抗應激反應劑的制作方法

專利名稱：抗應激反應劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗應激反應劑。具體地講，本發明涉及可以用作藥物、特殊保健用食品、保健食品等的抗應激反應劑，其有效用于預防和減輕由于緊張狀態導致的精神和身體癥狀。
背景技術：
現代社會處于科技日益進步密集且社會急劇變化的環境中。人們接觸多種類型的物理、化學、生理和社會應力。特別是在國際化的社會中，已形成復雜的人際關系，出現了由精神緊張狀態引起的多種癥狀。
已知精神緊張狀態對循環系統、免疫系統等造成很大影響。應激反應的科學概念和定義尚存在不明之處，并且在對應激反應的評價中存在很多問題。近幾年來，實行體格檢查。
例如，有報告稱接受應力時，血管緊張素II等升高，由于鈉離子的再吸收活體中的鈉離子含量過剩，引起血壓升高(Osamu Mohara；Metabolism 28(2)；323，1911)。此外，基于這些發現，對用作高血壓治療劑的血管緊張素轉化酶抑制劑依那普利和阿拉普利(alacepril)對應激反應引起的高血壓進行了研究(The American Journal ofCardiology；68(15)1362(1991)，International Medicine；32(9)691(1993))。
此外，有報告稱當大腦覺察到生理應力時，大腦部位的大部分區域釋放去甲腎上腺素，引起焦慮和緊張等精神癥狀(Masatoshi Tanaka，Metabolism Vol.26122-131，1989)。作為其機理，有報告稱下丘腦釋放促腎上腺皮質素釋放因子(CRF)，且機體對此做出反應，腦垂體增加分泌促腎上腺皮質素(ACTH)，于是由于ACTH的作用由腎上腺皮質釋放腎上腺皮質激素，以便啟動生物防御機制(Brabdenberger，G等，(1980)Biol.Physiol.Vol.10239-252)。
另一方面，下丘腦是自主神經系統的中樞，并刺激交感神經分泌去甲腎上腺素。人們假設交感神經存在于腎上腺髓質中，而對其進行的刺激導致腎上腺素分泌到血液中，并通過這些兒茶酚胺的作用，發生了物理變化如心跳加快、血壓升高及面部潮紅(Dimsdale，JE.，Moss，J.(1980)J.Am.Med.Assoc.Vol.243340-342)。
當應激反應強或者持續時間長時，該應激反應對整個身體的多種器官產生影響，結果可能發生嚴重的精神生理紊亂如消化性潰瘍、局部缺血性心臟病、腦血管病、高血壓和高血脂癥。
作為減輕和預防應激反應引起的精神和身體癥狀的制劑，使用化學合成藥物如鎮靜劑、抗焦慮劑和安眠藥。但是，這些藥物具有成癮問題和副作用，因此，為了預防應激反應引起的精神和身體癥狀每天使用它們是不可取的。作為對輕度精神疲勞的對癥治療，放松和香氣療法是已知的。但是，其作用存在很大的個體差異，因此，需要長期和持續的治療。
因此，需要開放新的抗應激反應劑，其可以重復使用，沒有安全性問題，并顯示出減輕和預防應激反應引起的精神和身體癥狀的作用。
從迄今進行的研究來看，有報告稱縮合度為3至20的環和/或直鏈聚L-乳酸的混合物用作抗腫瘤劑(日本專利申請公開號9-227388和10-130153。但是，沒有有關縮合度3至20的環和/或直鏈聚L-乳酸抗應激反應作用評價的報告。

發明內容
本發明的目的是提供可以用于抑制應激反應的新的抗應激反應劑。更具體地講，保密法的目的是提供可以重復使用、安全性高并能減輕和預防應激反應引起的精神和身體癥狀的抗應激反應劑。進一步講，本發明的另一個目的是提供抑制應激反應的食物和飲料。
為了研究解決上述目標的目的，本發明人給大鼠使用縮合度為3至20的環和/或直鏈聚L-乳酸的混合物，并研究由水浸束縛應力引起的胃粘膜損傷的發生率。結果發現，通過使用聚乳酸的混合物可以顯著抑制胃粘膜損傷的發生。
本發明人還研究了聚乳酸的混合物對接觸寒冷應力的糖尿病小鼠模型存活率的作用。結果發現，使用聚乳酸混合物的糖尿病小鼠模型的存活率較高。
此外，本發明人檢測了出于應激狀態的小鼠中的淋巴細胞數目、腫瘤的形成及厭氧酶活性。結果發現，通過使用聚乳酸混合物，由于應激反應造成的淋巴細胞數目降低和厭氧酶活性升高得到了抑制，并達到了抗腫瘤作用。
在這些發現的基礎上完成了本發明。
因此，按照本發明，其提供了一種抗應激反應劑，其含有縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。
本發明的抗應激反應劑可以用于，例如，預防和改善應激反應引起的醫學癥狀，更具體地講可以用于預防和改善應激反應引起的免疫功能的退化，預防和改善應激反應引起的潰瘍或腫瘤，并改善患者抗應激反應的存活率。
優選，作為聚乳酸的重復單元的乳酸基本上由L-乳酸組成。
優選，縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物是如下反應獲得的片斷在惰性氣體中通過脫水縮合乳酸，將所得反應溶液中溶解于乙醇和甲醇的片斷進行反相柱色譜，并用pH2至3的25至50％重量的乙腈水溶液洗脫，然后用pH2至3的90％重量或90％以上的乙腈水溶液洗脫。
