一枝黃花注射用脂肪乳劑及制備方法

專利名稱：一枝黃花注射用脂肪乳劑及制備方法
技術領域：
本發明屬中藥制劑技術領域。具體涉及一種一枝黃花注射用脂肪乳劑及制備方法。
背景技術：
原因不明的發熱是醫院門診、急診地最常見的疾病之一，由于絕大多數并非細菌性感染，目前西醫尚無良好的治療方法，現在臨床上常采用抗生素治療，加重了病人的經濟負擔，而且實質上屬于抗生素的濫用，其后果是非常嚴重的，即使合并了細菌感染，由于病因較為復雜，抗生素的單獨應用，效果常不滿意，致使病情遷延。
大量的臨床實踐表明，這些原因不明的發熱病人，多為“上感”，常用疏風清熱、消腫解毒之中藥，可獲良好的療效，但是傳統中藥的湯劑，因運輸貯存困難，不利推廣，即使應用沖劑、片劑等劑型，亦因患者發熱較高，而這些劑型的中藥見效較慢，所以頗感不便。
近年來部分醫院應用幾種靜注劑型之中藥，取得了一定的效果，但該藥常有沉淀現象，臨床上也有溶血、過敏等多方面的副作用，而有的藥，至今尚未確定其最終產品的質量標準，或者劑型的穩定性等方面尚存在一定的問題。隨著醫藥事業的發展和中醫中藥科研的進步，社會和市場都急需新一代中藥的出現。
一枝黃花[Solidago Virgo-aurea L.Var.Leiocarpa(Benth)A.Gray]屬菊科植物，早載于“植物名實圖考”和“本草綱目”等書，中藥大辭典也有收錄，俗名金鑰匙、滿山黃、黃花草等。該藥之沖劑已于70年代早期作為正式產品生產、銷售，并在臨床使用。
該藥性溫味苦，主治散火疏風、清熱解毒，植化研究已證明該藥含酚、鞣質、揮發油、皂甙、黃酮等，酚性成分中含綠原酸(ChlorogenicAcid)、咖啡酸(Caffeic Acid)，黃酮類中含榭皮素、榭皮甙、蕓香甙(Kutin)、山萘酚葡萄糖甙(黃耆甙Astragalin)、雙甙(Cyainidin3-gentiobioside)全草的熱水提出液有抗菌作用，其抗菌成分能由酸化沉淀，并溶于乙醇，上述成分也提示該藥可能具有解熱、鎮痛、消炎、抗感染、平喘及免疫調節作用。
70年代應用該藥之沖劑顯示了對上呼吸道感染具有良好的療效，而有些醫院曾利用其揮發油成分作靜脈注射用對上呼吸道感染顯示了確實的療效，具有退熱快，毒性小等特點。對頑固感染抗生素無效時，加用該藥可迅速控制病情。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是對一枝黃花進一步研究開發，獲取其有效組分，擴展其臨床應用。
本發明提供了一枝黃花注射用脂肪乳劑，該脂肪乳劑是以一枝黃花油為活性成分與藥用輔料組成的，包括
一枝黃花油1.0-100g
注射用磷脂3-50g
注射用豆油50-300g
甘油 25g
注射用水加至 1000ml
本品活性成分為一枝黃花油，處方中濃度為0.1-10％。輔料為注射用豆油，處方中濃度為5-30％(W/W)；注射用磷脂，處方中濃度為0.3-5％(W/W)；甘油和注射用水。在處方中注射用豆油作為油相，注射用磷脂作為表面活性劑，甘油作為等滲劑，注射用水作為水相。
本發明所要解決的另一技術問題是一枝黃花注射用脂肪乳劑的制備方法，該方法包括下列步驟
①稱取處方量的一枝黃花油入處方量的注射用豆油中，混勻，為油相；
②稱取處方量的注射用磷脂入高速攪拌機中，加入適量的注射用水和處方量的甘油，開動攪拌，使磷脂完全溶解，為水相；
③在高速攪拌下，將油相以線狀加入水相中，待油相加畢，繼續攪拌10分鐘，即得乳白色的初乳液；
④將初乳置二步均質機的加料斗中，開動機器，待管道中無氣泡時，先將低壓調節至5-15kg/cm2；待低壓穩定后，將高壓調節至30-50kg/cm2，連續循環數次后將乳劑轉移至貯液桶內；
⑤用0.1N的氫氧化鈉溶液將乳液調節到pH7左右，再用注射用水稀釋到1000ml；
⑥乳液用3號垂熔漏斗濾過；
⑦進行中間質量檢測；
⑧將乳液灌封于適當的容器內；
⑨灌封后的乳液經100℃流通蒸汽消毒30分鐘，即得。
本發明對一枝黃花的有效部位進行了分離提取，并作了藥效學篩選，方法如下
(1)揮發油部位
(2)水煎醇沉正丁醇萃取部位
(3)水煎醇沉大孔樹脂乙醇洗脫部位
(4)水煎醇沉大孔樹脂洗脫液經硅膠H柱層析部位
一枝黃花提取工藝流程
一枝黃花抗感染有效組分靜脈制劑藥效學研究
(一)一枝黃花抗感染有效組分藥效初篩
摘要一枝黃花提取工藝獲得的4個部位經鎮痛、抗炎、解熱藥理試驗，證明其供靜脈注射的有效部位為揮發油。
1.實驗目的
以鎮痛、抗炎、解熱藥理實驗篩選一枝黃花提取工藝獲得的4個有效部位藥理活性，從而決定可供靜脈注射的組分。
2.受試藥物
2.1.名稱一枝黃花正丁醇部位(B)
