用于治療發生缺血患者的組合物的制作方法

專利名稱：用于治療發生缺血患者的組合物的制作方法
技術領域：
本發明的領域本申請是1996年3月6日在中國提出的申請號為96193176.0的中國專利申請的分案申請，本申請涉及用于治療發生缺血患者的組合物，其包括胞磷膽堿和至少一個第二治療劑或它們的不同藥用鹽，及藥用載體。
本發明的背景大腦由于其存活及功能方面的原因較其它組織更需要恒定的有氧血流供應。雖然大腦只占體重的2％，但是它卻接受心臟輸出血量的15％并消耗全身所需氧的20％。此外，大腦還需要恒定的血流供應以提供葡萄糖，因為葡萄糖是大腦的主要能量底物，其可產生高能磷酸化物如ATP。
缺血是指組織喪失血流。腦缺血是指供應大腦的動脈血流被阻斷或者減少，通常是由于血凝塊(血栓)或者其它東西(栓子)阻塞動脈所致。局部血管區域血流的喪失稱為局部缺血，整個大腦血流的喪失則為腦缺血。
一旦喪失血流，即沒有氧氣及葡萄糖的供應，腦組織可出現缺血性壞死或者梗塞。由此導致的細胞變性及死亡的代謝變化有因ATP耗竭而致的能量障礙；細胞酸中毒；谷氨酸釋放；鈣離子內流；刺激膜磷脂變性及隨后產生的游離脂肪酸聚集；自由基產生。
基于對上述變化的了解，研究者已經在嘗試對一些類型的缺血損傷使用例如鈣離子通道阻滯劑，谷氨酸及甘氨酸拮抗劑，CDP-胺類，自由基清除劑/抗氧化劑，全氟烴及溶栓劑以改善腦血流供應及/或神經系統情況，這些制劑的療效是多種多樣的。的確，有些血管擴張劑可以改善血流供應，所以也可用作為抗缺血制劑。然而，沒有一種制劑可以減少梗塞面積，尤其是中風病人的梗塞面積。雖然有些研究認為鈣通道拮抗劑可以減少梗塞范圍，但是這些研究的結果尚不一致，并且還有一些意想不到的副作用，如脈壓或者灌流壓減小。可參見如Kaste，M.et al.Strike(1994)251348-1353。
更具體地講，在某些特定的實驗條件下，谷氨酸拮抗劑可減少梗塞的面積，可參見文獻如Olney，J.W.et al.Science(1991)2541515-1518。然而大多數這類化合物可引起大腦空泡形成，并且還可引起動物和人的苯環利定樣主觀癥狀。攝入苯環利定可引起情緒興奮，精神焦慮，情緒不穩定及長期精神病。
自由基清除劑/抗氧化劑為一組種類各異的化合物。總的來講，這類化合物減少梗塞面積的作用不是很一致。例如，已經發現超氧化物歧化酶抑制劑只有在腦室內注射的情況下才可減少梗塞面積。參見文獻Kinouchi，H.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)8811158-11162。另外還發現其它化合物如LUBELUZOLE在臨床上也有療效，但安全劑量范圍很窄。參見文獻Diener，H.C.et al.Stroke(1995)2630。
雖然，全氟烴對缺血性中風有一定療效，但由于這類化合物的半衰期很長，故在使用時須直接注入腦脊液中。此外還觀察到這類化合物可引起性腺肥大。參見文獻Bell，R.D.et al.Stroke(1991)2280-83。
溶栓制劑如t-PA(組織纖溶酶原激活劑)，鏈激酶，尿激酶也有希望用來治療缺血。然而，這類制劑有增加顱內出血的傾向，這就可以導致死亡率增加。參見文獻del Zoppo，G.J.et al.Seminars in Neurology(1991)11(4)368-384；The Ancrod Stroke Study Invest igators，Strode(1994)251755-1759；Hacke，W.et al.Stroke(1995)26167。另外，由于該類制劑須在中風發生最初的三個小時內使用，這也限制了這些制劑的有效性。
胞磷膽堿單鈉是胞苷-5′-二磷酸膽堿(CDP-膽堿)的一種外源形式。外源性CDP-膽堿是膜卵磷脂生物合成中的關鍵中間產物，它對維持細胞完整性的動態調節非常重要。磷脂對維持神經元的功能也是非常重要的，而缺血時可導致膜降解。
已有臨床實驗對胞磷膽堿進行了非常詳盡的研究。這些實驗的結果顯示其可改善各種臨床癥狀，包括頭痛，眩暈，運動失調及失眠。這些實驗還顯示其可改善運動功能，減少中風后遺癥。可是，在這些實驗中胞磷膽堿僅用于可能患中風的恢復期病人，這種治療是在推測的缺血情況發生后進行的。這些實驗還表明中風及頭顱創傷的病人可以耐受數周劑量范圍在250mg/天到1000mg/天的胞磷膽堿治療。
胞磷膽堿的所有治療效果可能與增加缺血大腦中的磷脂合成從而穩定細胞膜有關，本發明者認為以前的研究并沒有意識到這一點，因為以前的研究只是在缺血發生后才使用胞磷膽堿，而且治療的目的也只是促進病人的恢復。另外，這些治療的時間也不夠長。
中風是一種危害極大的疾病，在美國每年大約有500,000人患此病。臨床醫生僅靠支持措施及非特異制劑如類固醇和甘露醇來減少腦水腫。中風病人中有25％到50％的人癱瘓，所以目前迫切需要改進治療這些病人的方法。
雖然已有研究顯示如果能在中風后的最初的3小時內通過靜脈給予溶栓劑治療會有一定的療效，但是如果有一種口服藥物在中風后24小時內給予，并會在中風后3個月改善神經系統的情況，那么這種藥物治療會成為治療中風的重要新式武器。