優選，脫水縮合反應在氮氣氛下逐步減壓和升溫下進行。
優選，反相柱色譜通過ODS柱色譜進行。
按照本發明的另一方面，其提供了抑制應激反應的食品和飲料，其中含有上述本發明的抗應激反應劑。
按照本發明的另一方面，其提供了縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物在制備抗應激反應劑或者抗應激反應食品及飲料中的用途。
按照本發明的另一方面，其提供了抑制應激反應的方法，其中包括給哺乳動物如人使用有效量的縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。
附圖簡述附

圖1顯示了制備實施例1制備的聚乳酸的混合物的質譜。
附圖2顯示了CPL對由水浸束縛應力引起的大鼠胃粘膜損傷進程的影響。
附圖3顯示了CPL對接觸寒冷應力的糖尿病小鼠模型的存活率的作用。
附圖4顯示了糖尿病小鼠模型的禁食血糖水平的檢測結果。
實施本發明的最佳方式實施本發明的實施方案和方法詳述如下。
本發明的抗應激反應劑含有縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物作為活性成分，并可以用于減輕和預防應激反應引起的精神和身體癥狀。
應激反應的誘因(應激反應原)，其是使用本發明的抗應激反應劑的向靶，沒有特定限制。例如，應激反應原包括物理環境因素(溫度、噪聲、地震等)、社會和文化因素(戰爭、經濟危機、政變等)、個人環境條件(家庭、學校、辦公室等)的變化(運動、轉學、工作變動、退休等)，以及生物因素如人際關系中的不協調和沖突，以及過度疲勞、外傷、身體病變等。可以理解在目前觀察到的很多病生理疾病中，這些應激反應原是疾病發作的直接原因或者在其發作中起重要作用。
應激反應被認為是精神和身體扭曲，其發生于上述應激反應的誘因(例如，身體征兆如疾病，例如，疼痛和發燒，以及紊亂；精神征兆，例如，社會和家庭中人際關系引起的緊張、焦慮和恐懼；以及物理環境因素如噪聲、氣象變化)施加給生命體時。
生命體對引起任何干擾的刺激顯示出特定的反應。同時，不論刺激的類型如何，交感神經-腎上腺髓質系統和腦垂體-腎上腺皮質系統的活性升高，并分泌腎上腺素，于是升高了血壓并加快脈搏和呼吸頻率。另一方面，腎上腺皮質分泌的稱為皮質醇的激素升高，生命體顯示出保護或適應反應。該反應稱為應激反應，已知該反應通過如下機制發生。當生命體接觸物理或精神應激反應原時，其信息到達中樞神經系統并延伸至下丘腦。由其中給出對應激反應的指示。其傳遞主要通過兩個途經進行。其中之一是通過交感神經系統，而大部分交感神經系統本身到達生命體中的多種器官，由外周神經釋放去甲腎上腺素以表現出作用。其中一小部分到達腎上腺髓質，刺激髓質分泌腎上腺素。通過另一個應激信息傳遞途經，下丘腦分泌刺激腦垂體分泌ACTH激素的激素(CRH)，導致腦垂體分泌ACTH。通過血液ACTH轉運至腎上腺皮質中，刺激腎上腺皮質促進皮質醇激素的分泌。
應激反應在生命體的保護反應中起重要作用。假定在該反應中分泌了太多的皮質醇和腎上腺素，并因此對很多器官產生有害作用，導致生命體的體內平衡無法維持，引起應激疾病。即，過量的皮質醇破壞胃和十二指腸粘膜，引起胃十二指腸潰瘍并抑制免疫功能。因此，對感染的抵抗力越來越低，而且容易發生癌癥。過量的腎上腺素使高血壓和循環系統疾病易于發生。
較不使用該制劑的情況而言，當給對象使用本發明的抗應激反應劑時，生理指數如免疫功能的退化的變化(其是針對施加應力的反應)小。因此，可以理解本發明的抗應激反應劑具有降低對象患者的應激反應的作用，并可以預防患者每天接觸的各種應激引起的醫學癥狀的發作，并可以減輕和緩解這些癥狀。
應激狀態引起的醫學癥狀包括免疫功能降低、潰瘍或腫瘤的發生、患者的存活率的降低。
應激狀態引起的特定醫學癥狀，例如，循環系統疾病如動脈硬化、局部缺血性心臟病(心絞痛、心肌梗塞)、特發性高血壓、心臟神經機能病和心律異常；呼吸系統疾病如支氣管哮喘、換氣過度綜合征和神經性咳嗽；消化系統疾病如消化性潰瘍、潰瘍性結腸炎、應激性腸綜合征、神經性食欲缺乏、神經性嘔吐、胃部膨脹和吞氣癥；內分泌代謝系統疾病如肥胖癥、糖尿病、強迫性飲水癥和巴塞多氏病；神經系統疾病如偏頭痛、肌肉萎縮性頭痛和自主性張力障礙；泌尿系統疾病如尿床癥、陽痿和神經原性膀胱障礙；骨肌肉系統疾病如慢性關節風濕病、系統性肌痛和脊柱痛；皮膚系統疾病如神經性皮炎、斑禿、多汗和濕疹；耳鼻喉科疾病如迷路綜合征、咽喉外來物感覺、聽力紊亂、耳鳴、暈車、及失音和結巴；眼科疾病如原發性青光眼、眼疲勞、瞼痙攣和眼癔癥；婦產科疾病如痛經、閉經、月經病、功能障礙性子宮流血、更年期紊亂、交媾困難和不育癥；兒科病如自立循環紊亂、復發性臍絞痛、神經性發燒和夜驚；術前和術后癥狀如腸粘連、胃顛倒癥、外科手術癖(polysurgery)及整形手術后神經壞死；口腔科疾病如猝發性舌痛、特定的口腔炎、口臭、流涎異常、咬肌肌肉牙咬合(masseter muscle check bite)和假牙神經壞死；神經壞死；抑郁；及腫瘤發生。
