逆轉錄病毒載體，通常要求少量處于靜止期的造血干細胞進入細胞周期，并進行增殖。目前已經對被認為參與造血干細胞和造血前體細胞增殖的干細胞因子(SCF)和flk-2/flk-3配體的作用進行了研究。
試驗研究已經證明c-kit/SCF信號對造血干細胞和造血前體細胞的增長具有重要作用(Blood，781-19，1991；Blood，812844-2853，1993；Blood，904767-4778，1997)，而且還發現干細胞因子(SCF)是在造血干細胞和造血前體細胞上表達的酪氨酸激酶型受體c-kit的配體(Cell，63167-174，1990；Cell，63195-201，1990；Cell，63225-233，1990)。因此，研究人員認為SCF可能對造血干細胞和造血前體細胞的增殖有作用。可是，人造血干細胞和造血前體細胞上的c-kit表達量很低(Blood，874136-4142，1996)，而單獨使用SCF擴增活性低，且對造血干細胞和造血前體細胞的增殖不完全有效。
在多種組織和血細胞中都發現有所表達的受體型酪氨酸激酶flk-2/flt-3主要在未分化的造血干細胞中表達，而flk-2/flt-3配體(FL)已被鑒定為刺激未分化的造血細胞增殖的因子(Lyman S.D.Curr Opin Hematol 1998；5(3)192-6)。不過，該分子單獨使用時擴增活性低，且對造血干細胞和造血前體細胞的增殖不完全有效。
因此，單獨使用SCF或FL都不能對造血干細胞和造血前體細胞的增殖完全有效，理想的造血干細胞和造血前體細胞的擴增方法是將它們同多種細胞因子進行組合(Blood，892644-2653，1997；CancerChemother.Pharmacol.，38[Suppl.]64-68，1996)，有人已經研究了這類分子和TPO(血小板生成素)、白介素6(IL-6)/可溶性白介素6受體復合物或者超IL-6(IL-6和IL-6受體的融合蛋白質)等的組合(Exp.Hematol.29822-832，2001)。此外，還期待能夠闡明和得到具有高擴增活性的新因子。
Cofilin是分子量大約19000的蛋白質，屬于肌動蛋白結合蛋白(ABP)中的一種，其能夠響應于多種信號而與肌動蛋白絲(F-actin)按照1∶1的摩爾比結合，由此調節肌動蛋白的物理狀態，并在基于肌動蛋白的細胞骨架的再構建中發揮主要作用(試驗醫學、第12卷，第4號24-28，1994)。并且已知Cofilin通過和G肌動蛋白結合并切割G肌動蛋白(肌動蛋白單體)并使之解聚來調控多種細胞反應，包括形態變化、移動(運動)、分裂、分泌、胞吞(飲)作用和多種信號的傳導等(生物化學，第71卷，第2號101-114，1999)。Cofilin在細胞內存在磷酸化和去磷酸化的2種形式，磷酸化抑制，而去磷酸化促進其對肌動蛋白的結合活性。
近年來已知Cofilin的去磷酸化響應于多種外來刺激包括凝血酶刺激血小板、甲狀腺刺激激素刺激甲狀腺細胞、異丙腎上腺素刺激腮腺細胞、聯丁酰基cAMP刺激星形膠質細胞等(Moon，A.&Drubin，D.G.(1995)Mol.Biol.Cell.6，1423-1431)。此外，據報道當中性粒細胞和T細胞活化時，Cofilin發生去磷酸化。
目前已經提出了一些通過肌動蛋白結合蛋白質(ABP)的功能或者通過調節ABP功能來治療某些特定的疾病的方法。例如對因肌動蛋白沉淀而發病的疾病組織、器官施用肌動蛋白的治療或者緩解疾病的方法(特表平5-50603A，特表平8-510998A)；根據細胞凋亡的調節機制，用Cofilin去磷酸化的抑制劑治療凋亡調控失調相關的各種疾病(特開平10-67662A，特開平10-87484A)。
不過，到目前為止還沒有關于Cofilin及其類似化合物參與造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化的相關報道。
本發明的目的是提供造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其可以用于治療造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或者分化不足引發的疾病，尤其用于各型血細胞減少癥和/或造血功能低下相關疾病的治療。此外，本發明的另一目的是提供造血干細胞的體外擴增方法，其包括施用造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑，該方法也可用于造血干細胞移植、基因治療以及再生治療。
發明概述本發明者以前處理人骨髓性白血病細胞系，建立了特征為CD34表達為陽性而同時GP(糖蛋白)IIb/IIIa表達為陰性的新細胞系(特開平6-269284A)。本發明人命名該細胞為人骨髓樣白血病細胞S6SBM332(以下稱“S6細胞”)，1993年3月9日交付于日本茨城縣，筑波市東1-1-1通商產業部工業技術院生命科學工業技術研究所(現在的獨立行政法人產業技術綜合研究所，特許生物保藏中心)，以FERM BP-4227為代號進行了保藏。CD34是隨著造血干細胞分化而消失的糖蛋白，是人造血干細胞的標記物，而GP(糖蛋白)IIb/IIIa是在血小板和巨核細胞中特異表達的血小板膜糖蛋白，屬于隨著巨核細胞的分化被增強的分化抗原，它是人巨核細胞的標記物。
S6細胞系在存在血清的條件下能持續長期培養，保持CD34表達的陽性和GPIb/IIIa表達的陰性，而且，當添加12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酰酯(TPA)進行培養時CD34的表達減弱而GPIIb/IIIa的表達顯著增強。因此判斷S6細胞系向巨核細胞方向發生分化，具有分化能力。
本發明的發明人根據以前的這些常規試驗結果進一步進行了研究，并確定S6細胞的無血清培養上清中存在促進小鼠高增殖潛力集落形成細胞(HPP-CFC)增殖的因子。根據以前的發現和這個研究的結果本發明人發現S6細胞具有造血干細胞的性質，并在能促進造血干細胞增殖的未知因子(以下稱“S6因子”)存在下進行自分泌增殖。這樣即暗示S6因子可能是新型的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖因子。基于此可能性，發明人純化S6細胞的無蛋白質培養上清，不僅分離純化了具有HPP-CFC擴增能力的因子，確定其結構或克隆了該因子的基因，并對基因重組因子的HPP-CFC擴增能力進行深入研究，結果意外的發現該因子是低分子量的肌動蛋白結合蛋白，Cofilin。
基于此發現，本發明的發明人發現作為肌動蛋白結合蛋白質之一的Cofilin是能促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的因子，該因子能夠促進小鼠HPP-CFC擴增，并且和目前具有HPP-CFC擴增能力的細胞因子相比，該因子具有明顯更高的活性，至此完成本發明。
由此，本發明提供含Cofilin為有效成分并可再含有其它細胞因子作為可選成分的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑。
本發明還提供促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的方法，此方法包括施用至少一種上述造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的促進劑。
本發明還提供通過使用至少一種造血干細胞和/或造血細胞增殖和/或分化促進劑對造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化不足引發的疾病，尤其是各型血細胞減少癥或者造血功能低下等疾病進行治療的方法。
本發明還提供了體外擴增造血干細胞的方法，此方法包括施用至少一種上述造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑。
本發明還提供再生性醫療的方法，其包括使用至少一種造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑，體外擴增造血干細胞，并移植所擴增的造血干細胞。
附圖簡述

圖1是人非肌肉型Cofilin(ACP23528)的一級結構序列圖。
圖2是人胎盤非肌肉型Cofilin(ACD00682)的cDNA序列圖。下劃線部分表示合成為引物的2個寡聚物的位置，即引物SK013(序列號3)和引物SK014(序列號4)。
圖3是人胎盤來源(上部)和人S6細胞來源(下部)的非肌肉型Cofilin的堿基序列比對結果。兩者相比較，第198號堿基和第471號堿基不同，這兩個位點的不同都歸因于沉默突變。
圖4是對表達重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞的培養上清的造血干細胞擴增作用進行HPP-CFC分析的結果。
圖5表示與單獨添加SCF或者FL相比，人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL聯合時，擴增人臍帶血來源的CD34陽性細胞的顯著能力。
圖6A表示當人非肌肉型Cofilin和SCF、FL聯合時，引起人臍帶血來源的CD34陽性細胞的顯著擴增。
圖6B～D表示人臍帶血來源的CD34陽性細胞在人非肌肉型Cofilin+SCF+FL條件下培養后進行集落形成分析的結果，CFU-GM、BFU-E以及CFU-Mix的集落數量都分別顯著增加。
圖7表示人臍帶血來源的CD34陽性細胞在人非肌肉型Cofilin+SCF+FL條件下培養后進行集落形成分析的結果，CFU-Mk的集落數量顯著增加。
圖8是在人非肌肉型Cofilin和SCF、FL聯合的條件下，人臍帶血來源的CD34陽性細胞分化并生長成巨核細胞的顯微鏡照片。
圖9是在人非肌肉型Cofilin和SCF、FL聯合的條件下，將人臍帶血來源的CD34陽性細胞培養2周左右時，部分巨核細胞形成前血小板(proplatelets)的顯微鏡照片。