本發明概述本發明涉及用于治療發生缺血患者的組合物，其包括胞磷膽堿和至少一個第二治療劑或它們的不同藥用鹽及藥用載體。有多種疾病可引起缺血，如缺血性中風，這種方法為給予病人有效劑量的胞磷膽堿或者其藥用鹽。這類疾病包括有血栓或者出血性中風，腦血管痙攣，低血糖，心臟停跳，癲癇狀態等，另外還可包括精神分裂癥，癲癇，神經變性疾患，早老性癡呆和亨廷頓舞蹈病。
本發明還涉及使用胞磷膽堿制備減少梗塞體積，尤其是腦梗塞體積的藥物。其包括是將有效劑量的胞磷膽堿與藥用載體混合。
給予有效劑量的胞磷膽堿減少梗塞體積的這種方法應在缺血后短時間內最好是24小時內進行。隨后還應給予一段時間的胞磷膽堿，一般至少大約一周(5-10天，以至少7天為較好)，以幾周到數周為最好(如3-8周，以至少6周為較好)。劑量可在一定的范圍內變化。一般地來講，每天可以一次或者多次服用100-2000mg胞磷膽堿，在治療期間以一天一次給藥為較好。每天一次給藥量以500-1000mg為較好，但以500mg為更好。另外，上述藥物的單劑量每天也可多次給予，如需要也可一天兩次。
胞磷膽堿對于減少由缺血引起的梗塞體積要較其它制劑有更多的優點。由于其是一種內源性化合物，胞磷膽減本身是很安全的。胞磷膽堿具有低毒且治療指數高的特性。
胞磷膽堿的另一個優點是其具有多種作用機制。雖然胞磷膽堿對于減少梗塞大小的各種機制目前尚不清楚，但胞磷膽堿及其水解產物-胞苷和膽堿-對于膜形成及修復過程中磷脂的產生起很重要的作用。另外，這些化合物還可影響一些重要的代謝功能，如核酸及蛋白質的形成，神經遞質乙酰膽堿的合成。參見文獻Ulus，I.H.et al.Brain Research(1989)484217-227。這樣在缺血的情況下，胞磷膽堿可有如下功能(1)通過提供維持膜需要的底物來穩定膜；(2)通過提供重要的膜形成底物修復受損的膜；(3)通過提供形成乙酰膽堿所需的底物恢復神經元功能。此外與其它已被提出的治療制劑不同，胞磷膽堿不僅可減少初始的梗塞體積，還可修復已受損的區域。
這樣本發明的其中一個目的是提供一種方法以增進中風及頭顱損傷患者的恢復。所以本發明的另一個目的是在缺血發生的很短時間內，以24小時內為較好給予患者胞磷膽堿。當然胞磷膽堿的首劑最好在缺血后的12小時到15小時內給予。
另外，本發明還有一個目的就是提供一種用來減少病人梗塞體積的方法，這些疾病包括有缺血性中風，頭顱創傷或者可引起器官組織血流喪失的任何疾病。
在讀了上述的討論以及下面有關本發明優選實施方案的其它詳盡的說明后本領域普通技術人員將會清楚本發明的各種目的。
附圖的說明

圖1所示為載體對照組，100mg/kg胞磷膽減及500mg/kg胞磷膽堿治療組動物的梗塞體積棒狀圖。數值為均數+標準誤(SD)。
優選實施方案的詳細描述本發明為一種減少梗塞體積的方法，該方法是在缺血發生后的很短的時間里，每天給予一到四個劑量的胞磷膽堿或者其藥用鹽，每個劑量約從100mg到2000mg，隨后持續使用一周(如7天)到數周，一般4到8周，以5-8周為較好，但最好是持續使用至少6周。
不拘泥于理論，胞磷膽堿應至少有兩個作用機理限制如中風或嚴重頭顱創傷所引起的腦損害以及幫助受損的神經組織進行修復。
現認為給予胞磷膽堿可通過防止毒性游離脂肪酸的聚集來限制梗塞或者受損組織的范圍。此外還認為給予胞磷膽堿后，它可分解成兩種成分，胞苷和膽堿，而這兩種成分是合成細胞膜所需的底物。另外還推測為使大腦功能正常，因中風而受損的神經細胞須合成新的膜物質。正象如下所述的，中風動物模型臨床預實驗顯示給予胞磷膽堿可明顯地減少梗塞體積。這一結果得到了下面的一個有關人的臨床調查的證實，在這項調查中，所選的一組早期給予胞磷膽堿治療的病人均經過核磁共振影像技術的檢查。
本發明的目的是使用胞磷膽堿這樣一種新的重要的方法減少因腦缺血引起的梗塞體積。雖然認為穩定膜對于缺血是有益的，但目前還未完全證實穩定膜可以減少梗塞體積。本發明意外地發現使用胞磷膽堿僅7天即可明顯地減少梗塞體積，其機理可能是由于改變卵磷脂合成從而影響膜形成所致。
在一例通過縫術阻斷大腦中動脈(MCA)而造成前腦暫時缺血的大鼠模型中，可證實胞磷膽堿對大腦的保護作用。在試驗中與對照相比，采用500mg/kg的胞磷膽堿治療可顯著地減少平均梗塞體積。
胞磷膽堿一般是以藥用鹽的形式經口給予。一般采用胞磷膽堿的單鈉鹽，因這種形式很容易達到藥用純度。
如上所述，基于本發明的治療應至少在缺血發生后約24小時內進行，以發病后12到15小時內進行治療為較好，但發病后越早治療越好。具體地講，治療應至少持續約7天，以至少持續14天為較好，但最好是至少持續約30天。
依據本發明的說明可以知道本發明發現了一種可以減少經歷缺血病人梗塞體積的方法，其包括在缺血發生后的很短的時間內，一般不超過24小時，給予首劑有效劑量的胞磷膽堿或者其鹽，隨后至少一周持續給予有效維持劑量的胞磷膽堿或者其鹽。首劑以在缺血發生后的12到15小時內給予較好，隨后至少7天給予維持劑量的胞磷膽堿或者其鹽，但以14天為較好，30天為最好。
所用的胞磷膽堿或者其藥用鹽的劑量每天約從500mg到1000mg，可一次或分多次給予，以每天一到二次為較好。