本發明的抗應激反應劑具有預防作用，即在接觸應力前攝入該制劑使人很難處于緊張狀態，即使該人處于緊張狀態，也容易預防醫學癥狀的發生。因此，優選以保健品或藥品的形式每天使用本發明的抗應激反應劑。
在本發明的抗應激反應劑和抑制應激反應的食品和飲料中，縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物用作活性組分。
用于本發明的術語“聚乳酸的混合物”指以任何比例存在的縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。就是說，術語“混合物”不僅指縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物，還用來指包括環狀和直鏈聚乳酸的混合物的概念。如本說明書下文中所述，通過脫水，然后按照適當的方法進行純化，通過縮合乳酸可以獲得“聚乳酸的混合物”。雖然為了方便起見，在本發明中使用術語“聚乳酸的混合物”，但是該術語還包括由單一組分，例如，具有單一縮合度的環聚乳酸或者具有單一縮合度的直鏈聚乳酸，組成的聚乳酸。
術語“縮合度”用來指聚乳酸中重復單元乳酸的數目。例如，假設環聚乳酸具有如下結構式，其中n表示縮合度(n＝3至20)。
當本說明書中簡要地述及“乳酸”時，該乳酸包括L-乳酸、D-乳酸或者含有任何比例的這些類型的乳酸的混合物。在本發明中，優選乳酸基本上由L-乳酸組成。本文中使用的術語“基本上”指在聚乳酸混合物中L-乳酸單元的比例(L-乳酸單元數目/L-乳酸單元數目+D-乳酸單元數目×100)是，例如，不小于70％，優選不小于80％，更優選不小于85％，進一步更優選不小于90％，并特別優選不小于95％。聚乳酸的混合物中L-乳酸單元的比例依賴于用作起始物的乳酸中存在的L-乳酸與D-乳酸的比例。
制備縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物的方法沒有特別限制，例如，通過描述于日本專利申請公開號9-227388和10-130153或者日本專利申請號11-39894(本文中引用的所有出版物以其整體引入本文作為參考)中的制備方法，可以制備聚乳酸的混合物。
更具體地講，例如，縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物可以通過下面的方法A獲得。
方法A首先，在惰性氣體中乳酸(優選乳酸基本上由L-乳酸組成)通過脫水縮合。惰性氣體的實例包括氮氣和氬氣，并優選氮氣。
脫水和縮合反應在110℃至210℃，優選130℃至190℃溫度下在常壓至約1mmHg的減壓下進行，并特別優選該反應在逐步減壓下和逐步升溫下進行。可以適當地確定反應時間。例如，該反應可以進行1至20小時。當進行逐步減壓和逐步升溫時，該反應通過將反應時間分為兩個或多個部分反應階段進行，并再決定每個反應階段的壓力和溫度。當進行逐步減壓時，例如，壓力可以從常壓降低至150mmHg，然后降低至3mmHg。當進行逐步升溫時，例如，溫度可以由145℃升至155℃，然后至185℃。具體地講，該反應可以通過聯合使用以下這些反應調節進行，例如，145℃、常壓，3小時；145℃、150mmHg、3小時；155℃、3mmHg、3小時；及185℃、3mmHg、1.5小時。
接著，將乙醇和甲醇加入到脫水和縮合反應得到的反應混合物中，并將此混合物過濾。將所得濾液干燥為溶解于乙醇和甲醇的餾分。術語“溶解于乙醇和甲醇的餾分”在本說明書中指溶解于乙醇和甲醇的混合溶液中的餾分。為了得到溶解于乙醇和甲醇的餾分，將脫水和縮合反應獲得的反應混合物與乙醇和甲醇混合，其中乙醇和甲醇的比例可以適當地確定。例如，該比例是乙醇∶甲醇＝1∶9。向反應混合物中加入乙醇和甲醇的順序、方法等不受限制，并可以適當選擇。例如，可以向脫水和縮合反應所得反應混合物中先加入乙醇，然后再向其中加入甲醇。
將如此獲得的溶解于乙醇和甲醇的餾分進行反相柱色譜，特別是使用十八烷基硅烷(ODS)柱的色譜。首先，除去用pH2至3的25至50重量％乙腈水溶液洗脫的餾分，然后收集用pH2至3的的90重量％或90重量％以上乙腈水溶液，優選99重量％或99重量％以上乙腈水溶液洗脫的餾分，以便獲得縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。
如此獲得的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物用堿性物質如氫氧化鈉中和，然后減壓下干燥，然后再按照標準技術，可以將該混合物配制為如下的形式。
用于本發明的縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物的制備方法的其它實例，包括日本專利申請號11-26571 5描述的方法(下文中稱為方法B)，或者描述于日本專利申請號11-265732中的方法(下文中稱為方法C)(本文中引用的所有出版物以其整體引入作為參考)。方法B和C具體描述如下。
