專利名稱：(r)－異丁苯丙酸甲基磺酰胺及其鹽在治療和預防移植器官排斥反應中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及(R)-異丁苯丙酸甲基磺酰胺及其無毒性鹽在制備治療和預防由移植器官排斥反應引起的功能性損傷的藥物中的應用。
背景技術：
過去數(shù)十年，由于引入了改進的免疫抑制方案、器官保存、術前和術后護理，器官移植特別是腎移植取得了顯著進步。然而，改進空間仍然相當大，特別在改善長期療效方面。器官回收、保存和移植后出現(xiàn)首次局部缺血/再灌注損傷關系到以后惡化和移植失敗。在腎移植中，移植腎沒有立即恢復功能稱為腎功能延遲恢復(delayed graft function，DGF)，通常需要在移植后第一個星期內(nèi)進行透析。腎功能延遲恢復是移植后初期最常見的移植腎并發(fā)癥，新鮮尸腎移植發(fā)生率高達50％(Ojo At等人，Delayed graft functionrisk factors andimplications for renal allograft survival.Transplantation 63，7968-974，1997；Koning OHJ等人，Risk factors for delayed graft function in cadaveric kidneytransplantation.Transplantion 63，111620-1628，1997)。雖然引起移植腎腎功能延遲恢復的病因不同，但已經(jīng)積累了一些實驗和臨床證據(jù)認為，移植腎的后局部缺血再灌注損傷可能表示負責發(fā)生腎功能延遲恢復的主要關鍵性作用?，F(xiàn)在還沒有就腎功能延遲恢復和早期排斥的結合是移植腎存活低的指標以及出現(xiàn)腎功能延遲恢復可導致急性排斥的風險增大達成一致共識(CarmelliniM等人，Delayed graft function adversely affects one year graft survival ofcadaveric rendal transplants.Transplant Pro 28，1359-360，1996)。目前已知局部缺血/再灌注損傷的發(fā)病機理涉及細胞因子，特別是表面粘附分子，其表達啟動炎性細胞的附著。由患有急性腎局部缺血的實驗動物所獲得的證據(jù)顯示，細胞間粘附分子1(ICAM-1)受損后立即上調(diào)，隨后會出現(xiàn)嗜中性粒細胞、T細胞和巨噬細胞浸潤。白介素-8(IL-8)是一種對多形核細胞(PMN)具有很強趨化效應的細胞因子，可通過再灌注激活內(nèi)皮細胞而產(chǎn)生，對因為局部缺血/再灌注而最后導致腎功能延遲恢復的復合作用有利。最近發(fā)現(xiàn)了一些化合物，它們可選擇性抑制IL-8的生物活性。其中包括國際專利申請WO 00/24710所述的R(-)-N-[2-(4-異丁基苯基)丙?；鵠-甲基磺酰胺，下文稱(R)-異丁苯丙酸甲基磺酰胺，及其(L)-賴氨酸鹽(下文稱DF 1681B)，它們用作IL-8誘導的嗜中性粒細胞趨化性的選擇性體外抑制劑，因而非常適合嗜中性粒細胞依賴性病理的治療。
DF 1681B已經(jīng)顯示不僅能抑制小鼠模型的體內(nèi)趨化性，而且能抑制小鼠和大鼠不同局部缺血/再灌注損傷模型的多形核細胞浸潤。
