一種含有破骨細胞形成抑制因子及多糖的復合物的制作方法

專利名稱：一種含有破骨細胞形成抑制因子及多糖的復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有至少一種破骨細胞形成抑制因子(以下簡稱為OCIF)、其類似物或其變異體和至少一種多糖或其衍生物的復合物，本發明也涉及產生該復合物的方法、治療或預防骨代謝疾病且含有該活性成分復合物的藥物、及所述復合物在治療或預防骨代謝疾病中的用途。
發明的技術背景骨骼中約含有活體中的總鈣99％的量，所以不僅在支持身體時起重要作用而且是機體中最大的鈣儲存器官。骨骼在保持鈣的動態平衡中起重要的作用。眾所周知，在骨骼吸收中起重要作用的破骨細胞的活化將導致骨骼中的鈣過量流失到血液中，打破血液中的鈣的動態平衡，這樣就會誘導血鈣過多。骨吸收升高及破骨細胞活化產生的血鈣過多可能是癌擴散至骨中導致的不正常分泌的細胞因子所致[例如參見Jean-Jacques Body，Current and Future Directions InMedical TherapyHypercalcemia，CANCER Supplement，88(12)，3054-3058(2000)]。患有癌性血鈣過高的病人預后常常不好，因此非常希望有一種有效的治療手段治療該疾病。
在風濕病例如風濕性關節炎及其類似病癥或者骨關節炎中，破骨細胞不正常的形成或活化是患這些病癥的病人的骨及關節的各種癥狀的主要原因[例如，參見E.Romas，M.T.Gillespie and T，J，Martin，類風濕關節炎中骨破壞中NF-KB配體和α腫瘤壞死因子的受體激活因子的作用，《骨》，30(2)，340-346(2002)]。由于風濕病例如風濕性關節炎或骨關節炎所導致的關節及骨疼痛非常強烈，嚴重影響患有這些疾病的病人的生活質量。因此，高度期望發現一種治療這些疾病的方法。
破骨細胞已知在骨質疏松癥中也起到一定作用。因為更年期后女性激素分泌的減少或者老化，由破骨細胞輔助的骨吸收及成骨細胞輔助的骨形成之間的平衡逐漸向骨吸收傾斜，其結果是骨密度降低，如果骨密度降低非常嚴重就會導致骨質疏松。當具有高骨質疏松風險的老年患者經歷一次骨折，他們臥床不起的可能性是非常高的，由于全球人口的不斷老齡化，這已成為一個社會問題。[例如，參見Brumo Fautrel和Francis Guillemin，類風濕疾病研究的代價，Current Opinion in Rheumatology，14，121-126(2002)]。因此尋求一種可有效治療和預防骨質疏松癥的方法變得極為迫切。
治療這些疾病的傳統的方法包括補充激素例如雌激素及使用藥劑例如二膦酸鹽或降鈣素來抑制破骨細胞的活性[例如，參見Mohammad M.Iqbal和Tanveer Sobhan，OsteoporosisA Review，Missouri Medicine，99(1)，19-23(2002)]。然而，激素也有不希望有的副作用例如腫瘤形成的高風險性、誘導子宮內膜異位的發生及生殖器的非正常出血[例如，參見Joyce Penrose White和Judith S.Schilling，絕經后的激素替代歷史前景和現代影響，對護理工作者有臨床優勢，4(5)，277-285(2000)]。盡管已知二膦酸鹽很容易結合血液中的鈣且在骨中積累，一些研究者懷疑由此會將骨強度提高到何種程度。另外，同樣也有報道與其使用相關的腎功能損壞的危險性[例如，參見Jonathan R.Green，Yves Seltenmeyer，Knut A.Jaeggi和Leo Wildler，新的有潛力的雙膦酸鹽在兩個短期大鼠模型中的腎忍受性方案，《藥理和毒理》80，225-230(1997)]。至于降鈣素，不幸的是使用其所獲得的骨密度的增加只是短暫的。同樣也有報道中止降鈣素的使用會導致所治療癥狀的回復，而且是來自動物而不是人的降鈣素其有效性在長期治療后會降低，因為在人體中出現抗降鈣素的循環抗體[S.L.Porcel，J.A.Cumplido，B.Dela Hoz，M Cuevas和E.Losada，對降鈣素的敏感性，Allergologia et Immunopathologia，28(4)，243-245(2000)]。
如上所述，破骨細胞在輔助骨吸收中起主要作用，而骨吸收是在血液中控制鈣濃度提升的關鍵因子。然而，確信上面所提到的任一種已知藥劑無一具有抑制破骨細胞形成的活性。結果是這些傳統藥劑無一適宜于骨代謝疾病的基礎治療，因為其僅能夠治標而不治本。
最近，OCIF已被證明是一種內源蛋白，它可以抑制破骨細胞祖細胞分化為一種破骨細胞或者/和成熟破骨細胞的骨吸收活性(參見WO-A-96/26217及EP-A-0816380)。OCIF也稱為Osteoprotegerin(參見WO-A-97/23614)。考慮到上述骨代謝疾病例如血鈣過多，骨質疏松癥及風濕性關節炎都至少在某種程度上起因于骨吸收，希望通過使用OCIF(因為其可以抑制破骨細胞自身的形成和/或抑制成熟破骨細胞骨吸收活性的能力)對上述疾病進行成功治療。然而，OCIF是一種堿性蛋白，其等電點大約在9左右，且其在給藥后在血液中流失的很快。因此解決該問題的一種辦法在WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中已有報道，其中通過共給藥多糖例如肝素或硫酸右旋糖酐使OCIF在血液中滯留的時間(因此也使OCIF的效果)延長至一定程度。然而結果達到滯留時間的延長可能不足以使OCIF在血流中長期滯留從而使其成為用于治療骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質疏松及關節炎的真正的候選藥劑，因此，需要OCIF在給藥后滯留在血流中的時間延長的更好方法。
發明簡述因此本發明的目的是提供一種包含有OCIF的制劑，該制劑能使OCIF在給藥后保留在血流中的時間延長，因此提供一種藥劑，其中OCIF在治療和預防由破骨細胞介導的骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質疏松癥及關節炎等中的效果增強并延長。
本發明的其他的目的及優點將會在隨后的說明書中表明。
因此，本發明提供了一種復合物，其包含至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質，該物質結合于至少一種選自多糖及其衍生物的物質。
本發明也提供了一種延長OCIF或其類似物或其變異體在給藥患者后在血流中滯留的時間的方法，該方法將至少一種所述的OCIF、其類似物或其變異體與至少一種多糖或其變異體復合。
本發明也提供了一種藥物組合物，它含有有效劑量的藥物活性成分及一種載體或稀釋劑，其中所述的藥物活性成分是一種復合物，該復合物含有至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質，該物質結合有至少一種選自多糖及其衍生物的物質。尤其是本發明提供了這樣一種藥物組合物，其可以治療或預防骨代謝疾病。
本發明也提供了一種治療或預防患者的骨代謝疾病的方法，該方法包括給予所述患者有效劑量的復合物，該復合物含有至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質，該物質結合有至少一種選自多糖及其衍生物的物質。
本發明也提供了一種復合物在制造治療或預防骨代謝疾病的藥劑中的用途，所述復合物含有至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質，該物質結合至少一種選自多糖及其衍生物的物質。
發明詳述我們已經發現在一定條件下溫育至少一種選自OCIF、其類似物和變異體的物質和至少一種選自多糖及其衍生物的物質，結果形成一種復合物，其中所述一種或多種選自OCIF、其類似物及變異體的物質結合所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質，因此產生了一種試劑，其中所述OCIF或其類似物或變異體在治療和預防由破骨細胞介導的骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質疏松及關節炎等中的療效增強且延長。這主要歸功于這樣的事實與WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中公開的OCIF及多糖的已知技術組合相比，OCIF或其類似物或變異體給藥后在血流中滯留的時間延長了。
如上所述，本發明的復合物包含至少一種選自OCIF、其類似物及變異體的物質，該物質結合至少一種選自多糖及其衍生物的物質。在所述的復合物中，OCIF及多糖相互之間通過一個化學鍵例如共價鍵(例如形成席夫堿)、離子鍵、配位鍵或非化學鍵例如疏水性相互作用、氫鍵、靜電相互作用或親和力進行結合。
本發明所用到的OCIF、其類似物或變異體可以是天然型也可以是重組型，且其起源并不特別限制。天然型的OCIF意指從獲自人或非人動物的器官、體液、細胞培養物、或培養基中抽提、純化和/或分離而作為天然產生的蛋白獲取的OCIF。重組型的OCIF、其類似物或變異體是一種通過從通常用于這類技術中的寄主例如已經使用含有編碼OCIF、其類似物或變異體的多聚核苷酸的載體進行轉化的原核寄主細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如人或非人細胞系)中抽提、純化和/或分離所述蛋白得到的重組蛋白[例如，參見公開于EP-A-0816380(WO-A-9626217)及WO-A-97/23614的重組技術]。
本發明所用到的OCIF、其類似物及其變異體的起源并不特別限制，可以來自人或非人動物。優選是其可以來自哺乳動物例如人、大鼠、小鼠、兔子、狗、貓、牛、豬、綿羊或山羊或鳥類例如禽、鵝、雞或火雞，更為優選的是其來自哺乳動物，最為優選的是其來自人。
本發明所用到的OCIF或其類似物可以是單體類型的OCIF(例如，在人體中在非還原條件下的SDS-PAGE測量的單體的分子量大約為60000)或者二聚體類型(例如，在人體中在非還原條件下SDS-PAGE測量的分子量大約為120000)[參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]。
眾所周知OCIF在細胞中是以一種在氨基末端具有一個信號肽的多肽形式翻譯的，然后通過涉及到移去所述信號肽的加工步驟而成熟[例如，參見公開于EP-A-0816380(WO-A-96/26217)及WO-A-97/23614的重組方法]。本發明所用到的OCIF、其類似物或其變異體同時包括具有信號肽的多肽及其成熟形式。優選的實施例包括具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21至+380的含有信號肽的OCIF及具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1至+380的不含信號肽的成熟的OCIF。在所有這些中，成熟OCIF尤其推薦。
眾所周知，當在寄主細胞中尤其是當在一種原核寄主細胞例如大腸桿菌中作為重組蛋白表達時，甲硫氨酸可以被加到這種成熟形式的OCIF、其類似物或變異體中。這可以通過加入核苷酸三聯密碼ATG(AUG)至編碼OCIF、其類似物或變異體的成熟形式的多聚核苷酸的5’末端，然后將所得到的多聚核苷酸插入到合適的表達載體中而獲得。這樣便可以由被所述重組表達載體轉化的合適宿主細胞表達在氨基末端具有甲硫氨酸的所需成熟蛋白。此外，一個或多個氨基酸可以被加入到所述蛋白的氨基末端甲硫氨酸的下一位置，其通過在加到編碼OCIF、其類似物或其變異體的成熟形式的多聚核苷酸的5’端的ATG三聯密碼的下一位置增加額外的核苷酸三聯密碼而完成。