本發明發明了一種治療經歷缺血尤其是腦缺血，腦創傷等病人的很好的方法。但是，應該強調首劑有效劑量的胞磷膽堿或者其藥用鹽應在缺血發生后盡可能短的時間內給予，而且不應超過24小時。
所使用劑量的范圍很大。本發明中的胞磷膽堿每天可使用100mg到1000mg，并可一到四次分別服用。例如，如果每天服用一次胞磷膽堿，可給予的劑量為100mg到4000mg，但以每天500mg到2000mg為較好。在本發明的一個實施方案中每天所用的劑量為1000mg。
作為醫用，要取得治療效果所用的胞磷膽堿或者其鹽(活性成分)的劑量依據給藥途徑及所治療的特殊疾病而有所不同。對一個患有這里描述的疾病的哺乳類動物，活性成分的全身給藥的合適劑量范圍在每天100mg到4000mg之間，以每天1000mg為較好，500mg分二次給予。每天劑量為1000mg的胞磷膽堿可使血漿中的胞磷膽堿濃度達到1.5ng/ml，這與給予大鼠500mg/kg/天的胞磷膽堿所產生的血漿濃度相同，有關這些還將在實例中作進一步的闡述。然而，已有研究表明每天500mg的胞磷膽堿即可得到很好的治療效果，而同時又可減少某些病人可能出現的眩暈副作用。
在本臨床調查中，有二百五十九名病人在缺血性中風發生24小時內接受治療。病人被隨機地分在安慰劑治療組或者三個口服治療組的一個組(每天500mg，1000mg或者2000mg)，治療持續六周，隨后再監測六周。經過Barthel指數評估，中風發生后12周主要可見神經功能的改善。
每天接受500mg或者2000mg胞磷膽堿治療的病人，依據Barthel指數評估，在12周要比接受安慰劑治療的病人有明顯的改善(p＜0.05)。每天1000mg治療組有效性評估未見有統計學差異，雖然在這組病人中人數統計的失調及指標變化可完全解釋這一現象。
此外，以另一種著名的Ranking分級法進行評估，經胞磷膽堿治療的病人其全面的神經系統的狀況要較安慰劑治療的病人有明顯地改善(p＜0.04)。
Barthel指數采用100分分級。95或者大于95分為中風完全或者幾乎完全改善。總之，中風后12周，經安慰劑治療的病人中有33％分數大于95，而經每天500mg的胞磷膽堿治療的病人中有53％分數大于95(p＜0.04)。
以另一個結果分級，即NIH分級結果表明在中風后12周經胞磷膽堿治療的病人中有34％，而經安慰劑治療的病人中只有16％獲得功能完全或者大部分恢復，分數以小于或者等于1表示(p＜0.04)。
四個治療組在死亡率上無明顯差別。副作用及實驗室檢查的初步分析表明病人對三個胞磷膽堿的治療量均可很好地耐受。胞磷膽堿治療組病人與安慰劑治療組病人唯一的差別是眩暈及意外受傷如摔倒機會增加。但在500mg胞磷膽堿治療組的病人在這些指標上與安慰劑組沒有明顯區別。
每天給予500mg的劑量并起到療效，但與安慰劑組比較藥物的副作用沒有明顯的差異。本研究顯示每天500mg為適宜的藥物劑量。
雖然活性成分單獨服用是可能的，但還是以活性成分的制劑形式為較好。
適于口服的活性成分制劑可以是分個單位的形式，如膠囊，扁膠囊，片劑或者錠劑；也可以是經再組成的粉末或者顆粒形式；也可是水或者非水的溶液或者混懸液形式；也可是油水或者水油的乳劑形式。另外，活性成分也可為丸劑，藥糖劑或者膏劑的形式。
適于非口服給藥的活性成分的制劑應包括活性成分無菌及液化處理。制劑可以是單位劑量的形式并可通過已知的藥理學上的任何一種方法來制備。
除了含有標準的及已知的藥用載體及/或者賦形劑，上述的制劑也可含有其它的有治療活性的物質。因而，本發明還可考慮聯合治療計劃，也就是將胞磷膽堿及至少一種輔助治療劑或者其相應的藥用鹽一起服用。
可考慮作為輔助治療劑有許多種類。這些制劑包括抗血小板藥物(如白功擊素A(Alboaggregin A)，BB-2113，BN-50726，BN-50739，考塞溫M′(Corsevin M′)，C6g-22，Integrelin，KB-3022，Linotroban，血小板因子4，星形孢菌素，S-1452，噻氯砒啶，TP-9201等)，抗凝物質(如α-1抗胰酶，抗凝血酶III，抗凝血酶多肽，阿加曲班，凝血因子Xa，CTC-110，CTC-111及其它蛋白質C產物，CX-398，Deltaparin，Danaproid鈉，依諾肝素，因子XIIa抑制劑，Fraxiparin，肝素，水蛭素，Hirugen，Hoe-203，HV-1，ITF-300，及ITF-1300，單克隆抗體，ONO-3307，過硫化LMW肝素，Raviparin鈉，rTAP，R-020，SC-597，凝血調節蛋白，TMD1-105等)，溶栓及其相應制劑(如Kabi-2161，Kunitz蛋白酶抑制劑，纖溶酶原激活劑，纖溶酶原激活抑制劑，組織纖溶酶原激活劑等)，抗缺血及神經保護制劑(如興奮作用的抑制劑，氨基酸，ACEA-1021，ACPC，Aptiganel，BW-619C，CNS-1145，CNS-1505，CPC-71及CPC-702，右啡烷，右美沙芬，Eliprodil，ES-242-1，FPL-15895，FR-115427，GP-1-4688，L-687414，L-689560，L-695902，LY-104658，LY-235959，LY-274614，LY-293558，美金剛，NNC-07-9202，NS-257，NPC17742，Protara，立馬醋胺，利蘆噻唑，SDZEAA 494，Selfotel，SYM-1010，SYM-1207，YM-90K，MK-801等)。
