專利名稱：一種制備膠原海綿的方法和用于萃取部分膠原泡沫的裝置以及拉長(zhǎng)的膠原海綿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備膠原海綿的方法。按照本發(fā)明制得的所述膠原海綿特別適合用于先要停止毛細(xì)管流血的外科手術(shù)中。所述膠原海綿也可用作一種載體，以涂敷一種纖維蛋白膠水制液。本發(fā)明還涉及一種用于萃取部分膠原泡沫的裝置。本發(fā)明還涉及一種拉長(zhǎng)的膠原海綿。
背景技術(shù)：
膠原自從上世紀(jì)六十年代就已經(jīng)被用作止血試劑。膠原是所有哺乳動(dòng)物中最為常見的結(jié)構(gòu)蛋白。大約300kDa(原膠原)的單體蛋白質(zhì)在特定位置進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。所述成熟蛋白質(zhì)因而是不溶的，它形成具有高抗拉強(qiáng)度的特征原纖維。大量的膠原子類已經(jīng)被公開，其中最為常見為膠原I，它是皮膚、腱、骨和角膜中主要膠原。膠原是一種纖維狀蛋白質(zhì)，由一種長(zhǎng)度大約為290nm的三螺旋組成。這些三螺旋中的五個(gè)(原膠原分子)進(jìn)行交錯(cuò)排列，形成一種直徑大約為3.6nm的微纖維。這些微纖維具有極性和非極性片斷，它們可以容易地進(jìn)行纖維間和纖維內(nèi)的相互作用。微纖維可以被包裝到一個(gè)四角網(wǎng)格中，以形成具有直徑約30nm的亞原纖維。這些亞原纖維接著可裝配成膠原纖維，它是結(jié)締組織的基本單位，它具有數(shù)百nm的直徑，因而在光學(xué)顯微鏡下可以看到一個(gè)細(xì)線，參見參考資料1。在這些制備方法過(guò)程中制得的膠原凝膠和膠原海綿，包括這些原纖維作為最小的單位，這可由顯微鏡得到證實(shí)。
膠原可以用作一種用于密封傷口的材料，可能地與一種含有纖維蛋白膠水的涂料一起使用。纖維蛋白膠水，即纖維蛋白原、凝血酶和抑肽酶的組合物，許多年來(lái)已經(jīng)成功地用于治療粘合組織和神經(jīng)和用于密封存在少量流血的表面。所述纖維蛋白膠水的一種缺點(diǎn)是，對(duì)于大量流血情形，所述膠水在纖維蛋白有效聚合發(fā)生之前，就常常被沖走。為了克服這個(gè)問(wèn)題，外科醫(yī)生開始用手涂敷所述液體纖維蛋白膠水到可吸收載體如膠原棉網(wǎng)之上。
盡管這些結(jié)合應(yīng)用具有給人印象深刻的成功，但是，這種方法不能廣泛地應(yīng)用，這是由于它存在著一些缺點(diǎn)。其制備是相對(duì)麻煩的，所述方法需要經(jīng)驗(yàn)和熟練技術(shù)人員，且所述制備方法對(duì)于緊急情況不是很有效，制備時(shí)間在10-15分鐘之間。這些因素刺激著一種改進(jìn)產(chǎn)品的開發(fā)，從而導(dǎo)致開發(fā)出一種覆蓋有一種固體纖維蛋白原、固體凝血酶和固體抑肽酶涂層的固定組合物，如EP 0 059 265中所述。在EP 0 059 265中所公開的產(chǎn)品，其商標(biāo)為TachoComb，它可直接應(yīng)用到所述傷口之上。當(dāng)所述涂層開始與水合流體如血液、其它體液或鹽水接觸時(shí)，所述成分能夠溶解并有纖維蛋白形成。所述產(chǎn)品采用輕微的壓力應(yīng)用到所述傷口之上，膠原能夠牢固地結(jié)合(粘合)到所述受傷的表面。進(jìn)而實(shí)現(xiàn)止血和密封傷口。
除了一些血液凝結(jié)會(huì)刺激活性之外，在TachoComb中的膠原作用主要在于一種載體，它能吸收并賦予所涂敷的凝結(jié)制劑以機(jī)械穩(wěn)定性。膠原的其它優(yōu)點(diǎn)，特別是呈海綿形式，是其生物可降解性、其相對(duì)高抗張(即使是在其濕潤(rùn)狀態(tài))、其高耐液體和空氣透過(guò)性、和其在濕潤(rùn)狀態(tài)的高彈性。
本發(fā)明主要涉及一種膠原海綿的制備方法，它可用作纖維蛋白原、凝血酶和/或抑肽酶的載體，例如，用在TachoComb中。所述膠原海綿也可直接使用，即不需涂層，作為一個(gè)繃帶在局部傷口之上，用于止血的支撐，例如用來(lái)防止流血、用于從軟組織器官的弱小的彌漫流血、用于灼傷涂敷、皮膚移植、褥瘡或皮膚缺損、或作為在局部傷口上的繃帶。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)給出了大量用于制備膠原載體的方法。WO86/05811公開了一種用于固定移動(dòng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生物活性物質(zhì)的加重微海綿，所述微海綿包括一種高度交聯(lián)的膠原間質(zhì)。