專利名稱：Tie2受體介異的靶向性腫瘤基因治療的基因轉移系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因治療領域。具體地，涉及一種基于與促血管生成素受體Tie2結合的配體寡肽GA1的基因轉移系統。該轉移系統通過受體介導的內吞作用，將外源DNA靶向地導入腫瘤新生血管內皮細胞和表達Tie2受體的腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的。
背景技術：
PCT申請PCT/CN97/00106(WO98/18951)公開了用于靶向性腫瘤基因治療的新型的受體介導基因轉移系統，其中公開了包括針對EGFR、IGF I/II R及VEGFR三種受體介導的基因轉移系統用于腫瘤治療。然而，由于不同腫瘤細胞表面的受體多種多樣，表達量有多有少，甚至根本不表達某些受體，因此僅有三種系統不能解決全部的問題。
1996年Davis等發現了一種新的蛋白-Angiopoietin-1(Ang-1)，它是蛋白質酪氨酸激酶受體家族中Tie2受體的配體，Tie2受體幾乎僅在內皮細胞上表達。Ang-1在結構上與已知的血管生成因子或其它蛋白質酪氨酸激酶受體的配體不同，在體外不能直接促進培養的內皮細胞生長，所以推測它可能與腫瘤新生血管的啟動無關，而在血管生成過程的后期起作用，使血管網絡穩定。
在發現Ang-1后，利用同源篩選的方法，Maisonpierre又發現了Angiopoietin-2(Ang2)，該蛋白也可與Tie2受體結合。在體外Ang2不能激活內皮細胞上的Tie2受體，但可以激活其它細胞，如NIH-3T3細胞上的Tie2受體，所以，Ang2的功能可能是與Ang1拮抗，使血管網處于一種不穩定的狀態，有利于內皮細胞的分裂和血管網的重新建立。
這兩種配體的受體-Tie2，發現于1992年。該蛋白由1124個氨基酸殘基組成，當配體與受體結合后，使受體形成二聚體，897位的酪氨酸自身磷酸化并激活激酶活性。Tie2的表達具有相對特異性，在人體內主要表達于新生血管內皮細胞、部分腫瘤細胞和一些造血細胞表面。Tie2基因敲除的小鼠出生后無法存活，病理檢查發現，小鼠體內有血管形成但不能構成復雜的血管網絡。
在多種腫瘤，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌等，及這些腫瘤內的新生血管中，Ang-1和Tie2受體的表達均增高，所以利用阻斷Tie2受體的信號傳導，可以同時抑制腫瘤新生血管和腫瘤細胞的生長，達到直接和間接抑制腫瘤細胞生長的目的。
有文獻報道，利用腺病毒轉導可溶性Tie2受體胞外區基因，可以在體內抑制小鼠乳腺癌4T1和黑色素瘤B16F10.9細胞，抑制率分別達到64％和47％，并有效地抑制了腫瘤的轉移。該研究表明抑制Tie2受體的信號轉導對腫瘤的生長有一定的抑制效應。
綜上所述，本領域迫切需要開發新的、靶向性腫瘤基因治療的基因轉移系統，尤其是利用Tie2受體介導的基因轉移系統。
發明內容
本發明的目的是就是提供一種Tie2受體介導的靶向性腫瘤基因治療的基因轉移系統，它是一種與Tie2受體結合的配體寡肽和內吞小體釋放寡肽所構建的基因轉移系統。
在本發明的第一方面，提供了一種生長因子受體Tie2介導的靶向性基因治療的基因轉移系統，它包含(a)特異性結合于Tie2受體的配體寡肽和(b)多聚陽離子多肽。
較佳地，所述的基因轉移系統還含有(c)內吞小體釋放寡肽。
在另一優選例中，所述的基因轉移系統還含有(d)外源DNA。
在另一優選例中，所述的配體寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGNPSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在另一優選例中，所述的多聚陽離子多肽選自下組多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺(PEI)、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經聚乙二醇(PEG)修飾的上述蛋白及其混合物。
在另一優選例中，所述的外源DNA選自下組抗癌基因、細胞凋亡基因、細胞因子基因、癌基因反義序列的真核重組表達載體DNA，及其混合物。更佳地，所述的外源DNA選自下組
(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)細胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)細胞因子基因GM-CSF(粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子)基因、TNF(腫瘤壞死因子)α基因、INF(干擾素)α、γ基因、IL(白細胞介素)2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反義序列癌基因ras、c-myc、Akt的反義序列；(v)真核重組表達載體病毒性真核重組表達載體(逆轉錄病毒重組表達載體、腺病毒重組表達載體、腺相關病毒重組表達載體)以及以SV40、CMV啟動子為順式調控元件的非病毒真核重組表達載體。