在本發明中，OCIF類似物意指為一個天然存在于人體或上所列舉的非人動物細胞、體液、和/或器官中的多聚核苷酸所編碼的蛋白質。這樣的類似物的具體的優選實施例包括OCIF2、OCIF3、OCIF4及OCIF5[參見EP-A-0816380(WO96/26217)]。這樣的OCIF類似物或其活性片段可以通過下述方法獲得從一個人體或非人動物的體液、組織、器官或細胞中抽提出RNA；使用反轉錄酶合成與所述RNA互補的cDNA的第一條鏈，然后以第一條鏈作為模板使用DNA聚合酶合成所述cDNA的第二條鏈；如此獲得的雙鏈cDNA插入進一個適當的、常規使用的表達載體；然后將該表達載體轉化進入一個適當的常規使用的寄主細胞；然后使用雜交技術例如使用OCIF cDNA或其片段作為探針在嚴格條件下進行噬斑雜交或噬菌體雜交，篩選產生目的多肽的寄主(參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217))]；最后經過常規的技術由如此獲得的寄主細胞表達需要的OCIF類似物。
在本發明中，OCIF變異體意指一個蛋白，其具有一個氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基已被替代、刪除、加入或插入一個OCIF或其類似物的氨基酸序列，但依然具有至少部分OCIF活性。這樣的OCIF變異體例如，可以通過下述方法獲得使用聚合酶鏈式反應法(以下簡稱PCR)、基因重組法或使用核酸內切酶或核酸外切酶例如限制性酶的核酸酶消化法，在一個編碼OCIF或其類似物的核苷酸序列中替代、刪除、增加和/或插入一個核苷酸或多個核苷酸；利用已經插入了得到的編碼目的OCIF變異體的核苷酸的表達載體轉化一個真核寄主細胞例如一個動物細胞或一個原核寄主細胞例如大腸桿菌；然后按照本領域技術人員所普遍已知的技術從所述的轉化寄主的細胞培養物產生的包含蛋白部分中抽提、純化和/或分離需要的多肽。
已知氨基酸序列的相當一部分片段已經從OCIF多肽的羧基末端刪除的OCIF的截短形式，也保留了至少部分OCIF活性[例如，參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614]。這些截短的保留了完整OCIF多肽的至少部分活性的OCIF，同樣包括在本發明的OCIF變異體中。
更進一步，OCIF或其截短形式與一個免疫球蛋白區域例如Fc區域融合體也是已知的(例如，一個融合多肽，其中人類IgG的Fc區域附著于OCIF的羧基末端)，其至少具有部分完整OCIF多肽的活性(參見WO-A-97/26314)，這樣的融合蛋白同樣包括在本發明的OCIF變異體中。
同樣也可以看到，OCIF或其類似物或其變異體可被化學修飾且依然保持有效的活性，且在某些情況下，還可以表現出一些優勢，例如穩定性的增加或免疫原性的減少。這些化學修飾可以包括在OCIF或其類似物或其變異體分子的一個單一位點或多個位點衍生化。例如，已經顯示OCIF及其變異體(衍生物)，例如截短的形式，可以使用一個或多個水溶性聚合物例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚體、羧甲基纖維素及聚乙烯醇進行化學修飾，其結果表現出生物學活性提高(例如，參見WO-A-9726314)。這些OCIF或其類似物或其變異體的化學修飾類型同樣包括在本發明的OCIF變異體中。
已知的適宜于制備本發明的復合物的OCIF衍生物的例子包括OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1，OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIF-CC、OCIF-CDD2、OCIF-CDD1、OCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCOIF-CBsp、OCIF-CPst[參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]、muOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-180]-Fc、muOPG[22-401]、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C277、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-185]、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-212]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-Fc P26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、huOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支鏈PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k pEG二聚體、huOPG met[22-194]P25A二硫鍵交聯(WO-A-97/23614)、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194](WO-A-2001/17543)、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194(WO-A-2001/18203)。
在這些中，優選的實施例包括OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1、OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIOCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCIF-CBsp、OCIF-CPst、MuOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-FcP26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、uOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPGmet[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支鏈PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k PEG二聚體、huOPG met[22-194]P25A二硫鍵交聯、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194]、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194。
本發明所述的OCIF或其類似物或其變異體可能包含一個糖鏈作為分子的一部分。任一天然產生的OCIF或其類似物，或重組OCIF或其類似物或變異體，都可以包含一個糖鏈，其在翻譯后粘附于OCIF或其類似物或其變異體。包含有一個糖鏈的天然產生的OCIF或其類似物可通過傳統技術從獲自人或非人動物的細胞培養物、組織、器官、體液或細胞系得到。正如上述或舉例所述，含有一個糖鏈的重組OCIF或其類似物或變異體可以從使用一個含有編碼任一OCIF或其類似物或變異體的核苷酸序列的載體轉化的真核寄主細胞的培養物中得到。可以用到的適宜寄主細胞能夠翻譯后修飾OCIF或其類似物或變異體以至于粘附在糖鏈上，這樣的寄主的例子包括CHO細胞及COS細胞[Yasuda，H.等人，Endocrinology，139，1329-1337(1998)]。含有這樣一個糖鏈的OCIF或其類似物或變異體適用于形成本發明所述的復合物。
在另一方面，如果希望產生的重組OCIF或其類似物或變異體不含有翻譯后修飾所加入的糖鏈，那么優選的寄主細胞是原核細胞例如大腸桿菌。
形成本發明復合物所用的多糖是一個多聚體(聚糖)，其由兩個或多個單糖的糖苷鍵合產生，優選地是一個至少含有兩種不同類型單糖的雜多糖。任一多糖，不管是天然產生的或人工合成的都可用于本發明所述的復合物。
在本發明中，多糖的衍生物指的是這樣一種多糖至少一部分所述多糖分子為一個或多個非糖分子和/或殘基所取代。優選的衍生物包括多糖的酸酯尤其是多糖的硫酸酯。
適用于生產本發明所述復合物的天然多糖的例子包括透明質酸、硫酸軟骨素、酸性皮膚素、酸性乙酰肝素、酸性角質素、角叉膠、果膠及肝素。適用于生產本發明所述復合物的合成多糖的例子包括右旋糖酐，而適宜的合成多糖衍生物的例子包括硫酸右旋糖酐。在多糖及其衍生物中，最為適用于生產本發明所述復合物的是硫酸右旋糖酐。
在本發明中，多糖或其衍生物例如硫酸右旋糖酐包括其鹽。最適宜的硫酸右旋糖酐鹽是其鈉鹽。硫酸右旋糖酐鈉鹽的例子包括硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5(以下簡稱DS5為Meito Sangyo公司所生產)，和硫酸右旋糖酐鈉鹽5000及硫酸右旋糖酐鈉鹽10000(其均為Wako Pure化學公司所生產)。
硫酸右旋糖酐的分子量如下進行測定1)右旋糖酐分子量的測定右旋糖酐的分子量可以按照下述的Sato’s公式進行計算[例如，參見日本藥學手冊，第13修正版，為Hirokawashoten所出版(1998)，有關右旋糖酐40的內容]，其基于所述右旋糖酐極限粘度的測量。
極限粘度＝9.00×10-4×分子量0.502)硫含量的測量相關的硫酸右旋糖酐的硫含量可以通過本領域已知技術以重量百分比進行測量，例如在日本藥物手冊[第14版，Jihou出版(2001)]中有關硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5的內容中所述的方法。
盡管構成右旋糖酐單元的葡萄糖的分子量為180，右旋糖酐分子中的葡萄糖單元的實際分子量為162，該值是通過從180中減去水的分子量而得到的，因為在右旋糖酐分子中鄰近的葡萄糖單元相互之間通過α-1，6糖苷鍵連接。一個氫原子為硫酸鈉基團(SO3Na一克當量為103)所取代，在硫酸右旋糖酐的每一葡萄糖單元中其以這種方式取代。利用該信息，硫酸右旋糖酐分子的取代程度(以下簡稱取代度)可以依下述公式確定硫含量(重量百分比)＝[32×取代度/(162+102×取代度)]×1003)硫酸右旋糖酐分子量的計算如上所述，因為右旋糖酐鏈中葡萄糖單元的實際分子量為162，所以硫酸右旋糖酐的分子量可以使用下式公式從這一數據和2)中所確定的取代度計算硫酸右旋糖酐分子量＝右旋糖酐分子量×(162+102×取代度)/162已知多糖表現出分子量的分布，例如每一不同類型的硫酸右旋糖酐表現出一確定的分子量分布。形成本發明所述復合物所用到的多糖的分子量是以平均分子量的形式給出的。本發明所用到的多糖的平均分子量并不以任何形式限制，本發明的最適宜的多糖衍生物即硫酸右旋糖酐的平均分子量的范圍，一般為1500～12000，且最好是1800～6000。DS5的分子量(平均±標準方差)大約為1950±70(n＝7)。DS5的硫取代度(平均±標準方差)，如上計算，大約為0.32±0.01(n＝7)。硫酸右旋糖酐鈉鹽5000及硫酸右旋糖酐鈉鹽10000的平均分子量分別大約為5000及10000。在形成本發明所述復合物中所用到的多糖可以或不在使用前純化和/或分級分離。在本發明中，多糖或其衍生物不包括粘附在重組OCIF或其類似物或變異體或翻譯后和/或內源地于人或非人動物細胞或組織或機體中天然產生的OCIF或其類似物或變異體上的任何糖鏈。
在本發明所述的復合物中，選自OCIF、其類似物及其變異體的物質與選自多糖或其衍生物的物質的分子比例將根據各種因素有所變化，包括所述復合物中各種成分的特征和該復合物制備的條件。在本發明所述的復合物中，選自OCIF、其類似物及其變異體的物質與選自多糖及其衍生物的物質的分子比例并沒有特別限制。在本發明優選的復合物中，包括選自OCIF、其類似物及其變異體的物質及硫酸右旋糖酐，其中所述選自OCIF、其類似物及其變異體的物質硫酸右旋糖酐的分子比例是從1∶1至1∶10，更為優選的分子比例為1∶1至1∶8，更為優選的分子比例為1∶1至1∶5，最為優選的分子比例為1∶1.1至1∶4.5。