所述高度交聯(lián)膠原間質(zhì)是通過(guò)碾磨一種I、II或III型膠原來(lái)源以形成具有直徑在1-50μm水平且長(zhǎng)度不大于200μm的纖維而制備得到的。所述粉碎膠原形成為一種溶解在溶劑中的可溶膠原，如乙酸、乳酸、丙酸或丁酸。就膠原分散來(lái)說(shuō)，所述混合是通過(guò)使用一種混合器經(jīng)高水平攪拌而實(shí)現(xiàn)的，從而得到所述膠原的微纖維。之后，將一種加重的添加劑與所述膠原-液體混合物進(jìn)行混合，所述復(fù)合混合物形成為很小的微滴并通過(guò)冷凍固化。大量用于制備微小顆粒的技術(shù)已經(jīng)公開。所述冷凍組合物進(jìn)行真空凍干，冷凍和干燥的結(jié)合稱作凍干。對(duì)所述凍干膠原間質(zhì)組合物進(jìn)行處理，以交聯(lián)所述膠原。所述膠原可通過(guò)使用化學(xué)交聯(lián)劑、在高溫下嚴(yán)重脫水或兩者結(jié)合而進(jìn)行交聯(lián)。所述膠原間質(zhì)目的是在于抵抗膠原酶和其它酸降低，從而使得這些物質(zhì)特別適合用于培養(yǎng)有機(jī)組織。在洗滌所述交聯(lián)膠原間質(zhì)之后，所述膠原間質(zhì)具有一個(gè)開孔，使所述表面孔隙結(jié)構(gòu)具有平均孔隙尺寸范圍為約1-150μm，所述間質(zhì)孔隙占所述微海綿體積約70-98％。所述微海綿還具有約100-1000μm的平均顆粒尺寸，和高于約1.05的比重。所述加重物質(zhì)可為金屬或金屬合金、金屬氧化物和陶瓷。
US5660857公開了一種用于制備一種含有一種不溶蛋白質(zhì)間質(zhì)和一種含油物質(zhì)的組合物的方法，它可用作用于外科繃帶和生物醫(yī)學(xué)移植物的材料，和用作涂敷到所述皮膚上的化妝品原料。US5660857所述方法包括混合一種蛋白質(zhì)、所述含油物質(zhì)和水從而在所述蛋白質(zhì)的水合分散液中形成所述含油物質(zhì)的乳狀液步驟，和隨后干燥或凍干所述乳狀液以形成一種薄膜或一種海綿步驟。所述不溶纖維蛋白主要含有不溶膠原，它可合適地從牛皮膚制得。在一種實(shí)施方式中，所述膠原可在使用前于乳酸中進(jìn)行腫脹。
WO99/13902公開了一種用于制備一種腦膜組織生長(zhǎng)間質(zhì)的方法，包括制備生理相容的膠原步驟，它是基本不含活性病毒和蛋白感染素的。所述膠原形成為一種薄膜、一種海綿、一種非編織膠原或一種毛氈。所述膠原是通過(guò)一種包括清潔皮膚、腱、韌帶或脂肪骨的方法制得的。所述原料接著進(jìn)行一種酶處理，這樣，所述膠原進(jìn)行腫脹。所述膠原原料接著采用一種酸溶液進(jìn)一步進(jìn)行腫脹。所述膠原混合物接著進(jìn)行均化。所得到的產(chǎn)品可為一種呈膠原海綿、非編織間質(zhì)、氈或薄膜形式的間質(zhì)或者一種由兩種或多種前述形式的組合物。一種膠原海綿可通過(guò)采用在US5019087中所公開的用來(lái)形成膠原海綿的方法而提供。所述海綿可通過(guò)凍干按照WO99/13902所制得的膠原分散液而制備得到。所得到海綿密度據(jù)說(shuō)約為0.1mg/cm3-120mg/cm3。根據(jù)WO99/13902的描述，所述孔隙尺寸范圍為約10-500μm。層壓型膠原海綿和膠原薄片也提到了。
US5618551涉及一種非交聯(lián)的和潛在可交聯(lián)的胃蛋白酶處理的膠原或凝膠粉末，它是在一種水合溶液中通過(guò)氧化解理進(jìn)行改性的，它在一種酸性pH時(shí)是可溶的，且可在低于0℃的溫度時(shí)穩(wěn)定貯存至少一個(gè)月。所述專利還涉及一種用于制備所述粉末的方法，包括制備一種胃蛋白酶處理的膠原的酸性溶液，使所述酸性水溶液在室溫進(jìn)行控制氧化，在一種酸性pH時(shí)沉淀所述氧化且未交聯(lián)的胃蛋白處理膠原，分離，濃縮并對(duì)所述未交聯(lián)胃蛋白處理膠原進(jìn)行脫水，從而使其呈活潑酸性粉末形式，在低于0℃冷凍并貯存所得到的活潑酸性粉末。
以其應(yīng)用為目的，GB1292326公開了一種用于制備膠原分散液的方法和裝置，其中，制備一種膠原纖維的懸浮液，隨后引入到一個(gè)具有攪拌裝置的處理室中。在所述處理室中存在著負(fù)壓，其中，所述懸浮液在攪拌作用下被轉(zhuǎn)移到一種分散液中，并借助于一種無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸控制酸度。根據(jù)GB 1292326的描述，所述海綿膠原制品的制cx備受到膠原分散液或凝膠的影響。在其上下文中，所述文獻(xiàn)提到凍干方法和很多分散液或凝膠存在于氣泡中。GB1292326還提及一個(gè)以令人滿意方式控制氣泡的引入或除去的問(wèn)題。所述文獻(xiàn)在兩個(gè)實(shí)施例中分別公開了一種膠原含量為2.5％的不含有氣泡的膠原分散液，和一種具有膠原濃度為2.5％的充氣膠原分散液。
