專利名稱：丹參抗消化性潰瘍有效部位及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物提取物，用于治療消化性潰瘍的丹參有效部位(DSE-F)及其制備工藝。
背景技術：
消化性潰瘍是常見病、多發病。一般而言，約占人口的10％，此病的重要特點是反復再發，是一種容易愈合又容易再發的疾病。病人在急性期只要通過合理安排生活、飲食療法、選擇適當治療消化性潰瘍的藥物，絕大多數潰瘍可以愈合，但多數患者在季節變化(如到次年早春)再次發作，呈現周期性發作的特點。治療消化性潰瘍的目的是在急性期促進潰瘍的愈合，以及防止其后潰瘍的再發，現時后者是治療消化性潰瘍的難題，也是評價抗潰瘍藥物質量的主要指標，是人們關注的焦點。
目前治療消化性潰瘍的主要藥物有抑酸劑，抗蛋白酶藥，促進粘膜生成藥及粘膜覆蓋藥等，其中以抑酸劑療效最好，發展也較快。但隨機對比臨床試驗表明各種抑酸劑(HO2受體阻斷劑、質子泵抑制劑)彼此差別僅表現在急性期階段的應用劑量、抑制程度、癥狀緩解時間的不同，均不能解決復發問題。因此開發更為滿意的抗消化性潰瘍藥物，不僅要求近期效果好，而且能解決復發問題，是目前國內外研究的關鍵所在。
本發明人在過去的研究中率先發現活血化瘀中藥丹參一味藥就具有明顯的抗消化性潰瘍作用；丹參提取物F(DSE-F)是丹參抗潰瘍作用的有效部位，為水溶性丹酚酸類化合物；不僅具有促進潰瘍愈合的近期療效，而且有減少潰瘍復發的遠期療效，明顯優于現有市售抗酸劑。此研究成果的在先申請已公開(CN1242364A，治療消化性潰瘍的丹參提取物F及其制備工藝，申請日1998年7月22日)。
發明內容
本發明的目的是提供一種不僅能促進潰瘍愈合(近期療效)而且有減少潰瘍復發(遠期療效)的丹參有效部位(DSE-F)及工序簡化、回收率高的制備工藝，由原回收率0.28-0.3％提高到0.6％。
丹參抗消化性潰瘍有效部位(DSE-F)，其主要化學成分是以丹酚酸B為主的丹酚酸類成分，并含有少量的脂肪酸類成分，其結構式如下 提取物F中酚酸類成分的含量根據紫外分光光度法和雙波長薄層掃描法的測定，有效部位F中酚酸類成分的含量占80％以上。
制備工藝丹參藥材加水煎煮，水提液過濾，濾液上聚酰胺柱(2Kg生藥/Kg)，先用蒸餾水洗10個保留體積，再用90％乙醇液洗脫10個保留體積，減壓回收乙醇溶液，得紅棕色固體，用水加熱溶解(300ml/Kg生藥)，放冷沉淀，過濾得黃色上清液，沉淀用少量水洗滌，合并濾液和水洗液，減壓除去水分得產品(DSE-F)，棕色，收率約為0.6％。
丹參有效部位(DSE-F)是一種二類中藥新藥，已列入1997年度國家新藥研究基金，專題名稱《丹參抗消化性潰瘍有效部位(DSE-F)的開發研究》(專題合同編號96-901-05-104)。目前已完成以質子泵抑制劑奧美拉唑(Losec)作為陽性對照藥，探討丹參抗消化性潰瘍作用的有效部位DSE-F對實驗性胃潰瘍(二種急性，一種慢性)的防治作用和對潰瘍愈合復發過程的影響，并按照《新藥審批辦法》中對申請二類中藥的各申報項目要求，完成DSE-F的藥學評價(完善制備工藝，含量測定，丹參原藥材質量標準，制劑及其穩定性)及臨床前主要藥效學評價。正在進行急慢性毒性動物試驗及一般藥理學研究。
針對水提取液濃縮、醇沉淀過程是為了除去蛋白質和糖類雜質，而該類成分在下一步的聚酰胺處理過程中不被聚酰胺所吸附，可以被水完全洗去的現象，同時考慮到聚酰胺60％乙醇洗脫部分除含有大量水不溶性雜質外，仍含有部分有效成分，因而本發明制備工藝是用90％乙醇一次性洗脫被聚酰胺所吸附樣品，再經一次水沉淀，簡化了工藝步驟，并提高了收率。
具體實施例方式
制備工藝丹參藥材飲片加水煎煮3次，每次8倍量水藥重量比W/V、每次3小時，將提取3次的水提液合并，回收溶劑至小體積(0.5kg生藥/升)，過濾，濾液上聚酰胺柱(2Kg生藥/Kg)，先用蒸餾水洗10個保留體積除去雜質，再用90％乙醇液洗脫10個保留體積，減壓回收乙醇溶液，得紅棕色固體，用水加熱溶解(300ml/Kg生藥)，放冷沉淀，過濾得黃色上清液，沉淀用少量水洗滌，合并濾液和水洗液，減壓除去水份得產品(DSE-F)，棕色，收率約為0.6％。工藝流程如下水煎煮→過濾→聚酰胺吸附→水洗除雜質→90％乙醇洗脫物→水沉淀→上清液(黃色)回收溶劑→產品(DSE-F)，棕色，收率0.6％→質量檢驗TIC定性鑒別。
