專利名稱：一種殺菌制劑和殺菌濕巾及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種殺菌制劑和殺菌材料，尤其涉及一種殺滅引起奶牛乳腺感染的細菌的制劑和殺菌濕巾。
背景技術：
奶牛乳腺感染主要由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌等引起，畜群調查表明，美國30％到70％的母牛至少有一個被感染的乳區。奶牛乳腺感染引發的乳腺炎，使奶牛每天產奶量損失0.5千克，減少的產奶量被估計為乳腺炎總損失的69％-80％。美國奶牛業每年因乳腺炎引起的直接損失超過20億美元。可見，乳腺炎對乳業的經濟影響是巨大的。
國內外常以大劑量的抗生素(如青霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、新霉素等)治療奶牛乳腺感染，抗生素雖有一定的療效，但由于上述致病菌大都產生了耐藥性菌株，因此，療效并不明顯。反而造成牛奶中抗生素殘留，將這些牛所產生的奶混入食用牛奶造成的后果是嚴重的。聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)都建議，在奶牛接受抗生素治療停藥后至少3天內擠出的奶汁，不直接作為食用的奶原料(最好要停藥5-7天)。而目前世界上對付乳腺炎除了使用抗生素別無它藥。
美國專利US 5762948公開了一種預防和治療奶牛乳腺感染的濕巾，其成分以一種抗菌肽nisin為主，輔以酒精等其他抗菌成分。該濕巾能去除引起乳腺感染的各種致病菌，但對耐藥性金黃色葡萄球菌的效果不明顯，同時由于抗菌肽的合成工藝復雜，生產成本高，難以推廣應用。
發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一種殺滅引起奶牛乳腺感染的細菌的制劑，以克服現有技術存在的上述缺陷；本發明需要解決的技術問題之二是提供一種殺滅引起奶牛乳腺感染的細菌的殺菌濕巾。
本發明需要解決的技術問題之三是提供一種殺菌濕巾的制備方法。
本發明需要解決的另一個技術問題公開所述殺菌濕巾的應用。
本發明的發明構思是這樣的溶葡萄球菌酶(1ysostaphin)是一種含鋅的金屬蛋白酶，專一降解細胞壁的甘氨酸肽鍵，能裂解金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的細胞壁，從而起到徹底殺死細菌的目的，不易產生耐藥性，尤其對耐藥性金黃色葡萄球菌等難以根除的致病菌的效果非常好。但溶葡萄球菌酶只對革蘭氏陽性菌有效，而引起奶牛乳腺感染的細菌除革蘭氏陽性菌外，革蘭氏陰性菌也占了一定的比例，如大腸桿菌等，所以發明人將溶菌酶和溶葡萄球菌酶進行復配，溶菌酶能裂解細菌胞壁的β-1，4糖苷鍵，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有殺滅作用，同時溶菌酶除了拓寬了殺菌譜之外，還能加強溶葡球菌酶的殺菌作用。兩種酶都屬于蛋白質，沒有刺激也不會產生任何毒副作用，同時由于生產成本低，價格不貴。
消除和控制奶牛乳腺感染較有效的辦法是殺滅引起感染的各種細菌，特別是乳區的各種致病菌，不但引起自身的乳腺感染，同時還會傳染給其它的奶牛。發明人經過多次試驗，將溶葡萄球菌酶和溶菌酶按一定比例復配，并以此為原料制成的殺菌濕巾，可以簡便有效的殺滅奶牛乳區的各種致病菌，消除感染，同時還能起到防止復發和預防的作用。
本發明的技術方案是這樣的一種殺菌制劑，包括溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，穩定劑1～15wt％，表面活性劑0.1～0.5wt％，水余量。
所述及的穩定劑包括聚乙二醇或殼聚糖中的一種，其主要作用是保持酶在水溶液狀態下的穩定性，即保持酶的活性。
所述及的表面活性劑包括非離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，優選的為20≥HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80等以及甜菜堿等，其主要作用是去除奶牛乳區的污垢，使制劑中的活性成分充分作用于皮膚表面，有利于吸收。
可將上述的殺菌制劑負載于載體上，制成一種殺菌濕巾，載體包括無紡材料或棉紗布。
所述及的殺菌濕巾的制備方法包括如下步驟1、按上述比例稱取溶葡萄球菌酶、溶菌酶，穩定劑和表面活性劑與水混合；2、將配制好的溶液噴涂于所需規格的載體上或將載體浸漬于溶液中，取出，即獲得本發明的殺菌濕巾。