在另一優選例中，所述的組分(a)配體寡肽GA1、(b)多聚陽離子多肽和(c)內吞小體釋放寡肽中的兩者或三者以融合蛋白形式存在。
在另一優選例中，所述的內吞小體釋放寡肽元件選自下組HA20或VP-1。
在本發明的第二方面，提供了一種寡肽，它結合于Tie2受體，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在本發明的第三方面，提供了一種制備生長因子受體Tie2介導的靶向性基因治療的基因轉移系統的方法，包括步驟將(a)特異性結合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽和任選的(c)內吞小體釋放寡肽混合在一起，形成混合物。較佳地，對于組分(a)、(b)、(c)而言，可以使用任何二者形成二元復合物。
圖1是本發明的GA1基因轉移系統將β-gal基因導入人肺腺癌細胞系SPC-A1的X-gal染色結果。
A.GA1基因轉移系統介導β-gal基因進入SPC-A1(×400)B.GA1基因轉移系統介導β-gal基因進入SPC-A1(×100)C.生理鹽水對照D.空質粒β-gal對照圖2是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導外源β-gal基因在體內的分布情況。其中，A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腦；G.胃；H.腸。
圖3是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導外源β-gal基因在不同時間(1、2、3、7天)在裸鼠皮下所荷人黑色素瘤A375中的表達情況。其中，A第一天；B第二天；C第三天；D第四天。
圖4是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肺腺癌SPC-A1中的表達情況。
圖5是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌SMMC-7721中的表達情況。
圖6是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人胃腺癌SGC-7901中的表達情況。
圖7是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人乳腺癌BCaP-37中的表達情況。圖中放大的部分為一個小血管。
圖8是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表達情況。
圖9是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表達情況。
圖10是體內實驗中，GA1基因轉移系統轉導β-gal基因在裸鼠皮下所荷人宮頸癌移植瘤中的表達情況。
圖11是人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠皮下腫瘤在注射GA1基因轉移系統轉導p53基因三周后各個組瘤塊體積大小的比較。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，制備了特異性結合于Tie2受體的配體寡肽以及基于該配體寡肽的基因轉移系統。利用本發明配體寡肽識別Tie2受體的特性，經細胞的內吞作用，通過該載體系統將外源DNA選擇性地導入表達Tie2受體的腫瘤新生血管內皮細胞或腫瘤細胞，從而可以同時抑制血管新生和腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。在此基礎上完成了本發明。
配體寡肽配體寡肽是本發明靶向性非病毒載體的關鍵組分。如本文所用，“配體寡肽(Ligand oligopeptide，LOP)”和“受體識別寡肽”可互換使用，指任何識別并結合于表面含Tie2受體的靶細胞的寡肽。如上所述，本發明的配體寡肽可特異性識別并結合于Tie2受體。
一類特別優選的配體寡肽是長度為15-30個氨基酸，且含有基本單元序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)的寡肽。特別優選的例子是寡肽GA1，其氨基酸序列為WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。GA1的氨基酸序列是根據對促血管生成素1和2的氨基酸序列的生物信息學分析而得出的。
此外，本發明的配體寡肽還包括一個或幾個(通常1-8個，較佳地1-5個)位點的氨基酸可以用類似性能的氨基酸代替所形成的配體寡肽。
本發明的配體寡肽可以含有單個基本單元序列，或多個(如2-10個)基本單元序列。
本發明的配體寡肽可方便地用人工合成或基因工程重組方法制備。關于這些合成寡肽制法，可參見諸如WO98/18951(PCT/CN97/00106)等諸多文獻。