丹參有效部位(DSE-F)的藥用劑量為50-200mg/按成人60kg體重計，1-3次/日，空腹服用，2-4周/療程。用作藥品的丹參有效部位可按常規制劑工藝制成片劑、顆粒沖劑、膠囊和水煎劑等劑型，任何劑型應保證每次服用劑量為每單位含有效部位50mg。例如制片劑，可按如下組份有效部位(DSE-F) 200mg可壓性淀粉 630mg糊精133mg低取代羥丙基纖維素 35mgVc 2.25mg將以上各物質混勻，以75％乙醇制粒，顆粒干燥后，加入1％硬脂酸鎂，混勻，壓片，每片重0.25g(每片含有效部位50mg)。
顆料沖劑每包25g，含有效部位100mg。
產品質量檢驗本發明制備工藝制得有效部位(DSE-F)的初步質量控制標準性狀棕色粉末，水溶液為黃色，醇溶液為紅棕色。
TLC定性鑒別正反相簿層鑒別結果如下(1)色譜條件固定相ODS 流動相甲醇/水(65∶35)(2)色譜條件固定相silicagel流動相氯仿/甲醇/甲酸(75∶25∶2)(3)HPLC分析色譜條件固定相ODS流動相乙腈/水/甲酸(50∶130，pH-2.5)對本發明工藝中吸附柱中聚酰胺吸附參數考察取經丙酮、乙醇、水預處理過的聚酰胺5g，加入3000ml丹參水提液(0.5kg生藥/升)吸附，按上述工藝制得樣品A，稱重。將該通過聚酰胺柱的丹參水提液再次上柱按照工藝制備樣品B，稱重，考察聚酰胺對有效部位吸附的最大載量。結果表明每g聚酰胺吸附有效部位(DSE-F)最大量為14-16mg(見下表)。
吸附柱中聚酰胺吸附參數考察NoA(mg) B(mg)每g聚酰胺吸附量(mg)1 71.9 80.2 14.4-16.02 79.2 78.5 15.7-15.83 70.6 79.6 14.1-15.9按照提取工藝放大實驗制備藥效實驗、制劑穩定性研究用樣品9批，為考察工藝放大條件，同時為提供藥效實驗、制劑穩定性研究用樣品，制備工藝結果如下No生藥量(Kg) 聚酰胺量(Kg)產品得量(Kg)收率(％)1 1.0 1.0 5.1 5.12 1.0 1.0 4.8 4.83 1.0 1.0 5.5 5.54 1.0 1.0 6.0 6.05 2.0 1.0 9.5 4.76 2.0 1.0 10.5 5.27 2.0 1.0 11.0 5.58 2.0 1.0 10.9 5.49 2.0 1.0 12.0 6.0主要藥效學研究照《中藥新藥藥理毒理研究的技術要求》，對申報二類中藥的本發明工藝制備的丹參抗消化性潰瘍的有效部位DSE-F進行了主要藥效學研究。結果顯示DSE-F1、5、20mg/kg及奧美拉唑20mg/kg能顯著降低幽門結扎所致大鼠急性胃潰瘍及乙醇所致大鼠藥物性胃潰瘍的潰瘍指數；在乙酸所致大鼠慢性胃潰瘍的早期(第4天和第7天)，DSE-F劑量依賴性地使潰瘍面積顯著減小，降低潰瘍指數，促進潰瘍愈合；在乙酸所致大鼠慢性胃潰瘍的復發期，DSE-F大、中、小劑量組均能顯著降低復發率并減小潰瘍指數，并抑制其復發。DSE-F對乙酸所致大鼠慢性胃潰瘍的愈合及復發的作用略優于奧美拉唑。與奧美拉唑不同，DSE-F 20mg/kg能顯著增加胃粘膜血流量，但DSE-F各劑量組對大鼠胃液分泌功能未見顯著影響。具體實驗結果如下一、急性粘膜損傷
1、(DSE-F)對大鼠幽門結扎所致胃潰瘍的作用表1 (DSE-F)對大鼠幽門結扎所致胃潰瘍的作用組別 劑量動物數潰瘍指數(X±S) 潰瘍抑制率(mg/kg)(只)評分 評級(％)生理鹽水對照組- 1090.6±44.9 4.7±0.7 -奧美拉唑組 20 142.3±5.8*** 0.3±0.7*** 97.46DSE-F大劑量組20 1029.2±16.***3.4±1.3*** 67.77DSE-F中劑量組5 1131.1±17.3*** 3.5±1.0** 65.67DSE-F小劑量組1 1248.8±26.0* 4.3±1.2 46.14與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001結果表明，DSE-F各劑量組潰瘍指數均小于生理鹽水對照組，呈劑量依賴性。其中大、中劑量效果極其顯著(P＜0.001)。證明DSE-F對大鼠幽門結扎所致胃潰瘍有明顯的抑制作用。