Chemical Abstracts，Columbus Ohio，US，Vol.98 13 June 1983 No.24提及一種膠原，它是從已經(jīng)進(jìn)行過(guò)酸處理的動(dòng)物組織如皮膚或腱骨得到的。所述膠原通過(guò)滲析進(jìn)行再聚積，在此過(guò)程中，形成一種高度雙折射纖維。所述膠原可成型為0.5mm-2cm薄片，或者，可與空氣混合形成海綿，或者分散為一種乳劑。
發(fā)明概述業(yè)已發(fā)現(xiàn)，采用一種纖維蛋白膠水制劑的膠原海綿的成功涂敷，取決于所述膠原海綿的質(zhì)地。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于制備具有一定質(zhì)地的膠原海綿的方法，特別是對(duì)于制備適合于用纖維蛋白膠水制劑涂敷的膠原海綿，從而得到一種用于治療和密封傷口的材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于制備較現(xiàn)有技術(shù)海綿具有改進(jìn)物理性質(zhì)的膠原海綿的方法，在此意義上，它具有改進(jìn)的濕度、彈性、密度和彈性模量。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于制備空氣和流體密封的膠原海綿，在這意義上，一旦所述膠原海綿應(yīng)用到一個(gè)傷口上，它就不會(huì)允許空氣或液體滲入到所述膠原海綿之中。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種傷口封閉材料，它可用于腸胃漏斗或氣管中。
因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于制備膠原海綿的方法，包括以下步驟-制備一種膠原凝膠，-混合空氣到所述膠原凝膠中，得到一種膠原泡沫，-干燥所述膠原泡沫，得到一種其中具有腔室的干燥載體塊，-從所述膠原海綿中，分離出部分具有腔室直徑大于0.75mm但小于4mm、或具有腔直徑平均至多為3mm的海綿部分。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“腔直徑”應(yīng)該理解為在一個(gè)腔中最大的直線壁與壁間距離，即一個(gè)腔的最大對(duì)角直線距離。所述腔可為多邊形狀，如八邊形。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大于0.75mm但小于4mm的腔直徑或至多為3mm的腔直徑，可以使得所述膠原海綿特別適合用于被一種含有纖維蛋白原和凝血酶的懸浮液所涂敷。優(yōu)選地，所述膠原凝膠具有的干燥質(zhì)量范圍為2-20mg干燥質(zhì)量/g凝膠，如4-18mg，如5-13mg，如6-11mg/g凝膠。所述膠原凝膠的動(dòng)力學(xué)粘度優(yōu)選為2-20Ncm，如4-10Ncm，如6-8Ncm。所述膠原海綿優(yōu)選具有的水分不大于20％，如10-15％，如約18％。所述膠原海綿的彈性模量?jī)?yōu)選范圍為5-100N/cm，如10-50N/cm，所述海綿的密度優(yōu)選為1-10mg/cm3，如2-7mg/cm3。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，由上述方法制備得到的膠原海綿，是空氣和液體密封的，在此意義上，一旦所述涂層膠原海綿被涂敷到一個(gè)傷口上，則它就不會(huì)允許空氣或液體滲入到所述膠原海綿中。液體被吸收在所述海綿之中。這種效果主要是由于下述事實(shí)達(dá)到的所述混合空氣到所述膠原凝膠步驟提供了這樣一種膠原海綿，它是一種三維結(jié)構(gòu)，具有被膠原材料壁所分隔開且基本全部密封的層疊腔室，與那些具有纖維結(jié)構(gòu)的已知膠原海綿不同。
所述膠原凝膠可包括不同類型的材料，如源自哺乳動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因的或重組來(lái)源的I型、II型或III型，但是所有其它類型的膠原也可采用。所述膠原可包括源自于選自由馬腱、人腱和牛腱所組成的組中腱的原料。另外地或替代地，所述膠原凝膠包括重組膠原原料。
所述海綿分離部分的膠原含量，優(yōu)選為所述海綿干燥質(zhì)量的50-100％，如75-100％，如80-100％，如85-100％，如90-100％，如92-100％，如92-98％，如93-97％，如94-96％。
所述制備膠原凝膠步驟，優(yōu)選包括以下步驟-將所述腱在-10℃至-30℃之間的溫度進(jìn)行貯存，并剝下所述腱，-從所述腱中去除異種蛋白，-降低所述腱中的微生物含量，-使所述腱腫脹，-均化所述腫脹的腱。
所述貯存、剝離、去除蛋白、降低微生物含量和腫脹步驟，目的是在于純化所述，而所述均化步驟目的是在于得到呈一種凝膠形式的膠原。