多聚陽離子多肽多聚陽離子多肽是本發明靶向性非病毒載體的的另一關鍵組分。
如本文所用，“多聚陽離子多肽”指一類富含堿性氨基酸的多肽，其堿性氨基酸(賴氨酸、組氨酸和精氨酸)比例約20％以上，因而帶正電荷，能與帶負電荷的DNA藉靜電引力結合，使DNA更穩定。
可用于本發明的多聚陽離子多肽沒有特別限制，只要其堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)比例約20％以上，較佳地30％，更佳地40％以上，因而帶正電荷即可。代表性的例子包括多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經聚乙二醇(PEG)修飾的上述蛋白及其混合物。
內吞小體釋放寡肽元件本發明的靶向性非病毒載體還可含有內吞小體釋放寡肽元件，它起到防止內吞入細胞的DNA被降解的作用。
任何內吞小體釋放寡肽都可用于本發明，代表性的例子包括(但并不限于)HA20、VP-1。
靶向性非病毒載體如本文所用，本發明的“靶向性非病毒載體”指含有以下組分(a)和(b)、或者含有組分(a)、(b)和(c)的混合物或復合物(a)特異性結合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽、(c)內吞小體釋放寡肽。
在本發明中，組分(a)、(b)、(c)可以是非連接形式，也可以任何兩者或三者通過共價或非共價方式連接在一起。特別優選的形式包括配體寡肽—多聚陽離子多肽二元復合物、多聚陽離子多肽—內吞小體釋放寡肽二元復合物、配體寡肽—多聚陽離子多肽—內吞小體釋放寡肽三元復合物。例如HA20-多聚賴氨酸、HA20-魚精蛋白、HA20-組蛋白共價連接物等。
連接可以通過化學法(如使用SPDP等偶聯劑)，也可以通過重組法，例如形成融合蛋白。
對于融合蛋白而言，在(a)配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽，和(c)內吞小體釋放寡肽元件之間，可任選地含有連接肽，以便增加復合多肽空間結構的柔性和舒展性，讓各元件發揮各自的功能。可用于本發明的連接肽沒有特別限制，只要起連接作用即可。一類連接肽例子是(Gly)2-6Ser，例如(Gly)4Ser。連接肽可多個串聯使用。
本發明的(a)配體寡肽，(b)多聚陽離子多肽，和(c)內吞小體釋放寡肽元件都可以用類似性能的氨基酸替代，只要仍保留各自類似的生物功能。
靶向性非病毒載體的制備方法通常，將上述(a)、(b)、(c)組分或其復合物混合在一起，即可獲得本發明的靶向性非病毒載體。其中，(a)、(b)、(c)組分的混合比例通常為0.5-1∶1-2∶0-1，較佳地為0.8-1∶1-1.5∶0.5-1。
此外，當以(a)-(b)復合物和(b)-(c)復合物的形式施用時，(a)-(b)復合物(b)-(c)復合物的混合比例通常為0.8-1.2∶0.8-1.2，較佳地為0.9-1.1∶0.9∶1.1。
外源DNA
可用于本發明的外源DNA沒有特別限制，可以是各種治療性或預防性的DNA，例如目的基因、反義癌基因、抗癌基因、自殺基因、細胞調亡基因、細胞因子基因、或其組合，或者含有上述基因的真核表達載體DNA。原癌基因反義序列包括原癌基因(rasH、rasK、rasN、c-myc、bcl-2、Akt)、生長因子及其受體基因的反義DNA序列、反義寡核苷酸及反義寡脫氧核苷酸；抑癌基因包括p53、Rb、PTEN，自殺基因包括HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)基因；細胞凋亡基因包括p15、p16、p21WAF-1；細胞因子基因包括GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)基因，TNFα(腫瘤壞死因子)基因，INF(干擾素)α、γ基因，IL(白細胞介素)2、3、4、12、15、18基因等。
靶向性基因導入系統將本發明的靶向性非病毒載體與外源DNA混合，就構成Tie2受體介導的靶向性腫瘤基因治療的基因導入系統。取決于所用的外源DNA，本發明的基因導入系統可用于治療遺傳疾病或腫瘤等疾病，尤其是用于基因治療。
藥物組合物本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的一種或多種本發明的靶向性非病毒載體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。
施用時，藥物組合物中還含有一種或多種上述的外源DNA。
具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
本發明的主要優點在于，(1)本發明的Tie2受體介導的基因治療用非病毒載體，利用了腫瘤組織中血管內皮細胞及腫瘤細胞表面Tie2受體高表達的特點，可有效地將外源基因相對靶向性地導入腫瘤新生血管的內皮細胞和表達Tie2受體的腫瘤細胞，達到抑制腫瘤細胞生長的目的。