方法B方法B是制備環乳酸低聚物的方法，其包括在RYLi表示的鋰化合物[其中R表示脂烴基或芳基，Y表示氧原子或硫原子]存在下聚合乳酸。在進行聚合反應的情況下，鋰化合物(RYLi)的量的比例為1-0.1摩爾，優選0.2-0.3摩爾每摩爾乳酸。反應溫度為-100℃至0℃，優選-78至-50℃。反應優選起始于溫度-78℃至-50℃，再逐步升溫至室溫。該反應優選在反應溶劑的存在下進行。作為反應溶劑，例如，可以使用環醚如四氫呋喃、乙醚和二甲氧基乙烷。反應氣氛可以是惰性氣體如氮氣和氬氣。該反應壓力沒有限制，并優選常壓。
如上所得乳酸低聚物的組分(即環乳酸低聚物和鏈乳酸低聚物的混合比例)隨反應助劑鋰化合物而變動。當含1至3個碳原子的烷基醇的鋰化合物(ROLi)(其中R表示含1至3個碳原子的烷基)用作鋰化合物時，獲得環乳酸低聚物和鏈低聚物的混合物(環乳酸低聚物的比例80至85重量％)。當含4個和4個以上碳原子的烷基醇如叔丁醇的鋰化合物，和噻吩化合物的鋰化合物用作鋰化合物時，基本上只選擇性地得到環乳酸低聚物。
方法C該方法包括(i)第一加熱步驟，包括在350至400mmHg壓力條件下和溫度120至140℃下加入乳酸，以進行脫水和縮合，蒸餾掉并除去唯一的副產物水，但不要蒸餾出乳酸；(ii)通過脫水縮合合成產物的第二加熱步驟，該產物中含有鏈乳酸低聚物作為主要組分，該步驟包括第一加熱步驟完成后，將反應產物加熱至150至160℃，同時將反應壓力降低至15至20mmHg，減壓速度為0.5至1mmHg/分鐘，其中蒸餾掉并除去唯一的副產物水，同時避免蒸餾乳酸；此后，將反應壓力降低至15至20mmHg，在同樣的壓力條件和反應溫度150至160℃下維持該反應；(iii)合成環低聚物的第三加熱步驟，包括第二加熱步驟完成后，在0.1至3mmHg壓力條件和150至160℃下加熱，環合鏈乳酸低聚物。
在此方法中，首先，在第一加熱步驟中，乳酸在減壓下加熱進行脫水和縮合反應。在此情況下，反應時間為3至12小時，優選5至6小時。為了讓此反應在第一加熱步驟中順利進行，蒸餾掉乳酸脫水縮合產生的副產物水。此時，進行副產物水的蒸餾，而不蒸餾掉乳酸的兩個分子脫水縮合的產物二乳酸交酯。為了達到此目的，反應壓力保持在減壓下，優選300至500mmHg，更優選350至400mmHg。在此壓力條件下，加熱在100至140℃，優選130至140℃溫度范圍下進行。第一加熱步驟中的反應產物主要包括3至23個分子的乳酸脫水縮合產物作為主要組分。
在上述第一加熱步驟完成后，在第二加熱步驟中，為了得到平均聚合度升高的低聚物，加熱在比上述第一加熱步驟的反應溫度高的溫度下進行，優選145至180℃，更優選150至160℃，同時壓力降低至10至50mmHg，優選15至20mmHg，以便脫水和縮合反應繼續進行。
正如在上述第一加熱步驟中的反應，該反應進行的條件下副產物水被蒸餾掉，而二乳酸交酯沒有被蒸餾掉，保證該反應順利進行。反應壓力降低至上述范圍的速度(減壓速度)一般需要維持在0.25至5mmHg/分鐘，優選0.5至1mmHg/分鐘，以避免蒸餾掉二乳酸交酯，并提高反應效率。不優選減壓速度低于上述范圍，這是因為這樣增加了減壓至上述范圍所需要的時間。另一方面，也不優選減壓速度高于上述范圍，這是因為這樣會引起二乳酸交酯與副產物水一起蒸餾掉。
該反應后，將壓力降低至某個壓力水平，在該反應壓力下繼續反應。此情況下加熱時間為3至12小時，優選5至6小時。
通過上述第二加熱步驟中的反應，獲得平均聚合度為3至30，優選3至23的乳酸低聚物。在此情況下該低聚物中環低聚物的比例一般為約70至80重量％。
在第三加熱步驟中，上述第二加熱步驟完成后，反應壓力維持在0.25至5mmHg，優選0.5至1mmHg，并在145至180℃，優選150至160℃下繼續反應。反應時間為3至12小時，優選5至6小時。此情況下產生的副產物水也被蒸餾掉。在此情況下，優選避免蒸餾掉二乳酸交酯。但是，由于反應產物幾乎不含二乳酸交酯，不需要特別降低減壓速度。
通過上述第三加熱步驟中的反應，獲得平均聚合度為3至30，優選3至23的乳酸低聚物，且環低聚物的比例為90重量％或90重量％以上，優選99重量％或99重量％以上。
上述方法A、B和C只是制備用于本發明的聚乳酸混合物的方法的一些特定實例。通過其它方法制備的聚乳酸混合物也可以用于本發明。
例如，通過使用試驗動物并通過水浸束縛誘導法引起的胃粘膜損傷，可以證實本發明抗應激反應劑的作用。具體地講，將試驗動物(例如，大鼠)置于應激反應籠中，在22℃至23℃范圍內在一個容器中浸至劍突胸骨的高度，保持10小時，以施加應激刺激。在該應激刺激前使用藥物。然后，給試驗動物在乙醚麻醉下施行剖腹手術，切除胃，結扎胃的賁門，接著由十二指腸注射2％福爾馬林溶液到胃，以將其固定。也將胃粘膜浸在此溶液中進行固定。接著，切開較大的胃彎以檢測胃粘膜損傷的長度。胃粘膜損傷的長度比對照組的小，這證明了本發明抗應激反應劑的作用。