與胞磷膽堿一起使用的治療制劑還有鈣通道拮抗劑(如AJ-394，AK-275，鈣蛋白酶抑制劑，CD-349，CLENTIAZE，CNS-1237，CNS-2103，CPC-304及CPC-317，達唑地平(DAZODIPINE)，地潑地尼(DIPERDINENE)，依莫帕米，法修地爾(FASUDIL)，拉西地平，利法瑞嗪(LIFARIZINE)，老莫瑞嗪(LOMERIZINE)，鎂，MDL28170，NB-g18，尼伐地平，尼莫地平，NS-626及相應的化合物，SM-6586，SNX-111，S-312-d，U-92032，UK-74505，US-035等)，作用于一氧化氮的制劑，作用于其它神經遞質的制劑(如α2-受體的治療藥物，CV-5197，多巴按受體，艾那道林(ENADOLINE)，拉齊百邁得(LAZABEMIDE)，米爾那西元(MILNACIPRAN)，鈉美芬，RP-60180，SR-57746A，突觸攝取拮抗劑等)，細胞因子，激素及相關產物(如AN-100225及AN-100226，腦衍化神經營養因子，降鈣素基因相關肽，CEP-075及相關化合物，睫狀神經營養因子，內皮細胞因子，內皮素抑制劑，PR-139317，白介素-1受體拮抗劑(脂皮質蛋白)，JTP-2942，巨噬細胞調節化合物，運動神經元營養因子NBI-117，神經生長因子，神經干細胞，中性細胞抑制因子，NS-506，NT-3，胞沙替瑞啉(POSATIRELIN)，雪旺細胞促進劑，sCR1，索嗎濤嗚叮-1(SOMATOMEDIN-1)等)，自由基清除劑(如EPC-K1，MCI-186，尼卡瑞萬(NICARAVEN)，芬那唑叮(PHENAZOVIRDIN)，瑞沙思坦丁(RESORSTATIN)，路潤(RUMBRIN)，超氧化物歧化酶，泰喘拉雜得甲磺酸鹽(TIRILAZAD MESYLATE)，U-88999E，YISSUM PROJECT P-0619，YM-737等)，神經節甙酯及相關產物(如LIGA4，LIGA4，單唾液酸神經節苷脂(GM1)，ND-37，西高苷等)。
此外其它的附屬治療制劑還包括有各種特定酶的調節劑(如CEP-217，CEP-245，CEP-392，CNS-1531，艾伯塞啉(EBSELEN)，艾帕爾瑞思噠(EPALRESTAT)，JTP-4819，K-7259，蛋白酶連接蛋白-1，SK-827，酪氨酸激酶調節劑，Z-321等)，記憶增進劑或者促智劑(如ALORACETAM，膽堿-L-ALFOSCERATE，DN-2574，IDEBENONE，OXIRACETAM，PERACETAM，PRAMIRACETAM，塔克林及其類似物，VINCONATE)，有副作用的神經保護劑(如ADEMETIONINE SULPHATE TOSILATE，ANCROD，APOCUANZINE，CPC-111，CPC-211，HSV載體，KF-17329及KF-19863，LY-178002，MS-153，NICORANDIL，N-3393及N-3398，SUN 4757，TJ-8007，VA-045等)，血液流變學制劑及血液代用品(如DROTAVERINE ACEPHYLINATE，′RheothRx′血液代用品等)及造影或者對比制劑。
由上所述，本發明提供一種治療經歷缺血病人的方法，該方法為在缺血發生的很短時間內，最好不超過24小時同時給予首劑有效劑量的胞磷膽堿及至少另一種輔助治療劑或者其相應的藥用鹽。在首劑同時給藥后，可單獨給予一次或者多次有效維持量的胞磷膽堿，也可單獨給予至少另一種輔助治療劑或者其相應的藥用鹽，另外在維持治療時也可同時給予胞磷膽堿及輔助治療劑。與本發明介紹的其它方法一樣，首劑聯合給藥可在缺血發生后的約12到15小時內進行。聯合給藥這一詞是指將胞磷膽堿及至少另一種輔助治療劑或者其相應的藥用鹽一起服用或者依次服用。
所用的聯合治療的方法包括給予或者聯合給予最好是至少30天的維持劑量。在本發明的具體實施方案體中，聯合給藥的維持量應至少進行4到8周，但以約6個月到1年為較好。另外，在已制定好的療程內，首劑治療或者維持治療每天可同時或者分次服用。預期聯合治療以頭顱創傷及中風的療效為最佳。綜上所述，聯合治療應包括另一種輔助治療劑，該制劑可為t-PA，鏈激酶，甚至阿司匹林或者潘生丁。
因此，有可能提供一種組合物用來治療經歷過缺血的病人，該組合物包括與藥用載體混合的有效治療量的胞磷膽堿及至少另一種輔助治療劑或者其藥用鹽。在該組合物中，活性成分的有效量可依特定的需要而變化。但常用的范圍是從約100mg到1000mg的胞磷膽堿及約10mg到500mg的至少另一種輔助治療劑。
本發明將用下面的實例進行說明，但這些實例僅用于說明，而并非將本發明局限于這些實例的具體說明。
實例動物實驗1首先將大鼠的大腦中動脈(MCA)縫合阻塞制作前腦暫時性的缺血模型，然后通過此模型證實胞磷膽堿對大腦的保護作用。以500mg/kg的胞磷膽堿進行治療與對照組相比可明顯地減少平均梗塞面積。