(2)本系統有可能將外源治療性基因同時導入腫瘤細胞及腫瘤新生血管內皮細胞，通過抑制腫瘤血管新生和直接抑制腫瘤細胞，達到對腫瘤生長的雙重抑制效果。
(3)另外該系統還有可能應用于其它與血管增生有關的疾病，如糖尿病性眼疾、風濕性關節炎等。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1非病毒載體的構建A.各組分的獲得(1)配體寡肽GA1的合成采用美國ABI公司的多肽合成儀并按照其多肽合成操作手冊進行合成，柱層析分離得到寡肽GA1，其氨基酸序列為WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
(2)聚L-賴氨酸(Poly-L-lysine，簡寫為P.L.)購自美國SIGMA公司，分子量分布為15000-30000道爾頓。
(3)HA20采用美國ABI公司的多肽合成儀并按照其多肽合成操作手冊進行合成，柱層析分離得到寡肽HA20，其氨基酸序列為GLFEA IAEFI EGGWE ELIEG(SEQ IDNO2)。
B.二元復合物的制備首先，將GA1、HA20和聚L-賴氨酸(Poly-L-lysine，簡寫為P.L.)溶于PSB(0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4，含0.1M NaCl)中，然后，按下列步驟進行反應。
(1)P.L.+SPDP→P.L.-PDP注SPDP是N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯。
P.L.與SPDP(N-)的摩爾比為1∶5，反應時間為2小時，溫度為25℃。反應完畢后通過透析去除未反應的SPDP。P.L.-PDP冷凍干燥。
(2)P.L.-PDP干粉溶于PSB中P.L.-PDP+DTT→P.L.-SH注DTT是二硫蘇糖醇。
反應中DTT過量，反應時間為1小時，溫度為25℃。反應完畢后通過透析去除未反應的DTT。產物冷凍干燥。
(3)GA1+SPDP→GA1-PDPHA20+SPDP→HA20-PDPGA1、HA20與SPDP的摩爾比均為1∶5，反應時間為2小時，溫度為25℃。反應完畢后通過MWCO1000的透析袋透析去除未反應的SPDP。產物冷凍干燥。
(4)GA1-PDP、HA20-PDP和P.L.-SH干粉均溶于PSB中。
GA1-PDP+P.L.-SH→P.L.-GA1HA20-PDP+P.L.-SH→P.L.-HA20GA1-PDP、HA20-PDP與P.L.-SH的摩爾比為3∶1，反應時間為24小時，溫度為25℃。反應完畢后通過透析去除未反應的GA1-PDP和HA20-PDP。
C.靶向性非病毒載體的制備分別以質量比1∶1、0.8∶1.2、1.2∶0.8混合P.L.-GA1與P.L.-HA20，即得所需的非病毒載體。
或者，按質量比1∶1.5∶1將GA1、聚賴氨酸和HA20混合在一起，形成所需的非病毒載體。
實施例2質粒DNA的抽提與純化本實施例中所用重組真核表達載體質粒DNA的分離與純化均利用QIAGEN公司的Maxi plasmid kit而得到的DNA純品。
從LB平板上挑選單克隆接種于含氨芐青霉素的5mlLB培養基中，37℃，250rpm振搖過夜。1∶1000轉接于含氨芐青霉素的200ml LB培養基中，37℃，250rpm振搖16小時。轉移菌液于500ml離心管中，4,000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，收集菌體。沉淀重懸于10ml Buffer P1(50mM Tris·Cl，pH8.0，10mM EDTA pH8.0，100μg/ml Rnase A)。加入10ml Buffer P2(200mM NaOH，1％SDS)后輕輕顛倒4-6次，混勻，室溫下靜置5分鐘。加10ml Buffer P3(3.0M NaAc，pH5.5)，顛倒混勻后，轉移至50ml離心管，10,000rpm，4℃離心30分鐘，取上清。上清經四層無菌過濾到QIAGEN Maxi質粒抽提柱中(預先用10ml Buffer QBT平衡)，讓其自然流下，等上清完全進入柱中，再加Buffer QC 30ml洗滌二次，最后加入BufferQF 15ml，收集流出液，加入0.7倍體積異丙醇，10,000rpm，4℃離心30分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀1次，室溫下自然干燥，溶于適量體積的TE(pH 8.0)中，1％瓊脂糖凝膠電泳堅定DNA的質量，紫外分光光度計檢測其純度并定量，-20℃保存。
實施例3四元復合體基因導入系統的構建1).GA1-P.L.和HA20-P.L.溶解于水后，經0.22μm濾器過濾除菌，-20℃儲存備用。所有質粒經QIAGEN柱提取和純化，再用2倍體積的酒精和1/3體積的3M NaAc沉淀，75％酒精洗一次后，空氣中干燥。用適量MilliQ水溶解，使濃度成為0.2μg/μl。
2).非病毒載體與DNA形成復合物時二者之間的最佳質量比。