本發明的抗應激反應劑的作用還可以通過檢測接受空間限制約束應激刺激的試驗動物中淋巴細胞計數的變化來證實。具體地講，將試驗動物(例如，小鼠)飼養在丙烯酸聚合物箱中并接受含有抗應激反應劑的固體飲食。開始接受該固體飲食一周后，將小鼠置于薄圓筒中一段時間，讓其接受空間限制約束應激刺激4周(4次)。完成此約束后，立即在乙醚麻醉下由尾靜脈采血，并在光學顯微鏡下計數淋巴細胞數目。當通過抑制應激反應淋巴細胞計數降低時，可以證實本發明抗應激反應劑的作用。
如果需要，除了上述基本組分外，可以通過任選地選擇并使用不損害本發明作用的用于藥物制劑、準藥物等中的組分或添加劑，來制備本發明的抗應激反應劑。本發明的抗應激反應劑可以用作單一藥物，并還可以含于和用于藥物、準藥物等中。
本發明的抗應激反應劑的劑型不受特別限制，可以從劑型中選擇適于此目的的任何形式，進行口服或非腸道給藥。
適于口服給藥的劑型的實例包括片劑、膠囊、散劑、飲料、顆粒劑、丸劑、溶液劑、乳液、混懸劑、咀嚼片劑等。適于非腸道給藥的劑型的實例包括但不限于注射劑(如皮下、肌肉內或靜脈內注射劑等)、外用制劑、滴劑、吸入劑、噴霧劑、滴鼻劑、滴眼劑。
適于口服給藥的液體制劑如溶液劑、乳液或糖漿，可以用如下組分制備水；糖如蔗糖、山梨糖醇或者果糖；二醇如聚乙二醇或丙二醇；油如芝麻油、橄欖油或豆油；防腐劑如對羥基苯甲酸酯；以及較味劑如草莓香料和薄荷腦。為了制備固體制劑如膠囊、片劑、散劑或顆粒劑，可以使用賦形劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇；崩解劑如淀粉或藻酸鈉；潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石；粘合劑如聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠；表面活性劑如脂肪酸酯；以及增塑劑如甘油等。
適于非腸道給藥的注射劑或滴劑，優選含有溶解于或懸浮于滅菌的、與受者血液等滲的、含水介質中的上述物質作為活性組分。例如，對于注射劑，可以用由鹽水溶液、葡萄糖溶液或者鹽水溶液和葡萄糖溶液的混合物組成的含水介質制備溶液。對于腸道使用的制劑，其可以用載體如可可脂、氫化脂類或者氫化羧酸來制備，并可以為栓劑形式。為了制備噴霧劑，作為活性組分的上述物質可以分散為微粒，可以使用不刺激受者口腔和呼吸道粘膜的并有利于該活性組分吸收的載體。載體的特定實例包括乳糖、甘油等。氣霧劑或干粉等形式的制劑，可以根據活性組分和所用載體的性質來制備。可以向非腸道給藥的制劑中，加入一種或兩種或多種選自二醇、油、香料、抗菌劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、表面活性劑、注射劑等的輔劑。
本發明的抗應激反應劑的劑量和給藥頻率根據多種因素適當確定，如給藥目的，劑型，條件如患者的年齡、體重或性別。一般來說，每天活性物質的劑量是1至10000mg/kg，優選10至2000mg/kg，并更優選10至200mg/kg。優選該制劑的上述劑量分別使用，每天1至4次。
本發明的抗應激反應劑的給藥時間沒有特別的限制。預計會接觸應激刺激或者在應激刺激接觸時，使用該制劑，可以預防或減輕該應激反應。有規律地使用該制劑，也可以預防或減輕應激反應。
本發明還涉及抑制應激反應的食品和飲料，其中含有縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。因此，用于本發明的縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物不僅以上述單一制劑的形式使用，還可以與食品和飲料混合并使用。
本發明的抑制應激反應的食品和飲料的形式沒有特別限制，只要其中含有的聚乳酸的混合物不分解即可。
本發明的抑制應激反應的食品和飲料產品的特定實例包括保健品或補品，包括飲料，如一般稱為軟飲料、飲品、保健品、特殊補品、功能性食品、功能活性食品、營養強化食品、營養強化劑、食物、食物添加劑等。
食品和飲料的特定實例包括糖果，如口香糖、巧克力、糖果、甜味片、果凍、糕點、餅干和酸奶；冷凍餐后甜點，如冰淇淋和冰凍果子露；飲料，如茶、軟飲料(包括果汁、咖啡、可可茶等)，營養強化飲品和美容飲品；以及所有其它食品和飲料，如面包、火腿、湯、果醬、意大利面條及冷凍食品。或者，用于本發明的聚乳酸的混合物還可以加入到調味品、食品添加劑等中使用。通過使用本發明的食品和飲料，可以提供安全的食品和飲料，其可以發揮抑制應激反應作用并基本上沒有毒副作用。
通過將聚乳酸的混合物直接混合和分散于用于食品的常規原料中，再通過已知方法將該混合物加工為所需的形式，可以制備本發明的抑制應激反應的食品和飲料。
本發明的抑制應激反應的食品和飲料包括了各種形式的食品和飲料，而其形式沒有特別的限制。就是說，通過將本發明的抗應激反應劑混合于上述多種食品和飲料、或者多種營養組合物(如多種口服和腸內營養制品或飲料)中，可以提供該食品和飲料。除了縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物外，此類食品和飲料的組分可以包括蛋白質、脂類、碳水化合物、維生素和/或礦物質。食品和飲料的形式沒有特別限制，并可以是任何形式，如固體、粉末、液體、凝膠和漿液形式，只要該形式易于攝入即可。