確實，根據(jù)本領域的現(xiàn)有狀況，選擇性抑制IL-8誘導的趨化性并不是防止移植器官出現(xiàn)功能性損傷的充分條件。事實上，科學文獻識別了多個因子，它們涉及移植腎延遲恢復功能的病因，在這些因子中，IL-8肯定不是最重要的因子例如，據(jù)報導，IL-8和IL-3及可溶性CD 23無法用在給定的器官排斥的診斷上(Kutukculer N.等人，Transplantation，1995，59(3)，333-40)，總之，這些高水平標記物也存在于完全沒有排斥現(xiàn)象的移植病人身上。而且，除了IL-3、IL-8和CD 23外，科學文獻還識別了其它多個可能的炎癥前分子，它們可能是移植器官延遲恢復功能的致病因子，例如，IL-1β、IL-2、IL-10、IL-17、MIP-1β、MCP-1等等。由這些文獻數(shù)據(jù)可以看出，炎癥反應，或者至少是白細胞募集的非特異性抑制劑似乎是抑制器官移植特別是腎移植出現(xiàn)再灌注損傷所必需的。
發(fā)明內(nèi)容
令人驚奇的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)(R)-異丁苯丙酸甲基磺酰胺，及其(L)-賴氨酸鹽(L-賴氨酸或DL-賴氨酸)與上述討論的現(xiàn)有技術所預期的正好相反，它們能有效防止器官移植特別是腎移植出現(xiàn)功能性損傷。而且，這些化合物對預防局部缺血/再灌注具有活性。
這樣一種活性在大鼠的腎移植實驗模型中得到了證實，下文會作詳細敘述。在此模型中，DF 1681B證明了在同源腎移植出現(xiàn)局部缺血/再灌注后立即保存腎功能和防止在后缺血再灌注后在移植腎中出現(xiàn)的白細胞浸潤這兩方面都具有活性。
研究采用成年雄性Lewis大鼠(RT11)(Charles River，Calco Italia S.p.A，意大利)。所有動物都可以自由進食和飲水。本研究在同源腎移植模型中進行，供者和移植受者都使用這樣一些大鼠。供者動物用leptofen痳醉。通過使輸尿管與附件分離準備左腎。將腎動脈與腎靜脈解剖分開。供者腎和輸尿管“全部”切除，用含1000U/ml肝素的Belzer(UW)沖洗。再將腎置于冰凍的Belzer(UW)溶液4至6小時(冷缺血)，移植時才取出。受者準備好摘除左腎。以下簡要介紹用DF 1681B對動物進行處理。移植腎在移植前用鹽水溶液清洗。在受者和供者腎動脈之間以及腎靜脈之間建立端-端吻合。30分鐘(熱缺血)后取出血管夾。使供者和受者的輸尿管端-端接合。然后摘除原有的右腎。將動物放在各個代謝籠中測量每日排尿量，作為腎恢復功能的指標。16和24小時后，測定血漿肌酸酐濃度評估腎功能。腎移植后24小時，處死動物。摘除移植腎，切成薄片，并置于Dubosq-Brazil溶液中，以便用光學顯微鏡作常規(guī)組織學分析。另外，將其它一些腎切片凍存于液氮中，用來作炎性細胞(多形核細胞、MHC II類陽性細胞)浸潤液的免疫組織化學分析。
研究考慮了下列各組實驗動物第1組(3只動物)受者大鼠的移植腎經(jīng)歷冷缺血4小時，并用IL-8抑制劑DF 1681B處理。
第2組(3只動物)受者大鼠的移植腎經(jīng)歷冷缺血4小時，并用載體(vehicle)處理。
第3組(3只動物)受者大鼠的移植腎經(jīng)歷冷缺血6小時，并用IL-8抑制劑DF 1681B處理。
第4組(3只動物)受者大鼠的移植腎經(jīng)歷冷缺血6小時，并用載體處理。
受者在實驗前一天進行預處理(皮下輸注15mg/kg)。在移植腎再灌注之前才給動物靜脈注射DF 1681B(15mg/kg)。移植后2小時再施加所述化合物(皮下輸注15mg/kg)。在相一時間點給對照組動物施加載體，用DF 1681B處理的動物也使用同一施加方法。
此外，DF 1681B證實了在同種異體移植腎出現(xiàn)局部缺血/再灌注后立即保存腎功能上具有活性。研究考慮了下列各組實驗動物第1組(9只動物)受者Brown Norway大鼠移植Lewis大鼠的腎，移植腎經(jīng)歷冷缺血6小時，并用載體處理。
第2組(5只動物)受者Brown Norway大鼠移植Lewis大鼠的腎，移植腎經(jīng)歷冷缺血6小時，并用IL-8抑制劑DF 1681B處理。
