專利名稱：淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬藥理學領域，涉及一種中藥單體化合物的用途，具體的涉及淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途，可用于干細胞移植心肌再生或細胞心肌重建術中的促細胞分化劑。
淫羊藿苷(Epimedium Icariine，EI)是從淫羊藿中分離提純的天然產物，為一單體化合物，是淫羊藿的有效成分。化學結構式為 R1＝-GlcR2＝-Rha其提取過程大致為取淫羊藿藥材，粉碎→乙醇提取→得到浸膏提取物→最佳條件萃取→取得較高純度的淫羊藿苷。
淫羊藿苷具有多種藥理活性，對血液系統、免疫系統、骨髓系統均有一定的藥理作用1.淫羊藿苷具有抑制急性早幼粒白血病細胞端粒酶活性的作用。
2.淫羊藿甙具有抗腫瘤作用，已有實驗證實其對HL-60細胞具有明顯的增殖和分化誘導作用，能誘導腫瘤細胞凋亡。
3.淫羊藿苷能調節成骨細胞內ALP活性，促進成骨細胞增殖，增強成骨細胞活性。
4.淫羊藿甙具有免疫激活效應。通過恢復LAK細胞IL-2Rα表達，提高CD3AK細胞內穿孔素mRNA水平及促進CD3AK增殖，逆轉TGFβ2對LAK、CD3AK的免疫抑制作用。
5.淫羊藿苷能促進神經細胞的生長。
6.淫羊藿苷能抗缺氧再灌注從而改善肝臟功能。
7.淫羊藿苷通過抑制血管平滑肌細胞外鈣離子內流達到擴血管作用。
但目前尚未見有淫羊藿苷用于誘導胚胎干細胞定向分化的報道。
本發明的另一個目的是利用淫羊藿苷能誘導胚胎干細胞體外定向分化獲得的單一類型細胞，可用于干細胞移植心肌再生或細胞心肌重建術中的促細胞分化劑。
本發明的又一個目的是利用淫羊藿苷能誘導胚胎干細胞體外定向分化獲得的單一類型細胞，也可用于構建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進行藥物藥效初步篩選與評價。
本發明在細胞層面上對淫羊藿苷的藥效進行了嚴格論證，對其中蘊藏的大量生物學信息進行了初步探討，具體有以下優點1.本發明開拓了淫羊藿苷的新用途，即誘導胚胎干細胞定向分化為多種單一類型細胞(心肌細胞、神經細胞、內皮細胞等)。
2.羊藿苷可用作干細胞移植心肌再生(myocardial regeneration)或細胞心肌重建術(cellular cardiomyoplasty)中的促細胞分化劑。干細胞移植心肌再生目前正處于實驗研究階段(含臨床實驗研究)，預計促細胞分化劑淫羊藿苷的介入將有助于該領域的研究。
3.本發明一方面明確了具備藥理活性的成分淫羊藿苷，為中藥防治作用提供物質基礎，另一方面藥效機制的闡明為中藥現代化開發擁有自主知識產權的新藥提供借鑒。
具體實例方式本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。此外應理解，下面的優選具體實施方案僅僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
實施例1淫羊藿苷誘導胚胎干細胞(ES細胞)體外定向分化為心肌細胞的研究1.ES細胞的支持培養ES細胞D3細胞株(ES-D3細胞)在條件培養基(含DMEM培養基、胎牛血清)中，按2×107-5×107個/ml的密度接種于滋養層細胞(小鼠成纖維細胞或STO細胞株)上，按常規方法進行傳代培養。
2.淫羊藿苷誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的培養①ES-D3細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，按20-30μL接種于培養皿的蓋子內表面上，培養皿內加入10ml D-Hanks液，將蓋子翻轉形成懸滴，置培養箱中懸滴培養2天。此后將懸滴轉入盛有10ml ES細胞分化培養基(含DMEM培養基、胎牛血清)的培養皿中，進行ES細胞集落懸浮培養3天，形成ES細胞擬胚體。
②附著ES細胞的分化培養在顯微鏡下用吸管將擬胚體轉移到24孔板內，孵育4-5小時，使其吸附后，每孔中緩慢加入1ml ES分化培養基，加入中藥單體淫羊藿苷與ES細胞擬胚體共孵育。此時開始用倒置顯微鏡每天觀察細胞，以捕捉心肌細胞開始跳動的最初時間。