0.2μg CMV-β-gal質粒DNA與非病毒載體以質量比1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2混合，25℃靜置30分鐘，以1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的阻滯情況，確定最佳質量比。
3).按上述確定的配比制備四元復合體基因轉移系統。
實施例4 GA1基因導入系統轉導CMV-β-gal基因的體外導入實驗1).細胞培養SPC-A1細胞傳代培養SPC-A1細胞用0.25％胰酶消化后，接種于細胞培養瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM完全培養液，在37℃、5％CO2培養箱中培養。
2).體外導入實驗培養細胞用0.25％胰酶消化后，接種于六孔板中，每孔1.5×105，第二天細胞滿度約60％時，于1ml培養液中加入相當于2μg DNA的四元復合體基因轉移系統。轉染24小時后，換新鮮的含10％小牛血清的DMEM完全培養液，繼續培養24小時。然后細胞用PBS洗2次，加入新鮮配制的固定液于室溫固定10分鐘，再用PBS漂洗3次，每次15分鐘，以徹底去除固定液，用濾紙吸干瘤塊和臟器上的PBS，加入新鮮配制的染色液于37℃保溫24小時后，觀察外源基因導入的情況(染色液組成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)。
結果如圖1所示。由圖中可以看出，轉導β-gal基因的細胞呈藍色，而分別加入生理鹽水和單純質粒的對照組則未見外源基因的導入。
實施例5 GA1基因導入系統轉導pCMV-β-gal基因在體內的分布取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因導入系統100μl。于第2天后犧牲裸鼠，取裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等臟器用上述方法進行染色并進行冰凍切片和復染。
結果見圖2所示。結果表明，心、肝、肺、腎、腦均未見藍染，而在脾臟中有外源基因導入。而在胃、腸粘膜中，雖然也有藍染，但是我們實驗室對未作任何處理的裸鼠胃、腸進行染色，腺上皮細胞也發現有藍染，說明這些組織中存在非特異性的半乳糖苷酶活性。
實施例6 GA1基因導入系統轉導pCMV-β-gal基因在不同時間的表達情況取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因導入系統100μl，在注射后的第1、2、3和7天犧牲裸鼠，取出皮下腫瘤，按方法6進行組織染色和切片，于光學顯微鏡下觀察結果并拍照。
結果見圖3。結果表明，GA1基因導入系統導入的基因在第1天即開始有表達，第2天表達量最多，以后開始減少，至第7天仍有一定量的表達。
實施例7體內導入實驗取荷不同腫瘤的裸鼠(SPC-A1肺腺癌、SMMC-7721肝癌、SK-OV-3卵巢癌、SGC胃癌細胞株、A375人黑色素瘤、BCaP-37人乳腺癌、荷人宮頸癌移植瘤裸鼠)，于皮下瘤周注射相當于0.2μgβ-gal DNA的GA1基因導入系統100μl，在注射后48小時犧牲裸鼠，取皮下腫瘤，用PBS漂洗2次，加入新鮮配制的固定液于室溫固定20分鐘，再用PBS漂洗3次，每次15分鐘，以徹底去除固定液，用濾紙吸干瘤塊和臟器上的PBS，加入新鮮配制的染色液(染色液組成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)，于37℃保溫24小時后，觀察瘤塊導入外源基因的情況，48小時后進行石蠟切片，然后用核固紅對病理切片進行復染，觀察外源基因導入情況(是否有藍色斑點產生)。
結果如圖4-10所示。可以看出，在腫瘤包膜及腫瘤內的部分血管中有報告基因的表達。由于在部分腫瘤細胞的表面也存在Tie2受體的表達，所以在腫瘤細胞內也可觀察到有外源基因的表達。
這表明，本發明的基因轉移系統，可有效地介導外源基因靶向性地導入腫瘤包膜及腫瘤內的部分血管和腫瘤細胞。
實施例8體內有效實驗1)荷瘤裸鼠的準備將A375人黑色素瘤細胞株接種于5周齡裸鼠皮下，待瘤直徑長至0.5cm后，作為瘤源。犧牲裸鼠，取出瘤塊并切割成大小約1mm3碎塊，用穿刺針接種到6周齡裸鼠皮下。
一周后，待腫瘤長到直徑約為0.3-0.4cm時，挑選出瘤體均勻的動物，隨機分為5組，每組6只備用。
2)GA1系統介導pCEP-p53基因的有效實驗實驗分五個組，分別是①生理鹽水組，
②非病毒載體組(1μg GA1-PL)，③單純質粒pCEP-p53組(1μg pCEP-p53質粒)，④低劑量組(每只注射相當于0.2μg質粒的四元復合體基因轉移系統)，⑤高劑量組(每只注射相當于1μg質粒的四元復合體基因轉移系統)。
每周注射一次，持續1個月。每周用游標卡尺測量裸鼠皮下瘤體的長(a)、短(b)徑，根據V＝πab2/6計算瘤體積。