正如上面已經提到的那樣，OCIF或其類似物或變異體可以以單體或二聚體的形式存在，這樣本發明所述復合物中所含的OCIF或其類似物或變異體可以是均二聚體或雜二聚體，或其可以是均低聚體、雜低聚體、均聚合物或含有兩個以上的OCIF或其類似物或其變異體的單體單元的雜聚合物(例如，參見US6369027)。按照本發明在含有OCIF、其類似物或變異體及多糖或其衍生物的復合物中，選自OCIF、其類似物或其變異體的物質與選自多糖及其衍生物的物質的分子比例計算為每單體單元的OCIF、其類似物或其變異體的多糖或其衍生物的分子的數量。
本發明復合物中多糖或其衍生物的分子的數量優選可以如下進行確定所測試的復合物[指定為(X)]及僅含有未復合的游離OCIF或其類似物或變異體的參考樣品[指定為(Y)]中中性糖含量使用苯酚硫酸方法進行定量(在本申請其他部分進行詳細描述)。然后所測試的復合物中結合至OCIF或其衍生物或變異體中的多糖或其衍生物的數量通過從(X)中減去(Y)而確定。使用這樣得到的數據，結合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的分子數量按照下述(I)或(II)進行計算(I)結合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的數量除以所述多糖或其衍生物的平均分子量。結果的數據代表了在測試復合物中多糖或衍生物的總的分子數目。
(II)結合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的數量除以在所述復合物中所述的OCIF或其類似物或變異體的數量(mg)。得到的數據是在所述復合體中每1mg OCIF或其類似物或變異體中的多糖或其衍生物的數量，該數據再用于以所述多糖或其衍生物的平均分子量及所述OCIF或其類似物或變異體的分子量為基礎計算每一分子OCIF或其類似物或變異體中的多糖或其衍生物中的分子數目[例如參照下述實施例4(d)]。
本發明復合物中OCIF或其類似物或變異體的分子數量優選可以使用免疫測試技術例如本申請其他部分所述的技術來確定。
本發明所述的復合物的一個可以用于鑒定它們的優選特征是其對肝素的親和力。肝素是含有D-葡萄糖胺、D-葡萄糖醛酸及D-艾杜糖醛酸的多糖，其部分或全部被乙酰基或硫酸基衍生化。本發明的復合物的一個優選特征是所述OCIF或其類似物或變異體的復合物對肝素的吸附強度低于游離的未復合的OCIF或其類似物或變異體的吸附強度。吸附程度可以用裝填有已固定了肝素(例如獲自牛腸粘膜的肝素)的高度交聯的瓊脂糖珠的柱子來進行確定。適宜的這類柱子包括Hitrap肝素HP柱子、Hiprep16/10肝素及肝素瓊脂糖凝膠(均獲自Amersham Pharmacia)。復合物的吸附強度(親和性)可以按照本領域技術人員所普遍已知的用于確定蛋白與多糖的親和性的任何適當技術確定。優選的是，吸附程度可以通過比較在低離子強度下結合至肝素柱但是在高離子強度下從所述柱中洗脫的復合物的數量與在低離子強度下并不結合于肝素柱的復合物的數量(離子強度可以使用強酸鹽例如氯化鈉進行調節)來確定。這樣，一般來說，復合物對肝素的吸附程度可以通過下述方法確定(a)載有已經固定了肝素的支持物如交聯的瓊脂糖小珠的柱用相對低離子強度的緩沖液平衡(例如使用含有0.1-0.8M氯化鈉的磷酸鈉緩沖液)。
(b)將進行測試的本發明的復合物溶于(a)中使用的相同的低離子強度緩沖液中，并加到柱中，收集首次洗出液(A部分)。
(c)然后使用使用于步驟(a)的相同的低離子強度緩沖液進一步洗滌柱子并收集第二次洗出液(B部分)。
(d)然后使用具有相對高離子強度的緩沖液(例如，含有1.0-2.0M氯化鈉的磷酸鈉緩沖液)洗滌柱子，收集第三次洗出液(C部分)。
(e)然后確定A、B、C各部分中所含的復合物的數量[分別指定為(a)、(b)、(c)](例如通過免疫測定法)。
(f)復合物對肝素的吸附程度按照下列公式確定(g)吸附程度＝(c)/(a)+(b)+(c)復合物與柱子的結合力越大，(c)值就越高(正如其僅能使用具有相對高離子強度的洗脫液從柱子中移去)，因而吸附程度也越高，使用上述公式計算的本發明復合物的吸附程度可因肝素柱的類型及進行測定的條件而在一定程度范圍變化。然而，游離的未復合的OCIF的吸附程度總是大約為1.0，而本發明的OCIF復合物的吸附程度低于1.0，這樣就證明了含有本發明所述的OCIF或其類似物或變異體的復合物與肝素結合的強度要弱于游離的未復合的OCIF或其類似物或變異體的結合強度(例如，使用豬肝素固定在瓊脂糖小珠上，例如一個HiTrap肝素HP柱，使用含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液進行首次及第二次洗脫，使用含有2.0M氯化鈉的10mM磷酸納緩沖液進行第三次洗脫，含有OCIF或其類似物或變異體的本發明復合物的吸附強度并不高于0.7，最好不高于0.6，尤其是不要高于0.5)。
可用于鑒定本發明復合物的另一個優選特征是使用免疫測試技術(例如ELSLA)測量的所述復合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數目與使用測量所述復合物中蛋白總量的技術[例如，Lowry’s方法Lowry，O.H.等人，生物化學雜志193，265-275(1951)；吸光值(λ280nm)銀染色或BCA方法]測量的所述復合物中OCIF或其類似物或變異體的分子數目的比例。
測量在所述復合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數目可以利用免疫測試技術，例如ELISA來確定，用于與固定相結合的抗體及用報道酶例如ELISA中的過氧化酶標記的抗體可以是針對相關OCIF或其類似物或變異體的任何適用于此目的的抗體，例如適宜于與固相結合的抗體包括自可產生抗體OI-26的雜交瘤培養物(FERM BP-6421)純化的OI-26及純化自可產生抗體OI-19的雜交瘤培養物(FERM BP-6420)的OI-19，而在流動相中適宜于用作用報道酶標記的抗體包括用過氧化酶標記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4，它純化自可產生抗體OI-4的雜交瘤培養物(FERM BP-6419)。測量復合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數目的一個典型的程序如下(a)用游離的未復合的OCIF的已知濃度制作校準曲線；(b)在相關復合物上進行ELISA且用校準曲線確定OCIF的濃度；(c)使用(b)中所獲得的信息及OCIF單體的分子量計算所測試復合物中OCIF的分子數目。
所述復合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數目可以使用測量所述復合物中蛋白總量的技術來測定，這一數目也可以例如用Lowry方法進行測量，一個典型的程序如下(a)用牛血清白蛋白的已知濃度制作校準曲線；(b)用Lowry方法確定所測試復合物中的總蛋白濃度，使用校準曲線確定OCIF的濃度；(c)使用(b)中所獲得的信息及OCIF單體的分子量計算所測試復合物中OCIF的分子數目。
實際的比例可按照所使用的免疫測試技術的類型和/或用于測量總蛋白的技術而變化。本發明的一個優選實施方案包括一個人源OCIF或其類似物或變異體與硫酸右旋糖酐的復合物，其中，利用從產生抗體OI-19的雜交瘤(FERMBP-6420)的培養物中純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-19作為結合于固相的抗體和用流動相中的過氧化物酶標記從產生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養物中純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-4進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確定的所述復合物中存在的OCIF或其類似物或變異體的分子的數目與利用Lowry方法測量總蛋白質含量測定的所述復合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數目的比例至少是0.5，但不大于1.2。更為優選的是該比例至少為0.6，但不大于1.1，最為優選的是該比例至少為0.7，但不大于1.1。
優選的本發明的復合物包括(a)一種復合物，其中所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質為人類單體OCIF，其在非還原條件下用SDA-PAGE測量的分子量大約為60000；或人類二聚體OCIF，其在非還原條件下用SDS-PAGE測量的分子量大約為120000，所述多糖及其衍生物選自透明質酸、硫酸軟骨素、酸性皮膚素、酸性乙酰肝素、酸性角質酸、角叉藻聚糖、果膠、肝素、右旋糖酐及其衍生物，所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質與所述選自多糖及其衍生物的物質的分子比例是1∶1至1∶10；(b)一種復合物，其中所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質為人類單體OCIF，其在非還原條件用SDA-PAGE測量的分子量大約為60000；或為人類二聚體OCIF，其在非還原條件下用SDS-PAGE測量的分子量大約為120000，所述多糖和其衍生物選自硫酸右旋糖酐及其鹽，所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質與所述選自多糖及其衍生物的物質的分子比例是1∶1至1∶10；(c)一種復合物，其中所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質為人類單體或二聚體OCIF，其中所述單體或所述OCIF二聚體的一個單元含有序列表的SEQ.ID.NO.1的+1～+380氨基酸，所述多糖衍生物是一具有平均分子量從1500-12000的硫酸右旋糖酐鈉鹽，所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1～1∶10；(d)如(c)所述復合物，其中所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1～1∶8；(e)如(c)所述復合物，其中所述選自OCIF或其類似物或變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1～1∶5；(f)如(c)～(e)之一所述復合物，其中所述多糖衍生物是一個具有平均分子量從1800至6000的硫酸右旋糖酐的鈉鹽。
本發明所述復合物可使用有利于多糖或其衍生物與OCIF或其類似物或變異體結合的任何合適的方法進行制備。在本發明更進一步的實施方案中，提供了一種復合物的制備方法，所述復合物含有至少一種選自OCIF或其類似物或變異體的物質，所述物質與至少一種選自多糖及其衍生物的物質結合，所述方法包括如下步驟在有利于在所述OCIF或其類似物或變異體與所述多糖或其衍生物之間形成復合物的條件下，溫育所述至少一種選自OCIF或其類似物或變異體的物質及所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質，然后除去沒有結合至所述OCIF或其類似物或變異體的游離的多糖或其衍生物。
溫育所述至少一種選自OCIF或其類似物或變異體的物質及所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質是在適宜的條件下進行的，但典型的溫育條件是在水環境下進行的。優選溫育在堿性條件下進行，更為優選的是溫育在pH從9.5至12的條件下進行，最為優選的是溫育在pH從10至11的條件下進行。
