專利名稱：用于增強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞活性的發(fā)酵的大豆萃取液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵的大豆(Glycine max(L.))萃取液在增強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性、預(yù)防和/或治療個體涉及天然殺傷細(xì)胞活化作用的疾病中的用途。本發(fā)明還涉及其提高個體免疫力的用途，如提升化療法與放射療法等患者的免疫力，減輕這些療法副作用的產(chǎn)生。
具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性效力的物質(zhì)可用于作為預(yù)防或治療疾病的藥劑。大豆為人類膳食中一種異黃酮的集中來源。其亦包含多種化合物，包括皂苷類、植物甾醇類、大豆植酸鹽、蛋白酶抑制劑、酚酸、復(fù)合糖類(complex sugars)、硼、卵磷脂、ω-3脂肪酸與葉酸，其對健康有益。許多東方傳統(tǒng)食品(如天貝(tembe)與納豆)均由大豆發(fā)酵制成。例如天貝是由大豆使用少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、米根霉(R.Oryzae)、少根根霉(R.arrihizus)與黑根霉(R.stolonifer)發(fā)酵制成。納豆則使用納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)發(fā)酵制成。傳統(tǒng)的發(fā)酵食品可作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源。然而，現(xiàn)有技術(shù)均未公開任何已知的發(fā)酵的大豆食品與大豆具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的功效。
本發(fā)明的一個目的為提供一種增強(qiáng)個體NK細(xì)胞活性的方法，其包括給予有此需要的個體有效量的發(fā)酵的大豆萃取液，其中發(fā)酵的大豆萃取液由大豆水性萃取物與至少一種乳酸菌及至少一種酵母共同發(fā)酵制成。具體地說，大豆為一種黃豆或黑豆。更具體地說，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液包括發(fā)酵的黃豆萃取液與發(fā)酵的黑豆萃取液。
本發(fā)明的另一目的為提供一種預(yù)防和/或治療個體涉及NK細(xì)胞活化作用的疾病，其包括給予有此需要的個體有效量的發(fā)酵的大豆萃取液。具體地說，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液可用于預(yù)防和/或治療個體涉及NK細(xì)胞活化作用的疾病，可通過發(fā)酵的大豆萃取液預(yù)防或治療癌癥、感染性疾病或調(diào)節(jié)個體涉及天然殺傷細(xì)胞活性的免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及一種改善患者健康的方法，此方法包括將有效量的發(fā)酵的大豆萃取液給予需要改善和增進(jìn)免疫力的健康人或患者。
上述目的與概說僅提供本發(fā)明的簡要介紹。為了更詳細(xì)了解本發(fā)明的這些目的與其它目的及本發(fā)明本身，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)配合附圖
解讀本發(fā)明的詳細(xì)說明與權(quán)利要求書。說明書與附圖中指定的編號代表相同或相似的組件。
本領(lǐng)域技術(shù)人員參考詳細(xì)說明與附圖時，將更了解本發(fā)明的許多其它優(yōu)點(diǎn)與特色，其中涵括本發(fā)明原則的優(yōu)選實(shí)施例僅為實(shí)例說明。
具體地說，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液可用于預(yù)防和/或治療個體涉及NK細(xì)胞活化作用的疾病，如癌癥及感染性疾病。此外，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液亦可用于調(diào)節(jié)個體涉及NK細(xì)胞活化作用的免疫系統(tǒng)，如經(jīng)化療法及放射療法治療的癌癥病人。制造發(fā)酵的大豆萃取液的方法發(fā)酵的大豆萃取液的制法是由大豆水性萃取液與至少一種乳酸菌與至少一種酵母共同發(fā)酵后，發(fā)酵的液體經(jīng)例如加熱殺菌，及視需要過濾與濃縮。