本發明的制劑和殺菌濕巾用于殺滅引起奶牛乳腺感染的各種細菌，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。特別是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和化膿棒狀桿菌。可以治療由這些細菌引起的各種乳腺炎，也可以預防乳腺炎的發生。
可將本發明的制劑和濕巾在產奶前、后通過涂抹或擦拭奶牛乳區，進行消毒，保證乳區的清潔，減少感染的可能性。
可將本發明的制劑或殺菌濕巾涂抹或覆蓋于奶牛的發生感染的乳區，其劑量可根據奶牛的年齡、病情決定，一般為每日兩次。
殺菌濕巾通過體外殺菌試驗，證明它對引起奶牛乳腺感染的主要病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿棒狀桿菌的殺菌效果十分理想，殺滅率均超過99％。
殺菌濕巾對昆明小白鼠的急性毒性試驗結果表明，動物經肌注7天后，無異常反應，活動正常。經7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明無毒性作用。
殺菌濕巾對SD大鼠陰道黏膜刺激試驗，參照消毒技術規范(第三版)1999.11中皮膚刺激反應強度的評分標準評分及皮膚刺激強度分級，進行對陰道黏膜刺激強度的評定。結果表明，殺菌濕巾對大鼠陰道黏膜刺激反應最高總積分均值為0，屬無刺激性。
殺菌濕巾對乳區急性感染的治療試驗，并用青霉素G鉀和鏈霉素作為對照，給藥7天后，結果表明，殺菌濕巾能有效殺滅引起乳腺感染的各種病原菌，尤其對金黃色葡萄球菌特別有效，而兩種抗生素則不能有效的去除乳區的病原菌。
殺菌濕巾預防乳腺感染的試驗，可以看出，殺菌濕巾能有效的預防奶牛乳區受到細菌感染，可以保持乳區的清潔。
具體實施例方式
實施例1殺菌濕巾的制備1.配制100g用于殺菌濕巾的溶液，其中溶葡萄球菌酶含量0.001g(0.001wt％)，溶菌酶含量20g(20wt％)，聚乙二醇含量3g(3％)，聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)。
2.對桌面、儀器、器皿、配料桶消毒。
3.在電子天平上準確稱取溶葡萄球菌酶、溶菌酶、聚乙二醇和聚梨山醇酯20，置于配料桶中，按比例加水76.80g，攪拌均勻，并加熱至60℃溶解，即為所需溶液。
4.將無紡布剪裁成8cm×8cm，經過紫外光消毒20分鐘后，浸入上述溶液中，待浸透后撈出，滴去多余溶液，即可使用。
實施例2殺菌濕巾體外殺菌試驗1、試驗樣品的制備(1)殺菌濕巾樣品按實施例1的方法制備，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
(2)對照濕巾其中聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
2、試驗菌株金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和化膿棒狀桿菌(以上菌株來自于沈陽軍區軍馬防治研究所)。
3、試驗步驟(1)將培養好的試驗菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鮮斜面，并稀釋到適宜濃度，在107～108cfu/ml。
(2)將樣品濕巾和對照濕巾制成1×3cm大小，并放置在無菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到濕巾上，涂抹均勻同時開始計時。
(4)作用到預定時間后用無菌鑷子將濕巾投入含5ml中和劑的試管中，充分振蕩混勻。
(5)對照濕巾投入中和劑試管，充分振蕩后做適當稀釋。
(6)取終液0.5ml進行傾注平板，37恒溫倒置培養48小時。
(7)計算對照回收菌量及樣品回收菌量，得出殺滅率。
4、試驗結果表1殺菌濕巾體外殺菌試驗殺滅率結果試驗菌株殺菌濕巾對照濕巾大腸桿菌 99.92％ 0金黃色葡萄球菌 99.98％ 0無乳鏈球菌 99.92％ 0停乳鏈球菌 99.97％ 0乳房鏈球菌 99.56％ 0化膿棒狀桿菌 99.46％ 0實施例3殺菌濕巾體外殺菌試驗1、試驗樣品的制備(1)殺菌濕巾樣品按實施例1的方法制備，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，甜菜堿含量0.2wt％。
(2)對照濕巾其中聚乙二醇含量3％，甜菜堿含量0.2wt％。
2、試驗菌株金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和化膿棒狀桿菌(以上菌株來自于沈陽軍區軍馬防治研究所)。
3、試驗步驟按實施例2進行。