將30只體重為280-350克的雄性Sprague-Dawly大鼠隨機分為三組，每組10只其中10只動物以500mg/kg的胞磷膽堿進行治療；另10只動物以100mg/kg的胞磷膽堿進行治療；還有10只動物以胞磷膽堿的載體生理鹽水進行治療。
對所有的動物用400mg/kg的水合氯醛經腹腔麻醉。用PE-50聚乙烯導管經左股動脈進行插管，以持續監測動脈血壓及動脈血氣分析樣本的采取。在手術前，缺血后1小時，2小時，再灌流前記錄測定的結果。在手術及MCA阻塞期間，用恒溫加熱控制燈將直腸溫維持在37℃。
如上所述，經血管將右側MCA阻塞。參見參考文獻Minematsu，K.et al.Neurology(1992)42235-240；Zea Longa，E.et al.Stroke(1989)2084-91。簡言之，經過頸中線切口暴露右側頸總動脈及右側頸外動脈。用3-0號絲線縫合遠端CCA及頸外動脈。將4-0號單絲尼龍縫線(40mm長)經火加熱使其一端變為圓環并在表面涂上硅(Bayer，Leverkusen，Germany)，然后將此線經切除的CCA輕輕地插入頸內動脈。將圓環置于距離頸動脈分叉約17mm處，用縫線一端的圓環阻塞一側的前腦動脈的近端，該動脈為MCA及后連接動脈的起始處。為防止出血，用3-0號絲線在動脈切開處遠端輕輕縫合CCA。
動物缺血110分鐘后，經腹腔分別給予500mg/kg的胞磷膽堿；100mg/kg的胞磷膽堿；或者0.3ml的生理鹽水載體(對照)。在組織缺血達到二(2)小時后后，開通MCA并去除股動脈插管，使組織再灌注。動物麻醉恢復后允許自由地進食及飲水。此后持續6天重復胞磷膽堿治療。
治療的第7天，經腹腔給予400mg/kg的水合氯醛再次麻醉并斷頭處死動物。快速取出大腦，檢查確定無蛛網膜下腔出血，然后沿大腦冠狀面將其切成6片2mm厚的切片。將大腦切片在37℃的條件下在2％的2，3，5-氯化三苯基四唑氮(TTC)溶液中孵育30分鐘，然后將其浸入10％的緩沖福爾馬林溶液中進行固定。TTC將正常腦組織(有完整細胞膜)染為紅色；缺血腦組織染為粉色；而壞死腦組織染為白色。每只動物有6個腦切片行TTC染色，用Charge Couple相機(EDC-1000HR Computer Camera，ElectrimCorporation，Princeton，New Jersey)拍照，并將影象儲存在微機內。
已知腦水腫可以影響腦梗塞體積的測量，所以采用一種圖象處理軟件包(Bio Scan OPTIMAS，Edmonds，Washington)進行處理以計算出矯正后的梗塞體積。矯正后的梗塞面積可通過下面的公式進行計算矯正的梗塞面積等于左半球面積減去(右半球面積減去梗塞面積)。矯正后的梗塞體積的計算是用矯正后的梗塞面積乘以切片厚度而得到的。
在對照組中，10只動物中有5只在MCA阻塞后24至48小時之間死亡。100mg/kg組的10只動物中有5只死亡；其中4只是在24至48小時之間死亡，而另一個是在第5天死亡。500mg/kg組中10只有3只死亡；2只是在24至48小時之間死亡，而另一個是在第6天死亡。
如圖1所示，對照組平均的梗塞體積為243.5+88.6mm3(均值+標準差)；100mg/kg組為200.2+19.9mm3；500mg/kg組為125.5+45.2mm3。將對照組與500mg/kg組比較，平均梗塞體積有明顯的差異(p＜0.01，Scheffe′stest)。雖然對照組與100mg/kg組比較未見明顯的差異，但在100mg/kg組梗塞體積有減少的趨勢。
動物實驗2-行為對體重為250-300g的自發性高血壓雄性大鼠，SHRs，進行不同時間可逆性的大腦中動脈(MCA)及頸總動脈阻塞。簡言之，以水合氯醛麻醉動物(以1ml的生理鹽水溶解0.5g/kg的水合氯醛一次注入腹腔，麻醉可持續2小時)，將直徑為0.005英寸的不銹鋼絲線(Small Parts Inc.Miami，FL)置于鼻裂嘴側的左MCA下，并使之位于MCA主分支的近端及豆狀核紋狀體的遠端。然后將動脈提起并順時針旋轉絲線。然后使用兩個無創傷Heifetz動脈瘤夾阻塞左側CCA，以Vasamedics激光血流灌注監測器測定，發現經此處理后導致整個缺血期間梗塞核(MCA阻塞處背側4mm)血流減少到缺血前基值的4-8％。在按預定的時間0-120分鐘范圍內阻塞CCA/MCA后，通過先從CCA去掉動脈瘤夾，然后逆時針旋轉絲線并從MCA下將其去掉。
使用加熱燈及保溫毯將顳肌溫度維持在36.5+0.3℃。由于設計該研究是用來分析運動功能，所以需去除因股動脈插管而造成的創傷，此外該創傷還可干擾行為測定。因而，在手術中未記錄血壓，pH，PO2及pCO2。在缺血的整個過程里及再灌注的頭2個小時大腦的溫度維持在36.2+0.4℃。
在缺血后15分鐘，經腹腔一次性給予0.5-0.6ml用0.9％NaCl溶解的CDP-胞磷膽堿，劑量為0.5g/kg，隨后連續14天每天給予相同的劑量。每天制備新鮮的CDP-胞磷膽堿溶液。對照組大鼠僅以鹽水代替CDP-胞磷膽堿溶液進行注射。