根據(jù)本發(fā)明，用于制備發(fā)酵的大豆萃取液的優(yōu)選的大豆選自黃豆與黑豆。更具體地說，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液為發(fā)酵的黃豆萃取液或發(fā)酵的黑豆萃取液。
發(fā)酵的大豆萃取液的制法是由大豆萃取液與至少一種乳酸菌(例如乳酸桿菌屬(Lactobacillus)之一種或多種菌株或多種乳酸桿菌屬的數(shù)種菌株)及至少一種酵母菌(例如酵母菌屬(Saccharomyces)之一種或多種菌株或多種酵母菌屬的數(shù)種菌株)共同發(fā)酵。水性大豆萃取液與一種或多種乳酸菌及視需要選用的酵母菌的發(fā)酵作用可依任何順序進(jìn)行或同時進(jìn)行，優(yōu)選同時進(jìn)行。
若發(fā)酵過程中使用的微生物超過一種以上時，該發(fā)酵作用使用微生物按順序進(jìn)行或同時進(jìn)行。優(yōu)選地，采用選定品級的非基因改造的有機(jī)大豆的水性萃取液作為起始原科。優(yōu)選地，發(fā)酵作用采用乳桿菌的多相培養(yǎng)物進(jìn)行，例如含5、10、15、20、25或30株乳桿菌的培養(yǎng)物，并在乳桿菌的多相培養(yǎng)物中添加至少一種酵母。可使用的乳桿菌菌株包括例如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus CCRC10695、14026、14064、14065和/或14079)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii bulgaricus CCRC 10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098和/或16054)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis CCRC10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015和/或14117)、克非乳桿菌(Lactobaciilus kefir CCRC 14011)和/或克氏乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens CCRC 16059))?？墒褂玫慕湍妇ɡ玑劸平湍?Saccharomyces cerevisiae CCRC 20577、20578、20581、21494、21550、21797、21805、22138、22234、22337、22731和/或22728，和/或乳酒假絲酵母(Candida kefyr CCRC 21269、21742和/或22057))。發(fā)酵后，發(fā)酵液經(jīng)由例如加熱或放射(優(yōu)選加熱)，殺菌以得到無菌液體。優(yōu)選地，無菌液體經(jīng)過濾或離心(優(yōu)選過濾)，去除大部分或所有死微生物以得到發(fā)酵的大豆萃取液。更優(yōu)選地，繼過濾步驟后，去除濾液中部分水以濃縮發(fā)酵液體而得到發(fā)酵的大豆萃取液。除非另有詳細(xì)說明，否則本申請進(jìn)行的試驗(yàn)涉及濃縮步驟后的發(fā)酵的大豆萃取液。視需要，發(fā)酵的大豆萃取液可經(jīng)由干燥(例如利用冷凍干燥法)而得到粉末形式的發(fā)酵的大豆萃取液。
進(jìn)行此方法時，混合有機(jī)大豆(已脫脂)與蒸餾水，比例為1∶10。混合物于100℃下加熱30分鐘后并接著過濾以得到大豆萃取液。牛肉與海草于蒸餾水中煮沸30分鐘以得到肉汁。添加鹽、糖與洋菜以制成特制洋菜培養(yǎng)基。添加乳酸菌與酵母菌株至特制洋菜培養(yǎng)基中。自培養(yǎng)基中取出乳酸菌及視需要添加的酵母添加至大豆萃取液中，并于36-43℃下培養(yǎng)45至50小時。優(yōu)選地，依據(jù)類似的生長特性將各種不同微生物菌株分類，例如依獨(dú)特營養(yǎng)基的任何需求，微生物菌株是否在發(fā)酵后產(chǎn)生良好氣味，及所分類的微生物是否可在獨(dú)特條件下存活等條件分類，以便在培養(yǎng)前將分類的微生物分開加至大豆萃取液中。此步驟的目的在于減少不同菌株之間任何不良交互作用。亦優(yōu)選地，在培養(yǎng)前先添加等比例的不同類的微生物菌株至大豆萃取液中，所得萃取液于40℃下培養(yǎng)45-47小時。培養(yǎng)期完成時，再將多相培養(yǎng)物移至大豆萃取液中，于36-43℃下培養(yǎng)100-150小時。最終發(fā)酵萃取液經(jīng)加熱殺菌及過濾；于濃縮器中排除濾液中95％水份，得到濃縮型的發(fā)酵的大豆萃取液。取上層經(jīng)磁濾器過濾，然后分裝在容器中密封。