發明詳述本發明的Cofilin促進的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性可以參照促進HPP-CF擴增的活性(以下稱“HPP-CFC活性”)來進行測定。HPP-CFC代表高增殖潛能集落形成細胞，其可由在體外集落形成檢測中具有足夠強的擴增能力而形成宏觀集落來證明；HPP-CFC的分化程度比長期培養的起始細胞(long termculture-initiating cell、LTC-IC)快一個階段，后者由在間質細胞上培養骨髓細胞至少5周以后仍能保持集落形成能力而被檢測出來。并且，本發明中的HPP-CFC活性指的是被檢物質對HPP-CFC擴增的促進活性。
HPP-CFC活性可以按如下方法測定為了特異性地得到造血干細胞，用抗癌藥物5-氟尿嘧啶處理小鼠，從該小鼠的骨髓細胞中去除T細胞、B細胞、粒細胞以及巨噬細胞，分離得到造血干細胞級分；在添加樣品和/或者細胞因子后，造血干細胞在液體培養基中培養，將含有造血干細胞的部分條件化的培養液用于集落分析，計數形成的宏觀HPP-CFC集落數。根據此測定方法，可對本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑的活性進行測定。
本發明中，用Cofilin進行上述HPP-CFC活性測定時，發現Cofilin對HPP-CFC發揮作用，并顯示誘導其增殖和/或者分化的活性。因此，Cofilin能夠對那些多能干細胞或者那些處于其增殖和/或分化過程的最初級階段的造血干細胞和/或造血前體細胞發揮作用，由此促進這些多能干細胞的增殖和/或分化。
本發明中的“造血干細胞”指的是能分化成包括紅細胞、白細胞、血小板等所有血細胞的多能干細胞。此類細胞為CD34陽性、而其它細胞系標志完全陰性。例如本發明中的“造血干細胞”不僅包括骨髓來源的CD34陽性細胞，還包括臍帶血來源的CD34陽性細胞。
本發明中的“造血前體細胞”指比造血干細胞分化階段更進一步，但是還沒有分化成為各種血液細胞系的前體細胞(單潛能前體細胞)。例如本發明中的“造血前體細胞”包括粒細胞/巨噬細胞相關的前體細胞(集落形成單位粒細胞巨噬細胞CFU-GM)、紅細胞相關的前體細胞(爆發集落形成單位紅細胞，BFU-E)、巨核細胞相關的前體細胞(集落形成單位巨核細胞、CFU-Mk)以及骨髓相關的干細胞(混合的集落形成單位、CFU-Mix)等。
本發明的造血干細胞和/或者造血前體細胞的“分化”一詞既指造血干細胞向造血前體細胞的變化，也指從造血前體細胞向單潛能造血前體細胞和/或者有特定功能的細胞即紅細胞、白細胞、巨核細胞等成熟細胞的轉變。
因此，本發明的對造血干細胞和/或者造血前體細胞增殖促進活性指使具有上述功能的造血干細胞和/或者造血前體細胞擴增而增殖出具有同樣功能的造血干細胞和/或者造血前體細胞的活性。此外，本發明中的造血干細胞和/或者造血前體細胞分化促進活性指使造血干細胞和/或者造血前體細胞分化而轉化成具有上述功能的造血前體細胞，骨髓相關的干細胞，單潛能前體細胞和/或者成熟血細胞(紅細胞、白細胞和巨核細胞)的活性。本發明中術語HPP-CPC和造血干細胞和/或者造血前體細胞同義使用。
作為切割因子之例的Cofilin是在真核生物中普遍存在的低分子量(15-21kDa)的肌動蛋白結合蛋白質，而任何一個高等脊椎動物的Cofilin均由166個氨基酸組成。并且，此氨基酸序列在系統樹上遠離的物種間存在30％以上的全長同源性。例如，人的Cofilin包括肌肉型Cofilin和非肌肉型Cofilin，其同源性達到76.5％。在本發明中沒有特殊限定的情況下，所說的“Cofilin”指具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的Cofilin及其類似物。
本發明中的Cofilin類似物指具有造血干細胞和/或者造血前體細胞增殖和/或者分化促進活性的下列物質在SEQ ID NO1所示的Cofilin的氨基酸序列中含有1個或者多個氨基酸缺失、置換和/或者添加的氨基酸序列；可以和SEQ ID NO1所示的Cofilin氨基酸序列的編碼堿基序列的互補序列在嚴緊條件下雜交的堿基序列所編碼的氨基酸序列；和Cofilin的氨基酸序列(SEQ ID NO1)之間存在至少30％，優選至少50％、更優選至少60％，尤其優選至少70％同源性的氨基酸序列。本發明中提到的Cofilin類似物包括具有造血干細胞和/或者造血前體細胞增殖和/或者分化促進活性的下列物質由和SEQID NO2所示的Cofilin堿基序列的互補堿基序列能在嚴緊條件下雜交的堿基序列所編碼；由包含和SEQ ID NO2所示的Cofilin堿基序列之間至少存在30％、優選至少50％、更優選至少60％、最優選至少70％堿基序列同源性的堿基序列的DNA所編碼。
此處所說的“一個或者多個”優選指1到20個，更優選1到10個，且最優選1到5個。對于蛋白質，“缺失”、“置換”、“添加”指如在Cofilin(SEQ ID NO1)的情況中，其發生方式可保留造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化的促進活性。例如氨基酸“置換”的情況包括用具有相似性質的氨基酸進行置換，例如用另一個疏水性氨基酸置換某個疏水性氨基酸、用另一個親水性氨基酸置換某個親水性氨基酸、用另一個酸性氨基酸置換酸性氨基酸或者用另一個堿性氨基酸置換某個堿性氨基酸。
本發明中的嚴緊條件指目的堿基序列和Cofilin(SEQ ID NO1)編碼堿基序列(例如SEQ ID NO2)或者與其簡并序列之間能發生特異性雜交的條件。雜交條件取決于溫度、離子濃度等條件，且已知一般情況下，溫度越高，離子濃度越低，嚴緊程度越高。本領域技術人員可以根據例如Sambrook以及Russel(Molecular CloningALaboratory Manual，第三版(2001))所記載的方法對這樣的嚴緊條件進行設定。這種嚴緊條件的例子具體如使用6×SSC、5×Denhardt’s、0.1％SDS、25℃到68℃等的雜交條件。此時，雜交溫度優選可以為45℃到68℃(無甲酰胺)或25℃到50℃(50％甲酰胺)。
本發明的氨基酸或者堿基序列的序列同源性可以通過目測或者數學計算進行測定。可以在Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.，48443-453，1970)基礎上并使用威斯康辛大學遺傳學計算小組(UWGCG)的GAP計算機程序比較2個蛋白質序列的序列同源性。GAP程序中優選的缺省參數包括(1)Henikoff和Henikoff(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919，1992)所記載的得分矩陣blosum62、(2)12個缺口權重(gap weight)、(3)4個缺口長度權重(gap length weights)和(4)末端缺口無罰分(penalty)。
本發明中對氨基酸序列或者堿基序列進行同源型分析時，也可以使用其它本領域技術人員所用的序列比較程序。例如可以用Altschul等人(Nucl.Acids.Res.25.，p.3389-3402，1997)所述的BLAST程序對序列信息進行比較。具體而言，當分析堿基序列時，向核苷酸BLAST(BLASTN)程序提交堿基序列，和GenBank、EMBL及DDBJ等堿基序列數據庫進行比較。在進行氨基酸序列分析時，向蛋白質Blast(BlastP)提交氨基酸序列，和GenBank CDS、PDB、SwissProt、PIR等氨基酸序列數據庫進行比較。可以在互聯網的National Centerfor Biotechnology Informatin(NCBI)、或者DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)的網頁上得到上述程序。在那些網站中詳細記錄了用BLAST程序進行同源性檢索的各種參數。盡管可以適當改變部分設定，通常使用默認值進行同源性檢索。也可以使用本領域技術人員使用的其它的序列比較程序。
上述Cofilin及其類似物不限于天然產物，也可由本發明的技術領域內已知的基因工程方法制備，例如由定點突變、突變劑處理或PCR錯誤擴增的隨機突變、盒式突變等方法制備的產物。換言之，突變可以自然發生也可以使用基因工程技術產生。例如氨基酸酸序列(SEQID NO1)和基因序列(SEQ ID NO2)已知的Cofilin，可以這些序列為基礎，用已經建立的基因工程手段進行生產。可用的基因工程技術記敘于Sambrook和Russel(Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版(2001))。技術人員可以常規方法，容易地制備這些突變的蛋白質。
Cofilin因生物物種不同有不同的名稱，通常，將其統稱為Cofilin家族。本發明中將所有Cofilin分子，包括那些源自或屬于Cofilin家族的Cofilin分子總稱為Cofilin。因此，本發明中所說的Cofilin除了人肌肉型Cofilin和非肌肉型Cofilin之外，還包括例如豬destrin、雞肌動蛋白去聚合因子(ADF)、海膽卵的蠶食蛋白、酵母的Abpl、變形蟲載肌動蛋白和它們的類似物。
具有Cofilin活性的物質作為造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑的活性不具有嚴格的種屬特異性，例如小鼠來源的Cofilin能夠對人的細胞發揮作用。因此，本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑的有效成分絕不限于Cofilin，且只要其在促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性方面與Cofilin相當，該有效成分不需限定于特定的種屬來源，例如其可以源于牛、豬、鳥、山羊和綿羊等動物。不過，當用于人體時，優選用人源的，即來源于人的Cofilin或者來源于人的Cofilin類似物。