實施例2淫羊藿苷定向分化為心肌細胞在藥效評價方面的用途由實施例1獲得的擬胚體細胞團，若能有節律性地搏動，則以此作為定向分化成心肌細胞的指標，作出藥物淫羊藿苷對ES-D3細胞誘導分化的時效關系曲線和量效關系曲線(參見
圖1)，以此作為藥效評價的指標。也可以用于藥物開發和中藥活性成分的篩選。參見圖1，淫羊藿苷誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的作用很明顯，且具有很好的量效關系，其與ES-D3細胞共培養5-7天時，就有90％以上的細胞克隆出現節律性搏動，并有心臟胚芽纖維蛋白表達上調。圖1中，淫羊藿苷終濃度分別為-▲-0，-■-10-8，-◆-10-7mol·L-1。*P＜0.05，**P＜0.01***P＜0.001vs 0mol·L-1，每個濃度n＝400擬胚體，相同實驗重復做了6次。
利用胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)定向分化為心肌細胞的藥效篩選模型論證了淫羊藿苷對ES細胞定向分化為心肌細胞這一過程具有顯著的誘導作用。實驗中以ES細胞作為實驗測試載體，用培養基(含DMEM和胎牛血清)將ES細胞制成單細胞懸液，再懸滴培養形成擬胚體，擬胚體再進行貼壁培養；此時加入淫羊藿苷共培養(并用國際公認的誘導分化劑維甲酸A作為陽性對照藥，以未加藥組作為陰性對照組)，以擬胚體細胞團出現有節律性地搏動為定向分化成心肌細胞成功的指標。根據淫羊藿苷誘導擬胚體細胞團出現節律性地搏動，及該藥物誘導分化的時效關系和量效關系進行統計學分析，以此作為藥效評價指標。結果顯示淫羊藿苷可使ES細胞分化時間顯著提前(P＜0.05)，分化為心肌細胞率顯著提高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)(附圖1)。而且，實驗中淫羊藿苷組誘導的心肌細胞與對照組比較其跳動頻率和強度都有增加。淫羊藿苷對ES細胞分化為心肌細胞這一過程具有顯著的誘導分化作用，藥物淫羊藿苷有望成為一種以心臟為作用靶點的新型誘導分化劑。由于在淫羊藿苷誘導ES細胞定向分化為心肌細胞的過程中富含發育依賴性生物信息，能提供很多的靶點供藥效評價用，因此可將心肌發育依賴性特殊基因表達、心肌結構蛋白表達和離子通道形成等能夠反映心肌細胞功能的指標，借助膜片鉗、PCR、免疫組化等技術對淫羊藿苷的藥效進行深入評價，以論證淫羊藿苷對心肌細胞生長和功能改善的促進作用。
實施例3淫羊藿苷定向分化為心肌細胞在其他方面的用途利用淫羊藿苷誘導胚胎干細胞定向分化為心肌細胞，若能將其成功引入衰竭的心臟并與宿主細胞一起工作，則這條途徑能夠成為移植治療心功能不全的重要組織細胞來源；用這種方法可以培育大量心肌細胞克隆，提供組織工程學等其他方面研究。
實施例4淫羊藿苷誘導胚胎干細胞定向分化為神經細胞的研究淫羊藿苷對胚胎干細胞具有很強的誘導作用，并且對神經細胞有滋養保護作用。可選擇貼壁培養的方法，用淫羊藿苷誘導胚胎干細胞分化為神經細胞。
1.ES細胞的支持培養ES細胞D3細胞株(ES-D3細胞)在條件培養基(含DMEM培養基、胎牛血清)中，按2×107-5×107個/ml的密度接種于滋養層細胞(小鼠成纖維細胞或STO細胞株)上，按常規方法進行傳代培養。
2.淫羊藿苷誘導胚胎干細胞定向分化為神經細胞取處于對數生長期的ES-D3細胞，以0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代，按5×105細胞/ml接種于鋪過瓊脂的細菌培養皿中懸浮培養，培養液改為含15％胎牛血清、無巰基丙醇和LIF的DMEM培養液。2d后換液繼續培養兩天形成EB，到第5天，將EB打散，接種于粘附性組織培養瓶中培養，此時加入合適濃度淫羊藿苷(10-8-10-6mol/L)的培養液與ES-D3細胞共孵育，每2d換液1次，誘導其分化為神經細胞。
現已知的許多神經系統疾病如帕金森氏病是由于神經細胞死亡而成熟神經細胞無法分裂加以補充所引起的。如在淫羊藿苷作用下將胚胎干細胞誘導成為神經細胞，再將這些細胞移植入腦中，可以用于神經退行性疾病如帕金森氏以及其他中樞神經系統的細胞治療研究；也可以用于以神經細胞為作用靶點的藥物篩選和毒性評價，構建可靠的生物信息量大的藥效評價模型。
實施例5淫羊藿苷誘導胚胎干細胞定向分化為其他種類細胞的研究將淫羊藿苷以合適的濃度與胚胎干細胞共孵育，采用不同的培養方法可以將胚胎干細胞定向分化為其他類型細胞，如胰島細胞、血管內皮細胞等，均可用于構建藥物篩選模型和移植性治療研究。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