受者在實驗前一天進行預處理(皮下輸注20mg/kg)。在移植腎再灌注之前才給動物靜脈注射DF 1681B(20mg/kg)。移植后2小時再施加化合物(皮下輸注20mg/kg)。在相一時間點給對照組動物施加載體，用DF 1681B處理的動物也使用同一施加方法。
用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢定法多次比較或用Tukey-Cicchetti檢定法分析數(shù)據(jù)。
圖1所示為Lewis大鼠接受先經(jīng)歷冷缺血4和6小時的同源腎移植后16和24小時的血漿肌酸酐濃度。
具體實施例方式
結果圖1和表1所示為Lewis大鼠接受先經(jīng)歷冷缺血4和6小時的同源腎移植后16和24小時的血漿肌酸酐濃度。在接受4小時缺血腎的動物中，術后16和24小時血漿肌酸酐上升的數(shù)值遠遠高于接受無缺血同源腎移植的對照組動物所觀察到的數(shù)值。用DF 1681B處理可防止動物的腎功能衰竭，24小時的血漿肌酸酐數(shù)值與接受無缺血同源腎移植的動物的數(shù)值相當(表2)。一如所料，缺血6小時誘導的腎功能受損更嚴重，這反映在血漿肌酸酐水平比接受缺血4小時后的同源腎移植的動物高得多(圖1和表1)。DF 1681B使血漿肌酸酐濃度大幅下降至某些水平，然而，這些水平仍然遠遠高于接受無缺血同源腎移植的動物所測到的水平。
對移植后24小時的移植腎中白細胞浸潤進行詳細的免疫組織評估，其結果見表2。在冷缺血4小時的腎中，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)組織中有大量粒細胞，腎小球外區(qū)和周邊的粒細胞則少些。化合物使多形核細胞浸潤液減少，而且削弱了局部缺血/再灌注誘導的腎小管變化。腎小球外區(qū)的粒細胞計數(shù)由于IL-8抑制劑在數(shù)字上有所下降，但下降的幅度不大。與缺血4小時后相比，缺血6小時后細胞浸潤液并不是一直上升的。間質(zhì)炎性細胞由于DF 1681B而顯著下降(p＜0.01)。相對于嗜中性粒細胞，MHC II類細胞在缺血4和6小時后的移植腎中只有少量。檢測到的細胞主要在間質(zhì)中(表3)，它們的數(shù)量不受IL-8抑制劑影響。
在缺血4和6小時后的移植腎及移植后24小時所研究的移植腎切片中觀察到的腎小球、間質(zhì)和小管損傷的組織學計分見表4。通過光學顯微鏡發(fā)現(xiàn)，移植腎的特點是集中在近端小管的小管上皮細胞有降解變化，表現(xiàn)為細胞腫脹、空泡形成和壞死(表4)。DF 1681B使缺血4小時后的小管變化減弱但非正?；?。另外，所有腎都發(fā)現(xiàn)有小管管型(tubular casts)。只有經(jīng)歷6小時缺血的腎的腎小球中才檢測到病灶性缺血變化，它們可用DF 1681B來預防。
因此，DF 1681B能預防冷缺血后的腎功能受損?；衔餃p少了細胞浸潤液的數(shù)量，而且減弱了局部缺血誘導的小管變化。這些數(shù)據(jù)在其它動物也得到了證實。6小時缺血誘導的腎功能受損十分嚴重。
DF 1681B對Brown Norway大鼠在接受Lewis大鼠同源腎移植后16和24小時血清肌酸酐濃度的影響見表5。在所有接受20mg/kg治療的大鼠中都一致發(fā)現(xiàn)防止了血清肌酸酐水平顯著上升。
上述數(shù)據(jù)清楚顯示，醫(yī)學領域可優(yōu)選使用(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其賴氨酸鹽(L-賴氨酸或DL-賴氨酸)。
為此，將(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其賴氨酸鹽恰當?shù)嘏渲瞥伤幬锝M合物，該藥物組合物可術前或術后口服、經(jīng)腸胃外、直腸或局部途徑給予。合適的制劑的例子包括膠囊、片劑、栓劑、糖漿劑、滴劑、懸浮液、乳液、注射無菌液、注射用的無菌凍干粉末小瓶、控釋制劑、經(jīng)皮制劑、藥膏等等。采用常規(guī)技術和載體制備這些制劑，例如參見Remington’s PharmaceuticalSciences Handbook，Mack出版社，美國紐約，第XVII版。