在溫育過程中，水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的濃度范圍并不特別限制，只要其適宜于形成所述的復合物。一般來說，水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的最大濃度是從0.1至0.5mM，最小濃度是從0.001至0.05mM，優選地，水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的濃度為從0.01至0.2mM，最為優選的是0.05至0.1mM。以OCIF為例，水溶液中的最大濃度是從10至50mg/ml，最小濃度是從0.1至5mg/ml，優選的是，水溶液中的OCIF濃度為從1至20mg/ml，更為優選的是從5至10mg/ml。
在溫育過程中，水溶液中的所述多糖或衍生物的濃度范圍并不特別限制，只要其適宜于形成所述的復合物。一般來說，水溶液中所述多糖或衍生物的最大濃度是從0.1至0.5M，最小濃度是從0.00005至0.05M。優選的是，水溶液中所述多糖或衍生物的濃度是從0.005至0.25M，更為優選的是0.05至0.1M。以硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5為例，水溶液中所述多糖或衍生物的最大濃度是從200至1000mg/ml，最小濃度是從0.1至100mg/ml。優選地，水溶液中所述多糖或其衍生物的濃度為從10至500mg/ml，最優選地100至200mg/ml。
在溫育過程中，只要適宜于形成所述的復合物，溫度并不特別限制。一般來說，溫育的上限溫度是10-50℃，下限是0-4℃，優選溫度范圍是4-37℃，最為優選地4-10℃。
如上所述，本發明的復合物并不包括未與OCIF或其類似物或變異體結合的游離多糖或其衍生物。用于除去游離多糖或其衍生物的方法并不特別限制，只要其為實驗中常規使用的方法例如純化、分離和/或分級分離。適宜的方法的例子包括離子交換色譜、吸附色譜、分配層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、結晶、鹽析及超過濾。在所有這些中，凝膠過濾層析(下文中稱為“凝膠過濾”)及超過濾是優選的，凝膠過濾最為優選。
只要能夠用于從含有目的復合物的部分中分離出不結合至OCIF上的游離多糖或衍生物，用于溫育后從預期復合物中除去游離多糖或其衍生物的凝膠過濾中使用的凝膠并不特別限制，適宜的實例有瓊脂糖凝膠、右旋糖酐凝膠及聚丙烯酰胺凝膠。
本發明的復合物含有至少一種選自OCIF或其類似物或變異體的物質，其結合至少一種選自多糖及其衍生物的物質，該復合物可以使用不同的方法，包括等電點、糖含量及免疫檢測等將其與游離的未復合的OCIF或其類似物或變異體本身區別開來。
等電點可以使用本領域技術人員公知的任何傳統的等電電泳法來進行測量，OCIF為堿性蛋白，其等電點大約為pI9。這明顯高于本發明所述的含有OCIF及多糖及其衍生物例如硫酸右旋糖酐的復合物，該復合物典型的pI值一般在5-7這個區域，因此使用該技術是易于區別未復合的OCIF和復合的OCIF的。
本發明所述復合物和游離非復合OCIF或其類似物或變異體的糖含量可以使用傳統的測量中性糖含量的任何方法進行測量，其典型實例包括苯酚硫酸法[MDubois等人，化學分析，28，350(1956)]。由于含有OCIF或其類似物或變異體及多糖或衍生物的本發明復合物的總的糖含量大于OCIF本身，因而其可以相互區別。
將本發明所述的含有結合有多糖及其衍生物的OCIF或其類似物或變異體的復合物與游離的未復合的OCIF或其類似物或變異體區別的另一種方法是使用可特異性結合至所述多糖或衍生物的抗體定量每一種中的多糖或其衍生物。
為了測量OCIF或其類似物或變異體中或本發明所述的含有OCIF或其類似物或變異體和多糖及其衍生物的復合物中的蛋白數量，用于測量總蛋白含量的任何傳統方法都可以利用。適宜的例子包括Lowry方法[Lowry，O.H.等人，生物化學雜志193，265-275(1951)]、光吸收(λ280nm)銀染色及BCA方法。
游離的未復合的OCIF或其類似物或變異體或本發明所述的復合物中的OCIF或其類似物或變異體可以使用至少一種抗OCIF的單克隆抗體的免疫學方法進行測量。優選用于免疫學測量人類OCIF的適宜的抗OCIF單克隆抗體包括由雜交瘤OI-19(FERM BP-6420)產生的抗體、由雜交瘤OI-4(FERM BP-6419)產生的抗體、由雜交瘤OI-26(FERM BP-6421)產生的抗體(參見WO-A-99/15691)，這些抗體在本發明中分別被稱為“抗體OI-19”、“抗體OI-4”和“抗體OI-26”。抗體OI-19及抗體OI-4都以相同的親和力結合OCIF單體及二聚體，而抗體OI-26特異性結合OCIF二聚體。按照本領域普通技術人員的任一已知技術可以使用該種類型抗體進行免疫學測量(例如，參見WO-A-99/15691)，適宜的方法包括酶免疫試驗(稱為EIA)、放射性免疫試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及夾層EIA。在所有這些中，ELISA是優選的。OCIF如果是人源的，使用抗體OI-19或抗體OI-26作為固定抗體而抗體OI-14作為酶標抗體可以優選地進行ELISA。用于標記抗體的優選的酶是過氧化物酶(稱為POD)。
產生抗體OI-4的雜交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-4”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工業科學和技術部，人生物科學和人技術國家研究院(其已成為國際專利生物保藏中心，國立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并給予保藏號FERMP-16473，它已于1998年(平成-10)7月13日轉為國際保藏，保藏號為FERMBP-6419。
產生抗體OI-19的雜交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-19”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工業科學和技術部，國立生物科學和人技術研究院(其已成為國際專利生物保藏中心，國立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)并給予保藏號FERM BP-16474。它已于1998年(平成-10)7月13日轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-6420。
產生抗體OI-26的雜交瘤于1997年(平成-9)10月6日以“OI-26”保藏在1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本的工業科學和技術部，國立生物科學和人技術研究院(其已成為國際專利生物保藏中心，國立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukubashi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)并給予保藏號FERM P-16475。它已于1998年(平成-10)7月13日轉為國際保藏，保藏號為FERMBP-6421(參見WO-A-99/15691)。
本發明所述的含有OCIF或其類似物或變異體和多糖及其衍生物的復合物的血液或血清濃度可以如下進行測量；首先，將所述復合物對人或非人動物給藥，然后，經過一段時間，從中移出血清或血液，所述復合物的血液或血清濃度使用ELISA，利用至少一種如本申請其他部分所述的抗OCIF單克隆抗體進行測量(參見WO-A-99/15691)。
含有至少一種結合至至少一種選自多糖及其衍生物的物質的選自OCIF或其類似物或變異體的物質的本發明的復合物，對于治療或預防骨代謝疾病是非常有用的。在本發明中，骨代謝疾病可以是下述特征的疾病患者中骨的凈數量減少，且治療或預防所述疾病需要抑制骨的吸收和/或骨吸收的速率。可使用本發明所述復合物治療或預防的骨代謝疾病包括原發性骨質疏松癥(老年骨質疏松癥、絕經后骨質疏松癥及自發性青少年骨質疏松癥)；內分泌骨質疏松癥(甲亢、甲狀旁腺功能亢進、Cushing綜合癥及肢端肥大癥)；骨質疏松癥伴隨癥性腺機能衰退(垂體機能衰退、Klinefelter綜合癥及Turner綜合征)；遺傳及先天骨質疏松癥(成骨不全、高胱氨酸尿、Menkes綜合癥及Riley-Day綜合癥)；因為重力運載緩解或肢體固定的骨減少；Paget疾病；骨髓炎；骨質丟失引起的感染病灶；由實體瘤(例如，乳腺癌、肺癌、腎癌及前列腺癌)導致的高血鈣；惡性溶血癥(多重骨髓瘤、淋巴瘤及白血病)；自發性高血鈣；高血鈣伴隨甲亢或者腎功能障礙；由類固醇藥物引起的骨減少；由其他藥物(例如，免疫抑制劑例如氨甲喋呤及環孢菌素A、肝素及抗癲癇藥)引起的骨減少；由于腎功能障礙引起的骨減少；由于外科手術及消化器官疾病(例如小腸障礙、大腸障礙、慢性肝炎、胃切除、原發性膽肝硬化及肝硬化)引起的骨減少；由于各種類型的風濕病例如風濕性關節炎、骨折引起的骨減少；由于各種類型的風濕病例如風濕性關節炎引起的關節損壞；粘蛋白血癥風濕病骨關節炎；牙周骨損失；骨的癌轉移(骨溶解轉移)；伴隨外傷產生的骨壞死或骨細胞死亡、Gaucher疾病、鐮刀性細胞貧血癥、紅斑狼瘡癥系統性或非外傷傷害；骨營養不良例如腎骨膜炎；伴隨血堿性磷酸酶不足或者糖尿病的骨減少；伴隨營養紊亂或飲食不良的骨減少；以及其他骨減少。骨代謝疾病也包括由于實體癌或骨癌轉移或惡性溶血疾病產生的惡疾(參見日本專利申請公開2000-178200)。
含有至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質與至少一種選自多糖及其衍生物的物質的本發明的復合物與藥物適宜性載體或稀釋劑的組合物可以以安全口服或非口服的方式對人體或非人動物給藥。藥劑形式可以適宜選擇并根據各種因素改變，例如待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度、患者的年齡性別及體重等。例如，復合物可以以片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿的形式口服給藥；單獨或結合有傳統的助劑例如葡萄糖、氨基酸或其類似物靜脈注射；肌肉注射；皮下注射；皮內或者腹腔單獨注射；以泥敷劑的形式經皮給藥；以鼻滴的形式經過鼻腔給藥；經粘膜給藥，或以粘膜應用劑形式口腔給藥；或者以栓劑的形式直腸內給藥。這些藥劑可以以傳統的方法加入制藥領域的一般使用的添加劑例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、調味劑、溶解劑、懸浮劑、色料、pH調節劑、殺毒劑、膠凝劑、表面活性劑及包衣劑來配制。
當本發明的復合物以片劑形式配制時，可以用本領域已知的任何載體。例如載體包括賦形劑例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、硅酸鹽等等；粘合劑例如水、乙醇、丙醇、簡單的糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、蟲漆、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑例如干的淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布多糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸甘油一酸酯、淀粉、乳糖等等；分解抑制劑例如白糖、硬脂精、可可油脂、氫化油等等；吸收加速劑例如季銨堿、月桂基硫酸鈉等；加濕劑例如甘油、淀粉等等；吸附劑例如淀粉、乳糖、高嶺土、斑脫土、硅膠等等；潤滑劑例如精制滑石、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽如硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、滑石、硼酸粉末、聚乙二醇等。此外，如果需要，片劑可以包衣，如形成糖包衣片劑、明膠包衣片劑、腸衣片劑、薄膜包衣片劑、雙層片劑或多層片劑。