所有行為測試結束后，在缺血后14天進行形態測量分析。這樣可使行為及組織學結果在同一個動物上進行直接的相關比較。MCA/CCA阻塞14天后，缺血大腦的主要特征是梗塞的皮質組織萎縮。所以，缺血損傷量上的變化可通過計算同側及對側腦皮質體積的不同而得出。
缺血后14天在水合氯醛麻醉下處死動物。冷凍大腦并切成2mm厚的切片。使用帶有Drexel大學(DUMAS)分析器的計算機測定每個切片對側及同側腦皮質的面積，并經校對以mm2表示。皮質的體積是通過將各切片皮質面積之和乘以切片間隔的厚度而得到的。最后，萎縮的體積是將同一只大鼠對側皮質的體積減去同側的體積計算而得的。對形態測量分析者并不知道治療的計劃，即采用雙盲法確保數據的可靠性。
行為測定缺血后功能結果的評估采用下面的一套測定，該測定的這種模型已在以前的研究中有效使用過并被標準化。
輪子測試采用直徑12英寸的大鼠跑動輪子，輪子橫檔的間距為2mm，輪子的兩側用貼板封閉，只留一個可開關的結實的蓋子，這樣可將動物限制在輪子內側。將鼠籠內的大鼠限制在輪子內側，當大鼠跑動時以攝象機進行監測。觀察梗塞半球對側前爪所跑的100步，同時記錄該前爪在跑動時在輪子橫檔上滑脫的次數。同樣觀察同側前爪及后肢，記錄每個肢體單位步數中滑脫的數值(錯誤)。通過從對側錯誤的步數中減去同側錯誤的步數得到錯誤的數值。在手術后的4，7及10天每只動物每天測試一次。
上肢彎曲實驗通過提起大鼠的尾巴將其提起，并將其腹側暴露于觀察者10秒鐘。用計時器計時上肢不對稱彎曲的時間。在術后的1-14天每天測試動物一次(每天兩次實驗)。
布帶實驗不對稱實驗及不對稱恢復實驗以前已由Schallert及Whishaw詳細描述過。簡言之，將一個很粘的簽條(環狀直徑1cm)固定在大鼠每只前爪腕的橈骨遠端區域。記錄動物觸及簽條去掉簽條所需的時間及次序(對側與同側)并據此估計同側不對稱性。將大一點的簽條粘附于不優選的腕上并將相應較小的簽條粘附于另一只腕上，根據所需簽條的大小可消除偏差并同時可以量化。用來中和偏差的同側與對側簽條片面積比值越大(從1∶1到1/8∶15/8)，該大鼠所得的分數也越高，表明損傷也越嚴重。除了在手術前至少7天嚴格管理動物，預先不進行訓練。手術后的2-3天測試每個動物(每天測試一次)。
在外科手術前后，將所有動物飼養在各自的鼠籠內，這樣可減少外界環境對大鼠的刺激。至少需兩周的適應期，在此期間動物由同一個研究者管理，該研究者每天進行所有的行為測試(每只動物每天至少10分鐘)。該適應期是要減少接觸動物時所引起的刺激反應，尤其是在進行布帶實驗時適應期尤為重要。采用雙盲法，研究者在進行行為實驗時不知道治療的分組情況。
綜合的行為異常分數行為異常的分數是通過計算三個行為測試的綜合分數而得到的，包括錯誤數量(滑脫數/步數；輪子實驗)，時間(上肢彎曲)，或者分數(去除偏差所需的表面積；布帶實驗)，通過上述3個實驗來定量行為功能的異常。
首先，計算出每只動物在每個實驗中的整個時間內測試的均值。在每個行為測試里，平均2個最低值，并將其從2個最高平均值中減去。然后將均值范圍分為5個等份，隨后從0-4計分。其次，計算所有3個實驗的綜合分數，每個實驗占相同的權重。這樣每個大鼠依據3個不同的實驗進行記分并由此得到綜合分數，最大分數(缺陷)為3×4＝12。
缺血時間與梗塞體積或者行為異常的相關性通過使用行為異常分數及計算出的萎縮體積(mm3)得到未經治療及經CDP-胞磷膽堿治療動物的缺血時間與行為異常分數或者萎縮體積的相關性。
將綜合分數值及萎縮體積輸入計算機，并通過一種計算機曲線軟件程序ALLFIT制成一種描述行為異常/萎縮體積及缺血時間關系的曲線，依據曲線中因缺血導致的最大行為功能異常/最大萎縮體積(BDMAX\VolMAX)，引起半數最大行為功能異常/萎縮體積(BD50\T50)，及曲線的形態和坡度來進行分析。本分析中采用的計算機程序(ALLFIT)使用邏輯功能y＝(a-d)/[1+(xXc)b]+d，其中y為行為異常分數，x為缺血時間，a為x＝0時的反應，d為BDMAX-VolMAX，b為決定曲線陡度的因子，c為BD50/T50。該程序是用來同時適應一組S型劑量效應曲線而設計的，程序是由NIH的理論及物理生物學實驗室得到的。
統計學分析計算組間BD50/T50及BDMAX-VolMAX的統計學差異，計算中采用ALLFIT所提供數值相應的對數均數及標準誤，并采用student′st檢驗進行評估。
結果組織學-萎縮體積的分析在鹽水對照組及CDP-胞磷膽堿治療組相應的分別有18及23只大鼠。在導致半數最大萎縮(T50)的再灌注之前服用14天的CDP-胞磷膽堿可明顯地延長缺血的時間。
由ALLFIT程序計算出的對照組(未治療組)動物的T50為38.3+5.9分鐘，而經CDP-胞磷膽堿治療的動物為60.5+4.3分鐘。在此模型中，CDP-胞磷膽堿沒有減少最大梗塞體積；對照組及CDP-胞磷膽堿治療組VolMAX相應地為103.3+13.6mm3及101.6+11.4mm3。
上述結果表明CDP-胞磷膽堿主要是在導致亞最大損傷的缺血比較短的時間里服用才可減少形態學損傷。這些結果還是強調胞磷膽堿應在缺血發生后短時間內，即盡快地服用。