4、試驗結果表2殺菌濕巾體外殺菌試驗殺滅率結果試驗菌株殺菌濕巾對照濕巾大腸桿菌99.95％0金黃色葡萄球菌 99.97％0無乳鏈球菌 99.95％0停乳鏈球菌 99.98％0乳房鏈球菌 99.62％0化膿棒狀桿菌99.67％0實施例4動物體內急性毒性試驗1、樣品的制備按實施例1中的方法配制殺菌濕巾所需的溶液，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.01wt％，溶菌酶含量30wt％，聚乙二醇含量5％，聚梨山醇酯20含量0.3wt％。
2、試驗動物采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，體重33.5±0.25g，由復旦大學實驗動物部提供。
3、試驗方法每日一次連續7天經肌注小白鼠，觀察動物在最大劑量下毒性反應。實驗結果表明，動物經肌注7天后，無異常反應，活動正常。經7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明無毒性作用。
實施例5殺菌濕巾對試驗動物陰道黏膜刺激試驗1、樣品制備殺菌濕巾的制備方法參照實施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
2、試驗動物SD大鼠，雌性，普通級，18只，體重230克-250克，隨機分三組，殺菌濕巾組、賦形劑組和空白對照組，每組6只，由復旦大學實驗動物部提供。
3、試驗方法參照消毒技術規范(第三版)1999.11中的3.8條。將殺菌濕巾置動物陰道內，與陰道黏膜接觸4小時。賦形劑組用棉條0.01克浸以滅菌生理鹽水作同樣的試驗。空白對照組不做任何處理。于24小時處死動物，取出局部陰道組織，觀察有無充血、水腫現象。參照消毒技術規范(第三版)1999.11中皮膚刺激反應強度的評分標準評分及皮膚刺激強度分級，進行對陰道黏膜刺激強度的評定。
4、試驗結果表3殺菌濕巾對試驗動物陰道黏膜刺激試驗刺激反應評分組別 動物數(只)紅斑 水腫 總分殺菌濕巾組 6 0 0 0賦形劑組 6 0 0 0空白對照組 6 0 0 0
殺菌濕巾對大鼠陰道黏膜刺激反應最高總積分均值為0，屬無刺激性。
實施例6殺菌濕巾對乳區急性感染的治療試驗1、樣品準備5.殺菌濕巾的制備制備方法按實施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.008wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量2％，聚梨山醇酯20含量0.3wt％。
青霉素G鉀80萬單位，華北制藥廠硫酸鏈霉素100萬單位，華北制藥廠2、試驗動物的準備選擇泌乳期的4-8歲青、壯年高產、黑白花奶牛，共20頭，急性乳腺感染引發炎癥，，其癥狀為乳房腫脹，牛奶異常有凝塊，絮片或者以后有絮片。但是沒有疼痛，沒有其它癥狀。隨機分為4小組，1小組為殺菌濕巾治療組，2小組為青霉素G鉀治療組，3小組為鏈霉素治療組，4小組為空白對照組。
3、試驗方案1小組每天早晚各一次于擠干乳后，用殺菌濕巾反復擦拭并覆蓋于感染乳區，直至皮膚吸收。2、3小組每天早晚各一次，于擠干乳后，按青霉素10萬單位，鏈霉素10萬單位乳房內注射給藥。4小組對照組，不進行任何治療，給藥7天。
4、觀察指標(1)痊愈臨床乳腺炎的癥狀全部消失，乳房組織柔軟，牛奶里沒有凝塊，牛奶的顏色和平時一樣白。
有效臨床乳腺炎癥狀減輕，或者不再惡化，牛奶正常，但乳房腫脹沒有完全消失。
(2)細菌學檢測對治療前、后感染乳區的病原菌進行分離、培養、鑒定，其中因為奶牛乳腺感染以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿棒狀桿菌六種細菌為主，故本檢測試驗以上述六種細菌為主。具體操作步驟如下A、采樣同常規無菌采樣進行，用10ml試管，每頭牛每個乳區采集5-7ml鮮乳，注意的是前2-3把乳棄之不要，作好標記，盡可能快的放入4℃冰箱中保存。
B、培養、分離培養同常規進行，溫度37℃，相對溫度在50％以上。所用培養基主要有7％綿羊血瓊脂；加入1％七葉甙的綿羊湯瓊脂；卻浦曼瓊脂；疊氮鈉結晶紫血瓊脂；肉流培養基等。(以上培養基來自沈陽軍區軍馬防治研究所)C、鑒定金黃色葡萄球菌的鑒定采用試管法和玻片法進行，利用枸櫞酸兔血漿凝固實驗進行測定。
鏈球菌的鑒定采用Camp試驗進行，Camp試驗陽性而七葉甙為陰性者即是無乳鏈球菌，Camp試驗陽性而七葉甙為陽性者即是乳房鏈球菌，Camp試驗陰性七葉甙也為陰性者即是停乳鏈球菌，。
大腸桿菌的鑒定采用伊紅美蘭培養基分離培養以及進行V、P試驗和M、R試驗，V、P試驗陰性，M、R試驗陽性者為大腸桿菌。
化膿棒狀桿菌的鑒定采用血瓊脂培養基培養，36小時后，如見有直徑約1-2cm，圖形、凸起、乳白色、表面光滑有光澤，并出現β瓊血圈的小菌落者，即為化膿棒狀桿菌。