2、DSE-F對80％乙醇誘導大鼠胃潰瘍的作用將70只大鼠于解剖鏡下量取潰瘍長徑。以每1mm長度計為1分，積分作為潰瘍指數，評價藥物的抗潰瘍作用。結果見表2。
表2 DSE-F對乙醇誘發大鼠胃潰瘍的作用組別劑量動物數潰瘍指數 潰瘍抑制率(mg/kg)(只)(X±S)(％)生理鹽水對照組 - 14 60.3±30.7-奧美拉唑組 20 14 18.1±19.0*** 69.98DSE-F大劑量組 20 14 33.1±18.3** 60.11DSE-F中劑量組 5 14 30.9±15.3** 58.76DSE-F小劑量組 1 14 31.3±18.2** 48.09與生理鹽水對照組比較**P＜0.01，***P＜0.001結果表明，DSE-F各劑量組潰瘍指數均小于生理鹽水對照組，證明DES-F對乙醇誘發大鼠胃潰瘍具有明顯的抑制使用。
二、DES-F對大鼠乙酸慢性胃潰瘍愈合及復發過程的影響取大鼠560只做試驗，切口并在胃的腹側面，胃體部與幽門竇交界處漿膜下用50μ1微量注射器注入20％乙酸0.05ml，術后禁食18小時，常規給水。從手術次日起各組大鼠均灌胃給藥，每天一次，連續28天，分組及給藥劑量同實驗一。分別于手術后第4、7、10、60、130日分批將大鼠處死，取胃浸于1％甲醛溶液中，固定10分鐘后，沿胃大彎剪開，清除胃內容物及食物殘渣，以潰瘍的最長徑和最短徑的乘積表示潰瘍指數，評價DES-F對潰瘍的愈合及復發過程的影響。結果見表3-8及
圖1。
表3 DSE-F對大鼠乙酸性胃潰瘍的作用(術后第4天)組別劑量 動物數潰瘍指數 潰瘍抑制率(mg/kg)(只) (X±S)(％)生理鹽水對照組 - 10 88.3±24.6 -奧美拉唑組 2010 56.2±12.8** 36.35DSE-F大劑量組 2010 47.8±16.9*** 45.87DSE-F中劑量組 5 10 52.7±8.5*** 40.32DSE-F小劑量組 1 10 64.3±10.7*37.18與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
表4 DSE-F對大鼠乙酸性胃潰瘍的作用(術后第7天)組別劑量動物數潰瘍指數潰瘍抑制率(mg/kg) (只)(X±S) (％)生理鹽水對照組 - 1160.8±13.3 -奧美拉唑組 20 8 44.8±17.8* 26.32DSE-F大劑量組20 9 43.8±19.7* 39.96DSE-F中劑量組5 1144.9±18.3* 32.15DSE-F小劑量組1 1154.9±24.726.70與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表5DSE-F對大鼠乙酸性胃潰瘍的作用(術后第10天)組別劑量動物數潰瘍指數 潰瘍抑制率(mg/kg)(只) (X±S)(％)生理鹽水對照組- 12 35.50±16.10 -奧美拉唑組20 12 34.75±12.37 2.11DSE-F大劑量組 20 11 23.23±13.26*34.56DSE-F中劑量組 5 11 25.55±7.63 28.03DSE-F小劑量組 1 12 32.29±19.23 9.04與生理鹽水對照組比較*P＜0.05表6DSE-F對大鼠醋酸性胃潰瘍的作用(術后第60天)組別劑量動物數潰瘍指數潰瘍抑制率(mg/kg)(只) (X±S)(％)生理鹽水對照組 - 10 2.40±5.06 -奧美拉唑組 2012 0.33±0.78 86.25DSE-F大劑量組2012 