一枝黃花大孔樹脂柱洗脫部位(E)
一枝黃花揮發油部位(A)
單體(水楊甙)(F)
2.2.提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
2.3.含量
一枝黃花正丁醇部位(B) 1g相當于生藥27.7g
一枝黃花大孔樹脂柱洗脫部位(E) 1g相當于生藥17.3g
一枝黃花揮發油部位(A) 1mg相當于生藥1.2g
單體(水楊甙)(F)
2.4.配制方法
除一枝黃花揮發油溶解在花生油中外，其余均溶解在0.5％CMC配成混懸液。
2.5.劑量設置
因提取物含量不同，劑量折合生藥量計算，實驗取30g生藥/kg的劑量篩選。
2.6.給藥途徑腹腔注射或靜脈注射
2.7.用量0.5ml/20g小鼠，1ml/150g大鼠，1ml/kg家兔
2.8.其它材料
致炎劑角叉萊膠，1％，進口。
致熱劑大腸桿菌提取物，本室自備。
3.動物
3.1.品系、種屬、合格證
小鼠，昆明種，雌雄均有，18-20g，上海醫藥工業研究院動物房供應，合格證滬動合證字107號。
大鼠，SD系，雄性，130-150g，中科院上海實驗動物中心供應，合格證中科動管會第005號。
家兔，雌雄均有，體重2-2.2kg，中科院上海實驗動物中心供應，
合格證中科動管會第005號。
4.對照藥
4.1.阿斯匹林新華制藥廠原料，本次作為陽性對照品。
4.2.一枝黃花水針劑上海龍華醫院提供，1mI相當于2g生藥，供實驗動物用。
4.3.雙黃連針劑哈爾濱中藥二廠，批號9803172，600mg/支，臨床用量60mg/kg，i.p gtt。
5.實驗方法
5.1.一枝黃花提取物有效組分對大鼠的鎮痛作用一醋酸扭體法
5.1.1.昆明種小鼠50只，隨機分為5組，對照組用相應溶劑，其余分別口服一枝黃花柱洗脫液、一枝黃花正丁醇部位、一枝黃花揮發油及陽性對照藥阿斯匹林，給藥后半小時每鼠均ip 0.7％醋酸10ml/kg，對照組小鼠ip醋酸后出現扭體反應，扭曲軀體，腹部貼地，5分鐘后記錄注射醋酸后10分鐘內扭體次數，計算抑制率，與對照組比較。
5.1.2.實驗結果
實驗結果見表1
對照組小鼠注射醋酸后出現扭體反應，扭曲軀體，腹部貼地，給藥的各組小鼠均明顯的抑制扭體動作，其中一枝黃花柱洗脫液的小鼠扭體動作減少幾乎為零，而一枝黃花揮發油小鼠活動如常，扭體次數都減少。
表1 一枝黃花各組分對小鼠醋酸扭體法的影響
**P＜0.01與對照組比較
5.2.一枝黃花第二次提取得到的各組分對小鼠醋酸扭體法的鎮痛作用
5.2.1.實驗目的
再一次決定一枝黃花正丁醇部位I、II及單體、一枝黃花揮發油各組分的活性并與雙黃連比較。
5.2.2實驗方法
昆明種小鼠80只，隨機分為8組，除對照組給予相應溶劑外，其余各組分別為一枝黃花正丁醇I、II、單體、一枝黃花揮發油、對照藥雙黃連、一枝黃花針、阿斯匹林，各組動物給藥后半小時均腹腔注射0.7％醋酸10mi/kg，5分鐘后記錄小時10分鐘內的扭體次數。
5.2.3實驗結果
結果見表2
動物在注射醋酸后一枝黃花各組分均明顯抑制小鼠的扭體次數，其中一枝黃花正丁醇II的小鼠活動明顯減少，而單體及一枝黃花揮發油部位的小鼠活動如常，而動物扭體次數明顯減少，雙黃連及一枝黃花針均有一定的鎮痛作用。
表2 一枝黃花組分對小鼠醋酸扭體法的影響
**P＜0.01與對照組比較
5.3.一枝黃花各組分對大鼠由角叉萊膠致急性炎癥的影響
5.3.1.實驗目的
初篩一枝黃花各組分對大鼠有角叉萊膠致急性炎癥的作用
5.3.2實驗方法
大鼠50只，隨機分為5組，即相應溶劑組、一枝黃花揮發油、一枝黃花正丁醇部位、一枝黃花水提取物及阿斯匹林組，實驗前先用排水法測各組大鼠右后足的正常體積，實驗當日給各組動物口服喂藥1次，一小時后給各組大鼠右后足跖皮內注射1％角叉萊膠0.05ml致炎，測定致炎后1、2、3、4、5、小時內的右后足體積，大鼠致炎前后右足跖體積的差值為腫脹值，計算腫脹值及抑制率，并與對照組比較。
En＝致炎后不同時間的足跖腫脹值
E0＝致炎前的足跖腫脹值
C＝對照組的腫脹率
T＝治療組的腫脹率
5.3.3.實驗結果
結果見表3，一枝黃花各組分對角叉萊膠致急性炎癥大鼠均有不同程度的抑制作用，但以一枝黃花正丁醇部位及水提取部位的抗炎活性比揮發油好。
表3 一枝黃花對大鼠由角叉萊膠致急性炎癥的抗炎作用
( )內為抑制率
5.4.一枝黃花各組分對家兔由大腸桿菌致熱的影響
5.4.1.實驗目的
初篩一枝黃花各組分對家兔由大腸桿菌致熱的解熱作用。
5.4.2.實驗方法
