專利名稱：預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移的組合物及方法
技術領域：
本發明涉及一種預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移的藥物組合物及其方法，尤其是OPG在這種預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移的藥物中的應用。
腫瘤轉移是指惡性腫瘤細胞借助血道、淋巴道等途徑，在非腫瘤原發部位的器官內形成繼發瘤。目前發現的抗腫瘤轉移劑，如維甲酰胺，能顯著抑制大鼠前列腺癌細胞的生長和轉移；常用的組合物(紫杉醇、順鉑、他莫昔等)對腫瘤細胞具有基本的作用，事實上對正常細胞具有很大的副作用。
惡性變和轉移是惡性腫瘤的重要特征。癌轉移使局部病變擴散成全身多灶性分布的疾病。在臨床診斷出原發腫瘤時，一半以上的患者已經產生遠隔部位的癌轉移，以至現有的技術、放療和化療手段常常在治療癌癥時，無能為力，導致患者的死亡。因此防止腫瘤的惡性變以及腫瘤的轉移，是延長腫瘤患者的生命，提高手術成功率的重要途徑。
OPG是一種分泌型糖蛋白和缺乏跨膜結構域的TNF受體(TNFR)家族成員，OPG mRNA具有廣泛的組織分布，在肝、心、肺、腎、胃、小腸、皮膚、腦、脊髓和骨骼中的表達水平較高。OPG是一種誘餌受體，其作用是結合或中和可溶性細胞核因子-κB受體活化因子配體[(RANKL)，也稱破骨細胞分化因子、OPG配體(OPGL)和TNF相關活化誘導細胞因子(TRANCE)]及與基質細胞/成骨細胞結合的RANKL，從而阻斷RANKL與破骨細胞系細胞表面的細胞核因子-κB受體活化因子[(RANK)，也稱破骨細胞分化和活化受體]結合。RANKL配體一旦與RANK受體結合就會刺激前體破骨細胞分化，及活化成熟的破骨細胞，引起骨吸收。體外實驗證實，OPG抑制前體破骨細胞分化和成熟破骨細胞形成骨吸收陷窩，并誘導破骨細胞凋亡。此外，OPG還可抵抗促骨吸收因子(PTH、PGE2、1，25(OH)2D3、糖皮質激素和RANKL等)引起的骨吸收。在正常生理條件下，OPG控制骨骼的骨質疏松和骨硬化兩種極端表型。目前為止，所有關于OPG的功能性和病理性研究都集中在對骨的研究上，對于OPG在直接預防和治療除了骨以外其他部位的腫瘤惡性變及腫瘤轉移的應用尚未見到任何相關報道。
本發明的機理在于，應用受體與配體的理論，尋找可以直接抑制具有RANK受體的腫瘤的發生惡變及轉移的多肽藥物。
多肽生長因子與細胞因子是分泌因子，它們通過與不同的表面結合受體進行特異性結合，從而表明細胞生長、分化、代謝等變化的不同情況。作為一類蛋白，受體RANK在其結構和信號傳導模式方面有所不同。它們的特征在于具有與配體RANKL結合有關的細胞外結構域和傳遞適當細胞內信號的胞質結構域。受體表達方式確定那種細胞會應答一種特定的配體，而特定受體的結構確定由配體結合并誘導的細胞應答。
正常細胞表面不表達特異性受體RANK，只有發生非典型性增生時，細胞表面產生少量的受體RANK。如果繼續增殖，形成腫瘤細胞，這時產生大量的受體RANK。這種腫瘤細胞表面的受體RANK一旦與相應的配體RANKL結合后，隨即發生腫瘤惡性變。OPG恰好能與該配體RANKL(此時可稱為OPGL)優先結合，及時阻斷腫瘤細胞的受體與配體的結合，阻止了該腫瘤細胞惡性變的發生。但是人體自身的OPG數量有限，只有當我們給患者注入一定劑量的OPG復合藥物，才可以阻止大量腫瘤細胞惡性變的發生。
惡性變的腫瘤細胞沿著血管和淋巴道，進入在非腫瘤原發部位的器官組織內，當與該組織內大量存在的RANKL配體結合時，繼續惡性變，這時產生腫瘤轉移現象。我們如果預先給患者注入大量的OPG，就會搶先與配體RANKL結合，從而阻斷了腫瘤細胞在該器官內的轉移。