本發明的一個實施方案中，造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑除了Cofilin或者其類似物之外，還可以含有一或多種具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的細胞因子作為輔助有效成分。
本發明中作為輔助有效成分可添加的細胞因子包括，且不限于白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細胞生成素(EPO)、干細胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、上皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、蛋白酶連接蛋白I、蛋白酶連接蛋白II、血小板來源的生長因子(PDGF)、膽堿能分化因子(CDF)、白細胞移行抑制因子(LIF)等。如需要，還可以含有IL-6/可溶性IL-6受體復合物或者超IL-6(來自IL-6和可溶性IL-6受體的融合蛋白質)。本發明的可添加細胞因子優選為干細胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)以及兩或三種這些物質的組合。
如果作為輔助成分添加這些細胞因子，Cofilin作為造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑的效果會協同增加。這些細胞因子的添加量沒有特定限制，但可以例如以人Cofilin作為100，各種成分可以按照0.0001-200000重量％進行添加。這些輔助有效成分的添加量絕不限于上述值，而可根據癥狀、患者的年齡等采用適當的量。這些細胞因子并非必需和Cofilin同時以相同的劑量形式給藥，例如可在Cofilin給藥后，進行細胞因子的給藥。
在本發明的一個實施方案中，可以向上述造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑添加Cofilin以外的具有HPP-CFC活性的物質作為進一步的輔助成分。作為進一步的輔助成分的Cofilin以外的具有HPP-CFC活性的物質指能夠通過促進形成HPP-CFC來源的集落來促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的Cofilin以外的任何物質。將Cofilin和這些添加的輔助成分同時給藥，能夠協同增強對造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的促進作用。這樣的額外輔助活性成分包括，但不限于SCF、flk-2/flt-3配體、TPO、IL-6/可溶性-6受體或者超IL-6(來自IL-6和可溶性IL-6受體的融合蛋白質)等。
基于其對機體給藥后所表現出的效果，本發明的以Cofilin為有效成分的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑，在改進治療造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化不足引發的疾病的方法中有效，具體而言，如對于各型血細胞減少癥和/或者造血功能低下相關疾病，或者血細胞減少癥或者造血功能受損相關疾病和/或者在改善治療血細胞減少癥或者造血功能受損疾病的方法中有效。上述疾病實例包括范可尼綜合癥、再生不良性貧血、如惡性淋巴瘤或者急性白血病等的癌癥、慢性肝病、腎衰、手術時或者需輸入大量保存血的輸血患者、重癥感染、骨髓障礙性血小板減少癥、特發性血小板減少性紫斑病(ITP)、STE、毒蛇咬傷、溶血性尿毒綜合癥、脾功能亢進、出血、Barnard-Soulier綜合癥、Glanzmann’s血小板無力癥、尿毒癥、抗血小板抗體、骨髓增殖性疾病等。
本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑的給藥方式沒有特殊限定，但一般采用腸胃外給藥，例如以靜脈內、腹腔內、肌內等途徑給藥。本發明中優選靜脈內給藥。
本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑作為治療或者改善藥物時的使用量因其使用方法、使用目的等不同而變化。注射給藥時，以Cofilin蛋白質的量計算，該促進劑優選每日給藥約0.002μg/kg～20mg/kg，更優選0.2μg/kg～2mg/kg。
本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑可以制備成液體或者固體形式。
如果本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑制備成液體，則將Cofilin溶解在水溶液(如蒸餾水)、水溶性溶劑(如生理鹽水、Ringer溶液)、及油性溶劑(如芝麻油、橄欖油)等溶劑中，然后按照慣用的方法進行制備。根據要求，還可以添加溶解劑(例如水楊酸鈉和乙酸鈉)、緩沖液(例如檸檬酸鈉和甘氨酸)、等滲劑(例如葡萄糖和轉化糖)、穩定劑(例如人血清白蛋白和聚乙二醇)、防腐劑(例如苯扎氯銨和酚)、無痛劑(例如苯甲醇、鹽酸普魯卡因)等添加劑。此外，該水溶液的pH優選調整到3～8，更優選約5～7。為了調整到上述pH范圍，可添加例如稀酸(例如稀鹽酸)和稀堿(例如稀氫氧化鈉和稀碳酸氫鈉)等。
由本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑制備藥物制劑時，可向含有Cofilin的溶液制劑中添加人血清白蛋白(HSA)作為穩定劑，使其在pH調整到3～8時處于溶解形式。優選進行此步因為在保存過程中或者冷凍以及凍干操作中可使Cofilin的活性下降較低，而且可使冷凍制劑溶解為透明溶液。只要能將本組成物用于臨床，可采用任何類型的HSA，優選使用腸胃外給藥標準品質。例如根據Cohn的乙醇分離的第6種方法分離純化健康人血漿所得到的。此外，穩定劑可以含有乙酰色氨酸鈉和辛酸鈉。當各個成分制成水溶液時，優選每毫升水溶液含有約0.1mg～約50mg、特別優選約0.5mg～約20mg的HSA。
由本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑制備藥物制劑時，可向含有Cofilin的溶液制劑中，除添加上述HSA之外，還可添加一或多種選自下列的成分甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸等氨基酸、特別是單氨類脂族氨基酸或者環狀氨基酸；葡萄糖、甘露糖等單糖；山梨醇、甘露醇等糖醇，其生理學上可接受的鹽及其衍生物。當Cofilin制成水溶液時，上述化合物優選以每毫升水溶液中，若為單糖或者糖醇，則約10mg～100mg的量整合、而若為氨基酸，則約5mg～約50mg。制備上述藥物制劑時，該水溶液的pH調節至約3～8，優選pH約5～7。當添加谷氨酸等酸性氨基酸時，可通過按照上述量添加該物質來調節到所定的pH。或者，根據要求或不添加上述的酸性氨基酸時，用鹽酸，磷酸等的無機酸或者琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等的緩沖液調節到所定的pH。
此外，本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑可制備成固體形式，例如以冷凍或者凍干Cofilin的方法進行制備。特別是，出于對便于處理和貯存的穩定性方面的考慮，優選凍干Cofilin。為了由冷凍制備本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑，可以用制成水溶液的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑為起始原料，通常在-80℃～-20℃進行冷凍。該冷凍組合物貯存于約-80℃～25℃、優選約-80℃～15℃、更優選-80℃～-10℃。為由凍干制備本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑，例如可以將上述冷凍的組合物按照常規方法進行減壓干燥，或者，將上述水溶液或者上述冷凍組合物溶解得到的水溶液按照要求分成小份，如上述方法冷凍后，遵照常規方法減壓干燥進行制備。
在本發明中，固體形式的(例如粉末狀)Cofilin可混有稀釋劑(例如蒸餾水、生理鹽水和葡萄糖)、載體(例如羧甲基纖維素(CMC)和藻酸鈉)、防腐劑(例如苯扎氯銨和酚)、無痛劑(例如葡萄糖、苯甲醇和鹽酸普魯卡因)等。
當采用凍干方法制備上述固體制劑時，可在使用前將其溶解到適當的溶劑中。具體如將上述固體制劑用蒸餾水或者生理鹽水等溶解，以液體制劑使用。根據需要，可以用含有上述單糖、糖醇、氨基酸等的調節好pH的溶劑溶解后使用。
當本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑制成液體制劑或者以冷凍制備時，優選將含有Cofilin的水溶液利用過濾等手段除菌。制備液體制劑時，可以使用這樣除菌的水溶液；由冷凍制備該促進劑時，可以冷凍該除菌的水溶液。
本方明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑以凍干制備時，優選將含有Cofilin的水溶液進行過濾或以相似手段除菌，或者將此水溶液除菌后，在無菌操作下分裝到小瓶等類似容器中，再進行上述凍干處理。此時，將容器上層的空間進行真空處理或者用氮氣填充以提高該組合物在容器中的穩定性。如果此凍干品需要用含有氨基酸或者糖醇等的水溶液溶解，這些水溶液優選進行過濾除菌并無菌操作分裝到安瓿等類似容器中，再采用常規方法進行蒸氣滅菌。
因為本發明的以Cofilin為有效成分的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑可以發揮上述藥理學作用，因此本方明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑還可以用作再生治療藥物。