本發明的復合物可以以小丸藥的形式配制，制劑可含有本領域已知的載體，例如，賦形劑例如葡萄糖、乳糖、可可油脂、淀粉粉末、硬化植物油、高嶺土、滑石等等；粘合劑例如有阿拉伯樹膠粉末、黃芪膠粉末、明膠、乙醇等等；崩解劑例如昆布多糖、瓊脂等等。
當本發明復合物以栓劑形式配制時，制劑可以含有傳統的載體例如聚乙二醇、可可油脂、高級醇、高級醇酯、明膠、半合成甘油酯等等。
當本發明復合物以注射形式配制時，最好將溶液或懸浮液形式的制劑消毒且制成和血液等滲。當以溶液、乳狀液或懸浮液形式制備時，可以使用任何已知的和傳統使用的稀釋劑，例如水、乙醇、丙二醇、乙氧基異十八烷醇、多氧化異十八烷醇及聚乙烯山梨醇脂肪酸酯。此外，在可注射配方中，制劑也可以含有鹽、葡萄糖、甘油等等，其量足以與血液保持等滲。它們也可含有其他試劑，包括增溶劑、緩沖劑、撫慰劑、pH調節劑、穩定劑及溶解劑。配制后可將注射劑凍干。
本發明的制劑也可進一步含有色料、防腐劑、香味劑、調味劑、甜味劑及其他藥品等添加劑。
含有至少一種選自OCIF、其類似物及其變異體的物質和至少一種選自多糖及其衍生物的物質的本發明的復合物存在于用于治療和預防骨代謝疾病的組合物中的量并不特別限制，但是其一般的重量百分比為0.1％～70％，最好是占有整個制劑重量的1～30％。
按照本發明的復合物的劑量將根據多種因素而改變，這些因素包括所治療的癥狀、患者的年齡、性別、體重等及給藥的途徑。然而給予成人的量一般有這樣一個范圍，其上限是每天30-1000mg，下限是每天0.001～0.03mg，優選的范圍是每于0.03～30mg。給予的量一般是這樣一個范圍，其上限是每天1～20mg/kg，下限是每天0.01～0.5μg/kg，優選的范圍是從0.5μg/kg～1mg/kg每天。根據這樣的因素例如給藥形式及患者的身體狀況，本發明的復合物可以以一天一次或一天數次給予。
下述實施例、參考實施例和試驗實施例用于進一步舉例說明本發明，不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例1含有OCIF和硫酸右旋糖酐(I)的復合物的制備1(a)重組二聚體人OCIF的制備按照EP-A-0816380(WO-A-96/26217)的實施例中所述的方法獲得分子量為大約120000的重組二聚體人OCIF。命名為pBKOCIF的質粒載體包含編碼含有信號肽的人OCIF的核苷酸序列，是從根據EP-A-0816380的實施例11產生的大腸桿菌轉化株pBK/01F10中獲得的[根據布達佩斯條約，以保藏號FERMBP-5267保藏在1-3，Higashi lchome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566 Japan的工業科學和技術部，生物科學和人技術國立研究院(已經成為現代工業科學和技術國家研究院國際專利生物體保藏中心)]。將該質粒用限制性酶SalI和EcoRV消化。按照EP-A-0816380的的實施例14所描述的程序，回收編碼含有信號肽的人OCIF的核苷酸，該核苷酸等同于人OCIF cDNA。在所說的核苷酸被分離和提純后，它被插入表達載體pcDL-SRα296(分子和細胞生物學，第8期，p466，1988)，然后用它轉化大腸桿菌菌株DH5α(Gibco BRL)(見EP-A-0816380描述的程序)。這樣所獲得的名為pSRαOCIF的重組載體從所說的轉化培養物中提取并純化。
采用EP-A-0816380的實施例14的程序獲得重組人成熟OCIF。具體地說，將CHO dhFr-細胞(ATCC，CRL9096)用上面產生的重組質粒pSRαOCIF和表達二氫葉酸還原酶(DHFR)的質粒(WO-A-92/01053中公開的質粒pBAdDSV)進行轉染，然后選擇DHFR-表達轉染子。表達大量OCIF的轉化體被克隆。選擇其條件培養基中含有高濃度OCIF的克隆，并獲得表達最大量OCIF的克隆5561。調節獲得的克隆5561培養物，過濾，然后應用于肝素瓊脂糖-FF凝膠柱(2.6×10cm，Pharmacia Co.)并采用線性氯化鈉梯度洗脫液進行柱層析。含有OCIF活性的部分用約0.6～1.2M氯化鈉作為洗脫液洗脫，然后加入親和層析柱(blue-5PW，0.5×5.0cm，Tosoh Co)并采用線性氯化鈉梯度作為洗脫液進行親和層析。洗脫出的各部分在還原和非還原條件下進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，含有所期望的提純的重組人成熟OCIF的部分被確定是那些產生與EP-A-0816380例14中產生的OCIF蛋白質同樣條帶的部分，其表觀分子量為60000和120000。這個單體肽的氨基酸序列如序列表的SEQ.ID.NO.1所示，它與SEQ.ID.NO.4的全序列或WO-A-96/26217和EP-A-0816380的SEQ ID.No.5中氨基酸No.1到No.380相同。
然后用1/100體積的25％的三氟乙酸補充含有獲得的人OCIF的合并部分并將得到的混合物注入反相柱(購自YMC CO.的PROTEIN-RP，2.0mm×250mm)，該柱已經用含有0.1％的三氟乙酸的30％的乙腈進行了預平衡處理。然后該柱以0.2ml/分鐘的流速采用從30％到55％的乙腈線性梯度進行洗脫50分鐘。分別收集兩個峰部分，然后凍干。在還原條件下在SDS-PAGE上顯示出表觀分子量120000的條帶的部分隨后在下列實施例中作為二聚體人OCIF使用(見WO-A-96/26217和EP-A-0816380的實施例17和18)。
1(b)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物的制備將如上面實施例1(a)中所述制備的提純后的二聚體人OCIF溶解在10mM磷酸鈉緩沖溶液中(pH6.0)，緩沖液含有0.15M氯化鈉，從而得到濃度為1.5、2、5、6.5、10、12.5、20或50mg/ml的OCIF溶液。硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5(MeitoSangyo Co.，Ltd制造，以下簡稱“DS5”)溶解在水溶液中，從而獲得40、100、130、150、200、400、500、510或1000mg/ml的最后濃度，然后加入1N氫氧化鈉到最終pH為10、10.5或11。將獲得的水溶液在4、7、25或37℃下溫育1、3、6、18、24、48、72、96、144、168或288小時。
在溫育結束后，將4ml各溶液注入Superdex 200預制級凝膠過濾柱(柱的內徑16mm；長度60em，排阻極限分子量1,300,000；由Amersham PharmaciaBiotech制作)，該柱預先用含有0.3M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6)平衡，然后以2毫升/分鐘的流速用同一緩沖液進行洗脫。用紫外分光光度計監測280nm的吸收，收集大約28到36分鐘保留時間內的洗出液。在大約50到70分鐘的保留時間，不結合OCIF的游離DS5被洗脫。所有凝膠過濾步驟在室溫下進行。獲得的含有期望的二聚體人OCIF和DS5的復合物的制備物在-60℃冷凍并儲存。每一種復合物的制備條件歸納在下表1。
表1

1(c)天然人OCIF的制備按照WO-A-96/26217和EP-A-0816380的實施例1到4中描述的方法從人胎兒肺成纖維細胞IMR-90(ATCC-CCL186)的培養物中制備天然生產的人OCIF。
實施例2含有OCIF和硫酸右旋糖酐(II)的復合物的制備按照上面的實施例1(a)的描述制備的提純的二聚體人OCIF溶于10mM的磷酸鈉緩沖溶液(pH6.0)，這種溶液含有0.15M的氯化鈉，從而得到5mg/ml OCIF濃度的溶液。具有5000分子量的硫酸右旋糖酐鈉(DS5000，由Wako PureChemical Industries公司制造)溶于這樣得到的水溶液，DS5000最后濃度為150mg/ml，然后加入1N氫氧化鈉，最后的pH值為10.5。這種水溶液然后在4℃溫育24小時。
在溫育結束后，按照上面實施例1(b)的描述，對獲得的4ml溶液進行Superdex200預制級凝膠過濾柱色譜。用紫外分光光度計檢測280nm波長處的吸收，收集保留時間為大約28到36分鐘的洗出液。沒有結合OCIF的游離DS5000在保留時間約為40到65分鐘內洗脫。
所得的含有希望的二聚體人OCIF和DS5000的復合物的制備物被冷凍并在-60℃儲存。復合物的制備條件歸納在表2如下。
表2

實施例3等電點的測量如上所述在實施例1(a)中制備的提純的重組二聚體人OCIF和實施例1(b)制備的表1中制備序號為22的OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物，使用IEFpH3～7緩沖劑試劑盒(Technical Frontier Co.)分別注入等電電泳凝膠IEF PAGE mini(pH范圍3到10，由IWAKI GLASS制作)，按照下列方案使電壓作用于凝膠100V1小時，隨后200V 1小時，最后為500V30分鐘。在完成電泳后，每一種條件下獲得的凝膠用考馬斯藍染色。
由上述獲得的電泳凝膠測定的二聚體人OCIF的等電點大約為pI9，通過將OCIF和OCIF復合物的條帶位置與pI標志物進行比較，制備序號22的OCIF和硫酸右旋糖酐復合物的等電點大約為pI6.5。
實施例4含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比例的測量4(a)用過氧化物酶標記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4原液的制備在該步驟中，使用EZ-Link馬來酰亞胺活化的辣根過氧化物酶試劑盒(Pierce公司生產)，按照該試劑盒提供的說明書中所述的程序II，用過氧化物酶標記抗人OCIF單克隆抗體。具體操作如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的實施例4所述的方法，從產生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養物中純化抗人OCIF單克隆抗體OI-4，然后用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)將其稀釋至最終蛋白濃度為1mg/ml。
在使用前，將S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亞胺酯(在所述EZ-Link馬來酰亞胺活化的辣根過氧化物酶試劑盒中提供)溶于二甲基甲酰胺中，得到濃度為10mg/ml的溶液。加入4μl等份試樣到上面制備的稀釋的1ml含OI-4的溶液中，獲得的溶液在室溫下溫育30分鐘。溫育結束后，加入20μl通過在使用之前將5mg鹽酸羥胺溶解在100μl的馬來酰亞胺共軛緩沖液(提供在所述的EZ-Link馬來酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中)中得到的溶液，然后在室溫溫育得到的溶液2小時。然后，將反應混合物注入聚丙烯酰胺脫鹽柱(10ml，包含在所述EZ-Link馬來酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中)，該柱在使用前用30ml的馬來酰亞胺共軛緩沖液平衡。然后，在該柱中加入馬來酰亞胺共軛緩沖液。以0.5ml為一部分收集洗脫液。含有抗體的第7和第10部分合并。就在使用前將5mg的EZ-LINK馬來酰亞胺活化的辣根過氧化物酶(包含在所述EZ-Link馬來酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中)溶于500微升的蒸餾水中，取100μl加入到合并的洗脫部分中，得到的混合物在室溫下溫育1小時。溫育后，加入等體積的甘油，所獲得的溶液在-20℃保存。