這就是OPG在預防和/或治療腫瘤惡性變和腫瘤轉移的藥物中的應用。本發明提供的含有OPG及其OPG多肽的藥物組合物對于淋巴結、骨、肝，腎、腎上腺、腦等腫瘤易轉移的部位，都可以進行預防和治療。
“OPG”或“OPG多肽”指序列表中的氨基酸序列的多肽及相關多肽。相關多肽包括等位基因變異體，剪接變異體，片段，衍生物，替代、缺失和插入的變異體，融合多肽和非人類同源體。
本發明還提供包括OPG融合蛋白和其變異體、片段和衍生物的藥物組合物。本藥物組合物包括不同的緩沖體系、PH和離子強度的稀釋劑，還有一些常用的添加劑和填充劑，如抗氧化劑。該藥物組合物可以采用本領域人員熟知的緩沖劑，也可以采用固體片劑的形式。總之，制劑中要包含OPG融合蛋白或其變異體、片段或衍生物，以及惰性成分。該藥物組合物可以注射施用，也可以口服，或其他通用形式服用。
本發明優選液態藥物進行皮下或肌肉注射的方式。
施用一定劑量的OPG融合多肽來預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移，有效量從0.1mg/kg到10mg/kg，優選從1mg/kg到10mg/kg，尤其優選3mg/kg到8mg/kg。
本發明藥物對上皮細胞腫瘤惡變和腺癌具有顯著療效。尤其對腺癌的預防和治療具有極好的療效。
應用OPG及其相關多肽的藥物預防和治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移，不僅可以克服以往化學療法的副作用，減輕病人的痛苦，而且提高了病人術后的治愈率。服用一定劑量OPG藥物的病人，其腫瘤生長速度減慢，并且與沒有服用該藥的病人相比，用藥病人癌細胞出現可測量生長量的時間比用藥病人長2.5倍(5個月對2個月)。
本發明以下的實施例包含于但并不限制本發明的內容及范圍。實施例1受體RANK在細胞增生不同階段的數量檢測1、第一組，取成年未孕的雌性正常小鼠(北京大學醫學部提供)的乳腺細胞，檢測細胞表面受體RANK含量，用RANK受體單克隆抗體免疫組化的方法進行DBA顯色，無色(0)，表明不存在RANK受體。
2、第二組，取懷孕2周雌性小鼠的乳腺細胞，用同上1的方法DBA顯色，陽性，淡黃色(+/-)，表明在乳腺細胞上有少量RANK受體。
3、將第二組懷孕小鼠在乳腺部位皮下注射乳腺癌細胞，3周后取小鼠的乳腺細胞用同上1的方法檢測，強陽性，棕黃色(++)，表明此時有多量RANK受體在乳腺細胞上生成。
4、5周后取第二組小鼠的乳腺附近明顯腫大的淋巴結，鏡檢有轉移的腫瘤細胞出現，然后用同上1的方法檢測，強陽性，深棕色(++++)，表明在該發生腫瘤轉移的該部位已經生成大量的RANK受體。實施例2在小鼠模型中OPG對預防乳腺癌的作用取6-8周小鼠20只，將1*106個MDA-MB-435乳腺癌細胞靜脈注射到小鼠的全身循環中，腫瘤接種后立即給小鼠靜脈注射PBS緩沖液，然后給其中的10只小鼠注射含有有效劑量3mg/kg的OPG融合多肽藥物混合物，每周3次，連續4周。通過對比，發現沒有注射OPG藥物的小鼠全部出現乳腺癌的癥狀，腫塊直徑1.5cm，而注射OPG藥物的10只小鼠中只有4只有些微的腫瘤腫塊，直徑0.5cm，其余6只都沒有明顯腫瘤現象。實施例3在小鼠模型中OPG對治療乳腺癌和防止腫瘤轉移的作用對實施例2中的沒有注射OPG的10只小鼠繼續下列的實驗。當注射乳腺癌細胞的4周后，10只小鼠的腫瘤已經有明顯征兆，直徑1.5cm，這時給其中的5只小鼠靜脈注射含有有效劑量6mg/kg的OPG融合多肽藥物混合物，每周4次，連續5周。通過對比，發現沒有注射OPG藥物的小鼠腫瘤明顯繼續擴大，而且在皮下有腫瘤轉移發生，其中4只小鼠已經死去。而注射OPG藥物的5只小鼠中，除了1只死去，其余4只小鼠腫瘤的生長有部分緩解，其中2只小鼠的腫塊的生長完全緩解，并且沒有腫瘤轉移的發生。