0±0100DSE-F中劑量組5 12 0.67±2.31 72.08DSE-F小劑量組1 12 0.33±1.15 86.2 5表7 DSE-F對大鼠醋酸性胃潰瘍復發程度的影響(術后第130天)組別劑量 動物數潰瘍指數 潰瘍抑制率(mg/kg) (只) (X±S) (％)生理鹽水對照組- 25 13.88±10.60 -奧美拉唑組20 32 4.53±8.10***67.36DSE-F大劑量組 20 28 2.80±5.61***79.83DSE-F中劑量組 5 32 2.75±5.22***80.19DSE-F小劑量組 1 28 4.11±9.08***70.39與生理鹽水對照組比較***P＜0.001表8DSE-F對大鼠醋酸性胃潰瘍復發率的影響(術后第130天)組別 劑量動物數復發動物數潰瘍抑制率(mg/kg)(只) (只) (％)生理鹽水對照組 - 25 1976奧美拉唑組 20 32 1031.25***DSE-F大劑量組20 28 8 28.57***DSE-F中劑量組5 32 8 25***DSE-F小劑量組1 28 7 25***與生理鹽水對照組比較***P＜0.001
圖1 DSE-F對大鼠乙酸性慢性胃潰瘍愈合及復發過程的影響 三、DSE-F對大鼠胃液分泌功能的影響實驗用大鼠70只，分組及給藥劑量同實驗一，每日灌胃給藥一次，連續兩日。實驗前禁食24小時，不禁水。實驗當日，將大鼠用乙醚麻醉后開腹，暴露胃，將幽門結扎后，再沿十二指腸給藥一次，縫合腹壁切口。5小時后處死大鼠，打開腹腔，結扎賁門，摘取全胃，沿胃大彎剪開胃壁，收集胃液于溶器中，過濾并量取胃液量，以精密PH計(PHS-3C)測定胃液PH值后，將胃液以3000rpm速度離心10分鐘。上清液用于胃液總酸度、游離酸度及胃蛋白酶活性的測定，結果見表9、表10。
表9 DSE-F對大鼠胃液分泌功能的影響(X±S)組別劑量鼠數胃液量 PH 胃蛋白酶活性(mg/kg) (只)生理鹽水對照組 -145.64±1.70 1.54±0.23 258.48±131.32奧美拉唑組 20 142.81±1.62*** 7.96±0.52*** 199.13±99.78DSE-F大劑量組 20 135.52±2.11 2.30±0.16*** 274.86±81.32DSE-F中劑量組 5125.95±2.09 1.91±0.26 273.39±139.22DSE-F小劑量組 1145.58±1.80 1.82±0.44 277.17±135.06與生理鹽水對照組比較***P＜0.001表10 DSE-F對大鼠胃液分泌功能的影響(X±S)組別 劑量鼠數 游離酸酸度 總酸酸度(mg/kg) (只)生理鹽水對照組 - 1489.55±15.78 114.76±14.01奧美拉唑組 20140.00±0.00***38.09±11.64***DSE-F大劑量組 201284.08±20.82 117.95±21.60DSE-F中劑量組 5 1290.39±16.26 116.97±12.31DSE-F小劑量組 1 1497.95±9.39 129.04±9.74**與生理鹽水對照組比較**P＜0.01，***P＜0.001四、DSE-F對大鼠胃粘膜血流量的影響表11 DSE-F對大鼠胃粘膜血流量的影響(X±S)
組別 劑量 動物數 胃粘膜中性紅清除率 ml/100g(mg/kg) (只)生理鹽水對照組 - 11 178.80±64.33奧美拉唑組 20 13 177.54±77.34DSE-F大劑量組 20 12 304.93±160.57*DSE-F中劑量組 5 11 226.88±101.80DSE-F小劑量組 1 10 200.90±83.21與生理鹽水對照組比較*P＜0.05由表11可見，奧美拉唑組胃粘膜中性紅清除率Y與生理鹽水對照組之間無顯著性差異。DSE-F劑量依賴性地提高胃粘膜中性紅清除率，DSE-F大劑量組與生理鹽水對照組之間有顯著性差異.提示DSE-F在較大劑量時具有增加胃粘膜血流量的作用.