在該食品和飲料中聚乳酸的混合物的含量沒有特別限制，一般為0.1至20重量％，更優選約0.1至10重量％。
聚乳酸的混合物優選以達到本發明目的的起抑制應激反應作用的量含于食品和飲料中。每份將被攝入的食品或飲料優選含約0.1g至10g，更優選約0.5g至3g的聚乳酸的混合物。
作為本申請優先權基礎的日本專利申請號2001-16145的說明書的內容，作為本說明書公開內容的一部分，引入本文中作為參考。
在下列實施例中進一步描述本發明，但是本發明的范圍絕不限于這些實施例。
實施例制備實施例1聚乳酸的混合物(下文中稱為CPL)的制備將500mL的L-乳酸(其中也混合有D-乳酸)置于位于加熱套中的獨立的燒瓶中。攪拌的同時，通入300ml/分鐘的氮氣。通過加溫下降型連接管，將蓄積的水引入裝備有回流冷凝器的燒瓶中，同時在145℃下加熱3小時。接著，壓力降低至150mmHg且在相同溫度下加熱3小時后，將此混合物在3mmHg壓力下在155℃下加熱3小時，然后在3mmHg壓力下在185℃下加熱1.5小時，得到聚乳酸作為反應產物。
將所得聚乳酸保持在100℃，并分別向其中加入100ml的乙醇和400ml的甲醇，然后讓此混合物冷卻。將此混合物加入到500ml的甲醇中，并將此混合物充分攪拌，并放置。然后，將此混合物過濾純化。濾液進行真空干燥，然后溶解于乙腈中，共得到200ml(貯存溶液)。
將該貯存溶液加樣到事先平衡的反相ODS柱(TSK gel ODS-80 TM)上，并用各含0.01M鹽酸的30％、50％和100％乙腈(pH2.0)分級洗脫，得到聚乳酸(縮合度為3至20)，其形式為乙腈100％洗脫餾分。所得物質的質譜見圖1。在圖1中由規則碎片離子峰清楚可見，所得聚乳酸的混合物主要含有環狀縮合物，其中仍含有少量的鏈狀縮合物。
試驗實施例大鼠模型中CPL對由水浸束縛應激刺激引起的胃粘膜損傷的作用(材料和方法)試驗中使用6周齡的雄性Donryu系大鼠(日本SLC，試驗時體重180至200g)。
將CPL溶解于加溫至40℃的甘油中，然后加入丙二醇將體積調整至100mg/ml。此后，用蒸餾水稀釋此溶液得到50mg/kg的劑量。該藥以1ml/200g體重的比例每天口服給藥一次，給藥10天。在對照組中，只口服相同劑量的溶劑。
水浸束縛應激刺激誘發的胃粘膜損傷制備如下。開始試驗前，大鼠禁食18小時，開始試驗前2小時讓大鼠自由地飲水，接著停止水的攝入。將大鼠置于Toudai Yakusa型應激刺激籠(Natsume SeisakusyoCO.，LTD)中，并在22℃至23℃范圍內在一個容器中浸至劍突胸骨的高度，保持10小時，以施加應激刺激。在施加應激刺激前30分鐘再次使用該藥物。
通過如下步驟檢測胃粘膜損傷的區域。給試驗動物在乙醚麻醉下施行剖腹手術，切除胃。結扎胃的賁門，接著由十二指腸注射2％福爾馬林溶液到胃，以將其固定10分鐘。也將胃粘膜浸在此溶液中固定10分鐘。接著，切開較大的胃彎以用雙面顯微鏡檢測胃粘膜損傷的長度(mm)。
結果以平均值±標準誤差(平均值±S.E)(N＝10至11)。通過使用學生t檢驗計算差異的統計學顯著性，P＜0.05被認為具有顯著性。
(結果)檢測的結果見下表1和圖2。
表1、胃粘膜損傷(mm)對照組 CPL(50mg/kg)120.08.0222.019.0320.06.0419.016.0515.018.0616.015.0712.010.0812.016.0915.010.010 28.015.011 11.0平均值 17.913.1標準偏差 1.6 1.3如表1和圖2所示，應激刺激誘發的損傷的長度之和的平均值為17.9±1.6mm。相反，10天反復使用CPL期間，水浸束縛應激刺激引起的胃粘膜損傷的發生率受到顯著抑制，損傷長度之和的平均值為13.1±1.3mm。
試驗實施例2CPL對接受冷應激刺激的糖尿病小鼠模型存活率的作用(方法)特定的固體食物(1％CPL飼料)，其于標準固體食物CE2具有相同的營養含量并含有1％CPL，由CLEA JAPAN INC制備。
患有II型糖尿病的6周齡的雌性小鼠(C57-db/db)購自CLEAJAPAN INC。購買后，立即將小鼠分為兩組，CE2組用標準固體食物CE2喂養，而CPL組用特定食物(1％CPL食物)喂養。對于飲水，自由飲用自來水。由CLEA JAPAN INC.制備的供試驗動物用的熱干燥的地板材料，“Clean Chip”，置于地板上，并每天更換新的。
檢測血糖的前一天，18:00時不喂食，檢測的當天在08:30至09:30之間采集血樣。采血后，向0.01ml血液中加入0.12ml的5％TCA，攪拌此混合物并以10000rpm離心5分鐘。所得上清夜用作樣本。通過用鄰甲苯胺方法檢測葡萄糖來檢測血糖。
使用ESCO，Ltd.(Densi Kagaku K.K.)制造的系統量熱計作為比色計檢測釋放的熱量。在09:00將小鼠置于系統量熱計中，并在第二天17:00取出。在卡路里檢測中讓小鼠自由地攝取食物和水。