上述方法獲得的溶液用作為用過氧化物酶標記的注抗人OCIF單克隆抗體OI-4(以下簡稱為POD-OI-4)原液，以下簡稱為“POD-OI-4原液”。
4(b)OCIF的定量通過采用兩個抗OCIF單克隆抗體進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量實施例1和實施例2中制備的任何復合物和參考實施例1制備的混合物中的OCIF的含量，詳細步驟如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的實施例4所描述的方法，從產生抗體OI-26的雜交瘤(FERM BP-6421)的培養物中提純抗人OCIF單克隆抗體OI-26，然后溶解在0.1M的碳酸氫鈉中獲得蛋白質終濃度為5μg/ml的溶液。將100μl的等分試樣轉移到96孔的微滴盤(Maxisorp，由NUNC制造)的每個孔中，然后將該盤密封，并在4℃下溫育過夜。溫育后，每一孔都用250微升的磷酸緩沖鹽(PBS)(pH7.4)沖洗三次，這種緩沖液含有0.1％聚山梨醇酯20。將20μl稀釋緩沖液(含有0.2M的TRIS鹽酸、40％Block Ace(購自Dainippon Pharmaceutical公司)和0.1％聚山梨醇酯20；pH7.4]加入到每個孔中，然后，將盤保持在室溫下20分鐘以封閉未結合OI-26的孔的區域。
欲加入上述制備的OI-26結合孔中的樣品優選采用上面用于封閉孔的稀釋緩沖液進行稀釋。為了制作標準曲線，含有已知濃度的人OCIF的稀釋緩沖液用作標準。稀釋緩沖液用作對照。將每種樣品50μl轉移到各個孔。
在樣品加入到這些孔中后，將50μl的通過用稀釋緩沖液
稀釋POD-OI-4原液(如在實施例4(a)所描述的方法制備)1500倍得到的溶液加入每個孔中，并且在室溫下溫育微滴盤2小時。然后，每個孔用250μl的含0.1％的聚山梨醇酯20的磷酸緩沖液(以下簡稱PB pH7.4)沖洗四次。
將0.1M的檸檬酸和0.2M的磷酸氫二鈉混合，用作底物溶液(pH4.5)。將32.5ml等分試樣轉移到試管中，并加入6.5μl的過氧化氫。然后，將13mg的鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)片(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)溶解于上述溶液。將100微升等分試樣注入每個孔，用鋁膜覆蓋微滴盤，然后在室溫下溫育15分鐘。然后加入50微升的反應終止液到每個孔中，這種終止液含有體積比為250∶50的純水和濃硫酸。在用振動器(Titer Mixer MB-1，由JapanTrika制造)輕輕攪拌孔中的溶液后，采用微板讀數器(SPECTRAFLUORTECAN制造)測量490nm波長處每個孔的吸收。
在從上述已知濃度的人OCIF的標準溶液的吸光度產生的標準曲線的基礎上，計算每份樣品中人OCIF的量。
4(c)硫酸右旋糖酐的定量如上實施例1和2所述產生的每種復合物中硫酸右旋糖酐的量，是通過苯酚硫酸方法作為中性糖來測定的，具體描述如下。
具有已知濃度在10到60μlg/ml范圍的DS5(Meito Sangyo Co.Ltd.生產)或DS5000(Wako Pure Chemical Industries公司生產)溶液是用稀釋溶液(0.01M檸檬酸、0.3M氯化鈉、0.01％聚山梨醇酯80水溶液pH6.0)制備的，用作標準溶液。將標準品、樣品或稀釋溶液各0.2ml轉移到每個試管。0.2ml的50mg/ml水性苯酚被加入其中，并快速攪拌。將得到的混合物在60℃水浴溫育20秒后，將1.0ml的濃硫酸加入其中。輕柔但快速攪拌后，試管被置于室溫溫育10分鐘，再次快速攪拌，然后被置于室溫溫育20分鐘。然后，試管中溶液在490nm波長的吸光度用分光光度計(UV-20Shimadzu Seisakusho，K.K.制造)測量。
根據吸光度和標準曲線，測定了中性糖的含量。人OCIF含有一個糖鏈。因此，可根據所分析的制備物的中性糖含量測量值推導出人OCIF本身的中性糖含量值，從而計算出所分析的制備物中與人OCIF結合的硫酸右旋糖酐的含量。
4(d)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物中OCIF和硫酸右旋糖酐分子比的計算。
如例4(c)所述測定的被分析的制備物中硫酸右旋糖酐的含量除以如例4(b)所述測定的被分析的制備物的人OCIF的含量，得到在所分析的制備物中每1mg人OCIF中所含的硫酸右旋糖酐的量。
所獲得的數字用于根據設定的人OCIF單體分子量是60000，DS5的分子量是1950，DS5000的分子量是5000，借助計算每個OCIF單體分子的硫酸右旋糖酐分子的數目，計算所分析的制備物中單體OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比。
結果在下列表3中顯示。
表3

實施例5OCIF/硫酸右旋糖酐復合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之間的結合穩定性如上面實施例4(c)所述，含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物的凝膠過濾重復兩次，測量每次凝膠過濾后得到的復合物中的硫酸右旋糖酐的量。
5(a)OCIF和硫酸右旋糖酐的溫育使用實施例1(b)所述的步驟。如實施例1(a)所述制備的重組二聚體人OCIF溶于含有0.15M氯化鈉的10mM的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，獲得OCIF5mg/ml濃度的溶液。將DS5溶于這個溶液中，獲得最后DS5濃度為150mg/ml，然后加入1N的氫氧化鈉溶液調整pH值到10.5。所獲得的溶液在4℃溫育7天，獲得含有人二聚體OCIF和DS5復合物的溶液。
5(b)第一次凝膠過濾按照實施例1(b)描述的方法，在實施例5(a)中溫育后獲得的含有人二聚體OCIF和DS5的復合物的溶液進行凝膠過濾。收集保留時間約為28到36分鐘的部分，而未結合OCIF的游離硫酸右旋糖酐是在保留時間約為50到70分鐘內洗脫的。
5(c)蛋白質含量測量按照如下Lowry方法[Lowry，O.H.等人，生物化學雜志，193，265-275(1951)]，測量復合物中的蛋白質含量。
將0.2g五水硫酸銅(II)(Wako Pure Chemical)溶于水獲得50ml的最終體積。將0.4g酒石酸鈉二水合物(Wako Pure Chemical)溶于水獲得50ml的最終體積。將20g碳酸鈉溶于水獲得最終100ml的體積。在使用之前上述三種水溶液按照1∶1∶2的體積比混合(該溶液稱A溶液)。10g十二烷基硫酸鈉(Nacalai TesqueInc.)溶于水獲得最終200ml的體積(該溶液稱B溶液)。3.2g氫氧化鈉(Wako PureChemical)溶于水至最終體積為100ml(該溶液稱為C溶液)。A、B和C溶液在使用之前按照1∶2∶1的體積比混合。
在使用之前，福林(Folin-ciocalteu)試劑(Wako Pure Chemical)和水按照1∶5的體積比混合。2.76g的檸檬酸三鈉鹽二水合物(Wako PureChemical)、0.13g的單水檸檬酸(Wako Pure Chemical)、17.5g的氯化鈉和0.1g的聚山梨醇酯80溶于水至最終體積為1L(pH6.9)，獲得的溶液稱為稀釋溶液。
9.5ml的稀釋溶液加入在含濃度小于0.1％的疊氮化鈉的0.9％氯化鈉水溶液中的含2mg/ml牛血清白蛋白(稱為“BSA”)的牛血清白蛋白(Pierce Co.Ltd)的標準溶液500μL中，得到的溶液稱為“100μg/ml BSA溶液”。3.5ml、3ml、2.5ml或2ml的稀釋溶液分別加入到1.5ml、2ml、2.5ml或3ml 100μg/ml BSA溶液中，得到的溶液分別稱為“30μg/ml BSA溶液”、“40μg/ml BSA溶液”、“50μg/ml BSA溶液”、“60μg/ml BSA溶液”。將3ml稀釋溶液加到1.5ml60μg/ml BSA中，得到的溶液稱為“20μg/ml BSA溶液”。
用稀釋液稀釋待確定蛋白質含量的樣品，得到最后蛋白質濃度約為40μg蛋白質/ml的溶液。將1ml的20μg/ml BSA溶液、30μg/ml BSA溶液、40μg/mlBSA溶液、50μg/ml BSA溶液、60μg/ml BSA溶液、稀釋樣品或稀釋溶液(n＝3)轉移至試管中，加入1ml的堿性銅試劑，將得到的溶液混合，在室溫下溫育10分鐘。然后加入0.5ml稀釋的福林試劑，混合得到的溶液，在室溫下溫育30分鐘。然后，用寬10mm的石英杯，在紫外分光光度計中(Lambda20Perkin ElmerCo Ltd.)測量波長750nm處每種混合物的吸光值。然后，根據用標準BSA溶液的吸光值(作為換算為BSA的量的值)產生的校正曲線，計算樣品中含的蛋白質的量。
5(d)硫酸右旋糖酐的定量分析采用實施例4(c)描述的步驟，測量了實施例5(b)中第一次凝膠過濾后獲得的復合物中結合人OCIF的硫酸右旋糖酐的含量。
5(e)第二次凝膠過濾上面實施例5(b)中獲得的合并收集部分轉移到兩個Centriprep過濾單元(YM-30，30,000MW cutoff，Millipore Amicon Co Ltd.)，采用離機(himacCT60，Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度離心20分鐘。收集從兩個Centriprep過濾單元得到的沒有過濾出去的濃縮溶液并混合。該溶液按照實施例1(b)的描述進行凝膠過濾，收集保留時間大約為28到36分鐘的部分并合并。如實施例5(c)和5(d)所述測量合并部分中的復合物的蛋白質和糖的含量。
5(f)第三次凝膠過濾實施例5(e)中獲得的合并收集部分轉移到兩個Centriprep過濾單元(YM-30，30,000MW cutoff，Millipore Amicon Co Ltd)，采用離心機(himacCT60，Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度離心20分鐘。收集兩個Centriprep過濾單元中沒有過濾出去的濃縮溶液并混合。得到的濃縮液按照實施例1(b)的描述進行凝膠過濾，收集保留時間為大約28到36分鐘的部分物并混合。然后，合并部分中的復合物的蛋白質和糖的含量按照例5(c)和例5(d)的描述進行測量。
5(g)OCIF與硫酸右旋糖酐的分子比的計算在實施例5(b)中第一次凝膠過濾后、在實施例5(e)中第二次凝膠過濾后、在實施例5(f)中第三次凝膠過濾后獲得的部分中的復合物中存在的單體OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比按照實施例4(d)進行計算。得到的結果匯總在如下表4中。
表4

可以從上表立刻明顯發現，本發明的復合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比經過三次凝膠過濾還非常恒定，表明本發明的復合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之間的結合高度穩定。
實施例6肝素交聯柱上OCIF和硫酸右旋糖酐復合物的吸附程度6(a)肝素柱色譜本例中以每分鐘4ml的流速進行所有的柱色譜步驟。
采用5ml的含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液預平衡肝素交聯柱(HiTrap肝素HP柱，Lot.289212，Amersham Pharmacia Biotech)。取實施例1中表1的制備物，并用含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液稀釋到最終蛋白質濃度為0.1mg/ml。獲得的1ml稀釋溶液注入色譜柱，收集1ml的第一次洗提液(部分A)。再注入5ml的10mM的含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液，收集第二次洗提液5ml(部分B)。最后，注入4ml的1含有2M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液，收集4ml的洗提液(部分C)。