實驗結果如表1，圖11所示。結果表明，五個組的平均值分別為①1.498±0.600cm3②1.734±0.811cm3③1.727±0.526cm3④1.169±0.381cm3⑤0.731±0.328cm3，高劑量組與①、②、③組相比，抑制率分別為51.2％、57.8％、57.7％，并且與三個對照組的差別均有顯著意義(P＜0.05)，而低劑量組只與單純質粒組的差別有顯著意義(P＜0.05)。這表明，本發明基于Tie2受體的配體寡肽的基因轉移系統，可有效地介導pCEP-p53基因進入細胞并有效的抑制人黑色素瘤A375的生長。
表1體內有效實驗中瘤塊體積的比較①生理鹽水 ②空載體 ③單純質粒 ④高劑量 ⑤低劑量0.849 0.697 1.218 0.315 0.9280.998 0.934 1.277 0.421 0.9411.094 1.752 1.286 0.558 1.0001.735 2.037 1.979 0.719 1.1152.0036 2.081 2.353 1.120 1.2322.306 2.901 2.248 1.255 1.795平均值± 1.498± 1.734± 1.727± 0.731± 1.169±標準差 0.600 0.811 0.526 0.381 0.328在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>Tie2受體介導的靶向性腫瘤基因治療的基因轉移系統<130>025446<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>結合于Tie2受體的配體寡肽<400>1Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp15 10 15Leu Gly Asn<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>內吞小體釋放寡肽HA20
<400>2Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Glu1 5 10 15Leu Ile Glu Gly20
權利要求
1.一種生長因子受體Tie2介導的靶向性基因治療的基因轉移系統，其特征在于，它包含(a)特異性結合于Tie2受體的配體寡肽和(b)多聚陽離子多肽。
2.如權利要求1所述的基因轉移系統，其特征在于，它還含有(c)內吞小體釋放寡肽。
3.如權利要求1或2所述的基因轉移系統，其特征在于，它還含有(d)外源DNA。
4.如權利要求1所述的基因轉移系統，其特征在于，所述的配體寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
5.如權利要求1所述的基因轉移系統，其特征在于，多聚陽離子多肽選自下組多聚賴氨酸、聚乙酰亞胺、魚精蛋白、組蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，經聚乙二醇修飾的上述蛋白及其混合物。
6.如權利要求3所述的基因轉移系統，其特征在于，所述的外源DNA選自下組抗癌基因、細胞凋亡基因、細胞因子基因、癌基因反義序列的真核重組表達載體DNA，及其混合物。
7.如權利要求3所述的基因轉移系統，其特征在于，所述的外源DNA選自下組(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)細胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)細胞因子基因GM-CSF基因、TNFα基因、INFα、γ基因、IL2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反義序列癌基因ras、c-myc、Akt的反義序列；(v)真核重組表達載體病毒性真核重組表達載體以及以SV40、CMV啟動子為順式調控元件的非病毒真核重組表達載體。
8.如權利要求3所述的基因轉移系統，其特征在于，所述的組分(a)配體寡肽GA1、(b)多聚陽離子多肽和(c)內吞小體釋放寡肽中的兩者或三者以融合蛋白形式存在。
9.如權利要求2所述的基因轉移系統，其特征在于，所述的內吞小體釋放寡肽元件選自下組HA20或VP-1。
10.一種寡肽，其特征在于，它結合于Tie2受體，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
全文摘要
本發明提供了一種由促血管生成素受體Tie2介導的基因轉移系統，它包括它包含(a)特異性結合于Tie2受體的配體寡肽、(b)多聚陽離子多肽和任選的(c)內吞小體釋放寡肽和(d)外源DNA。所述基因轉移系統能有效地在體內外將外源基因靶向性地導入腫瘤新生血管內皮細胞和表達Tie2受體的腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長。
文檔編號A61K31/7088GK1504235SQ0215090
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月2日 優先權日2002年12月2日
發明者顧健人, 韓峻松, 田培坤 申請人:上海市腫瘤研究所