本發(fā)明范圍內(nèi)容包括依上述類似方法制造，但改用中國藥草替代大豆制成的發(fā)酵的中國藥草萃取液。中國藥草的發(fā)酵的萃取液可為甘草(Glycyrrhiza uralensis Fish)、枸杞(Lycium barbarum)、薏仁(Coixlacryma-jobi L.var.ma-yune Stapf)、山豆根(Sophora tonkinensisgapnep.)、決明(Cassia obtusifolia.)、黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、茵陳(Artemisia capillaries Thunb.)、黃蓮(Coptis chinensisFrsnch.)、龍膽草(Gentiana scabra Bge.)、蓮子(Nelumbo nuciferaGaertn.)、菊花(Chrysantheiferamum morifolium Ramat.)、梔子(Gardeniajasminoides Ellis)、麥芽(Hordeum vulgare L.)、肉桂(Cinnamomumcassia Presl)、蘿卜(Raphanus sativus L.)、山藥(Dioscorea oppositaThunb.)、當(dāng)歸(Angelica sinensis(Oliv.))、川芎(Ligusticum chuanxiongHort.)、羌活(Notopterygium incisum)、白杓(Paeonia lactiflora Pall.)、大蒜(Allium satiumL.)、五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)、生地(Rehmannia glutinosa Libosch.)、五加(Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith)、阿膠(Equus asinus L.)、女貞子(Ligustrum lucidum Ait.)、綠豆(Phaseolus radiatus L.)、小麥(Triticum aestivum L.)、扁豆(Dolichoslablab L.)、白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz.)、防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata)、金銀花(Lonicera japonica Thund.)、桂枝(Cinnamimumcassia Presl.)、生姜(Zingiber officinale Rosc.)、天麻(Gastrodia elataBl.)、天門冬(Asparagus cochinchinensis(Liur.)Merr.)、石斛(Dendrobiunloddigesii Rolfe)以及黑芝麻(Sesamum indicum L.)。增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的用途天然殺傷細(xì)胞為外周血淋巴細(xì)胞的小族群，對人體健康與疾病有重要的功能。除了其在控制轉(zhuǎn)移與感染方面的作用，NK細(xì)胞亦參與免疫調(diào)節(jié)作用、造血作用、生殖及神經(jīng)內(nèi)分泌交互作用。NK細(xì)胞活性與NK細(xì)胞數(shù)不相同。NK細(xì)胞的數(shù)量可能充足，但除非經(jīng)過活化，否則無法有效發(fā)揮其作用。NK細(xì)胞活性下降與許多疾病的發(fā)展與進(jìn)行有關(guān)，亦與放射療法及化療法有關(guān)。因此，NK細(xì)胞功能似乎為疾病的生物標(biāo)記，且為指示健康情形下降或改善的重要指針。此外，NK細(xì)胞活性亦為多種癌癥的重要診斷因素。
本發(fā)明的研究證實(shí)，發(fā)酵的大豆萃取液比其它已知的發(fā)酵的大豆食品及未發(fā)酵的大豆更能提高NK細(xì)胞活性。由發(fā)酵的大豆萃取液提高的NK細(xì)胞活性可通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)生長因子活化及殺死癌細(xì)胞和/或傳染性細(xì)胞而具有細(xì)胞毒性效應(yīng)。且提高的NK細(xì)胞活性可抑制腫瘤生長。