6(b)洗提液中OCIF的含量測量將以10μg/ml的濃度溶解了抗人OCIF單克隆抗體OI-19(FERM BP-6420)的100μL的0.1M的碳酸氫鈉(pH9.6)轉移到96孔的微量滴定平板(MaxisorpNUNCCo Ltd.)的每一孔中。將平板密封并在4℃溫育過夜。然后，通過傾注，清除每個孔中的溶液，將300μL的50％的BLOCK ACE(購自Dainippon PharmaceuticalCo.，Ltd.)加入每個孔中，在室溫下溫育平板2小時。在清除每個孔中的溶液后，用300μL含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec Co Ltd.)沖洗每個孔三次。
在如上所述預備了每個孔后，將實施例6(a)獲得的各20μl三種洗提液(部分A、B和C)采用含有40％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.2M Tris-鹽酸(pH7.4)稀釋，獲得最終體積為120μL，然后用同樣體積的純水稀釋。同時，已知量的人OCIF溶解于120μl含有40％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.2MTris-HCl(pH7.4)中，然后用同樣體積的純水稀釋。將這樣得到的溶液用作標準。
100μL的每一種稀釋洗提液和標準溶液注入如上所述預備好的微量滴定平板的每一個孔中，然后在室溫用微板混合器(NS-PIuchi Seiei-Do，Co Ltd.)輕輕攪拌，將平板溫育2小時。然后，從每個孔中清除溶液，采用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec CoLtd.)沖洗每個孔6次。在100μL的含有25％Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1％的聚山梨醇酯20的0.1M Tris-HCl(pH7.4)中加入實施例4(a)制備的POD-OI-4原液，獲得體積比為0.01％的溶液，然后再注入每個孔中，在室溫用相同的微板混合器溫和攪拌2小時溫育平板。從每個孔中清除溶液，采用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHERMW-96R(Bio Tec Co Ltd.)沖洗每個孔6次。
在沖洗這些孔后，100μL的3，3`，5，5`-四甲聯苯胺(TMB)可溶試劑(Scytek Co Ltd.)加入每個孔中，然后在室溫用相同的微板混合器溫和攪拌溫育平板10到15分鐘。然后，100μl的TMB終止緩沖液(Scytek Co Ltd.)加入每個孔。用微板混合器溫和攪拌平板大約1分鐘后，采用微板讀數器(SPECTRATHERMOTECAN Co Ltd.)測量450nm處每個孔的吸光值。根據每個所述的標準溶液對濃度的吸光值畫出的標準曲線，計算部分A、B和C每部分中含有的OCIF的量[標注為(a)、(b)和(c)]。按照下式計算所測試的OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物對肝素交聯柱的吸附程度。(c)(a)+(b)+(c)]]>在下表5中匯總了上面的實施例1制備的7個復合物的結果。也給出未復合的OCIF的對應結果。從表中可以看出，未復合OCIF比本發明的復合物更強烈地結合肝素柱。還發現本發明的復合物可以由其對肝素交聯柱的吸附程度進一步表征。
表5

實施例7OCIF/硫酸右旋糖酐復合物的免疫檢測7(a)蛋白質的含量的測量按照上面實施例5(c)描述的方法確定實施例1的復合物制備物中的蛋白質的含量。
7(b)OCIF的量的免疫測量采用實施例6所述的ELISA技術測量免疫方法確定的實施例1的復合物制備物中OCIF的含量。
7(c)免疫檢測率的計算實施例7(b)獲得的值除以實施例7(a)獲得的對應值，獲得的值稱為免疫檢測率。
這些結果歸納于下表6。也給出未復合OCIF的對應結果。也發現本發明的復合物可以用其免疫檢測率進一步表征。
表6

參考實施例1OCIF和硫酸右旋糖酐的混合物的制備采用EP-A-1127578(WO-A-2000/24416)的實施例1公開的步驟如下制備OCIF和硫酸右旋糖酐鈉鹽(分子量5000或10000)的混合物。
按照實施例1(a)所述制備分子量大約為120000的提純的二聚體人OCIF，將其溶解到10mM的含有0.15M氯化鈉和0.01％聚山梨醇酯80的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，得到OCIF濃度為0.25mg/ml的溶液。將實施例2描述的DS5000(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)或分子量為10000的硫酸右旋糖酐鈉鹽(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造，以下稱為DS10000)溶解在上述水溶液中，得到最終硫酸右旋糖酐鈉鹽濃度為1或4mg/ml的溶液，再加入氫氧化鈉得到最終的pH值為7。所得水溶液在4℃溫育24小時，得到含OCIF和DS5000或DS10000的期望制劑，然后用于與如下試驗實施例1中進行對比。
每一種混合物的制備條件歸納于下表7。
表7

試驗實施例1含OCIF和硫酸右旋糖酐的復合物的血清濃度的測量1(a)注射和收集血液5周齡Wistar雌性大鼠(體重大約100g)禁食過夜。用含有0.01％聚山梨醇酯80的PBS(pH7.4)稀釋所要測試的實施例1、2或參考實施例1中制備的OCIF和硫酸右旋糖酐的制備物到濃度為0.25mg/ml制備注射液，然后注射溶液進入一只試驗大鼠的尾巴的靜脈，單劑量注射量為2ml/kg體重。注射六小時后，從大鼠的心臟取血。
1(b)血清分級分離1(a)中收集的血液在室溫下凝結30分鐘后，用直徑10cm的轉子以14000rpm離心血液3分鐘得到上清液血清。
1(c)血清中的OCIF的定量分析抗人OCIF單克隆抗體OI-19(參見EP-A-0974671/WO-A-99/15691)溶解在0.1M碳酸氫鈉溶液中獲得最終OCIF濃度為10μg/ml的溶液，將100μL的該溶液加入96孔微滴平板(MaxisorpNUNC制造)的每一個孔中，然后密封平板，在4℃下放置過夜。傾注法清除抗體溶液，再加入300μL的封閉緩沖溶液(50％Block Ace購自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)到每個孔中，該平板在室溫下放置2小時。然后用300μL的含0.1％聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)沖洗每個孔三次。
將100μL的純水和120μL稀釋緩沖溶液[成分0.2M Tris-HCl、40％Block Ace(購自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1％聚山梨醇酯20，pH7.4]加入20μL的如1(b)所述收集的待測試血清中，然后混合。作為對照，將100μL的純水和含有已知濃度的人OCIF二聚體的120μL的稀釋緩沖液加入20μL蒸餾水，然后混合。
100μL的每種獲得的血清制備物加入到每個孔中，平板在室溫下放置2小時。在反應完成后用300μL的含有0.1％聚山梨醇酯20(pH7.4)的溶液沖洗每個孔6次。用稀釋溶液[含有0.1M的Tris-HCl、25％Block Ace(購自DainipponPharmaceutical Co.Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1％聚山梨醇酯20(pH7.4)]稀釋實施例4(a)獲得的POD-OI-4原液1000倍得到的溶液100μl加入到每個孔中，平板在室溫放置2小時。
然后，每個孔用含0.1％聚山梨醇酯20的300μL的PBS(pH7.4)沖洗6次。100μL的底物溶液(TMB可溶試劑Scytek生產)加入每個孔，平板在室溫放置10到15分鐘。然后，100μL的反應終止液(TMB終止緩沖液Scytek生產)加入到每個孔中。
在采用振動機(微板混合器NS-PIuchi Seiei-Do Co Ltd.制造)溫和攪拌后，采用微板讀數器(SPECTRA THERMOTECAN制作)測量450nm波長處每個孔的吸光值。根據用標準OCIF溶液制作的標準曲線，計算試驗血清的OCIF濃度。以類似于血清的方法，通過測量1(a)中制備的每個注射液中的OCIF濃度計算每公斤體重的OCIF的劑量(mg/kg)。
1(d)血清濃度按照1(c)所述的方法，對每個樣品定量分析1(b)得到的血清中的OCIF。試驗結果表示在表8。
表8

*血清中的校正濃度是當每公斤體重OCIF的劑量轉化為0.5mg/kg時，血清中的OCIF濃度。
如表8所示，在以每公斤體重注射0.5mg/kg本發明的制備物6小時后血清的濃度比采用同樣劑量的參考制備物1注射后的濃度高2.2到11.7倍。
本發明的先優點如上所示，與在WO-A-2000/24416中公開的含有OCIF和多糖的已知混合物相比，本發明的含有至少一種OCIF、其類似物或變異體和至少一種多糖或其衍生物的復合物在注射后在血液中的保留濃度明顯高得多。本發明的復合物可用于預防或治療各種骨代謝疾病諸如骨質疏松癥、血鈣過多癥、骨溶解轉移、由于風濕性關節炎產生的骨損失、由于類固醇藥物產生的骨減少、多重骨髓瘤、或由于腎臟功能障礙產生的骨減少或血鈣過多、腎病性骨營養不良、骨關節炎等。
序-列表<110>三共株式會社<120>含有OCIF和多糖的復合物<130>EPP85710(FP-200229SW)<150>JP 2001-198985<151>2001-06-29<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT<213>人<220><221>SIGNAL<222>(-21)..(-1)<223><220><221>mat_peptide<222>(+1)..