所述降低微生物含量步驟，優(yōu)選包括添加一種酸如一種有機(jī)酸，如乳酸到所述腱之中。而且，一種有機(jī)溶劑如一種醇如乙醇，優(yōu)選地也可添加到所述腱之中。此外，所述腱的腫脹步驟，優(yōu)選地，包括添加乳酸至所述腱之中。所采用的乳酸為0.40-0.50％的乳酸，如0.45％的乳酸。
所述腱的腫脹步驟，可包括在4-25℃的溫度貯存所述腱，如在10-20℃的溫度，持續(xù)48-200小時(shí)，如100-200小時(shí)。
所述腫脹腱的均化步驟，優(yōu)選是這樣進(jìn)行的，以保證得到膠原凝膠片斷即纖維球狀物的顆粒尺寸具有的直徑為0.8-1.2cm，如大約1cm。而且，所述膠原凝膠的物理性質(zhì)，優(yōu)選地如上所述。舉例來(lái)說(shuō)，合適的性質(zhì)，可通過(guò)借助于齒條式盤磨機(jī)或充分均化設(shè)備，對(duì)所述腫脹腱實(shí)施所述均化步驟而達(dá)到。
所述混合空氣到所述膠原凝膠步驟，優(yōu)選包括以下步驟-借助于一個(gè)混合器，將室內(nèi)空氣混合到所述凝膠中，形成一種膠原泡沫，-將所述混合凝膠泡沫進(jìn)料到一種分餾通道中，-分離存在于所述分餾通道中的膠原凝膠和膠原泡沫。
從所述分餾通道中膠原泡沫分離出來(lái)的至少部分膠原凝膠，可引回到所述混合器中。在這種情形中，從所述分餾通道引回到所述混合器的膠原凝膠數(shù)量與引入到所述混合器中的新鮮膠原凝膠數(shù)量的比值，優(yōu)選是在0.1-0.5之間。所述分離膠原凝膠和膠原泡沫步驟，優(yōu)選包括以下步驟-分離出一部分選定的存在于所述分餾通道中的膠原泡沫，-將所述選定部分的膠原泡沫引出所述分餾通道，用于對(duì)其進(jìn)行干燥。
在所述方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在所述分餾通道中保持15-40℃的溫度，如20-25℃。
在混合空氣到所述膠原凝膠之后，所述膠原泡沫可以進(jìn)行均化2-4分鐘的一段時(shí)間。
在所述干燥膠原泡沫步驟之前和在所述混合空氣到所述膠原凝膠步驟之前，一種中和劑可以添加到所述膠原泡沫之中，且所述膠原泡沫優(yōu)選是進(jìn)行中和的，以便使通常為2.5-3.5的pH，達(dá)到所述pH為6.5-8.5的膠原泡沫?？梢圆捎靡环N含氨溶液的中和劑，所述膠原泡沫優(yōu)選是中和持續(xù)5-30小時(shí)，如10-20小時(shí)，如大約24小時(shí)。
在所述干燥膠原泡沫步驟之前，所述膠原泡沫，優(yōu)選地以這樣一種方式注入到一種干燥容器中，使得在填充時(shí)實(shí)質(zhì)上沒有空氣被帶入到所述泡沫中。
所述干燥步驟優(yōu)選包括在15-60℃之間的溫度，如20-40℃，進(jìn)行干燥，持續(xù)50-200小時(shí)，如100-150小時(shí)，得到一種干燥的膠原海綿。所述干燥步驟可在略微低于大氣壓的壓力中進(jìn)行，如壓力在700-900mbar之間，如大約800mbar。
由上述方法制得的膠原海綿，優(yōu)選具有至少一個(gè)下述標(biāo)準(zhǔn)-pH值在5.0-6.0之間，-乳酸含量至多為5％，-銨含量至多為0.5％，-可溶蛋白含量至多為0.5％，以白蛋白計(jì)，-硫酸鹽灰分含量至多為1.0％，-重金屬含量至多為20ppm，
-微生物純度至多為103CFU/g，-膠原含量為75-100％，-密度為1-10mg/cm3，如2-7mg/cm3，-彈性模量范圍為5-100N/cm，如10-50N/cm。
所述分離膠原海綿部分步驟，可包括通過(guò)切割將所述膠原海綿分為多個(gè)部分。所得部分可成型為任意希望的形狀，如圓錐形、圓柱形(包括具有環(huán)形橫截面的圓柱形)、矩形、多角形、立方形和平坦薄片，或者，它們可通過(guò)一種適合的造粒方法等轉(zhuǎn)變?yōu)榱睢?br>
在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于制備一種膠原海綿的方法，包括以下步驟-制備一種膠原凝膠，-混合空氣到所述膠原凝膠中，得到一種膠原泡沫，-干燥所述膠原泡沫，得到一種其中具有腔室的干燥載體塊，-從所述膠原海綿塊中，分離出具有下述性質(zhì)的海綿部分-彈性模量范圍為5-100N/cm，-密度范圍為1-10mg/cm3，-其腔室直徑大于0.75mm但小于4mm，或腔室直徑平均至多為3mm。