取以測體溫并已穩定在38.5-39.6℃的家兔，由靜脈注射滅活的大腸桿菌菌體，0.5-1hr后選擇體溫升高1℃以上的發熱家兔18只，隨機分為6組，分別靜脈注射一枝黃花揮發油、一枝黃花水蒸餾液、單體、一枝黃花正丁醇部位及阿斯匹林，對照組給予生理鹽水，給藥后每1小時由肛門測體溫1次。
5.4.3.實驗結果
結果見表4，家兔在注射大腸桿菌菌體后體溫迅速上升，對照組體溫在1-2小時上升較快，3小時后稍有下降，而一枝黃花水蒸餾液及單體體溫上升及下降均較均勻，一枝黃花正丁醇部位家兔ip注射后立即死亡，只有一枝黃花揮發油部位在致熱劑注射后2小時體溫開始下降，阿斯匹林組在2小時后體溫開始下降。
表4 一枝黃花各組分對家兔大腸桿菌致熱的影響
(二)一枝黃花各組分溶血試驗
1.實驗目的
觀察一枝黃花各組分對家兔的溶血情況，從而決定可供靜脈制劑的有效部位。
2.動物家兔，體重2.5kg，中科院上海實驗動物中心供應。
合格證中科動管會第005號。
3.受試樣品
一枝黃花正丁醇部位濃度10mg/ml
一枝黃花柱洗脫物濃度10mg/ml
一枝黃花揮發油濃度10mg/ml
4.溶劑生理鹽水
5.實驗方法
取新鮮兔血2ml，用竹簽攪拌以去除纖維蛋白，再用生理鹽水沖洗3-5次，離心，直至上清液紅色不再呈現，離心取沉淀，按所得紅細胞容積，用生理鹽水配成2％的懸液。以下列方法加入各種溶液，第6管不加供試品，作為空白對照，第7管加蒸餾水作為溶血對照，37℃水浴中保溫1小時觀察結果。
6.結果
一枝黃花正丁醇部位溶血
一枝黃花柱洗脫物溶血
一枝黃花揮發油不溶血
7.結論
由于一枝黃花正丁醇部位及一枝黃花柱洗脫物均有溶血現象產生，并給家兔靜脈注射后產生死亡。進一步的提取又無法將溶血組分分離，故只有采取一枝黃花揮發油作為有效活性組分，制備供靜脈注射的制劑。
一枝黃花揮發油成分及質控標準的研究
揮發油通常是一些成分非常復雜的混合物，但是根據二類中藥的要求，對其成分進行適當的研究是必不可少的，為此我們采用氣相色譜和氣相色譜—質譜聯用的方法對一枝黃花揮發油的成分進行了研究。
(一)一枝黃花揮發油的理化性質
一枝黃花揮發油顏色呈淡棕色，二次測定的理化性質如下
比重 旋光 折光率
0.96 [α]20-11.16°o1.5036
0.95 [α]20-10.34°o1.5015
(二)一枝黃花揮發油成分研究
揮發油為含多種成分的混合物，其組成極其復雜，通常有幾十種到上百種的化合物。對于揮發油成分的分析，氣相色譜法與測定物化常數的方法相比，具有分離效率強、靈敏度高的特點。為此，采用程序升溫毛細管氣相色譜法，對一枝黃花揮發油分別在非極性柱(HP-1，HP-5)和極性柱(SUPELCOWAX)上進行了分析考察，從而建立了氣相色譜分離分析方法，對一枝黃花揮發油中各成分進行分離，并采用面積歸一法確定各成分的百分含量。
關于各組分的定性研究工作揮發油的定性分析一般采用標準品對照、參考文獻值或結合其它分析手段來進行。由于除個別成分外難以得到成分的標準品，而且文獻值既少又散。因此采用了氣相色譜一質譜聯用的方法，通過氣相色譜的高分離能力和質譜方法鑒定化合物的功能，結合質譜譜庫檢索，對一枝黃花揮發油成分進行定性研究。以下是對目前已完成的工作進行歸納。
1.一枝黃花揮發油的氣相色譜分析
色譜條件的選擇
為了實現多組分的良好分離，采用程序升溫毛細管氣相色譜法，選擇極性不同的色譜柱考察揮發油(樣品編號1#)中成分的色譜行為，樣品在非極性色譜柱(HP-1，HP-5)分離效果較差，而在極性色譜柱(SUPELCOWAX)上分離效果好。分別改變程序初溫、載氣線速、升溫速率等參數，觀察色譜條件的適用性，確定了一枝黃花揮發油的氣相色譜分離分析條件。
2.一枝黃花揮發油的定性研究
一枝黃花揮發油經毛細管氣相色譜法對其成分進行了分離，但是由于除個別成分(β-石竹烯)難以得到標準品，通過色譜法保留時間對各個組分進行對照鑒別。鑒于氣相色譜—質譜聯用技術是當今分析中草藥揮發油成分的首選方法，為此我們采用氣質聯用技術對一枝黃花揮發油的成分進行了定性研究。
(1)儀器及實驗條件
儀器FinniganMATGCQ氣相色譜一質譜聯用儀
色譜條件色譜柱Supelcowax 30m 0.25mmlD o.25film
載氣He 分流比80∶1 進樣口溫度230℃
程序升溫條件50℃(hold3min)→2℃/min→160℃
(hold9min)→3℃/min→200℃
質譜條件
電離方式El.離子源溫度190℃
電子能量70eP. 掃描質量范圍25-350
分辯率1000
GCQ數據處理系統
(2)實驗結果