(+380)<223><400>1Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile-20 -15 -10Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp-5 -11 5 10Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr15 20 25Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro30 35 40Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys45 50 55Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu60 65 70 75Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr80 85 90Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe95 100 105Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg110 115 120Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys125 130 135Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys140 145 150 155Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr160 165 170Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg175 180 185Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val190 195 200Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile205 210 215Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu220 225 230 235Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln240 245 250Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala255 260 265Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly270 275 280Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys285 290 295Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn300 305 310 315Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser320 325 330Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr335 340 345Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu350 355 360Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys365 370 375Leu380
權利要求
1.一種復合物，所述復合物含有至少一種選自破骨細胞形成抑制因子(OCIF)、其類似物和變異體的物質，它結合于至少一種選自多糖及其衍生物的物質。
2.根據權利要求1所述的復合物，其中所述的選自OCIF、其類似物和變異體的物質是天然類型或重組類型的。
3.按照權利要求1或2所述的復合物，其中所述的選自OCIF、其類似物和變異體的物質是一種單體或二聚體。
4.按照權利要求3所述的復合物，其中所述的選自OCIF、其類似物和變異體的物質，是在非還原條件下采用SDS-PAGE測量時分子量為大約60000的人單體OCIF或采用SDS-PAGE在非還原條件下測量的分子量為大約120000的人二聚體OCIF。
5.按照權利要求1到4中任何一項所述的復合物，其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的-21到+380的氨基酸。
6.按照權利要求1到4中任何一項所述的復合物，其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的+1到+380的氨基酸。
7.按照權利要求1到6中任何一項所述的復合物，其中所述的多糖及其衍生物選自透明質酸、硫酸軟骨素、皮膚素酸、己酰肝素酸、角質素酸、角叉膠、果膠、肝素、右旋糖酐和其衍生物。
8.按照權利要求7所述的復合物，其中所述多糖衍生物選自硫酸右旋糖酐及其鹽。
9.按照權利要求8所述的復合物，其中所述多糖衍生物是硫酸右旋糖酐的鈉鹽。
10.按照權利要求9所述的復合物，其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量為1500到12000。
11.按照權利要求9所述的復合物，其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量為1800到6000。
12.按照權利要求1到11中任何一項所述的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質和所述選自多糖及其衍生物的物質的分子比為1∶1到1∶10。
13.按照權利要求12所述的復合物，其中所述的分子比是1∶1到1∶8。
14.按照權利要求1到13中任何一項所述的復合物，其中所述含有OCIF或其類似物或變異體的復合物對肝素的吸附強度比游離的未復合OCIF或其類似物或變異體的吸附強度低。
15.按照權利要求14的復合物，其中按照下列步驟計算的對肝素的吸附度小于0.7(a)裝填了固定有肝素的交聯瓊脂糖珠的色譜柱采用含有0.1到0.8M氯化鈉的低離子強度緩沖液平衡；(b)將試驗的復合物溶解在與(a)相同的低離子強度緩沖液中并注入柱中，然后收集第一次洗提液(部分A)；(c)然后采用與(a)相同的低離子強度緩沖液進一步洗脫，收集第二次洗提液(部分B)；(d)然后采用含有1.0到2.0M氯化鈉的高離子強度緩沖液洗脫，收集第三次洗提液(部分C)；(e)每一部分A、B、和C中的復合物含量(分別標注為(a)，(b)和(c))采用免疫測定法測量；(f)按照下列公式測定復合物對肝素的吸附度吸附度＝(c)/[(a)(b)+(c)]。
16.按照權利要求1到15中任何一項所述的復合物，該復合物包括OCIF或其類似物或變異體和硫酸右旋糖酐或其鹽，其中通過酶聯免疫吸收測定法(ELISA)測定所述復合物中所述OCIF或其類似物或變異體的分子數目與通過利用Lowry方法測量總蛋白含量測定的所述復合物中OCIF或其類似物或變異體分子數目的比是0.5到1.2，其中ELISA方法利用從產生抗體OI-19的雜交瘤(FERMBP-6420)的培養物純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-19作為結合到固相的抗體，流動相中使用從產生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養物純化的用辣根過氧化酶標記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4。
17.按照權利要求16所述的復合物，其中所述的比例為0.6到1.1。
18.按照權利要求16所述的復合物，其中所述的比例為0.7到1.1。
19.按照權利要求1所述的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質是通過SDS-PAGE在非還原條件下測量的分子量是大約60000的人單體OCIF，或通過SDS-PAGE在非還原條件下測量的分子量是大約120000的人二聚體OCIF，所述多糖及其衍生物選自透明質酸、硫酸軟骨素、皮膚素酸、乙酰肝素酸、角質素酸、角叉膠、果膠、肝素、右旋糖酐和其衍生物，所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質與所述選自多糖和其衍生物的分子比是1∶1到1∶10。
20.按照權利要求1所述的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質是在非還原條件下采用SDS-PAGE測量的分子量是大約60000的人單體OCIF，或在非還原條件下采用SDS-PAGE測量的分子量是大約120000的人二聚體OCIF，所述多糖及其衍生物選自硫酸右旋糖酐和其鹽，所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質與所述選自多糖和其衍生物的物質的分子比為1∶1到1∶10。
21.按照權利要求1所述的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質是人單體或二聚體OCIF，其中所述單體或所述OCIF二聚體的一個單元包括序列表中SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸+1至+380，所述的多糖衍生物是平均分子量為1500至12000的硫酸右旋糖酐的鈉鹽，所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶10。
22.按照權利要求21所述的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶8。
23.按照權利要求21的復合物，其中所述選自OCIF、其類似物和變異體的物質與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶5。
24.按照權利要求21至23中任何一項的復合物，其中所述多糖衍生物是平均分子量為1800至6000的硫酸右旋糖酐鈉鹽。
25.在給藥病人后延長OCIF或其類似物或變異體保留在血流內的時間的方法，該方法包括在給藥前將權利要求1至6中任何一項定義的至少一種所述OCIF、其類似物或其變異體與至少一種如權利要求1和7至11中任何一項定義的多糖或其衍生物復合。
26.一種藥物組合物，包括有效量的藥理學活性劑與其載體或稀釋劑，其中所述藥理學活性劑是按照權利要求1至24中任何一項的復合物。
27.按照權利要求26的藥物組合物，該組合物用于骨代謝疾病的治療和預防。
28.按照權利要求1至24中任何一項的復合物，該組合物用作藥物。
29.按照權利要求1至24中任何一項的復合物，該組合物用作預防或治療骨代謝疾病的藥物。
30.按照權利要求1至24中任何一項的復合物，該復合物用作預防或治療骨代謝疾病的藥物，所述骨代謝疾病選自骨質疏松癥、骨質減少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、歸因于骨損失的傳染性病灶、血鈣過多、骨破折、歸因于風濕病的關節損壞或骨質減少、骨關節炎、牙周骨損失、骨的癌轉移、伴隨跌打損傷的骨壞死或骨細胞死亡、高雪氏病、鐮狀細胞血癥、紅斑狼瘡全身性或非外傷性損傷、骨質營養不良和歸因于實體癌或者骨的癌轉移或惡性溶血疾病的惡疾。
31.按照權利要求1至24中任何一項的復合物在制備預防或治療骨代謝疾病的藥物中的用途。
32.按照權利要求31的用途，其中所述骨代謝疾病選自骨質疏松癥、骨質減少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、歸因于骨損失的傳染性病灶、血鈣過多、骨破折、歸因于風濕病的關節損壞或骨質減少、骨關節炎、牙周骨損失、骨的癌轉移、伴隨跌打損傷的骨壞死或骨細胞死亡、高雪氏病、鐮狀細胞血癥、紅斑狼瘡全身性或非外傷性損傷、骨質營養不良和歸因于實體癌或者骨的癌轉移或惡性溶血疾病的惡疾。
33.按照權利要求1至24中任何一項的復合物的制備方法，所述的方法包括在9.5至12的pH溫育至少一種選自如權利要求1至6中任何一項定義的OCIF、其類似物和變異體的物質和至少一種選自如權利要求1和7至11中任何一項定義的多糖及其衍生物的物質，然后除去未結合所述OCIF、其類似物或變異體的任何游離多糖或其衍生物。
34.按照權利要求33的方法，其中在10至11的pH進行所述的至少一種選自OCIF、其類似物和變異體的物質和所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質的溫育。
35.按照權利要求33或權利要求34所述的方法，其中通過凝膠過濾層析法除去溫育后未結合所述OCIF、其類似物或變異體的任何游離多糖或其衍生物。
36.如權利要求1至24中任何一項定義的復合物，所述的復合物按照權利要求33至35中任何一項的方法制備。
全文摘要
一種新的復合物，該復合物含有至少一種選自破骨細胞形成抑制因子(OCIF)及其類似物及變異體的物質，該物質與至少一種選自多糖及其衍生物的物質結合，該復合物在給予患者時在血流中的滯留時間延長，這對于治療和預防骨代謝疾病是非常有用的。
文檔編號A61K47/48GK1442201SQ02155849
公開日2003年9月17日 申請日期2002年6月29日 優先權日2001年6月29日
發明者山本真一, 岡田純一, 栗原厚, 沼澤琢, 近藤淳一, 津田英資, 望月伸一, 西宏高, 宮崎秀樹 申請人:三共株式會社