藥物制劑最好以單位劑量形式給予，所述單位劑量含有1至500mg，更優(yōu)選含有10至100mg的(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其等量的賴氨酸鹽。也可考慮較高劑量，視情況而定。給予可以是一次性，或者在一適當時期內(nèi)分成多次給予，正常是從術前某一天直到術后數(shù)星期。(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其可接受的鹽，例如賴氨酸鹽，若需要可與其它輔助或者總會起到一定作用的藥物，例如消炎藥、免疫抑制劑、止痛藥、抗血栓形成藥結合使用。
實施例1(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺的制備R(-)-2-(4-異丁基苯基)-丙酸(R-異丁基苯丙酸，4g，0.019mol)與亞硫酰氯(7.4mL)的懸浮液回流4小時；再在室溫下自然冷卻。真空蒸發(fā)掉過量的亞硫酰氯。
用幾滴無水二惡烷洗滌殘留物二次，真空蒸發(fā)溶劑，除去最后殘余的亞硫酰氯。得到4.66g(0.019mol)黃色油，即R(-)-2-(4-異丁基苯基)-丙酰氯，將該化合物溶于幾毫升無水四氫呋喃(THF)中。
另將甲基磺酰胺(2.3g，0.0243mol)加入到叔丁醇鉀(2.73g，0.0244mol)與無水四氫呋喃(28mL)的懸浮液中，混合物室溫攪拌30分鐘。然后，邊攪拌邊加入上述所得的R(-)-2-(4-異丁基苯基)-丙酰氯(4.66g，0.019mol)，室溫下使反應混合物攪拌過夜。
濾掉分離出來的無機鹽，真空蒸發(fā)掉溶劑，油狀殘留物隔在二氯甲烷(30mL)與磷酸二氫鈉飽和溶液之間。有機相用水(2×10mL)洗滌，水相用二氯甲烷(2×10mL)萃取?；旌系挠袡C萃取液用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)掉溶劑，再向油狀殘留物在無水甲醇(10mL)中的溶液加入2微滴濃硫酸，起酯化反應生成甲酯，除去任何殘余未轉(zhuǎn)化的R(-)-2-(4-異丁基苯基)-丙酸。室溫下混合物放置過夜，真空小心蒸發(fā)溶劑，殘留物隔在水(10mL)和二氯甲烷(25mL)之間。棄掉水相，有機相用碳酸氫鈉飽和溶液(2×20mL)萃取。混合堿相，用濃鹽酸酸化，再用二氯甲烷(3×15mL)萃取。按常規(guī)方法洗至中性后，混合的有機萃取液用硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)掉溶劑，得到1.86g(0.0066mol)R(-)-N-[2-(4-異丁基苯基)丙?；鵠-甲基磺酰胺溶點為103-105℃(dec.)；[α]D＝-68(c＝1；甲醇)；1H-NMR(DMSO-d6)87.3(d，2H，J＝8Hz)；7.09(d，2H，J＝7Hz)；3.42(q，1H，J＝8Hz)；2.8(s，3H)；2.45(d，2H，J＝7Hz)；1.55(m，1H)；1.3(d，3H，J＝8Hz)；0.95(d，6H，J＝7Hz)。