一枝黃花揮發油1#樣品經GC-MS分析，獲得質譜數據后直接由儀器數據處理系統進行譜庫檢索，再進一步與質譜標準圖譜EPA/NIHMass Spetral Data Base和The Wiley/NBS Registry Of MassSpectral Data核對，從而鑒別了一枝黃花揮發油的主要成分。
所得總離子流圖及實驗結果如表4所示
表4 一枝黃花揮發油化學成分及含量
(4)不同季節、批號樣品藥效學研究
考慮到不同批號(即不同季節所采樣品)上述幾種成分的含量不。一致，故決定以7#和8#樣品進行藥效學測定。
結果如下
表5 20010820對醋酸扭體法的鎮痛效果
**P＜0.01與對照組比較。
20010820批號療效遠不如以前的實驗結果。
表6 一枝黃花揮發油不同批號對醋酸扭體法的鎮痛效果
混合批7#和8#樣品的混合
表720011030對醋酸扭體法的鎮痛效果
**P＜0.01與對照組比較 注20011030即混合批。
3.小結
經過已進行的工作，總結以下幾點
(1)采用程序升溫毛細管氣相色譜法較好的分離分析了一枝黃花揮發油的成分，所含組分多，而且大多是若干沸點很接近，或是同分異構體的化合物，目前采用峰面積歸一法對一枝黃花揮發油進行定量分析，得到的是各組分的相對百分含量。
(2)氣相色譜一質譜聯用法是分離鑒定未知化學成分的最有效的方法之一。通過氣一質聯用技術和譜庫檢索鑒定了一枝黃花揮發油主要成分。
(3)實驗表明，從同一原料產地和采集季節提取的一枝黃花揮發油具有相似的組分，不同季節(批號)的揮發油成分基本相同，只是組分的含量上有差異。含量較高的幾個組分經鑒別為p-石竹烯(β-Caryophyliene)保留時間約36.7分鐘、大牻牛兒烯保留時間約42.5分鐘、氧化石竹烯(Caryophyliene oxide)保留時間約59.3分鐘、匙葉桉油烯醇保留時間約66分鐘、環丙奧-7-醇保留時間約75分鐘。經過對幾批樣品的測定發現這幾種組分的含量高低各有不同，但它們含量之和在34-43％之間。
一支黃花初步藥效學研究
1.一支黃花的鎮痛作用
1.1.實驗目的
證實一支黃花制劑的鎮痛效果。
1.2.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶
性針劑，每支針劑1ml含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量1、2、4mg/kg
用量0.5ml/20g小鼠
用法iv×1
1.3.動物
來源、品系、合格證小鼠，昆明種，雄性，19-21g，上海醫藥工業研究院動物房供應。
合格證滬動合證字107號。
1.4.對照藥阿斯匹林，本室自備(新華藥廠原料)
雙黃連，哈爾濱中藥二廠，批號980372，每支含
600mg，劑量60mg/kg，iv，gtt。
1.5.實驗方法
昆明種小鼠60只，分為6組，一支黃花分別為1、2、4mg/kg，雙黃連60mg/kg，阿斯匹林100mg/kg，對照組給予相應溶劑，均為iv×1，給藥后半小時每鼠ip 0.3％醋酸10ml/kg，5分鐘后記錄10分鐘內的小鼠扭體次數，并與對照組比較。
1.6.實驗結果
結果見表1，一支黃花有明顯的抑制醋酸引起小鼠的疼痛，并有——定的劑量效應，雙黃連及阿斯匹林也均有明顯的抑制疼痛的作用。
表8 一支黃花對小鼠醋酸法的鎮痛作用
**P＜0.01與對照組比較
2.一支黃花對家兔由大腸桿菌引起的發熱反應影響
2.1.實驗目的
觀察一支黃花的解熱作用，并與雙黃連作比較。
2.2.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1ml含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量2、4mg/kg
用量0.5ml/kg
用法iv×1
2.3.對照藥阿斯匹林，本室自備(新華藥廠原料)
雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
2.4.致熱劑大腸桿菌菌體，本室自行制備。
2.5.動物來源、品系、合格證
家兔，雌雄均有，2.0-2.2kg，中科院上海實驗動物中心提供。
合格證中科動管會第005號。
2.6.實驗方法
取以測體溫并已穩定在38.5-39.6℃的家兔，由靜脈注射滅活的大腸桿菌菌體，0.5-1hr后選擇體溫升高1℃以上的發熱家兔15只，隨機分為5組，一支黃花分別靜脈注射2、4mg/kg，雙黃連60mg/kg，阿斯匹林100mg/kg，對照組給予生理鹽水，給藥后每1小時由肛門測體溫1次，觀察體溫變化。
2.7.實驗結果