應(yīng)該能夠理解，本發(fā)明第一方面所述方法中的所有步驟，也可在本發(fā)明第二方面所述方法中進(jìn)行。而且，由本發(fā)明第一方面所述方法制得的膠原海綿的任意和所有特征和性質(zhì)，也可由本發(fā)明第二方面所述方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于萃取部分膠原泡沫和用于退化另一部分膠原泡沫為一種膠原凝膠，包括-一個(gè)分餾通道，它含有一個(gè)用于接受膠原泡沫物流的入口、一個(gè)部分膠原泡沫物流的出口、和一個(gè)底部，它按膠原泡沫物流的方向向下傾斜，-在所述分餾的底部具有至少一個(gè)用于膠原凝膠的出口，其中，所述出口位置在所述分餾通道的一端的垂直方向上是可移動(dòng)的。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種拉長(zhǎng)的膠原海綿，它具有一種透過(guò)性的小孔或孔腔和一種彈性壁。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，這類膠原海綿可用于封閉哺乳動(dòng)物的傷口或重新建立腸胃漏斗和氣管壁。因此，所述膠原海綿可具有圓形或橢圓形橫截面。所述膠原海綿可用作填料、或用作腸胃漏斗、或用作涂敷到一種腸胃漏斗外表面上的外套。
所述透過(guò)性小孔或孔腔的內(nèi)徑，對(duì)于不同人體腸胃漏斗和氣管的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，例如，可為如下所述腸 0.5-6cm直腸1-4cm大腸2-6cm小腸0.5-3cm食管0.5-2cm氣管1-4cm所述膠原海綿，舉例來(lái)說(shuō)，可用于在外科手術(shù)除去腸胃漏斗壁上的外囊后封閉傷口，如在直腸外科手術(shù)后，如在痔瘡切除手術(shù)后?？赡苓m用本發(fā)明所述膠原海綿的實(shí)施例有-傷口繃帶，-止血支撐物，例如-軟組織器官的弱小的彌漫流血，-在應(yīng)用所述膠原海綿之前的已經(jīng)進(jìn)行ectrosurgery或結(jié)扎術(shù)的外科部位的外科手術(shù)中，-防止再流血(保證縫合)-灼傷涂敷，-在局部損傷上的繃帶，-藥物輸送劑，如輸送抗生素。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1和圖2包含一個(gè)圖示說(shuō)明本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中所述涉及步驟的流程圖，圖3為本發(fā)明所述方法制得的膠原海綿表面的圖片(courtesy Prof.Dr.Roman Carbon，Chirurgische Univ.Klinik Erlangen，Germany)，和圖4描述了一種用于得到膠原凝膠粘度量度的攪拌裝置。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明包括如圖1和2所示的下述步驟步驟1 輸送深凍的馬腱在-18℃至-25℃貯存腱。
步驟2 剝離馬腱在半凍狀態(tài)，采用小刀手動(dòng)或機(jī)械除去所述腱的薄皮膚。所述腱接著在-18℃至-25℃再次深凍步驟3 機(jī)械切斷剝離的馬腱任意性地，剝離的冷凍腱在70％乙醇中消毒30分鐘，并在乙醇存在下使之流入制備室。所述接著洗滌，在洗滌之后，將所述腱壓縮成塊，并在-18℃至-25℃深凍。所述冷凍的腱塊接著采用一種切割裝置進(jìn)行切斷，用一種轉(zhuǎn)刀切割成具有約1mm厚度的切片。
步驟4 對(duì)所述腱切片進(jìn)行洗滌和消毒為了除去可溶蛋白質(zhì)，所述腱切片先浸泡在注射用水中3-6小時(shí)，用注射用水或除離子水或含有Ca2+和/或Mg2+離子濃度在1-10mM的鹽溶液進(jìn)行洗滌，直到所述上清液不含血紅蛋白。所述腱切片接著在70％乙醇進(jìn)行消毒15分鐘，并在含0.45％乳酸的飲用水中(消毒過(guò)濾和depyrogenised)洗滌兩次，以除去乙醇。
步驟5 制備膠原凝膠所述洗滌的腱切片在0.45％乳酸浸泡2-5天，優(yōu)選為4天，接著均化至一種膠原凝膠。與0.45％乳酸接觸，據(jù)信是重要的病毒滅活步驟。
步驟6 起泡采用溶解攪拌器，消毒過(guò)濾空氣被攪動(dòng)到所述膠原凝膠中。分離所升起的泡沫，并收集具有1-3mm氣泡尺寸的餾分。所述泡沫從所述鋼容器倒入到一個(gè)桶內(nèi)，它緩慢地進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)約3分鐘，得到一種均勻的泡沫。將這種泡沫注入到干燥容器中。所述容器底部具有紡織品，它對(duì)流體具有滲透性，可允許排出所述泡沫。在5-24小時(shí)后，優(yōu)選是18-24小時(shí)后，排出的泡沫與氨氣接觸，例如由具有DAB性質(zhì)的26％氨溶液產(chǎn)生的氨氣。在此過(guò)程中，多余的氨使所述泡沫的pH遷移到堿性范圍。在隨后的干燥中氨被除去，從而得到一種中性產(chǎn)品。
步驟7 干燥膠原泡沫所述所述泡沫在一個(gè)高級(jí)鋼干燥室中于熱空氣中干燥48-150小時(shí)，優(yōu)選120-150小時(shí)。其結(jié)果是得到呈塊狀形式的膠原海綿。