行為分析實驗分析了16只未經治療及21只經胞磷膽堿治療的大鼠。與在組織學分析中所觀察到的類似，CDP-胞磷膽堿治療可明顯地延長BD50。對照組大鼠的BD50為41.9+4.6分鐘。而經CDP-胞磷膽堿治療后可延長BD50約30分鐘，為72.9+24.5分鐘。
CDP-胞磷膽堿治療對BDMAX無明顯作用；在對照組及CDP-胞磷膽堿治療組其值相應地為8.5+0.7及10.1+4.0。
上述數據表明通過較長時間的CDP-胞磷膽堿治療由于延長了T50及BD50因而明顯地改善了組織學變化及功能的恢復。可是，在該實驗中CDP-胞磷膽堿對VolMAX及BDMAX沒有影響。這些結果表明CDP-胞磷膽堿是在亞最大缺血損傷時使用效果較好，在本實驗中導致亞缺血最大損傷的時間是30-75分鐘。
雙盲，安慰劑-對照的臨床實驗基于對兩個臨床實驗的總結及以往文獻中的17篇報道，在中風及頭顱創傷病人中一致認為可以很好地耐受5天到8周療程的胞磷膽堿(劑量范圍為250到1000mg/每天)。基于對文獻中50多個實驗的總結，一致認為在其他人群中也可很好地耐受胞磷膽堿。除了一些因嚴重缺血導致的死亡病例(這在人群研究中是可以預測的)，在臨床中末見有大的副作用。在臨床的實驗室檢查，生命體征或者心電圖檢查中均未見大的改變。
本實驗是設計用來評估在急性缺血性中風的病人中給予三種劑量的胞磷膽堿(500mg，1000mg及2000mg)及安慰劑對疾病所產生的作用。
劑量使用說明/計劃如果隨機地在下午3:00以前病人進入本研究則立即給予2片藥，在下頓吃飯時再服用2片藥，這樣在進入研究的當天共服用4片藥。否則，病人進入的當天只給2片藥(晨量)，1天(晚上的量)的藥停止使用。在本研究剩下的時間里，對病人早晨給予2片藥并晚上給予2片藥(可參見下面的治療計劃)。對于不能服用本研究的整個藥片的病人，可采用其它可接受的給藥途徑包括鼻飼或者將藥片碾碎并與食物或者飲料一起服用。
治療時間研究藥物每天服用2次(早晨2片及晚上2片)共服用6周。
胞磷膽堿各種劑量的效果采用Barthel指數來評估。
在本研究期間采用的輔助有效性評估包括12周時的Barthel指數(至少61分才可認為有效)，修改的Rankin分數，NIH中風分級，NIH中風運動項目分級，出院所需的時間，死亡率，及其它種類的神經精神分數。NIH中風分級及Barthel指數是有關日常生活中中風癥狀及功能情況的標準測定。
雙盲，安慰劑-對照的實驗表明以NIH中風分級評價，中風后12周每無服用500mg胞磷膽堿的病人功能基本恢復或者完全恢復要較服用安慰劑的病人多2倍，而以Barthel指數評價為多1.6倍。
擴散加量MRI(DWI)研究在缺血發生的數分鐘內，DWI可發現缺血損傷的區域，并且動物模型證實使用DWI可監測神經保護性治療。以安慰劑作為對照的實驗表明，胞磷膽堿可減少如上所述的大鼠暫時性阻塞模型的梗塞范圍。
在本研究中，對III期雙盲安慰劑對照實驗中的12例病人進行了研究，病人在在急性中風期(發病24小時內，MCA供血區域)，服用胞磷膽堿(每天口服500/1000/2000mg共6周)。整個實驗的設計及結果已經在上面敘述過在急性期及慢性期的不同時間里進行多層次回聲平面的DWI及T2-加重MRI。也就是說，在基線水平(即推測的中風時間，癥狀發生后8到24小時之間)進行DWI掃描，并且在治療開始后再進行至少一次的照相。跟蹤的平均時間為9.3周(范圍在4.1-26.3周；中間數為6.6周)。損傷體積的測定是由3名不知道病人治療及臨床情況的醫生經2次測定而得到的結果。然后得到基線掃描及治療后第2次掃描梗塞體積變化的百分比。
4例安慰劑治療的病人中有3人顯示損傷有擴大，而經胞磷膽堿治療的8例病人中有7人顯示損傷體積減少(4/5服用500mg；3/3服用2000mg)。基于劑量的卡方檢驗有統計學意義p＝0.031。Fisher′s Exact檢驗值為p＝0.067。將這些測定與以往以相同方式收集到的若干對照病人(n＝31)比較。31例病人中有22人梗塞體積增加，7例梗塞體積減少，2例無變化。本研究中4例安慰劑治療的病人中有3例梗塞體積增加而1例減少，這與以往對照的比例相同。在本發明實際治療的8例病人中(5例500mg每天服藥1次，3例2000mg每天服藥2次)，7例梗塞體積減少而1例增加。
使用Feshers Exact檢驗對本發明治療的梗塞體積減少的病人的比例與以往對照的比例進行比較檢驗(即22/7比1/7)，傾向于本發明的差別有顯著性(p＝0.0021)。如采用DWI評價，當缺血發生后在盡可能短的時間內使用胞磷膽堿進行治療并將治療持續數周，結果表明可明顯地減少梗塞體積。
聯合治療對40到60只體重為280-365g的未進食雄性Sprague-Dawlew大鼠用水合氯醛(400mg/kg體重)經腹腔進行麻醉。在手術過程中為了維持麻醉狀態，在給予了起始劑量的水合氯醛后，還應周期性地給予100mg/kg的水合氯醛。僅在動脈阻塞的90分鐘里保持麻醉狀態。經左股靜脈將導管插入下腔靜脈，以備給藥用。在整個麻醉期間，監測大鼠的體溫并將體溫維持在37℃。