本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑用于再生治療藥物時，可以將其如上所述體內給藥或者離體添加到培養基中。當離體使用本方明的增殖和/或分化促進劑時，通常可以采用下面的方法實施，不過也可以采用此方法之外的該領域內公知的方法。首先，用該領域內公知的方法從被檢體中取得造血干細胞和/或造血前體細胞，接著，將其在含有本發明的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑的培養液中培養，使之增殖，由此促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化，然后，將增殖和/或分化后的造血干細胞和/或造血前體細胞再次移入被檢體內。
當離體使用本方明的增殖和/或分化促進劑時，其在培養液中添加的量使Cofilin在培養基中的濃度處于1ng/ml～100μg/ml范圍內，優選2.5ng/ml～50μg/ml，更優選25ng/ml～10μg/ml，最優選250ng/ml～2.5μg/ml，如前所述，可向本發明的增殖和/或者分化促進劑中進一步加入細胞因子。本發明中可選添加的細胞因子優選為干細胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)以及二或三種這些物質的組合。
發明的實施方式(1)檢測具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的方法為了檢測造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖，本發明采用了如下方法將去除了表達細胞譜系標記物(Lineage maker)細胞的小鼠骨髓細胞樣品進行液體培養后，在含有造血干細胞的條件化的培養液中測定存在的高增殖潛能集落形成細胞(HPP-CFC)的數量。以HPP-CFC為指標的檢測系統已經廣泛用于造血干細胞研究之中。例如作用于造血干細胞的干細胞因子(SCF)參考HPP-CFC指標進行純化。
(2)純化具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質為純化具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質，以S6細胞的無蛋白質培養上清(600L)以及細胞為出發原料，用分子量為10000的UF膜進行分離，超濾濃縮(到18L)后，然后進行一系列處理，包括用50％的硫酸氨沉淀并經過多個色譜柱純化，使用苯基瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、肝素瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、螯合瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K)、MonoS(AmershamPharmacia Biotech)、凝膠過濾法等。以280nm光吸收、Lowry定量和SDS-PAGE對蛋白進行驗證。
(3)具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的結構測定為了測定具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的結構，通過參考蛋白質有限降解產生的多個肽片段的分子量以及參考其碰撞誘導裂解得到的分子量來檢索蛋白質/核酸序列數據庫并鑒定原始蛋白。此方法的技術背景包括下列三個方面質譜儀和質譜質析的發展可以對蛋白質和肽的分子量進行高精度的測定；(2)基因組計劃和其它技術努力已經積累了大量蛋白質/核酸序列；以及(3)計算機技術已經發展到可以高速處理大量數據的水平。此方法的優點是可以通過簡單的操作對很少量的樣品(約10ng)進行處理，來迅速并且可靠地確定未知的蛋白質。
(4)HPP-CFC活性的測定方法采用如下方法測定HPP-CFC活性為了特異性取得造血干細胞，從對小鼠進行抗癌藥物5-氟尿嘧啶處理后得到的骨髓細胞中去除T細胞、B細胞、粒細胞以及巨核細胞，分離得到造血干細胞級分，在加入樣品和細胞因子后對造血干細胞進行液體培養基培養，并將含有造血干細胞的條件化的培養液的一部分作集落分析，對形成的宏觀HPP-CFC集落進行計數測定。
在本說明書中用省略語表示堿基、氨基酸等時，采用IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature的省略語或者該領域內慣用的省略語。
說明書的以下部分記載的是實施例。這些實施例用于對本發明進行更詳細的說明，而不限定本發明的范圍。
實施例實施例1具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的純化和鑒定(1)人S6細胞的制備將人S6細胞在750cm2有效面積的搖瓶(Corning，430851)中培養。具體來說，每個搖瓶接種1×108個細胞，用500ml含有10％胎牛血清(FBS、Hyclone公司)的F-12培養基(Flow Laboratories)在37℃、以0.5rpm培養72小時。72小時后，離心去除上清，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS、日水制藥)洗滌3次。洗凈后，離心，將去除上清的細胞沉淀在-20℃凍存。
(2)用小鼠骨髓細胞測定具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質以下列步驟測定能促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性物質為了特異性取得造血干細胞，從對小鼠進行抗癌藥物5-氟尿嘧啶(KYOWA HAKKO KOGYO Co.，Ltd)處理后得到的骨髓細胞中去除T細胞、B細胞、粒細胞以及巨核細胞，分離得到造血干細胞組分，在加入樣品和細胞因子后對造血干細胞進行液體培養基培養，將含有造血干細胞的條件化的培養液的一部分作集落分析，對形成的宏觀HPP-CFC集落進行計數測定。以下，稱此測定法為HPP-CFC活性測定法。
具體細節對小鼠DBF1(雌性，10～15周齡、購自日本CharlesRiver公司)進行5-氟尿嘧啶給藥，2天后，從大腿骨中采取骨髓細胞。用大鼠抗小鼠CD4抗體(CALTAG)、CD8抗體(CALTAG)、B220抗體(CEDERLANE)、Gr-1抗體(CEDERLANE)、和Mac-1抗體(CALTAG)對所采骨髓細胞進行標記。這些抗體全部為IgG。接著，用Dyna珠(DYNAL)標記的的山羊抗大鼠IgG抗體進行反應后，磁性去除結合Dyna珠的細胞，獲得細胞譜系標志物陰性的骨髓細胞(Lin-BMCs)。將Lin-BMC在含有10％FCS(Invitrogen)的α-MEM培養基(Invitrogen)中調節至濃度為2.5×104個細胞/ml。向此細胞懸浮液中添加小鼠IL-3(以最終濃度為10ng/ml，INTERGEN)后，將此細胞懸浮液加到24孔板(Corning)中，每孔1ml。接著，向各孔中加入樣品，在37℃、5％CO2的條件下于CO2溫箱中培養。液體培養的第6天和第10天，懸浮起各個孔中培養的細胞后，取出細胞懸液中的200μl。在15ml離心管中將取得的200μl細胞懸液混合1.5ml FCS(以終濃度為30％)、0.5ml BSA(以終濃度為1％，ICN)、50μl的2-ME(以終濃度為1×10-4，Wako Pure ChemicalIndustries Ltd.)、在αMEM中制備的2ml的2.5％甲基纖維素(以終濃度為1％，Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.)、每種造血因子50μl(即，小鼠IL-3(INTERGEN)、SCF(PeproTech)、人IL-6(PeproTech)、G-CSF(CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)、及M-CSF(綠色十字公司)；全部以終濃度為10ng/ml)及0.5mlαMEM，得到總體積5ml。之后，靜置20分鐘去除所有氣泡，并將其中的1ml轉到4個35mm的培養皿(Corning)中培養懸浮細胞。向9cm的培養皿中放入2個35mm的皿以及1個不加蓋子的添有蒸餾水的35mm皿。在37℃、5％CO2的條件下于CO2溫箱中培養14天。對直徑達到2mm以上的HPP-CFC集落進行計數。
(3)具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的純化向用PBS洗凈并凍存的(濕重為269g)S6細胞中加入20mMTris/HCl緩沖液(pH7.0)，在Potter-Elvehjem型Teflon勻漿器(IWAKI GLASS CO.，LTD)中破碎混合物。離心分離細胞殘渣(8000rpm，20分鐘)，取得上清，添加硫酸氨達50％的飽和度。將上清加到用2M硫酸胺/20mMTris/HCl緩沖液(pH7.0)平衡的苯瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)上，充分洗滌后，硫酸氨的濃度按照1.5M、1M、0.5M、0M分階段下調，洗脫相應的結合級分。本說明書中所述的S6因子主要存在于1M硫酸胺/20mMTris/HCl緩沖液(pH7.0)的洗脫級分中，由(2)所述的測定HPP-CFC活性的同樣方法確認。
用0.6M NaCl/20mM Tris/HCl緩沖液(pH7.0)充分透析苯瓊脂糖得到的活性組分后，將其加樣到肝素瓊脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech K.K.)上進行洗脫，用2M NaCl/20mM Tris/HCl緩沖液(pH7.0)處理來洗脫各個結合級分。用20mM Tris/HCl緩沖液(pH7.0)4倍稀釋肝素洗脫級分，并使之吸附到用0.5M NaCl/20mMTris/HCl緩沖液(pH7.0)平衡的銅(Cu)螯合瓊脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech K.K.)上，用0.5M和0.3M NaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)分2個階段洗滌，進行緩沖液置換。