5、試驗結果表4殺菌濕巾對乳區急性感染的治療試驗結果殺菌濕巾組 青霉素G鉀組鏈霉素組空白對照組臨床 痊愈(頭數) 4 2 1 0表現 有效(頭數) 1 2 2 0大腸桿菌 99.7 97.2 92.30病原 金黃色葡萄球菌 99.8 65.3 41.20菌殺 無乳鏈球菌 99.5 86.2 85.30滅率 停乳鏈球菌 99.3 78.2 86.40(％) 乳房鏈球菌 99.1 89.6 91.30化膿棒狀桿菌 99.4 78.5 87.90從上表中可以看出，殺菌濕巾能有效殺滅引起乳腺感染的各種病原菌，尤其對金黃色葡萄球菌特別有效，而兩種抗生素則不能有效的去除乳區的病原菌。
實施例7殺菌濕巾預防乳腺感染的試驗1、樣品準備殺菌濕巾的制備制備方法按實施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
碘消靈溶液100ml，浙江農業大學。
采樣液1％蛋白胨，0.5％硫代硫酸鈉，2％吐溫-80，0.5％卵磷脂的PBS，每管10ml。
2、試驗動物的準備選擇泌乳期的4-8歲青、壯年高產、黑白花奶牛，正常無任何感染癥狀，共3頭，1小組為殺菌濕巾預防組，2小組為碘消靈組，3小組為空白對照組。
3、試驗方法將一支無菌棉拭沾濕采樣液采乳區，檢測乳區每個采樣樣本的自然菌落數。1小組用殺菌濕巾擦拭原采樣的鄰近部位后，1分鐘，30分鐘，2小時，各采一次樣；2小組方法同1小組，檢測作用后殘留的自然菌數，計算作用前后的自然菌殺滅率。
4、試驗結果表5殺菌濕巾預防乳區感染的試驗結果殺滅率(％) 殺菌濕巾組碘消靈組空白對照組1分鐘后 99.9 94.2 13.530分鐘后99.2 92.1 15.22小時后 98.4 62.3 14.6從上述試驗可以看出，殺菌濕巾能有效的預防奶牛乳區受到細菌感染，可以保持乳區的清潔。
權利要求
1.一種殺菌制劑，其特征在于包括溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，穩定劑1～15wt％，表面活性劑0.1～0.5wt％，水余量。
2.根據權利要求1所述的殺菌制劑，其特征在于所述及的穩定劑是聚乙二醇或殼聚糖中的一種。
3.根據權利要求1所述的殺菌制劑，其特征在于所述及的表面活性劑是非離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑。
4.根據權利要求3所述的殺菌制劑，其特征在于所述及的非離子表面活性劑是20≥親水親油平衡值≥6的非離子表面活性劑。
5.根據權利要求4所述的制劑，其特征在于非離子表面活性劑為聚山梨醇酯系列。
6.根據權利要求3所述的殺菌制劑，其特征在于所述及的兩性離子表面活性劑是甜菜堿。
7.一種殺菌濕巾，其特征在于由載體和負載于其上的權利要求1～6任一所述的殺菌劑組成。
8.根據權利要求7的述的殺菌濕巾，其特征在于所述載體包括無紡材料或棉紗布。
9.根據權利要求7所述的殺菌濕巾的制備方法，其特征在于包括根據下步驟(1)按比例稱取溶葡萄球菌酶、溶菌酶，穩定劑和表面活性劑與水混合；(2)將配制好的溶液噴涂于所需規格的載體上或將載體浸漬于溶液中，取出，即獲得本發明的殺菌濕巾。
10.權利要求7或8所述的殺菌濕巾在殺滅引起奶牛乳腺感染的細菌中的應用。
11.根據權利要求10所述的殺菌濕巾的應用，其特征在于所述的細菌是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。
12.根據權利要求11所述的殺菌濕巾的應用，其特征在于所述的細菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和化膿棒狀桿菌。
13.根據權利要求9-11任一所述的殺菌濕巾的應用，其特征在于于產奶前、后擦拭奶牛乳區。
14.根據權利要求9-11任一所述的殺菌濕巾的應用，其特征在于擦拭或覆蓋于奶牛的發生感染的乳區。
全文摘要
本發明公開一種殺菌制劑，含有溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，穩定劑1～15wt％，表面活性劑0.1～0.5wt％，水余量。本發明還公開了一種殺菌濕巾及其制備方法和在治療和預防奶牛乳腺感染中的應用，將上述殺菌制劑負載于載體上，即可獲得一種殺菌濕巾。本發明提供的殺菌濕巾用于殺滅引起奶牛乳腺感染的各種細菌，可取得十分顯著的效果，尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿棒狀桿菌的殺滅率均超過99％。
文檔編號A61L2/16GK1484959SQ0213724
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月28日 優先權日2002年9月28日
發明者黃青山, 陸婉英 申請人:上海高科聯合生物技術研發有限公司