結果見表9，對照組家兔注射致熱劑后體溫迅速上升，在6小時后內基本穩定，給一支黃花組動物1-3小時內體溫上升較慢，4小時開始逐漸下降，雙黃連組動物體溫下降不明顯。
表9 一支黃花對家兔由大腸桿菌致熱的影響
3.一支黃花對大鼠由角叉萊膠致急性炎癥的抑制作用
3.1.實驗目的
觀察一支黃花針劑對大鼠致急性炎癥的抗炎作用。
3.2.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1mi含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量1、2、4mg/kg
用量1ml/只大鼠
用法ip×1
3.3.動物來源、品系、合格證
大鼠，SD系，130-150g，雄性，中科院上海實驗動物中心提供。
合格證中科動管會第005號。
3.4.對照藥阿斯匹林，本室自備(新華藥廠原料)
雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
3.5.致炎劑角叉萊膠，1％，進口。
3.6.實驗方法
大鼠50只，隨機分為5組，即相應溶劑組、一支黃花分別為1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg及阿斯匹林100mg/kg，實驗前先用排水法測各組大鼠右后足的正常體積，實驗當日給各組動物口服喂藥1次，一小時后給各組大鼠右后足跖皮內注射1％角叉萊膠0.05ml致炎，測定致炎后1、2、3、4、5、小時內的右后足體積，大鼠致炎前后右足跖體積的差值為腫脹值，計算腫脹值及抑制率，并與對照組比較。
En＝致炎后不同時間的足跖腫脹值
E0＝致炎前的足跖腫脹值
C＝對照組的腫脹率
T＝治療組的腫脹率
3.7.實驗結果
結果見表3，一支黃花對角叉萊膠致炎大鼠有不同程度的抑制作用，并呈現一定的量效關系，陽性藥阿斯匹林也有抑制炎癥的作用。
表10一支黃花對大鼠由角叉萊膠致急性炎癥的抗炎作用
P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較
4.一支黃花對小鼠免疫功能的影響
4.1.一支黃花針劑對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(體內)
摘要一支黃花針劑能明顯促進對小鼠脾淋巴細胞轉化，有一定的量效關系。
4.1.1.實驗目的
測試一支黃花針劑對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響。
4.1.2.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1mI含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量2、4mg/kg
用量0.5ml/20g小鼠
用法ip×6
4.1.3.動物來源、品系、合格證
小鼠，057BE16，19-21g，雄性，每組5只。中科院上海實驗動物中心提供。合格證中科動管會第005號。
4.1.4.對照藥雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
4.1.5.其它材料
刀豆球蛋白ConAsigma，50μg/ml。
3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml。
1640培養基Difco產品
4.1.6.實驗方法
C57BL/6小鼠，隨機分組，一支黃花分別給予2mg/kg、4mg/kg、雙黃連60mg/kg、對照組為生理鹽水，均為腹腔注射，每日1次，共6次，給藥結束后，處死動物，無菌條件下取脾，計數脾細胞，并調整細胞濃度為1×107/ml，在96孔細胞培養板上每孔加細胞懸液100μl，ConA 50μl和培養液，每組均設三復孔，37℃，5％CO2條件下培養48小時，加入3H-TdR 0.5μci/孔，繼續培養18小時，用多頭細胞收集器收集細胞，在液閃儀上測CPM值，并與對照組比較。
4.1.7.結果
結果見表11。
一支黃花針劑對小鼠脾淋巴細胞轉化在2、4mg/kg時有較明顯的促進作用。
表11 一支黃花對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(體內)
**P＜0.01與對照組比較
4.2.一支黃花對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(體外)