五、丹參提取物F(DSE-F)急性毒性實驗丹參提取物F是沈陽藥科大學提供的褐色粉末，實驗用丹參提取物F的飽和溶液按20g體重小鼠，每只0.5ml-1.0ml的容量灌胃給藥，每組15只，雌雄各半，觀察一周未見死亡。最大耐受量相當成人用量的150倍。
實驗結論綜合上述實驗結果得出結論如下1、DSE-F能顯著抑制幽門結扎所致大鼠急性胃潰瘍的形成。
2、DSE-F能顯著抑制乙醇所致大鼠藥物性胃潰瘍的形成。
3、DSE-F能顯著促進醋酸所致大鼠慢性胃潰瘍早期的愈合，并能顯著抑制其復發。
DSE-F對乙酸所致大鼠慢性胃潰瘍的愈合及復發的作用略優于奧美拉唑。
4、與奧美拉唑不同，DSE-F較大劑量能顯著增加胃粘膜血流量，但對大鼠胃液分泌功能未見顯著影響。
權利要求
1.丹參抗消化性潰瘍有效部位(DSE-F)，其特征在于其主要化學成分是以丹酚酸B為主的丹酚酸類成分，并含有少量的脂肪酸類成分，其結構式如下 提取物F中酚酸類成分的含量根據紫外分光光度法和雙波長薄層掃描法的測定，有效部位F中酚酸類成分的含量占80％以上。
2.丹參抗消化性潰瘍有效部位的制備工藝，其特征是丹參藥材加水煎煮3次，每次8倍量水(W/V)、提取3次，每次3小時，水提液合并，回收溶劑至小體積(0.5g生藥/升)過濾，濾液上聚酰胺柱(2Kg生藥/Kg)，先用蒸餾水洗10個保留體積除去雜質，再用90％乙醇液洗脫10個保留體積，減壓回收乙醇溶液，得紅棕色固體，用水加熱溶解(300ml/Kg生藥)，放冷沉淀，過濾得黃色上清液，沉淀用少量水洗滌，合并濾液和水洗液，減壓除去水分得產品(DSE-F)，棕色，收率約為0.6％。
3.根據權利要求1所述的丹參有效部位(DSE-F)，其特征是藥用劑量為50-200mg/按60kg體重計，1-3次/日，空腹服用，2-4周/療程。
4.根據權利要求3所述的丹參有效部位(DSE-F)，其特征是將藥用劑量按常規制劑工藝制成片劑、顆粒沖劑、膠囊和水煎劑等劑型，各種劑量每單位含有效部位50mg。
全文摘要
丹參抗消化性潰瘍有效部位及其制備工藝，丹參有效部位其主要化學成分是以丹酚酸B為主的丹酚酸類成分，并含有少量的脂肪酸類成分。制備工藝丹參藥材加水煎煮，濾液上聚酰胺柱(2Kg生藥/Kg)，先用蒸餾水洗10個保留體積除去雜質，再用90％乙醇液洗脫10個保留體積，減壓回收乙醇溶液，得紅棕色固體，用水加熱溶解(300ml/Kg生藥)，沉淀，過濾得黃色上清液，沉淀用少量水洗滌，減壓除去水分得產品(DSE－F)，棕色，收率約為0.6％。提取物(DSE－F)可按常規方法制成片劑、沖劑、膠囊、水煎劑等劑型，其藥用劑量為50－200mg/按60kg體重計，1－3次/日，空腹服用，2－4周/療程。(DSE－F)是一種二類中藥新藥，具有明顯抗消化性潰瘍作用，對急慢性胃炎亦有良好療效。療效機理主要在于增強胃粘膜吸附功能，增加抗氧化能力。改善胃粘膜血流，促進胃粘膜上皮細胞再生等。
文檔編號A61P1/00GK1508133SQ0214477
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月13日 優先權日2002年12月13日
發明者李和泉, 王玉林, 李銑, 王金輝 申請人:中國醫科大學