(結果)CPL對接受冷應激刺激的糖尿病小鼠模型存活率的作用見圖3。在CE2組中，通過在開始飼養動物第91天進行的31小時的卡路里檢測，由于接觸寒冷6只小鼠中有4只死亡。剩下了2只小鼠分別死于開始飼養動物后第181天和第254天。在CPL組中，通過在開始飼養動物第82天進行的31小時的卡路里檢測，由于接觸寒冷6只小鼠中有1只死亡。在開始飼養動物后第242天有1只死亡，而其余4只動物存活。
圖4顯示了禁食血糖的檢測結果。在開始飼養后第310天，CPL組的4只存活動物的平均禁食血糖為210mg/dl。在開始飼養動物后第432天平均禁食血糖為170mg/dl。
表2顯示了CPL組的4只存活動物的禁食血糖。在開始飼養后第472天4只動物中有3只的禁食血糖比開始飼養后第78天的禁食血糖低很多。具體地講，db/db(4)和(6)的禁食血糖顯示出正常值。喂食后沒有檢測出這2只動物有血糖尿。
表2、CPL對禁食血糖的長期作用動物 飼養時間(天)78 148432 472db/db(1) 371277209 162db/db(4) 434340176 99db/db(5) 362389221 354db/db(6) 20216884 91表3顯示了CPL對散熱的作用。在開始飼養后第140天CPL組的平均散熱量為32.0kJ/天，其是db/-組的77％。開始飼養后第480天平均散熱量為41.5kJ/天，等于開始飼養后第140天db/-組的數值。
表3、CPL對散熱量的作用(放熱)第140天 第480天db/-，CE2(n＝4)41.3±4.0db/db， CE2(n＝6)22.5±7.7db/db， CPL(n＝6)32.0±4.841.5±10.2(n＝4)如上所述，開始食用不含CPL的標準食物的db/db小鼠的存活期短，在出生后約10約內所有6只動物都死亡。在用含1％CPL的食物喂養的組別中，6只中有4只存活。存活的4只小鼠中有2只的禁食血糖在正常范圍內，且沒有檢測出尿糖。即，II型糖尿病被治愈。4只小鼠中有1只的高血糖得以改善至幾乎正常的數值，且只檢測到非常低數值的尿糖。
試驗實施例3、CPL對接受空間限制約束應激刺激的小鼠的淋巴細胞計數變化的作用(方法)在聚丙烯酸籠中飼養四周齡雄性CBA/JNCr小鼠。
將小鼠分為自由接受標準固體食物CE2(得自CLEA JAPAN INC.)的對照組以及自由接受在上述標準固體食物中含0.1％(重量)聚乳酸混合物的標準固體食物CE2(由CLEA JAPAN INC.制備)。開始喂食CPL后，將小鼠每周置于薄壁圓筒(直徑2.7cm，長度9.5cm)19小時(17:00至次日早9:00)，空間限制約束應激刺激進行4周(4次)。約束完成后，立即在乙醚麻醉下由尾部靜脈采集0.005ml血樣，并在光學顯微鏡下計數淋巴細胞數目。
(結果)淋巴細胞計數的結果見表4。如表4所述，到空間限制約束應激刺激開始后第3周，對照組的淋巴細胞計數線性降低至該試驗開始前數值的30％。在第4周，數值沒有顯示出變化。在CPL組中，第一次空間限制約束應激刺激試驗后類似于對照組，觀察到淋巴細胞的降低。此后，重復空間限制約束應激刺激試驗，但是淋巴細胞維持在幾乎可比較的計數。
表4、CPL組與對照組由空間限制約束應激刺激引起的淋巴細胞計數變化的比較淋巴細胞計數(×104/mm3)試驗時間開始1周 2周 3周 4周對照組 33.6±10.7a)26.5±4.317.7±7.1b)10.8±2.0c)12.1±4.9d)CPL組 29.3±8.5 22.0±4.423.9±6.6 25.5±5.824.6±4.7a)平均值±標準偏差通過t檢驗與對照組試驗開始時比較的顯著性差異b)p＜0.05c)p＜0.001d)p＜0.01試驗實施例4應激刺激下CPL的瘤形成抑制作用用于試驗實施例3的小鼠為發生遺傳性小泡上皮增生種系的小鼠。按照迄今的研究，腫瘤組織依賴厭氧糖原酵解獲取能量。認識到CPL是具有通過抑制此糖原酵解而抑制上述瘤形成作用的物質(第56屆日本癌癥協會年會論文集，第605頁；日本癌癥治療協會雜質32(5)165；第57屆日本癌癥協會年會論文集，第646頁；日本癌癥治療協會雜質33(3)222)。因此，將小鼠保持在與試驗實施例3相同的條件下，并研究在此應激刺激下抑制瘤形成的作用。
作為試驗組，讓對照組(應激刺激組)自由獲取標準固體食物CE2(得自CLEA JAPAN INC.)，而應激刺激CPL組自由獲取在上述標準固體食物中含0.1％(重量)CPL的標準固體食物CE2(由CLEA JAPAN INC.制備)。給上述組施加類似于試驗實施例1的空間限制約束應激刺激。此外，在沒有應激刺激條件下的接受CE2的組(CE2組)和在沒有應激刺激條件下接受含CPL的CE2的組(CPL組)作為對照組。
將上述4組維持到第30周，在第20周和第30周在乙醚麻醉下施行安樂死，切除肺。制備薄的組織切片，用光學顯微鏡觀察肺泡上皮增生的比例。結果見表5和6。表5顯示了CPL給藥開始后第20周時肺部腫瘤區域的比較。包括在每組6只動物(每只動物5至8個位點)的組織病理學薄切片中的腫瘤區域觀察的結果以百分率給出。表6顯示了CPL給藥開始后第30周時肺部腫瘤區域的比較。包括在每組6只動物(每只動物5至8個位點)的組織病理學薄切片中的腫瘤區域觀察的結果以百分率給出。