用0.1M咪唑/0.3M NaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫結合的級分，并如此加樣到用0.4M NaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡的MonoS離子交換柱上，以流速0.7ml/分鐘，進行0.4～2M NaCl的梯度洗脫，向洗脫液中加入終濃度為0.1％的表面活性劑CHAP，保存。經確認，其中HPP-CFC活性存在于47～50洗脫級分中，經ELISA檢測，該級分中含有目的S6因子之外，還共存有堿性FGF。將MonoS活性級分分成第一組(47，48洗脫組分)和第二組(49、50洗脫組分)兩組，并嘗試以肝素柱梯度洗脫的方法去除堿性FGF。將樣品加到用0.4M NaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)/0.1％CHAPS平衡的肝素色譜柱后，以流速0.7ml/分鐘，用0.4～4M NaCl進行梯度洗脫。
第一MonoS活性組在第30～32洗脫級分表現出活性。經ELISA檢測，確認其中含有堿性FGF，由此闡明該活性來自堿性FGF。
第二MonoS活性組在除了30～32(堿性FGF組分)之外的洗脫級分中表現出HPP-CFC活性，經ELISA檢測，其中22、23洗脫級分沒有FGF。對活性級分附近的各個級分進行了劑量分析和在用1ng/ml堿性FGF補充的系統中的分析。經確認第22、23級分的活性具有劑量依賴性，且液體培養第10天的HPP-CFC集落形成促進活性高于第6天的培養液。此外，在補充堿性FGF的分析系統中發現第22、23級分的活性比單獨的堿性FGF的HPP-CFC活性高。
為了再次確認活性，改變肝素柱梯度斜率，再次進行柱純化。將樣品加到用0.3M NaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)/0.1％CHAPS平衡的肝素色譜柱后，用較溫和的斜率以0.3～2M的NaCl進行梯度洗脫。經確認HPP-CFC活性在25～27級分中，經ELISA確證該級分中不含堿性FGF。還確證活性級分26存在劑量依賴性的活性，在添加堿性FGF的分析系統中，其活性比單獨用堿性FGF的HPP-CFC活性高。此外，用SDS聚丙烯酰氨電泳(膠濃度10～20％梯度)對活性級分進行分析，在20kDa左右存在條帶。
通過以上各個步驟，從120L的S6細胞中得到了0.4μg的級分，其在SDS聚丙烯酰氨電泳分析顯現20kDa的條帶，經確認那些級分具有HPP-CFC活性，其中此20kDa的條帶是具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質。
(4)具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性物質的性質本發明目的因子具有下述性質。
1.分子量大約20kDa(SDS-PAGE)經SDS聚丙烯酰氨電泳分析，該因子作為20kDa附近的單一條帶被檢出，在還原和非還原狀態下，移動度沒有差別。因此分子間沒有二硫鍵結合。
2.等電點8.1±0.5用AFB MultiphorII(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)進行雙向電泳分析，該因子檢測為靜止區域內的一個點。
(5)測定具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的結構按照以下的流程，測定該因子的結構。
為MS以及MS/MS測定制備樣本將含有鑒定為目的因子的20kDa條帶的純化級分用12.5％丙烯酰胺凝膠進行SDS聚丙烯酰氨電泳分析后，用0.1％CBB/40％MeOH/1％AcOH染色。檢出20kDa條帶后，切取該條帶，在40％MeOH/1％AcOH中脫色。將脫色的膠在10mMDTT/100mM NH4CHO3(pH8.7)中浸泡，56℃孵育1小時。添加55mM碘乙酰胺，暗孵育45分鐘來還原并烷基化該因子。從膠中去除過剩的還原劑和烷基化劑后，添加150mg胰蛋白酶(Promega)/5mMCaCl2/50mM NH4HCO3，在37℃條件下進行膠內胰蛋白酶消化18個小時。反應結束后，提取肽片段，用SPEED BACK(Savant)進行干燥。將溶解在0.05％TFA中的肽片段混合物加到用0.05％TFA平衡的PorosR2(Perseptive Co.Ltd.)，并用50％MeOH/0.2％FA洗脫除鹽。將除鹽后的肽片段混和物作為質譜分析(MS)和串聯質譜分析(MS/MS)的樣品(條件化的肽片段化合物)。作為陰性對照，從只用樣品緩沖液進行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳的泳道中的認為是20kDa條帶的位置切取膠條，按照與該因子相同的方法條件化。詳細操作可參考Wilm等人的方法進行(Wilm，M.，Shevchenko，A.，Houthaeve，T.，Breit，S.，Schweigerer，L.，Fotsis，T.and Mann，M.Nature 379，466-469，1996)。
通過MS以及MS/MS分析進行結構測定用Q-TOF(四重極直交加速飛行時間質譜分析儀，Micromass公司)對該因子的結構進行測定。可遵照MS以及MS/MS測定操作指南進行測定。首先，對條件肽片段混合物和陰性對照分別由MS在100～1500的mz范圍內進行測定。對于作為肽指示的多價分子離子進行了兩種方法的比較，在條件肽片段混合物中明確檢測出了3個2價分子離子(見表1)。
表1在MS以及MS/MS分析中得到的主要離子分子離子序號1分子離子583.82(2價)分子離子序號2分子離子669.39(2價)產品離子(y離子)712.43，827.45，990.51，1103.60，1174.66產品離子(i離子)86.08，136.07分子離子序號3分子離子670.9(2價)然后，分別選擇這3個2價離子進行MS/MS測定。根據主要產品離子的所得信息，用國際互聯網上公開的數據庫檢索程序之一ProteinProspector(http//prospector.ucsf.edu/mshome3.2.htm)進行檢索，得到了眾所周知為低分子量肌動蛋白調節蛋白的人非肌肉型Cofilin(ACP23528、pI 8.22、166aa)。目的因子和人非肌肉型Cofilin的分子量、等電點等類似。
可是，僅僅根據MS及MS/MS分析確認本因子是人非肌肉型Cofilin還比較困難。因此，為了將表1中所記述的信息和人非肌肉型Cofilin匹配性進行更加嚴密的研究，根據得到的信息合成肽(表2)并測定碰撞解離譜驗證其同一性。結果得到的信息完全和表1所記載的信息一致。更值得特別指出的是所得信息中含有表2所記載的N末端和C末端肽相關的信息，因此表明該因子的N末端和C末端和人非肌肉型Cofilin一致。據此確定，該因子被確定為人非肌肉型Cofilin(肌動蛋白調節的活性類型)，其在翻譯起始點沒有甲硫氨酸，接下去的丙氨酸發生了乙酰化，再接下去的絲氨酸沒有發生磷酸化(見表1)。
表2根據數據庫檢索推測的部分氨基酸序列分子離子序號根據信息1推測的N末端肽(AcetN)ASGVAVSDGVIK+添加的Na分子離子序號根據信息2推測的肽
YALYDATYETK分子離子序號根據信息3推測的C末端肽LGGSAVISLEGKPL實施例2Cofilin的制備(1)制備人S6細胞系來源的cDNA文庫用含無血清培養基F12(Invitrogen)的搖瓶連續培養S6細胞(1.2×108個細胞)4天。用FastTrack mRNA分離試劑盒(Invitrogen)，制備37μg S6細胞-polyA RNA。由5μg S6細胞-polyA RNA用TimeSaver cDNA合成試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)和Directional Cloning Toolbox(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)制備在2相對端含有EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)限制性酶切位點和NotI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)限制性酶切位點的cDNA。
然后，將cDNA插入到λ噬菌體克隆載體λExCellNotI/EcoRI/CIP(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)，用GigapackIII Gold Packaging Extract(Stratagene)進行體外包裝。以大腸桿菌NM522(Stratagen)為宿主，根據瓊脂培養基上的嗜菌斑數目測定效價為1.37×106pfu。此外，以大腸桿菌NM522為宿主，進行文庫擴增，得到了6.9×1010pfu/ml效價的S6細胞cDNA文庫。S6細胞cDNA文庫的平均插入大小是1.0kb。
(2)用PCR全長克隆人非肌肉型Cofilinc的DNA。
根據胎盤來源的人非肌肉型Cofilin的氨基酸序列的編碼堿基序列(ACD00682，501bp)合成了寡聚物SK013(對應于圖2的1～16，引物SK013SEQ ID NO3)和SK014(對應于圖2的476～501所，引物SK014SEQ ID NO∷4)。