4.2.1.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1’8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1mI含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
4.2.2.動物來源、品系、合格證
小鼠，C57BL/6，19-21g，雄性，中科院上海實驗動物中心提供。
合格證中科動管會第005號。
4.2.3.對照藥雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
4.2.4.其它材料
刀豆球蛋白ConAsigma，50μg/ml。
3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml。
1640培養基Difco產品
4.2.5.實驗方法
C57BL/6小鼠，無菌條件下取脾，分離脾細胞，并調整細胞濃度為1×107/ml，一支黃花用培養基小鼠成1、0.1、0.01、0.001μg/ml，雙黃連稀釋成6、0.6、0.06、0.006μg/ml，在96孔細胞培養板上每孔加各種藥液100μl，ConA 50μl，培養基100μl，37℃，5％CO2條件下培養48小時，加入3H-TdR 0.5μci/孔，繼續培養18小時，用多頭細胞收集器收集細胞，液閃儀上測CPM值，并與對照組比較。
4.2.6.結果
結果見表12，一支黃花在不同劑量對小鼠脾淋巴細胞轉化有不同的作用，雙黃連也有同樣作用。
表12一支黃花對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(體外)
**P＜0.01與對照組比較
4.3.一支黃花對小鼠自然殺傷細胞(NK細胞)的影響
摘要一支黃花對小鼠NK細胞有一定的激活作用。
4.3.1.實驗目的
測試一支黃花針劑對小鼠NK細胞的影響。
4.3.2.供試樣品
名稱一支黃花
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1ml含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量2、4mg/kg
用量0.5ml/20g小鼠
用法ip×6
4.3.3.動物來源、品系、合格證
小鼠，C57BL/6，19-21g，雌性，每組5只。
中科院上海實驗動物中心提供。
合格證中科動管會第005號。
4.3.4.對照藥雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
4.3.5其它材料
YAC-1細胞上海醫藥工業研究院藥理室傳代。
1640培養基Difco產品
3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml。
4.3.6.實驗方法
C57BL/6小鼠，隨機分組，一支黃花分別為2mg/kg、4mg/kg、雙黃連60mg/kg，均ip×6，末次給藥結束后，處死動物，無菌條件下取脾，計數脾細胞，并調整細胞濃度為1×106/ml作為效應細胞，另取已培養24小時的YAC-1細胞，調整細胞濃度為1×104/ml作為靶細胞，以靶細胞與效應細胞之比為1∶100的濃度加在96孔細胞培養板上，加入3H-TdR 0.5μci/孔，每組均設三復孔，37℃5％CO2條件下培養24小時，收集細胞，測CPM值，計算特異性百分率(pi)表示NK細胞活性。
4.3.7.結果
結果見表13，一支黃花對小鼠NK細胞有一定的促進作用，雙黃連也有一定的作用。
表13一支黃花對小鼠NK細胞的影響(體內) **P＜0.01與對照組比較
4.4.一支黃花對小鼠NK細胞的影響(體外法)
4.4.1.供試樣品
名稱一支黃花針劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+吐溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1mI含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
4.4.2.動物來源、品系、合格證
小鼠，C57BL/6，19-21g，雄性，中科院上海實驗動物中心提供。合格證中科動管會第005號。
4.4.3.對照藥雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
4.4.4.其它材料
YAC-1細胞上海醫藥工業研究院藥理室傳代。