由上文可知，本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液對增強(qiáng)NK細(xì)胞活性具有優(yōu)越效果，因此可用于預(yù)防和/或治療個體涉及提高NK細(xì)胞活性的疾病，如癌癥、傳染性疾病及免疫調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，發(fā)酵的大豆萃取液可用作消炎劑、抗癌劑或促進(jìn)免疫功能的藥劑。抗癌劑用途本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液具有治療和/或預(yù)防癌癥的抗癌活性，并可克服已有技術(shù)用于治療癌癥的化放療劑的一項(xiàng)或多項(xiàng)缺點(diǎn)?？墒褂冒l(fā)酵的大豆萃取液治療的癌癥包括人類最常見的癌癥，亦即乳癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸癌與肝癌。
本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液可在癌細(xì)胞中誘發(fā)一種或多種抑制細(xì)胞增生的效應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞分化，誘發(fā)細(xì)胞凋亡(漸進(jìn)性細(xì)胞死亡)，和/或阻斷細(xì)胞循環(huán)。因此，本發(fā)明的萃取液對癌細(xì)胞具有極廣泛的活性，因此可有效治療和/或預(yù)防癌癥，包括良性前列腺肥大、前列腺癌、乳癌、子宮癌、白血病、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰癌、肺癌、腦瘤、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膀胱癌、甲狀腺癌、肝癌、腎癌及鼻咽癌。促進(jìn)免疫功能用途除了控制癌癥的作用外，NK細(xì)胞亦有助于調(diào)節(jié)及影響我們整體健康的免疫系統(tǒng)功能。利用免疫療法來幫助提升NK細(xì)胞活性已漸成趨勢且將隨對免疫系統(tǒng)的知識增加而更為廣泛應(yīng)用?；铙w外試驗(yàn)指出本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液可改善免疫功能。發(fā)酵的大豆萃取液對于動物(Balb/c老鼠)免疫力的調(diào)節(jié)的影響，是通過將動物以發(fā)酵的大豆萃取液與含有或不含各種促細(xì)胞分裂劑的刺激而試驗(yàn)，這些促細(xì)胞分裂劑包括脂多醣、伴刀豆凝集素A以及植物血球凝集素(PHA)。脾臟細(xì)胞增殖分析顯示，發(fā)酵的大豆萃取液與免疫力調(diào)節(jié)中的T細(xì)胞及B細(xì)胞的交互作用有關(guān)。發(fā)酵的大豆萃取液也與抗發(fā)炎的反應(yīng)有關(guān)。大豆萃取液也可將巨噬細(xì)胞的吞噬活性增強(qiáng)71％。相似的結(jié)果也可在老鼠的活體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。發(fā)酵的大豆萃取液的抗癌效果，也證實(shí)是由所釋放的細(xì)胞激素而調(diào)節(jié)。由發(fā)酵的大豆萃取液而得到的培養(yǎng)液，可刺激45-56％的外周血液單核細(xì)胞。白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-β及腫瘤壞死因子α的濃度，都遠(yuǎn)高于未處理的對照組。因?yàn)槲刺幚淼木奘杉?xì)胞及T淋巴球細(xì)胞產(chǎn)生很少或沒有產(chǎn)生細(xì)胞激素，以及正常的單核球細(xì)胞并不會抑制血癌細(xì)胞的生長，因此，抗腫瘤的活性可由增加的細(xì)胞激素的量而推估。發(fā)酵的大豆萃取液的給藥本發(fā)明中，發(fā)酵的大豆萃取液可單獨(dú)給藥或以組合物給藥，其中包含發(fā)酵的大豆萃取液及醫(yī)藥上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。優(yōu)選地，發(fā)酵的大豆萃取液為發(fā)酵的黃豆萃取液或發(fā)酵的黑豆萃取液。發(fā)酵的大豆萃取液的給藥劑量可為每公斤體重約0.001至40毫升，每次給藥的最大劑量為每人2000毫升。優(yōu)選地，發(fā)酵的大豆萃取液劑量為0.01至20毫升/公斤個體體重，優(yōu)選為0.1至5毫升/公斤。這些劑量以濃縮型的發(fā)酵的大豆萃取液為主，但可依此計算呈未濃縮型或干粉型式發(fā)酵的大豆萃取液的適當(dāng)劑量。劑量可依個體的健康條件或待預(yù)防或治療疾病調(diào)整。