引物SK0135’-ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGA-3’(SEQ ID NO∷3)引物SK0145’-TCACAAAGGCTTGCCCTCCAGGGAGA-3’(SEQ ID NO∷4)人非肌肉型Cofilin的cDNA以上述S6細胞cDNA文庫為模板，用SK013(SEQ ID NO∷3)和SK014(SEQ ID NO∷4)作為引物，用Advantage2聚合酶(CLONTECH公司)進行PCR擴增。將此擴增產物用Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒(Invitrogen公司)亞克隆到pCR-Blunt II-TOPO載體中，得到具有約500個堿基對的DNA片段的陽性克隆。對此陽性克隆，用BigDye Terminater Cycle Kit(Applied Biosystems公司)用ABI PRISM310(Applied Biosystems公司)進行堿基序列分析，確認取得了501個堿基對的非人肌肉型Cofilin的cDNA全長。和胎盤來源的非肌肉型Cofilin cDNA的堿基序列相比，S6細胞來源的存在2個堿基的差異，不過二者都沒有氨基酸突變(圖3)。
(3)人非肌肉型Cofilin cDNA表達載體的構建非肌肉型Cofilin cDNA克隆和pKDEMSS載體(Kitano K，Fukuda Y，Nagahira K，Nasu T，Izumi R，Kawashima K，Nakanishi T ImmunoL. Lett.47，215-222，1995)來源的pDE載體經EcoRI消化后，用堿性磷酸酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)去磷酸化。之后，將含有非肌肉型Cofilin cDNA的EcoRI片斷和pDE載體DNA片斷進行瓊脂糖電泳，切取含有DNA的膠，用CONCERT Rapid GelExtraction System(Invitrogen)進行純化。用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo Co.，Ltd.)將非肌肉型Cofilin片段插入到pDE載體的DNA片段中并用于轉化大腸桿菌JM109(Toyobo Co.，Ltd)，由此制備人非肌肉型Cofilin的表達載體。用限制性內切酶確認表達載體中插入的人非肌肉型Cofilin cDNA相對于表達所用啟動子而言其方向是正向。
(4)在COS-1細胞中表達人非肌肉型Cofilin按照以下的流程將重組人非肌肉型Cofilin進行表達，并對表達進行確認。
在COS-1細胞中表達人非肌肉型Cofilin用人非肌肉型Cofilin cDNA表達載體，在動物細胞中表達人非肌肉型Cofilin，對所表達的蛋白質是否具有HPP-CFC活性進行檢測。用COS-1(購自理化研究所)作為宿主動物細胞。用脂轉染技術轉染此人非肌肉型Cofilin cDNA。具體來說，在直徑為10cm的培養皿(Corning，430167)中接種1×106個COS-1細胞。培養基為含10％胎牛血清的Dulbecco最小必需培養基(DMEM、NISSUIPHARMACEUTICAL CO.，LTD)。第二天，用Opti-MEM I培養基(Invitrogen)5ml浸洗1次后，然后加入5ml的Opti-MEM I培養基，在37℃培養細胞2小時。培養2小時后，加入在實施例2(3)中制備的表達質粒1μg以及脂轉染試劑(lipofectin，Invitrogen)10μg的混和液，在37℃再培養5小時，培養后，加入5ml Opti-MEM培養基，共計10ml。在5％CO2存在的條件下，于37℃培養72小時。培養72小時后，離心回收上清。用沒有插入人非肌肉型Cofilin的表達載體作陰性對照進行同樣的表達過程。
分泌型重組人非肌肉型Cofilin的檢測用SDS聚丙烯酰氨電泳分析培養上清顯示轉入了人非肌肉型Cofilin cDNA載體的培養上清有可見的重組人非肌肉型Cofilin的20kDa條帶。此20kDa條帶在蛋白質印跡分析中，能夠和兔抗人非肌肉型Cofilin肽(13～22)的多克隆抗體(Cytoskeleton)發生特異反應。因此確認重組人非肌肉型Cofilin的分泌。根據蛋白印跡分析和SDS聚丙烯酰氨電泳分析，分泌型重組Cofilin的表達量為每毫升約有2.5μg。
分泌型天然人非肌肉型Cofilin的檢出對轉入了未插入人非肌肉型Cofilin的原始載體(pDE載體)的細胞的培養上清用加入10％三氯乙酸進行沉淀后，將100體積的沉淀進行上述同樣的蛋白質印跡分析時，也檢測出了微弱的天然人非肌肉型Cofilin條帶。由此說明，認為只在細胞內部存在的非肌肉型Cofilin也有微量的分泌型。
實施例3重組人非肌肉型Cofilin作為具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質的活性確認。
為了評價COS-1細胞表達的分泌型重組人非肌肉型Cofilin是否為具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質，對其培養上清進行了HPP-CFC分析。
對小鼠DBF1(雌性，10～15周齡、購自日本Charles River公司)施用5-氟尿嘧啶(150mg/kg，i.v.，KYOWA HAKKO KOGYO Co.，Ltd.)，2天后，從大腿骨中采取骨髓細胞。用大鼠抗小鼠CD4抗體(CALTAG)、CD8抗體(CALTAG)、B220抗體(CEDERLANE)、Gr-1抗體(CEDERLANE)、和Mac-1抗體(CALTAG)對所取骨髓細胞進行標記。這些抗體全部是IgG。接著，用Dyna珠(DYNAL)標記的的山羊抗大鼠IgG抗體進行反應后，磁性去除結合有Dyna珠的細胞，獲得細胞譜系陰性的骨髓細胞(Lin-BMCs)。這些細胞用作HPP-CFC分析中的造血干細胞級分。
將得到的造血干細胞級分在添加了10％FCS的α-MEM培養基中調節至濃度為2.5×104個細胞/ml。向此細胞懸浮液中添加小鼠IL-3(以最終濃度為10ng/ml)后，將此細胞懸浮液加到24孔板(Corning)中，每孔1ml。將實施例2制備的Cofilin培養上清或細胞因子加入每孔，進行液體培養，將部分含造血干細胞的條件培養液用于集落分析，通過計數所形成的宏觀HPP-CFC集落數對HPP-CFC的活性進行測定。
圖4中，Cofilin 1、2、3、4分別指的是10倍濃度的Cofilin培養上清的1-、10-、100-、和1000倍稀釋。因實施例2中分泌型重組人非肌肉型Cofilin的表達量是2.5μg/ml。其中具有所加稀釋的Colifin培養上清1/10體積的液體培養的αMEM培養基中，重組型人Cofilin的濃度分別是Cofilin 1為2500ng/ml、Cofilin 2為250ng/ml、Cofilin 3為25ng/ml、Cofilin 4為2.5ng/ml。再參見圖4，C1、C2代表加入與培養上清等量PBS的孔。SCF1、SCF5、SCF10分別表示在液體培養的培養基中含有1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的SCF。圖4數據表示在液體培養第6天和第10天各個孔的200μl細胞懸液中HPP-CFC的集落數目。輸入值表示液體培養前200μl細胞懸浮液中的HPP-CFC集落數。
和陰性對照相比較，重組人非肌肉型Cofilin，以目的因子特有的顯著的濃度依賴方式顯示HPP-CFC活性，該因子在液體培養第10天傾向比第6天活性高(圖4)。測得活性的濃度為25ng/ml(圖4中由Cofilin3標記)和SCF的1ng/ml(圖4中由SCF1標記)相當。在陰性對照的培養上清中可以測得分泌型的天然人非肌肉型Cofilin，這暗示所述Cofilin與HPP-CFC活性有一定關系(圖4)。
經過上述過程，本發明人發現已知為低分子量肌動蛋白調節蛋白質的人非肌肉型Cofilin可作為具有造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進活性的物質。
實施例4重組人非肌肉型Cofilin促進人造血干細胞和/或造血前體細胞(CD34+細胞)增殖的活性評價為了解重組人非肌肉型Cofilin是否具有促進人造血干細胞和/或者造血前體細胞增殖，將實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清添加到人造血干細胞的培養中。
向人臍帶血中加入硅膠懸濁液達到10％(V/V)并緩慢攪拌混合物。在37℃靜置大約1小時。在重力為1.077的lymphpprep(NYCOMED公司)上覆蓋后，于1600轉/分鐘條件下進行重力離心30分鐘，得到單核細胞級分。然后，用Direct CD34前體細胞分離試劑盒以及Auto-MACS(Miltenyi Biotec)得到了CD34陽性細胞。將如此得到的CD34陽性細胞在補充有20％FCS(CCT)和1％BSA(SIGMA)的αMEM(GIBCO)的培養基中調節至細胞濃度為1×104個細胞/ml，加入到12孔培養板(Falcon)中，每孔添加1ml。
向這樣制備的SCF+FL組培養板中加入人SCF(100ng/ml，R&D)和人Flt-3配體(FMA-樣酪氨酸激酶3配體，FL；100ng/ml，R&D)；向SCF+FL+Cofilin組中加入人SCF(100ng/ml，R&D)和人FL(100ng/ml，R&D)以及100μl實施例2所制備的含有重組型人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清的10倍濃縮液，然后在CO2溫箱中于37℃條件下孵育。在PBS組(對照組)，只加入等量的PBS替代上述的SCF、FL以及Cofilin。在培養的第3、5、7、9、12以及14天用血球計數板在顯微鏡下測定細胞數。用相對于培養開始時初期細胞數的增殖倍數表示結果，并將其表示在圖5中。
其結果表明人非肌肉型Cofilin和SCF+FL共存的情況下，人臍帶血來源的CD34陽性細胞隨時間增殖，與只添加SCF+FL的情況相比，表現出顯著的增殖活性。具體而言，在培養的第14天時，增加到比初期細胞數高約90倍(圖5)。