采用管腔內縫術阻塞MCA模型，該模型已經在其它的地方作過詳細地描述。參見文獻Minematsu，K.et al.Neurology(1991)42235-240。簡言之，將4-0號單絲尼龍線經火焰加熱使其頂端變為一稱之為閉塞器的圓頭，然后將其經過結扎的右側CCA插入頸內動脈，再將其輕柔地插到距CCA分叉17mm處的顱內部分。用該縫線阻塞單側的大腦前動脈的近端，頸內動脈的遠端及MCA和后交通動脈的起始處。
將動物分為4組(i)用NMDA治療，(ii)鹽水+胞磷膽堿治療，(iii)NMDA拮抗劑+胞磷膽堿治療及(iv)鹽水對照組。在MCA阻塞5分鐘后，對10-15只大鼠經靜脈緩慢注射以1ml/kg的生理鹽水溶解的0.5mg/kg體重的MK-801(一種NMDA拮抗劑)。在MCA阻塞后的8小時及20小時，經腹腔給予維持劑量的MK-801，0.5mg/kg。對第2組的另外10-15只大鼠與NMDA拮抗劑組相同，在同樣的時間給予同樣量的生理鹽水，所不同的是，在MCA阻塞后的5分鐘，8小時及20小時經腹腔同時給予500mg/kg體重的胞磷膽堿。在第3組的另外10-15只大鼠重復NMDA治療組的治療，但另外也在MCA阻塞后的5分鐘，8小時及20小時經腹腔給予500mg/kg胞磷膽堿。在第4組和最后一組的其它10-15只大鼠，與NMDA治療組相同在同樣的時間給予同樣量的鹽水。
動物在麻醉恢復清醒以后，允許自由進食及飲水。在經過選擇性神經系統評估后，經腹腔再次給予300mg/kg的水合氯醛麻醉動物并立即斷頭處死。立即將大腦取出，仔細檢查以確定管腔內縫線所致的MCA阻塞，以2mm的間隔沿冠狀面進行切片，在37℃的溫度下用2％的2，3，5-氯化三苯基四唑氮溶液(TTC)對切片染色30分鐘，然后將其浸入10％的福爾馬林緩沖溶液中進行固定。對每個動物以TTC染色的腦切片進行照相以測定梗塞的大小。采用雙盲的方法對放大的照片進行評估。以TTC染色未將切片染紅的區域被認為是梗塞的區域。梗塞(mm3)是通過計算每個動物的所有TTC染色切片的梗塞面積及切片間的距離積和而得到的。
通過統計學的標準檢驗方法來評估所監測的各組間生理學變量及梗塞面積和體積的的統計學差異。如雙尾概率值小于0.05則認為是有統計學差異。
本發明發現接受同一種類型治療的3個組的大鼠其梗塞體積的減少要較對照組明顯且有統計學差異。的確，單獨接受NMDA拮抗劑或者單獨接受胞磷膽堿的兩個組的大鼠的梗塞體積也較對照組有減少，而接受NMDA拮抗劑及胞磷膽堿聯合治療的第3組大鼠療效要好于其它組。該結果表明有明顯的協同作用趨勢。神經系統的評估也表明第3組的大鼠的分數要好于其它組的大鼠。使用上述的其它治療劑如組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，鏈激酶及尿激酶等與胞磷膽堿聯合使用亦可見類似的益處。在經過聯合治療的首劑治療后，還可進行一次或者多次的維持治療，可以是單獨給予胞磷膽堿，或者單獨給予至少一種輔助治療劑或者如本發明中所述的兩者同時使用。
胞磷膽堿和阿司匹林作為聯合治療的一部分，本發明還研究了胞磷膽堿和阿司匹林的同時給藥，即在缺血發生的短時間內同時或者依次給予胞磷膽堿和阿司匹林。(實際上，只要確定中風為非出血性，而是缺血，栓塞或者其它所致，即可開始聯合治療)。依據病人個體的需要可以變化阿司匹林及胞磷膽堿的劑量。但是，一般地來講每劑阿司匹林的量為50到500mg(以70-300mg為較好)，而每劑胞磷膽堿或其鹽的劑量為100-1000mg(以300-700mg為較好)。在所優選的實例中，組合物含有70-90mg的阿司匹林及帶有藥用載體的400-600的胞磷膽堿或者其鹽，可在中風發生的短時間內每天分1次或者2次給予。聯合治療計劃應至少持續30天，以持續數周為較好，持續幾個月則更好。為了減少組織的損傷，加大病人的恢復及降低中風等繼發癥的發病率，最好治療持續6個月到一年。
綜上所述，本發明研究了在缺血發生的短時間內同時給予胞磷膽堿及至少一種輔助治療制劑的聯合治療。聯合給藥可以是同時給藥或者是依次給藥。如果是依次聯合給藥，胞磷膽堿或者其鹽及至少一種輔助治療劑最好是在缺血發生后的頭24小時內給予。
通過上述所提供的詳細說明應容易了解其它的實施方案，因為這些實施方案都在本發明的范圍和精神實質內。例如，潘生丁等可以代替阿司匹林。所以，無論如何上述的實施方案不應是用來限制本發明的。
權利要求
1.用于治療發生缺血患者的組合物，其包括胞磷膽堿和至少一個第二治療劑或它們的不同藥用鹽，及藥用載體。
2.權利要求1的組合物，其中胞磷膽堿的量為100mg至1000mg，至少一個的第二治療量為10mg-500mg。
3.權利要求1或2的組合物，其中第二治療劑為t-PA，鏈激酶或尿激酶。
4.權利要求1或2的組合物，其中第二治療劑為阿斯匹林或潘生丁。
全文摘要
本發明涉及用于治療缺血患者的組合物，其包括胞磷膽堿和至少一個第二治療劑或它們的不同藥用鹽，及藥用載體。
文檔編號A61P7/00GK1488353SQ0214580
公開日2004年4月14日 申請日期1996年3月6日 優先權日1995年3月6日
發明者B·W·桑達吉, M·費舍爾, K·W·勞克, B W 桑達吉, 勞克, 岫 申請人:英特紐隆制藥有限公司