在嚙齒動物的慢性毒性試驗(yàn)中已證實(shí)，長期每日攝取1至10毫升發(fā)酵的大豆萃取液長達(dá)6個月時，安全性極高。接受20毫升/公斤與1毫升/公斤給藥的兩組試驗(yàn)動物均未出現(xiàn)肉眼可見的毒性或死亡率。在艾氏(Ames)試驗(yàn)中，證明發(fā)酵的大豆萃取液沒有誘發(fā)突變性，不會在活體外造成哺乳動物細(xì)胞染色體傷害，而且不會在ICR試驗(yàn)小白鼠的骨髓細(xì)胞中誘發(fā)小核形成。
以發(fā)酵的大豆萃取液喂食小白鼠(Balb/c)3周后，檢視NK細(xì)胞活性如下測試三組。第一組Balb/c小白鼠接受PBS緩沖液，第二組接受0.1％FSE，第三組則接受0.4％FSE。
表1組別 NK細(xì)胞活性，殺死百分比喂食PBS補(bǔ)充液體的試驗(yàn)組 24.8±4.80.1％FSE 33.2±4.2**0.4％FSE 35.1±5.9**每個數(shù)值均以平均值±SD表示。采用單向ANOVA試驗(yàn)分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)，**表示與對照組相比較之顯著差異程度達(dá)0.01。
為分析FSE對化療法所誘發(fā)NK功能下降的恢復(fù)能力，為18位接受化療的患者檢查給予發(fā)酵的大豆萃取液前及后的NK活性變化。結(jié)果顯示口服發(fā)酵的大豆萃取液患者的NK總活性由5.751％提高至13.493％(p＝0.02)。
NK活性百分比示于下表2表2NK活性臨床分析法(n＝18)處理 NK活性(％，K562，E/T＝25) p值對照組(C/T) 5.751FSE(C/T+FSE) 13.493 0.02上述結(jié)果為開放標(biāo)識，交叉試驗(yàn)，沒有安慰劑對照組設(shè)計的臨床分析法。
雖然本文已出示及說明本發(fā)明某些新穎特色，且在所附權(quán)利要求書中指明，但并無意受上述詳細(xì)說明的限制，因?yàn)榭梢粤私?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不偏離本發(fā)明精神的前提下，為所說明裝置的形式與細(xì)節(jié)進(jìn)行各種省略、修飾、取代及改變。
權(quán)利要求
1.發(fā)酵的大豆萃取液在制備預(yù)防和/或治療個體涉及天然殺傷細(xì)胞活化作用的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中該疾病為癌癥或感染性疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中該萃取液通過將大豆萃取液的水溶液與至少一種乳酸菌及至少一種酵母菌共同發(fā)酵而制得，藉此提高天然殺傷細(xì)胞活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中該發(fā)酵的大豆萃取液為發(fā)酵的黃豆萃取液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中該發(fā)酵的大豆萃取液為發(fā)酵的黑豆萃取液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中該涉及天然殺傷細(xì)胞活化作用的疾病為調(diào)節(jié)個體涉及天然殺傷細(xì)胞活性的免疫系統(tǒng)的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆萃取液的應(yīng)用，其中所述藥物用于個體經(jīng)化療法與放射療法后的免疫力調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵的大豆(Glycine max(L.))萃取液在增強(qiáng)天然殺傷(NK)細(xì)胞活性中的用途，該大豆萃取液由大豆水性萃取液與至少一種乳酸菌及至少一種酵母菌共同發(fā)酵制得。具體地說，發(fā)酵的大豆萃取液可用于預(yù)防和/或治療個體涉及NK細(xì)胞活化作用的疾病，如癌癥、感染性疾病及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的發(fā)酵的大豆萃取液還在改善經(jīng)化學(xué)治療和放射治療的患者的免疫力方面有效，以減輕對這些治療途徑所產(chǎn)生的副作用的反應(yīng)。
文檔編號A61P37/00GK1471935SQ0212715
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者路孔明 申請人:中天生物科技股份有限公司