實施例5重組人非肌肉型Cofilin促進人造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和分化的活性評價。
用實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清做實驗，以各種細胞集落形成能力為增殖和/或分化促進活性的指標來了解重組型人非肌肉Cofilin是否具有促進人造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和分化的活性。
首先，將人臍帶血來源的CD34陽性細胞按照實施例4所述調節濃度到2.5×104個細胞/ml，然后向12孔培養板的每個孔中加入1ml。將實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清進行10倍濃縮，從中取出100μl和人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)和/或者人TPO(100ng/ml，R&D)以多種組合添加到上述培養板中，培養7天后，用血球計數板在顯微鏡下對細胞數目進行測定。結果用相對于培養開始時的初期細胞數的增殖倍數表示，圖6A出示各個組情況“T/C”組存在人TPO(100ng/ml，R&D)和上述的含有Cofilin的培養上清；“S/F/C”組存在人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)以及上述的含有Cofilin的培養上清；“S/F/T”組存在人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)以及人TPO(100ng/ml，R&D)；“S/F”組存在人SCF(100ng/ml)和人FL(100ng/ml)；C組存在上述的含有Cofilin的培養上清；且T組存在人TPO(100ng/ml，R&D)。PBS組表示在只添加PBS的條件下的培養物。
結果，當人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存時(即S/F/C組)令人臍帶血來源的CD34陽性細胞顯著增殖，顯示出的增殖活性約為S/F組的6倍，約是S/F/T組的2倍，培養第7天時增殖到大約“輸入值”(培養前200μl細胞懸濁液中的集落數)的58倍(見圖6A)。
接著，取一部分上述的(1)中的培養了7天的人臍帶血來源的CD34陽性細胞懸濁液，用甲基纖維素法進行集落形成分析。
按照以下的步驟用甲基纖維素法進行集落形成分析。以αMEM為基礎，在半固體培養基中添加2.2％甲基纖維素(信越化學有限公司)、30％FCS、1％BSA、5×10-5M 2ME(和光純藥)、SCF(100ng/ml)、IL-3(20ng/ml)、TPO(10ng/ml、R&D)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF；10ng/ml，CHUGAI PHARMACEUT1CAL有限公司)及紅細胞生成素(EPO；2U/ml，麒麟麥酒有限公司)，并于37℃，5％CO2的條件下在所得培養基中培養所取得的CD34陽性細胞2周，以形成各種細胞集落。
在形成的各種細胞集落中，確定粒細胞巨噬細胞相關前體細胞(集落形成單位粒細胞，巨噬細胞，CFU-GM)、紅細胞相關前體細胞(爆發集落形成單位紅細胞，BFU-E)和骨髓相關干細胞(集落形成混合單位，CFU-Mix)的集落，并利用倒置顯微鏡進行目測觀察計數。CFU-GM指的是由較小細胞密集聚集形成的粒細胞集塊和較大細胞聚集形成的粗糙的巨噬細胞集塊構成的細胞集塊，可以同BFU-GM相區分，后者指由因血紅蛋白合成而變成紅色的細胞的較大集塊。對于判別困難的集塊和沒有典型集落形態的集塊，可以在制做成細胞纖維(cytospun)樣品后，根據May-吉姆薩染色進行判斷。大于50個由粒細胞和巨噬細胞構成的細胞集塊被評價為CFU-GM集落，而500個以上的紅細胞的細胞集塊被評價為BFU-E集落，包含BFU-E和至少50個其它系譜細胞的集落被被評價為CFU-Mix集落。結果各自用相當于培養開始時的初期細胞數的增殖倍數表示，圖6B～6D分別表示了CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix集落的結果。
人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存(即S/F/C組)條件下允許人臍帶血來源的CD34陽性細胞增殖，然后對細胞進行集落形成分析。結果，CFU-GM、BFU-E以及CFU-Mix的集落數分別為“輸入值”(培養前的200μl細胞懸浮液中的集落數)的約4倍、約6倍以及約8倍(圖6B、6C、6D)。具體而言，BFU-E和CFU-Mix的集落數目比其他任何細胞因子的聯用都多得多。
實施例6重組人非肌肉型Cofilin促進人巨核細胞的前體細胞增殖和分化的活性評價發明人用實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清進行實驗，以巨核細胞的前體細胞(集落形成單位巨核細胞，CFU-Mk)的集落形成能力為指標來了解重組人非肌肉型Cofilin是否具有促進人巨核細胞的前體細胞增殖和分化的活性。
首先，按照實施例4所述方法將人臍帶血來源的CD34陽性細胞濃度調至2.5×104個細胞/ml，向12孔培養板的每個孔中加入1ml。將實施例2制備的含有重組型人非肌肉Cofilin的COS-1細胞培養上清進行10倍濃縮，從中取出100μl和人SCF(100ng/ml)、人FL(100ng/ml)和人TPO(100ng/ml，R&D)參照實施例5進行組合，即以T/C組、S/F/C組、S/F/T組、S/F、C組、T組的條件添加，培養7天。PBS組表示在只添加PBS的條件下的培養物。
接著，取部分培養7天的人臍帶血來源的CD34陽性細胞的懸濁液，用MegaCult-C(Stem Cell Technologies)使之形成CFU-Mk集落，鑒定巨核細胞和測定集落數。具體而言，將部分(100μl)細胞懸浮液添加到膠原蛋白凝膠(含有IL-3、IL-6以及TPO)中攪拌后，移到培養用玻片的小室中，培養12～14天，使之形成CFU-Mk集落。將玻片上的細胞用甲醇/丙酮溶液固定后，用抗-GP(糖蛋白)IIb/IIIa(人巨核細胞的標記物)抗體免疫染色和用Evans藍染色細胞核來檢測巨核細胞。在實施例6中，在顯微鏡下觀察時，將由20個以上巨核細胞組成的細胞集塊計為一個CFU-Mk集落。其結果用相當于培養開始時的初期細胞數的增殖倍數表示，此結果示于圖7。
人非肌肉型Cofilin和SCF以及FL共存(即S/F/C組)條件允許人臍帶血來源的CD34陽性細胞增殖，將細胞再進行集落形成分析。結果，CFU-Mk集落擴增到“輸入值”(培養前的200μl細胞懸浮液中的集落數)的約4倍(見圖7)。由其他細胞因子組合得到的擴增效果跟輸入值基本相同。
實施例7重組人非肌肉型Cofilin在人巨核細胞的前血小板(Proplatelet)形成中的活性評價用實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清進行形態學研究來了解重組人非肌肉型Cofilin是否具有人巨核細胞的前血小板形成活性。
在具有1％BSA和GIBCO補充成分(胰島素，10μg/ml；轉鐵蛋白，5.5μg/ml；氨基乙醇，2mg/ml、亞硒酸，6.7mg/ml)的αMEM培養基中調節人臍帶血來源的CD34陽性細胞的濃度為2.5×104個細胞/ml，向12孔培養板的每個孔中加入1ml。然后將實施例2制備的含有重組人非肌肉型Cofilin的COS-1細胞培養上清進行10倍濃縮，從中取出100μl和人TPO(100ng/ml)單獨添加或者組合添加，然后在5％CO2、37℃的條件下，培養7天。在第7天時，再補充1ml與各個孔中的培養基相同組成的培養基，繼續培養。之后，在顯微鏡下觀察，確認有無形成巨核細胞的前血小板。
人非肌肉型Cofilin和TPO共存的條件使人臍帶血來源的CD34細胞向巨核細胞方向顯著分化并生長(圖8)，使得在培養2周左右后，在部分成熟的巨核細胞中形成了認為是反映血小板釋放前階段的可見的前血小板(圖9)。可是，單獨添加人非肌肉型Cofilin或者TPO組沒有檢測到前血小板的形成。
工產實用性本發明提供含Cofilin為有效成分的造血干細胞和/或者造血前體細胞增殖和/或者分化促進劑，由此提供促進廣泛種類的血液細胞的增殖和/或者分化的功效。利用這個功效，該促進劑可以用作治療各型血細胞減少癥和/或者造血功能低下相關疾病的藥物。進一步，該促進劑劑還可以在再生治療領域有效再生血液細胞。
序列表<110>SUNTORY LIMITEDSUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LIMITED<120>造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑<130>YCT-785<150>JP 2001-400330<151>December 28，2001<160>4<200>1<211>166<212>PRT<213>人<223>人Cofilin的氨基酸序列<400>1Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn5 10 15Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg20 25 30Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ile Ile35 40 45Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val