3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml。
1640培養基Difco產品
4.4.5.實驗方法
C57BL/6小鼠，無菌條件下取脾，調整細胞濃度為1×106/ml作為效應細胞，另取測試樣品調整濃度為1、0.1、0.01、0.001gg/ml，雙黃連調整濃度為6、0.6、0.06、0.006gg/mI，另取已培養24小時的YAC-1細胞并調整細胞濃度為1×101/ml，作為靶細胞，以靶細胞與效應細胞之比為1∶100的比例加入96孔細胞培養板上，加入3H-TdR0.5μci/孔，每組均設三復孔，37℃，5％CO2條件下培養24小時，收集細胞，測CPM值，計算特異性百分率(pi)表示NK細胞活性。
4.4.6.結果
結果見表14，一支黃花對小鼠NK細胞在不同濃度呈現不同的作用。
表14一支黃花對小鼠NK細胞的影響(體外)
**P＜0.01與對照組比較
4.5.一支黃花對小鼠IL-2產生的影響
摘要一支黃花對小鼠IL-2在低劑量時呈現抑制作用。
4.5.1實驗目的
觀察一支黃花對小鼠產生IL-2的影響。
4.5.2供試樣品
名稱一支黃花
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
成分一支黃花+溫80以1∶8的比例混合后，得到的水溶性針劑，每支針劑1ml含揮發油4mg，可供靜脈注射用。
劑量2、4mg/kg
用量0.5ml/20g小鼠
用法ip×6
4.5.3動物來源、品系、合格證
小鼠，C57BL/6，19-21g，雌性，中科院上海實驗動物中心提供。
合格證中科動管會第005號。
4.5.4.對照藥雙黃連，哈爾濱中藥二廠，600mg/支，60mg/kg，
批號980372。
4.5.5.其它材料
CTLL細胞上海醫藥工業研究院藥理室自備。
培養基1640，Difco產品
3H-TdR上海原子核研究所，放射性濃度1mci/ml。
4.5.6.實驗方法
C57BL/6小鼠20只，隨機分為4組，一支黃花分別為2mg/kg、4mg/kg、雙黃連60mg/kg及對照組，對照組給生理鹽水，每組藥物均ip×6，給藥結束后，處死動物，無菌條件下取脾，分離脾細胞，并調整細胞濃度為1×107/mi，在24孔細胞培養板上每孔加細胞懸液2ml及ConA 50μg/ml(終濃度)，37℃，5％CO2條件下培養24小時，收集上清液作為待測樣品，用IL-2依賴細胞CTLL以3H-TdR摻入法測CPM值，比較對照組與給藥組的CPM值。
4.5.7實驗結果
結果見表15，一支黃花對小鼠產生IL-2產生抑制作用。
表15一支黃花對小鼠產生IL-2的影響(體內)
*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較
一支黃花抗病毒作用的研究
一支黃花在250pg/ml濃度下體外未發現對流感病毒及腺病毒有明顯的抑制作用，同時做雙黃連進行比較(1mg/ml濃度)亦未見雙黃連有明顯的作用。
一支黃花抗真菌作用的研究
用一支黃花體外于200μg/ml濃度下，對白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、石膏毛癬菌均無抑制作用，同時作雙黃連在1mg/ml濃度下，亦未見明顯的抑制作用。
一支黃花對細菌的抑制作用
一支黃花對肺炎雙球菌在30μg/ml濃度下有抑菌作用，雙黃連亦在低至30μg/ml濃度下有抑菌作用。
一支黃花對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均無明顯的抑制作用。
一支黃花急性毒性的研究
以一支黃花靜注液0.5ml(含2.5mg揮發油)靜脈注射20只小鼠(體重18-20g，雌雄各10只)，觀察一周，無動物死亡，未見有任何異常反應，所以一支黃花的LD50大于125mg/kg。
一支黃花脂肪乳劑藥效學試驗
摘要一支黃花制備成脂肪乳劑后小鼠鎮痛試驗證明它有明顯的鎮痛作用。
1.實驗目的
一支黃花脂肪乳劑對小鼠醋酸扭體法的鎮痛作用。
2.待測樣品
名稱一支黃花脂肪乳劑
提供單位上海醫藥工業研究院中藥室
含量每1mi含8mg一支黃花
3.動物
來源、品系、合格證
小鼠，昆明種，19-21g，雄性，上海醫藥工業研究院動物房提供，合格證滬動合證字107號。
4.實驗方法
昆明種小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，分為一支黃花脂肪乳劑2mg/kg、4mg/kg，均為iv×1，阿斯匹林100mg/kg，ip×1，對照組給予生理鹽水，給藥后半小時ip 0.7％醋酸10ml/kg，5分鐘測10分鐘內小鼠的扭體次數。