步驟8 切斷膠原海綿塊所述膠原塊也稱作膠原薄片，例如，可用作一種涂層的載體。所述切斷是采用一種垂直切割裝置進(jìn)行的。首先，切除所述海綿塊的側(cè)邊，以得到一個(gè)具有側(cè)邊長(zhǎng)度為50cm的垂直邊。這種塊接著被垂直切割成4個(gè)寬度為11cm的條棒。所述條棒在其上邊和其下邊再次進(jìn)行修整，接著將其切割為50×11×0.4-0.7cm的條帶。所述膠原海綿條帶的重量，優(yōu)選應(yīng)當(dāng)考慮到將要得到的最終產(chǎn)品中膠原規(guī)定，如TachoCombH、TachoComb和Tachotop。
步驟9 對(duì)所述膠原海綿進(jìn)行分類所述膠原海綿條帶接著進(jìn)行病毒控制。廢棄具有一個(gè)或兩個(gè)缺陷的條帶-具有平均腔直徑小于1mm或大于3mm的條帶-具有不均勻腔結(jié)構(gòu)的條帶-具有小孔的條帶(深度大于其它海綿厚度的單個(gè)腔室)。
所述分類條帶在15-25℃溫度下于消毒的輕金屬容器中最長(zhǎng)可貯存1年時(shí)間。
圖3為本發(fā)明所述方法制得的膠原海綿表面的圖片，所述圖片是以約20000放大倍數(shù)取得的(courtesy Prof.Dr.Roman Carbon，Chirurgische Univ.Klinik Erlangen，Germany)。在圖3圖片中所示的表面，是在本發(fā)明所述方法制得的膠原海綿橫截面的表面。在所述圖片中的黑色區(qū)域表示腔室，而所述圖片中的明亮區(qū)域表示膠原物質(zhì)，包括分隔所述腔室的膠原物質(zhì)的壁。
圖4描述了一種用于得到膠原凝膠粘度量度的攪拌裝置，包括一個(gè)適于容納一種液體的容器和用來(lái)攪拌所述液體的工具。所述攪拌工具包括一個(gè)附著在一個(gè)叉形元件上的連桿。在所述容器中的液體，通過(guò)對(duì)所述連桿施加一個(gè)轉(zhuǎn)矩而得到攪拌，從而導(dǎo)致所述叉形元件進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。所述叉形元件包括一個(gè)主部件41，所述連桿連接到其上，和第一和第二輔助部件42。所述輔助部件連接到所述主部件的兩端。當(dāng)所述叉形元件旋轉(zhuǎn)時(shí)，所述表面使所述液體移動(dòng)，從而攪拌所述液體。
在一種實(shí)施方式中，所述裝置具有下述尺寸。所述容器高為110mm，寬為146mm。所述連桿高為220mm，其直徑為10mm。所述叉形元件的主部件41，其長(zhǎng)為90mm，寬為30mm。所述輔助部件42高為90mm，寬為30mm。所述輔助部件42的外邊緣至所述容器的內(nèi)表面的距離為28mm。
實(shí)施例I下述表I給出了本發(fā)明所述方法的三種不同循環(huán)的參數(shù)值。
表I
下述表II給出了由本發(fā)明所述方法制得的三種不同膠原海綿的參數(shù)值。
表II
實(shí)施例II本實(shí)施例涉及采用轉(zhuǎn)矩測(cè)量方法直接測(cè)量所述膠原凝膠的粘度。
用于轉(zhuǎn)矩測(cè)量方法的裝置是-攪拌器EUROSTAR POWER control-visc-Windows軟件IKASOFT dc-轉(zhuǎn)矩指示器VISCOKLICK VK 1-數(shù)據(jù)記錄器DC 2-具有限定尺寸的特定攪拌器構(gòu)造(“叉”)，參見圖4-具有內(nèi)徑為14.6cm和高度為20.5cm的漏斗-溫度計(jì)-天平將1500g數(shù)量的膠原注入到所述漏斗中。樣品溫度為23℃。所述“叉”攪拌器固定在所述漏斗的中心。接著開始測(cè)量。轉(zhuǎn)矩指示器從阻抗所述攪拌器轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)表示動(dòng)力學(xué)凝膠粘度的數(shù)值(Ncm)。
為了檢驗(yàn)所述轉(zhuǎn)矩的測(cè)量，制備一種59％聚乙二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用一種Haake Visosimeter RV 20 Totovisko測(cè)量這種溶液的粘度。這種溶液的動(dòng)力學(xué)粘度η在23℃時(shí)，其范圍為η＝925±25mPas。這種溶液粘度可通過(guò)上述凝膠測(cè)量裝置進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)此測(cè)量得到的所述轉(zhuǎn)矩?cái)?shù)值在23℃時(shí)，其范圍應(yīng)該為3.66Ncm+5％。