實施例4在小鼠模型中OPG對治療前列腺癌中的作用按照實施例2的方法，取20只4-6周雄性裸鼠，皮下注射5*106個DU-145前列腺癌細胞誘導異體移植。在注射癌細胞的2周后，給其中10只小鼠靜脈注射含有有效劑量3mg/kg的OPG多肽藥物混合物，每周3次，連續5周。利用RT-PCR技術對血液中微轉移癌細胞的檢測，對兩組小鼠的腫瘤細胞數量進行對比，發現注射OPG藥物的一組小鼠中，腫瘤細胞的數量低于沒有藥物注射的一組。實施例5在小鼠模型中OPG對治療肝癌的作用取20只4-6周小鼠，皮下注射1*106個人的SMMC-7721肝癌細胞(來自于中國科學院細胞庫)，注射兩周后，同樣分為兩組，每組10只，作為對照。一組小鼠注射含有有效劑量3mg/kg的OPG多肽藥物混合物，每周3次，連續4周。利用RT-PCR技術對血液中微轉移癌細胞的檢測，對兩組小鼠的腫瘤細胞數量進行對比，發現注射OPG藥物的一組小鼠中，腫瘤細胞的數量低于沒有藥物注射的一組。實施例6在小鼠模型中OPG對治療淋巴結轉移的作用取成年雌性小鼠20只，將1*106個MDA-MB-435乳腺癌細胞靜脈注射到小鼠的全身循環中，4天后，給其中一組小鼠注射含有有效劑量3mg/kg的OPG多肽藥物混合物，每周3次，連續3周。另外一組不作任何處理。全部處死及自然死亡動物均經詳細解剖學檢查，測量腫瘤體積及侵襲和轉移情況，觀察乳腺附近的淋巴結有無轉移。腫瘤組織及淋巴結經10％中性福爾馬林固定、石蠟切片、HE染色。部分切片同時進行CEA(ABC法)免疫組織化學染色、光學顯微鏡觀察。實驗發現，沒有注射OPG藥物的小鼠，少數腫瘤細胞團的轉移見于邊緣竇，明顯時侵入淋巴結實質，呈片塊狀。嚴重時幾乎破壞全部淋巴結結構，發展成轉移瘤結節。注射OPG藥物的小鼠只有部分呈現輕微的淋巴結轉移現象，癥狀并不明顯。實施例7在小鼠模型中OPG對治療多種腫瘤疾病的作用按照實施例2和實施例3的方法及步驟，給小鼠在相關的部位注射相關的腫瘤細胞，大腸癌，甲狀腺癌，骨癌，肝癌，腦癌、腎上腺癌、腎癌、胃癌、大腸癌、肺癌等細胞，以及轉移到淋巴結、肝、腎、骨、腦等部位的腫瘤細胞，然后采用同樣的方法分組檢測，發現注射OPG藥物的一組小鼠中，腫瘤細胞的數量低于沒有藥物注射的一組，而且可以預防和治療相關的腫瘤細胞轉移。
序列表本發明中OPG的序列表采用AMGEN INC.在PCT/US00/22806申請進入中國時的文本。<210>1<211>232<212>蛋白質<213>人<400>1Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30LyS Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 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權利要求
1.一種預防或治療哺乳動物腫瘤惡性變或腫瘤轉移的方法，它包含施用有效劑量的OPG多肽。
2.權利要求1的方法，其中腫瘤發生部位包括乳腺、前列腺、腎上腺、甲狀腺、胃、大腸、肺等腺體、器官和組織上，以及轉移到淋巴結、肝、腎、骨、腦等部位。
3.權利要求1的方法，其中有效劑量的OPG多肽為0.1mg/kg-10mg/kg。
全文摘要
本發明公開了一種預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移的組合物及其方法，尤其是OPG在這種預防或治療腫瘤惡性變或腫瘤轉移的藥物中的應用。具體的說，本發明公開了施用一種有效劑量的OPG融合蛋白和其變異體、片段和衍生物的藥物組合物，可以預防或治療腫瘤惡性變和腫瘤轉移。
文檔編號A61P35/00GK1471967SQ0212591
公開日2004年2月4日 申請日期2002年8月2日 優先權日2002年8月2日
發明者方健秋 申請人:方健秋