5.實驗結果
結果見表16，小鼠iv給脂肪乳劑后，仍能明顯抑制小鼠對化學刺激物一醋酸引起的疼痛反應，結果和一支黃花水針劑結果相仿。
表16一枝黃花脂肪乳劑對小鼠醋酸扭體法的影響
上述結果表明一枝黃花注射用脂肪乳劑具有鎮痛解熱、消炎和調節免疫功能等作用，并且藥價較廉，將有較大的經濟效益和社會效益。


圖1 顆粒數分布圖(1)
圖2 顆粒數分布圖(2)
圖3 顆粒數分布圖(3)具體實施方式
實施例1
1.處方
一枝黃花油 10g
注射用磷脂15g
注射用豆油100g
甘油 25g
注射用水加至 1000ml
2.制備方法
(1)稱取處方量的一枝黃花油入處方量的注射用豆油中，混勻，為油相；
(2)稱取處方量的注射用磷脂入高速攪拌機中，加入適量的注射用水和處方量的甘油，開動攪拌，使磷脂完全溶解，為水相；
(3)在高速攪拌下，將油相以線狀加入水相中，待油相加畢，繼續攪拌10分鐘，即得乳白色的初乳液；
(4)將初乳置二步均質機的加料斗中，開動機器，待管道中無氣泡時，先將低壓調節至5-15kg/cm2待低壓穩定后，將高壓調節至30-50kg/cm2，連續循環數次后將乳劑轉移至貯液桶內；
(5)用0.1N的氫氧化鈉溶液將乳液調節到pH7左右，再用注射用水稀釋到1000ml；
(6)乳液用3號垂熔漏斗濾過；
(7)進行中間質量檢測；
(8)將乳液灌封于適當的容器內；
(9)灌封后的乳液經100℃流通蒸汽消毒30分鐘，即得。
3.結果
(1)有效成分的含量
(2)pH值5.0-7.5
(3)乳粒的大小及范圍本品的乳粒的大小平均在1μm以下，結果如圖1所示。實施例2
1.處方
一枝黃花油 50g
注射用磷脂 20g
注射用豆油 150g
甘油 25g
注射用水加至 1000ml
2.制備方法同實施例1
3.結果
(1)有效成分的含量
(2)pH值5.0-7.5
(3)乳粒的大小及范圍本品的乳粒的大小平均在1μm以下，結果如圖2所示。實施例3
1.處方
一枝黃花油 80g
注射用磷脂 20g
注射用豆油 200g
甘油25g
注射用水加至1000ml
2.制備方法同實施例1
3.結果
(1)有效成分的含量
(2)pH值5.0-7.5
(3)乳粒的大小及范圍本品的乳粒的大小平均在1μm以下，結果如圖3所示。
權利要求
1.一枝黃花注射用脂肪乳劑，其特征在于該乳劑是以一枝黃花油為活性成分與藥用輔料組成的，包括
一枝黃花油1.0-100g
注射用磷脂3-50g
注射用豆油50-300g
甘油 25g
注射用水加至 1000ml
本品活性成分為一枝黃花油，處方中濃度為0.1-10％；輔料為注射用豆油，處方中濃度為5-30％(W/W)；注射用磷脂，處方中濃度為0.3-5％(W/W)；甘油和注射用水；在處方中注射用豆油作為油相，注射用磷脂作為表面活性劑，甘油作為等滲劑，注射用水作為水相。
2.一種如權利要求1所述的一枝黃花注射用脂肪乳劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟
①稱取處方量的一枝黃花油入處方量的注射用豆油中，混勻，為油相；
②稱取處方量的注射用磷脂入高速攪拌機中，加入適量的注射用水和處方量的甘油，開動攪拌，使磷脂完全溶解，為水相；
③在高速攪拌下，將油相以線狀加入水相中，待油相加畢，繼續攪拌10分鐘，即得乳白色的初乳液；
④將初乳置二步均質機的加料斗中，開動機器，待管道中無氣泡時，先將低壓調節至5-15kg/cm2；待低壓穩定后，將高壓調節至30-50kg/cm2，連續循環數次后將乳劑轉移至貯液桶內；
⑤用0.1N的氫氧化鈉溶液將乳液調節到pH7左右，再用注射用水稀釋到1000ml；
⑥乳液用3號垂熔漏斗濾過；
⑦進行中間質量檢測；
⑧將乳液灌封于適當的容器內；
⑨灌封后的乳液經100℃流通蒸汽消毒30分鐘，即得。
3.一種如權利要求1所述的一枝黃花在制備具有鎮痛解熱、消炎和調節免疫功能的注射用脂肪乳劑中的應用。
全文摘要
本發明屬中藥制劑技術領域。本發明公開了一種一枝黃花注射用脂肪乳劑，該乳劑是由一枝黃花的有效部位揮發油與藥用輔料組成的。經藥效學研究，本發明的制劑具有鎮痛解熱、消炎和調節免疫功能。本發明提供了制備方法。
文檔編號A61P29/00GK1395961SQ02136369
公開日2003年2月12日 申請日期2002年8月2日 優先權日2002年8月2日
發明者劉全海, 戴靜芝, 楊培明, 李悅, 馬晉隆 申請人:上海醫藥工業研究院