50 55 60Asp Asp Pro Tyr Ala Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys65 70 75 80Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys85 90 95Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Ser Ala Pro Leu Lys100 105 110Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu115 120 125Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys130 135 140Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser145 150 155 160Leu Glu Gly Lys Pro Leu165<200>2<211>501<212>DNA<213>人<223>人Cofilin的核苷酸序列<400>2atggcctccg gtgtggctgt ctctgatggt gtcatcaagg tgttcaacga catgaaggtg 60cgtaagtctt caacgccaga ggaggtgaag aagcgcaaga aggcggtgct cttctgcctg 120agtgaggaca agaagaacat catcctggag gagggcaagg agatcctggt gggcgatgtg 180ggccagactg tcgacgatcc ctacgccacc tttgtcaaga tgctgccaga taaggactgc 240cgctatgccc tctatgatgc aacctatgag accaaggaga gcaagaagga ggatctggtg 300tttatcttct gggcccccga gtctgcgccc cttaagagca aaatgattta tgccagctcc 360
aaggacgcca tcaagaagaa gctgacaggg atcaagcatg aattgcaagc aaactgctac 420gaggaggtca aggaccgctg caccctggca gagaagctgg ggggcagtgc ggtcatctcc 480ctggagggca agcctttgtg a 501<200>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>擴增人Cofilin基因的引物序列<400>3atggcctccg gtgtggctgt ctctga 25<200>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>擴增人Cofilin基因的引物序列<400>4tctccctgga gggcaagcct ttgtga 2權利要求
1.含Cofilin為有效成分的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑。
2.根據權利要求1的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO1所示的Cofilin的氨基酸中含有一或者多個氨基酸缺失、置換和/或添加的氨基酸序列，該Cofilin具有促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性。
3.根據權利要求1的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸與序列或具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的編碼堿基序列的互補堿基序列在嚴緊條件下可以與之雜交的堿基序列所編碼的氨基酸序列，該Cofilin具有促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性。
4.根據權利要求1的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或者同Cofilin氨基酸序列(SEQ ID NO1)具有至少30％氨基酸序列同源性的氨基酸序列，該Cofilin具有促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性。
5.根據權利要求1的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin由SEQ ID NO2所示的堿基序列或者在嚴緊條件下，可和SEQ ID NO2所示Cofilin的堿基序列的互補堿基序列進行雜交的堿基序列所編碼，該Cofilin具有促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性。
6.根據權利要求1的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin由SEQ ID NO2所示的堿基序列或者包含和SEQ ID NO2所示的堿基序列有至少30％堿基序列同源性的堿基序列所編碼，該Cofilin具有促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的活性。
7.根據權利要求1到6中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin是基因重組技術產品。
8.根據權利要求1到7中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中Cofilin含有糖鏈。
9.根據權利要求1到8中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其進一步含有另一種細胞因子。
10.根據權利要求9的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中的另一種細胞因子是至少以下成員之一白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10和IL-11、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細胞生成素(EPO)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子(TGF-α)、蛋白酶連接蛋白I、蛋白酶連接蛋白II、血小板來源的生長因子(PDGF)、膽堿能分化因子(CDF)、白細胞移行抑制因子(LIF)、干細胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配體(FL)、血小板生成素(TPO)、IL-6/可溶性IL-6受體復合物或者超IL-6(來自IL-6和可溶性IL-6受體的融合蛋白質)。
11.根據權利要求9的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中所述另一種細胞因子是IL-3。
12.根據權利要求9的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其中所述另一種細胞因子是干細胞因子(SCF)、flk-2/flt-3配體(FL)或其組合。
13.根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其用于治療造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化不足所導致的疾病。
14.根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其用于治療各型血細胞減少癥和/或造血功能低下相關疾病。
15.根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑，其可用于再生醫療。
16.促進造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化的方法，其包括施用至少一種根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑。
17.治療造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化不足所導致的疾病的方法，其包括施用至少一種根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化促進劑。
18.根據權利要求17的方法，其中由造血干細胞和/或造血前體細胞的增殖和/或分化不足導致的疾病是各型血細胞減少癥和/或造血功能低下相關疾病。
19.通過使用至少一種根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑離體擴增造血干細胞的方法。
20.涉及使用至少一種根據權利要求1到12中任何一項的造血干細胞和/或造血前體細胞增殖和/或分化促進劑離體擴增造血干細胞的再生醫療的方法。
全文摘要
本發明提供造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化促進劑，此促進劑可作為藥物用于治療因造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化不足引發的疾病，尤其用于各型造血細胞減少癥和/或造血功能低下相關疾病的治療。本發明提供了含Cofilin為活性成分的造血干細胞和/或者造血前體細胞的增殖和/或者分化促進劑。
文檔編號A61K38/16GK1499980SQ02807279
公開日2004年5月26日 申請日期2002年12月27日 優先權日2001年12月28日
發明者三浦健壽, 忠, 春山宗忠, 保, 児玉志保 申請人:第一三得利制藥株式會社, 株式會社第一三得利生物醫學研究所