表5、CPL給藥開始后第20周時肺部腫瘤區域的比較肺組織病理學薄切片中肺泡上皮增生的區域(％)10％和更低 10-30％ 30-50％ 50-80％80％或更高CE2組 36.125.0 33.3 2.82.8CPL組 51.429.7 16.2 2.70.0應激刺激組 21.126.3 13.2 23.7 13.2應激刺激CPL組 44.430.6 16.7 8.30.0表6、CPL給藥開始后第30周時肺部腫瘤區域的比較肺組織病理學薄切片中肺泡上皮增生的區域(％)10％和更低 10-30％ 30-50％ 50-80％ 80％或更高CE2組 42.412.1 27.3 12.1 6.1CPL組 69.215.3 11.5 3.8 0.0應激刺激組 25.72.9 11.4 34.3 25.7應激刺激CPL組 41.217.6 14.7 11.8 11.8由表5結果，可以理解用CE2喂養的小鼠中，在應激條件下腫瘤區域擴大。但是，用CPL喂養的小鼠在應激刺激存在和不存在下腫瘤區域之間沒有差別。用CE2喂養的情況中，應激刺激導致顯示50％以上腫瘤區域的動物比例由5.4％增加至36.9％，但是在CPL喂養的情況中，該比例僅增加至8.3％。
由表6結果，可以理解用CE2喂養30周的小鼠中，顯示50％腫瘤區域的動物比例為18.2％，是第20周的3.25倍。當小鼠接受此食物并保持在應激刺激條件下時，該比例增加至60％，而當食用CPL時該比例為23.6％。
此外，將第30周處死的小鼠的肺勻漿化制備樣品，將該樣品離心獲得上清夜。用此上清夜來檢測厭氧糖原酵解的酶活性，即己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。結果見表7。
表7、第30周厭氧糖原酵解的酶活性HKPFK PK LDHCE2組(無應激) 75.5±7.7a)48.3±4.5224.0±28.5 1330±105應激刺激組 91.7±4.9b)64.0±4.4c)274.0±32.0d)1531±99b)應激刺激CPL組 69.4±8.7 51.6±7.6229.0±28.1 1364±172a)平均值±標準偏差通過t檢驗與CE2應激組比較的顯著性差異b)p＜0.01c)p＜0.001d)p＜0.05由此結果可以理解，空間限制束縛應激刺激顯著增加了決定肺部糖酵解的酶活性的速度。但是，食用CPL后與CE2組相比，這些酶的活性都沒有顯示出顯著差異。
試驗實施例3和試驗實施例4的結果表明通過使用CPL，由于應激刺激造成的淋巴細胞計數的降低和厭氧酶活性的增加受到了抑制，并獲得了抗腫瘤作用。
工業實用性本發明的抗應激反應劑可以用來減輕和預防多種應激反應。此外，作為活性組分的用于本發明聚乳酸的混合物是得自有機組分的乳酸低聚物，并因此顯示出高的生物相容性和極小的副作用。因此，本發明的抗應激反應劑安全性非常好，使用時沒有特殊的限制，為了預防和/或減輕應激反應，可以每天使用，例如，以飲料的形式。
權利要求
1.抗應激反應劑，其含有縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物。
2.權利要求1的抗應激反應劑，用于預防和改善應激引起的醫學癥狀。
3.權利要求1或2的抗應激反應劑，用于預防和改善應激引起的免疫功能衰退。
4.權利要求1或2的抗應激反應劑，用于預防和改善應激引起的潰瘍或腫瘤。
5.權利要求1或2的抗應激反應劑，用于改善患者對抗應激刺激的存活率。
6.權利要求1至5任一項所述的抗應激反應劑，其中作為所述聚乳酸中作為重復單元的乳酸基本上由L-乳酸組成。
7.權利要求1至6任一項所述的抗應激反應劑，其中縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物是通過下述方法獲得的餾分在惰性氣體中通過脫水縮合乳酸，將所得反應溶液的溶解于乙醇和甲醇的餾分加樣到反相柱色譜上，并用pH2至3的25至50重量％乙腈水溶液洗脫，然后用pH2至3的90重量％或90重量％以上的乙腈水溶液洗脫。
8.權利要求7的抗應激反應劑，其中通過脫水的縮合反應通過在氮氣氛下逐步減壓和升溫進行的。
9.權利要求7或8的制劑，其中反相柱色譜是通過ODS柱色譜進行的。
10.抑制應激反應的食品和飲料，其中含有權利要求1至9任一項所述的抗應激反應劑。
全文摘要
本發明的目的是提供可以用來抑制應激反應的新的抗應激反應劑。按照本發明，其提供了含有縮合度為3至20的環狀和/或直鏈聚乳酸的混合物的抗應激反應劑。
文檔編號A61K31/765GK1518453SQ0280716
公開日2004年8月4日 申請日期2002年1月22日 優先權日2001年1月24日
發明者村上正裕, 高田繁生, 長戶康和, 岡部進, 和, 生 申請人:天藤制藥株式會社