參考資料Baer，E.Gathercole，L.J.And Keller，A.，Structure hierarchies in TendonCollagenan interim summary，Proc.Colston Conf.，1974，189；Hiltner，A.Cassidy，J.J.and Baer，E.，Mechanical Properties of bioperties ofBiological Polymers，Ann.Rev.Mater.Sci.，15，455，1985)
權(quán)利要求
1.一種用于制備膠原海綿的方法，包括以下步驟-制備一種膠原凝膠，-混合空氣到所述膠原凝膠中，得到一種膠原泡沫，-干燥所述膠原泡沫，得到一種其中具有腔室的干燥載體塊，-從所述膠原海綿中，分離出部分具有腔室直徑大于0.75mm但小于4mm的部分、或具有平均腔對(duì)角尺寸為3mm的海綿部分。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述海綿的分離部分的膠原含量為50-100％。
3.權(quán)利要求2或3所述方法，其中所述膠原凝膠包括從至少一種下述來(lái)源的不同類型的膠原材料哺乳動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因的和重組來(lái)源。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中所述膠原包括源自于選自由馬腱、人腱和牛腱所組成的組中腱的原料。
5.權(quán)利要求3或4所述方法，其中所述制備膠原凝膠步驟包括以下步驟-將所述腱在-10℃至-30℃之間的溫度進(jìn)行貯存，并剝下所述腱，-從所述腱中去除異種蛋白，-降低所述腱中的微生物含量，-使所述腱腫脹，-均化所述腫脹的腱。
6.權(quán)利要求5所述方法，其中所述降低微生物含量步驟包括添加一種酸和一種有機(jī)溶劑到所述腱之中。
7.權(quán)利要求6所述方法，其中所述酸為一種有機(jī)酸，如乳酸。
8.權(quán)利要求6或7所述方法，其中所述有機(jī)溶劑為一種醇，如乙醇。
9.權(quán)利要求5-8任一所述方法，其中所述腱的腫脹步驟包括添加乳酸至所述腱之中。
10.權(quán)利要求5-9任一所述方法，其中所述具有的pH值范圍為1-4，如1.5-3.5，如2.5-3.0。
11.權(quán)利要求5-10任一所述方法，其中所述乳酸為0.45％的乳酸。
12.權(quán)利要求5-11任一所述方法，其中所述腱的腫脹步驟，包括在4-25℃的溫度貯存所述腱，持續(xù)48-200小時(shí)。
13.權(quán)利要求12所述方法，其中所述腱貯存時(shí)間為100-120小時(shí)。
14.權(quán)利要求5-13任一所述方法，其中所述腫脹腱的均化步驟包括得到一種含有腱顆粒的物質(zhì)，所述顆粒具有的長(zhǎng)度或直徑為0.8-1.2cm。
15.權(quán)利要求5-14任一所述方法，其中所述腫脹腱的均化步驟包括得到一種具有粘度為2-20Ncm的物質(zhì)。
16.權(quán)利要求5-15任一所述方法，其中所述腫脹腱的均化步驟是借助于一種齒條式盤磨機(jī)或可比設(shè)備進(jìn)行的。
17.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述膠原凝膠具有的動(dòng)力學(xué)粘度為2-20Ncm。
18.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述混合空氣到所述膠原凝膠步驟，包括以下步驟-借助于一個(gè)混合器，將室內(nèi)空氣混合到所述凝膠中，形成一種膠原泡沫，-將所述混合凝膠泡沫進(jìn)料到一種分餾通道中，-分離存在于所述分餾通道中的膠原凝膠和膠原泡沫。
19.權(quán)利要求18所述方法，其中，從所述分餾通道中膠原泡沫分離出來(lái)的至少部分膠原凝膠，被引回到所述混合器中。
20.權(quán)利要求19所述方法，其中，從所述分餾通道引回到所述混合器的膠原凝膠數(shù)量與引入到所述混合器中的新鮮膠原凝膠數(shù)量的比值，優(yōu)選是在0.1-0.5之間。
21.權(quán)利要求18-20任一所述方法，其中，所述分離膠原凝膠和膠原泡沫步驟，包括以下步驟-分離出一部分選定的存在于所述分餾通道中的膠原泡沫，-將所述選定部分的膠原泡沫引出所述分餾通道，用于對(duì)其進(jìn)行干燥。
22.權(quán)利要求18-21任一所述方法，還包括在所述分餾通道中保持15-40℃的溫度。
23.前述權(quán)利要求任一所述方法，還包括在混合空氣到所述膠原凝膠之后，對(duì)所述膠原泡沫進(jìn)行均化2-4分鐘的一段時(shí)間。
24.前述權(quán)利要求任一所述方法，還包括在所述干燥膠原泡沫步驟之前和在所述混合空氣到所述膠原凝膠步驟之前，添加一種中和劑到所述膠原泡沫之中，并中和所述膠原泡沫，使所述膠原泡沫pH值達(dá)到6.5-8.5之間。