實施例2(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺的L(+)-賴氨酸鹽(DF 1681B)的制備將L(+)-賴氨酸(129mg，0.88mmol)的水(1.3mL)溶液加入到R(-)-N-[2-(4-異丁基苯基)丙酰基]-甲基磺酰胺(250mg，0.88mmol)在1毫升甲醇的溶液中。蒸發(fā)掉溶劑，殘留物用乙醚(5mL)溶解，室溫攪拌過夜。在氮氣氣氛下迅速過濾分離出來的吸水性高的晶狀物質(zhì)，在濾膜上用無水乙醚洗滌，50℃真空干燥2小時，得到360mg R(-)-N-[2-(4-異丁基苯基)丙酰基]-甲基磺酰胺的L(+)-賴氨酸鹽，它是一種淺黃色粉末。[α]D＝-17.3(c＝1.15；甲醇)；1H-NMR(D2O)δ7.30(dd，4H，J＝8Hz)；3.77(t，1H，J＝7Hz)；3.65(q，1H，J＝7Hz)；3.05(m，5H)；2.52(d，2H，J＝7Hz)；1.92(m，2H)；1.75(m，2H)；1.50(m，3H)，1.40(d，3H，J＝7Hz)，0.90(6H，d，J＝7Hz)。
表1 DF 1681B對接受同源腎移植的大鼠的血清肌酸酐的影響
數(shù)據(jù)以平均值±SD表示*p＜0.05，**p＜0.01，與對照組比較°p＜0.05，與載體(4小時)比較#p＜0.05，與載體(6小時)比較Δp＜0.05，與DF 1681B(4小時)比較表2 DF 1681B對每只動物在至少10個隨機選擇的高倍顯微鏡視野(X400)中所計算的粒細胞數(shù)量的影響
數(shù)據(jù)以平均值±SD表示*p＜0.05，與載體(4小時)比較°p＜0.05，與載體(6小時)比較表3 DF 1681B對每只動物在至少10個隨機選擇的高倍顯微鏡視野(X400)中所計算的MHC II陽性間質(zhì)細胞數(shù)量的影響
數(shù)據(jù)以平均值±SD表示表4腎損傷的半定量測定計分
數(shù)據(jù)以平均值±SD表示表5 DF 1681B對接受同源腎移植的大鼠的血清肌酸酐的影響
權利要求
1.(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其無毒性鹽的應用，其特征在于所述化合物用于制備預防或治療局部缺血/再灌注損傷的藥物。
2.(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其無毒性鹽的應用，其特征在于所述化合物用于制備預防或治療由移植器官排斥反應引起的功能性損傷的藥物。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述無毒性鹽是L-賴氨酸或DL-賴氨酸鹽。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述無毒性鹽是L-賴氨酸鹽。
5.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述移植器官是移植腎。
6.預防或治療由移植器官排斥反應引起的功能性損傷所用的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其無毒性鹽，并摻有可接受的載體。
7.預防或治療局部缺血/再灌注損傷所用的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有(R)-異丁基苯丙酸甲基磺酰胺或其無毒性鹽，并摻有可接受的載體。
8.如權利要求6或7所述的藥物組合物，其特征在于所述無毒性鹽是L-賴氨酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明敘述了(R)－異丁苯丙酸甲基磺酰胺在制備治療和預防由移植器官排斥反應引起的功能性損傷的藥物中的應用。具體地說，本發(fā)明敘述了(R)－異丁苯丙酸甲基磺酰胺的無毒性鹽，例如(L)－賴氨酸鹽，在預防和治療移植腎排斥反應中的應用。
文檔編號A61P9/00GK1561205SQ02804226
公開日2005年1月5日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權日2001年2月2日
發(fā)明者R·貝爾蒂尼, F·科洛特塔, R·諾韋爾里尼 申請人:冬姆佩股份公司