本發明涉及的部分參考文獻1、H.-R.Liang，P.Vuorela，H.Vuorela，R.Hiltunen Isolation and ImmunomodulatoryEffect of Flaconol Glycosides from Epimedium hunanense Planta Medica63(1997)316-319.2、Joseph MM，Linda CS，Elizabeth MR，et al.Embryonic stem cell cardiogenesisapplication for cardiovascular research.TCM，1997，7(2)63-68.3、Mi-Kyeong Lee，Young-Joo Choi，Sang-Hyun Sung et al.AntihepatotoxicActivity of Icariin，a Major Constituent of Epimedium Koreanum PlantaMed.61(1995)523-526.4、都同功，陳系古，劉蘭英，等.小鼠胚胎干細胞的培養.中國實驗動物學報，1999，7(1)1-4.5、娟娟，杜冠華.藥物篩選模型研究進展.基礎醫學與臨床，2001，21(4)302-304.6、郭曉霞，賀福初.胚胎干細胞的研究與利用.科學通報，2000，45(5)467-474.7、杜忠偉，叢笑倩.胚胎干細胞體外分化的研究進展.細胞生物學雜志，1998，20(3)102-106.8、薛慶善主編.《體外培養的原理與技術》.科學出版社.9、沈干，叢笑倩，劉曉音，汪錚，曹宜林.胚胎干細胞向神經細胞誘導分化的研究.國外醫學生物醫學工程分冊，2002，25(4)150-156.10、葛堅，郭彥，王智崇，劉海泉等，體外誘導胚胎干細胞定向分化為神經細胞的初步研究，解剖學報，2001，32(4)301-305.11、Minpei Kuroda，Yoshihiro Mimaki，Yutaka Sashida，Emiko Umegaki etal.Flavonol Glycosides from Epimedium sagittatum and Their Neurite OutgrowthActivity on PC12h Cells.Planta Med，2000，66575-577.
權利要求
1.一種淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途，其特征是用單體淫羊藿苷誘導胚胎干細胞在體外定向分化為多種單一類型細胞，該單一類型細胞可作為促細胞分化劑，也可用于構建高效率藥效篩選模型。
2.根據權利要求1所述的淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途，其特征是淫羊藿苷能誘導胚胎干細胞體外定向分化為多種單一類型細胞，包括心肌細胞、神經細胞、內皮細胞等。
3.根據權利要求1和2所述的淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途，其特征是作為促細胞分化劑，是用于干細胞移植心肌再生或細胞心肌重建術中。
4.根據權利要求1和2所述的淫羊藿苷在誘導胚胎干細胞體外定向分化方面的用途，其特征是利用構建的高效率藥效篩選模型，可進行藥物藥效初步篩選與評價。
全文摘要
本發明提供一種淫羊藿苷的新用途，是由淫羊藿苷誘導胚胎干細胞體外定向分化為單一類型細胞，可用于干細胞移植心肌再生或細胞心肌重建術中的促細胞分化劑；也可用于構建高效率藥效篩選模型，并利用該模型進行藥物藥效初步篩選與評價。本發明在細胞層面上對淫羊藿苷的藥效進行了嚴格論證，對其中蘊藏的大量生物學信息進行了初步探討。本發明一方面明確了具備藥理活性的成分淫羊藿苷，為中藥防治作用提供物質基礎，另一方面藥效機制的闡明為中藥現代化開發擁有自主知識產權的新藥提供借鑒。
文檔編號A61L27/00GK1425763SQ0216036
公開日2003年6月25日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者樓宜嘉, 王志強, 王丹雁 申請人:浙江大學