25.權(quán)利要求24所述方法，其中所述中和劑包括一種氨溶液。
26.權(quán)利要求24或25所述方法，其中所述膠原泡沫是中和持續(xù)5-30小時(shí)。
27.權(quán)利要求26所述方法，其中所述膠原泡沫是中和持續(xù)20-30小時(shí)。
28.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述干燥步驟包括在15-60℃之間的溫度，進(jìn)行干燥持續(xù)48-200小時(shí)，從而得到一種干燥的膠原海綿。
29.權(quán)利要求28所述方法，其中所述干燥是在700-900mbar的壓力下進(jìn)行的。
30.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述干燥步驟包括在15-40℃之間的溫度，進(jìn)行干燥持續(xù)100-200小時(shí)。
31.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述膠原海綿，具有至少一個(gè)下述標(biāo)準(zhǔn)-pH值在5.0-6.0之間，-乳酸含量至多為5％，-銨含量至多為0.5％，-可溶蛋白含量至多為0.5％，以白蛋白計(jì)，-硫酸鹽灰分含量至多為1.0％，-重金屬含量至多為20ppm，-微生物純度至少為103CFU/g，-膠原含量為75-100％，-密度為1-10mg/cm3，-彈性模量范圍為5-100N/cm。
32.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述膠原海綿具有的水分含量不超過(guò)20％。
33.前述權(quán)利要求任一所述方法，其中所述分離膠原海綿部分步驟，包括通過(guò)切割將所述膠原海綿分為多個(gè)部分。
34.一種制備一種膠原海綿的方法，包括以下步驟-制備一種膠原凝膠，-混合空氣到所述膠原凝膠中，得到一種膠原泡沫，-干燥所述膠原泡沫，得到一種其中具有腔室的干燥載體塊，-從所述膠原海綿塊中，分離出具有下述性質(zhì)的海綿部分-彈性模量范圍為5-100N/cm，-密度范圍為1-10mg/cm3，-其腔室直徑大于0.75mm但小于4mm，或腔室直徑平均至多為3mm。
35.權(quán)利要求34所述方法，包括權(quán)利要求1-33任一所述步驟。
36.一種用于萃取部分膠原泡沫和用于退化所述膠原另一部分為膠原凝膠的裝置，包括-一個(gè)分餾通道，它含有一個(gè)用于接受膠原泡沫物流的入口、一個(gè)部分膠原泡沫物流的出口、和一個(gè)底部，它按膠原泡沫物流的方向向下傾斜，-在所述分餾的底部具有至少一個(gè)用于膠原凝膠的出口，其中，所述出口位置在所述分餾通道的一端的垂直方向上是可移動(dòng)的。
37.一種拉長(zhǎng)的膠原海綿，它具有一種透過(guò)性的小孔或孔腔和一種彈性壁。
38.權(quán)利要求37所述拉長(zhǎng)的膠原海綿還具有圓形或橢圓形的橫截面。
39.權(quán)利要求37或38所述拉長(zhǎng)的膠原海綿，還具有可允許所述海綿用于在哺乳動(dòng)物腸胃漏斗或氣管系統(tǒng)中封閉傷口或重新建立壁的外部尺寸。
40.權(quán)利要求37-39任一所述拉長(zhǎng)的膠原海綿，其中所述孔腔或小孔具有的對(duì)角尺寸對(duì)應(yīng)于哺乳動(dòng)物腸胃漏斗或氣管的內(nèi)部或外部橫截面尺寸。
41.權(quán)利要求39或40所述拉長(zhǎng)膠原海綿，具有的外部尺寸對(duì)應(yīng)于所述人體直腸的內(nèi)徑尺寸，從而可使所述海綿適合用于封閉所述直腸壁中的傷口或重新建立所述直腸壁。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備膠原海綿的方法，包括混合空氣到一種膠原凝膠中，從而得到一種被干燥的膠原泡沫。從所得到的干燥產(chǎn)物，通過(guò)分離出具有腔室直徑大于0.75mm但小于4mm的海綿部分、或具有平均腔對(duì)角尺寸為3mm的海綿部分而得到膠原海綿。所述膠原海綿可用作封閉傷口的植物，可以帶有一層含有纖維蛋膠水的涂層，如纖維蛋白原、凝血酶和抑肽酶的組合物。還公開了一種用于萃取部分膠原泡沫和用于退化所述膠原泡沫另一部分為一種膠原凝膠的裝置。一種具有透過(guò)性小孔或孔腔和彈性壁的拉長(zhǎng)的膠原海綿，可用于在哺乳動(dòng)物的腸胃漏斗或氣管系統(tǒng)中重新建立內(nèi)壁。
文檔編號(hào)A61L15/32GK1487967SQ02804095
公開日2004年4月7日 申請(qǐng)日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月25日
發(fā)明者阿爾佛雷德·肖費(fèi)勒, 阿爾佛雷德 肖費(fèi)勒 申請(qǐng)人:奈科明醫(yī)藥有限公司