專利名稱：治療結腸癌等消化道腫瘤的抗iv型膠原酶單抗3d6與力達霉素的免疫偶聯物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由單克隆抗體和抗腫瘤藥物組成的免疫偶聯物及其制備方法和在腫瘤靶向治療中的應用。
據報道，基質金屬蛋白酶(MMPs)與惡性腫瘤的生長、轉移和新血管生成之間存在著密切的關系，惡性腫瘤或其間質細胞通過分泌多種基質金屬蛋白酶來降解基底膜和細胞外基質組分，從而有利于腫瘤的侵襲和轉移過程。因此，MMPs成為引人注目的腫瘤治療的分子靶點(Drugs Aging 1997，11229)。IV型膠原酶，又稱為明膠酶，包括MMP-2和MMP-9兩個組分，是MMPs家族中的重要成員，它可以降解基底膜中作為其它組分構建支架的IV型膠原，從而有利于腫瘤細胞破壞和穿透基底膜進行侵襲和轉移(Mol Med Today 2000，6149)。大量研究表明，抑制IV型膠原酶或其它MMPs的分泌及其活性的小分子藥物在體內具有抑制腫瘤生長和轉移的作用(J Natl Cancer Inst 2001，93178)。由于IV型膠原酶在惡性腫瘤組織的表達和活化顯著增加，本實驗室以往以抗IV型膠原酶單抗3D6的Fab’片段攜帶抗腫瘤藥物進行的單抗導向治療取得了良好的效果，并申請了專利(專利公開號CN1268377A)。本實驗室在對人的結腸癌和其它消化道腫瘤組織進行研究的過程中發現，用抗IV型膠原酶單抗3D6進行免疫組織化學染色，人的結腸癌、食管癌及胃癌等消化道腫瘤組織染色結果呈陽性。其中，在對5例人結腸癌組織及其鄰近正常組織進行染色時發現，正常組織與單抗3D6的免疫組織化學染色為陰性，而結腸癌組織則呈現不同程度的陽性染色，表明IV型膠原酶在腫瘤組織中特異性表達。而用單抗3D6及其Fab’片段與抗腫瘤藥物組成的免疫偶聯物治療結腸癌等消化道腫瘤的研究尚未見報道。以本研究所自行研制的抗腫瘤抗生素力達霉素(LDM)(中國抗生素雜志1994，19(2)164)作為彈頭藥物，本發明制備了單抗3D6-LDM偶聯物，并觀察了其對小鼠移植性結腸癌C26的體內抗腫瘤作用。結果顯示，與同等劑量的游離力達霉素相比，3D6-LDM偶聯物的抗腫瘤作用顯著增強。因此，3D6-LDM偶聯物有可能成為治療結腸癌等消化道腫瘤的新型抗腫瘤藥物。
本發明的目的是以合適的方法制備單抗3D6-LDM的偶聯物，并將此偶聯物用于結腸癌等消化道腫瘤的治療。
2.以2-IT和MBS作為交聯分子的單抗3D6-LDM偶聯物的制備利用抗IV型膠原酶單抗3D6作為攜帶抗腫瘤藥物的導向載體(1)經羥基磷灰石柱純化后的單抗3D6置截留分子量為10kDa的透析袋中用pH8.0的0.05M硼酸緩沖液進行透析，調節其濃度為5mg/ml。取溶于pH為8.0的0.05M的硼酸緩沖液中，濃度為4 mg/ml的2-IT溶液10μl加入上述5mg/ml的3D6溶液中，在充氮氣的條件下于室溫反應40min。反應結束后，置截留分子量為30kDa的離心濃縮管中，以0.05M，pH為6.8的磷酸鹽緩沖液(PB)進行緩沖液交換，并離心除去未反應的2-IT。(2)取力達霉素溶解于0.05M pH6.8的PB中配成5mg/ml的濃度，攪拌下加入溶于DMF的濃度為10mg/ml的MBS，室溫反應40min。反應結束后，置截留分子量為10kDa的透析袋中，以0.05M，pH6.8的PB充分透析16h。透析完畢后立即與經2-IT修飾的單抗3D6進行偶聯反應，室溫反應6h或過夜。反應液置截留分子量為30kDa的超濾離心濃縮管中，離心超濾3-4次，去除未反應的MBS修飾的力達霉素，得到3D6-LDM的偶聯物。
3.以SPDP或長鏈的N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)作為交聯分子的3D6-LDM偶聯物的制備(1)取LDM 2mg溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配成4mg/ml的濃度，然后加入摩爾數為10倍過量的SPDP或LC-SPDP(15mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中)，室溫反應30min。反應結束后置濃度為0.1mol/L的醋酸緩沖液(pH4.5)中充分透析。取透析內液加入二巰基蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mmol/L，室溫反應30min，然后置磷酸鹽緩沖液中充分透析。(2)另取單抗3D6 2mg溶于pH為6.8，濃度為0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中，加入摩爾數為10倍過量的SPDP或LC-SPDP，室溫反應30min，于PBS液中充分透析。(3)合并(1)和(2)中的透析內液，室溫反應過夜。然后經Sephadex G-75柱分離，收集第一峰，得到3D6-LDM的偶聯物。
本發明所說的單抗3D6-LDM偶聯物與IV型膠原酶和腫瘤細胞的免疫反應性實驗證明，該偶聯物保留了與IV型膠原酶和上述各種腫瘤細胞的結合能力。本發明所說的單抗3D6在不同人腫瘤組織的免疫組織化學染色實驗結果顯示，結腸癌等消化道腫瘤組織對單抗3D6呈現陽性染色、而在結腸癌周圍的正常組織中染色為陰性，說明IV型膠原酶在結腸癌組織中的表達具有特異性。本發明所說的3D6-LDM偶聯物對腫瘤細胞的殺傷作用實驗顯示，3D6-LDM偶聯物比單獨使用LDM對腫瘤細胞的細胞毒性強，且與偶聯物的濃度成依賴關系。而本發明所說的3D6-LDM偶聯物靜脈注射給藥時，對小鼠結腸癌的治療效果明顯高于單獨使用LDM。
以下所舉3D6-LDM偶聯物的抗腫瘤活性的實施例，對本發明而言只是說明性的，而非限制性的。實施例1單抗3D6和3D6-LDM偶聯物與IV型膠原酶和腫瘤細胞的免疫反應性以ELISA方法進行。單抗3D6與人結腸癌HT-29細胞、小鼠結腸癌C26細胞、人口腔鱗癌KB細胞、小鼠肝癌H22細胞呈現良好的免疫結合活性(圖2)。偶聯后測定單抗3D6-LDM偶聯物與IV型膠原酶以及人結腸癌HT-29細胞、小鼠結腸癌C26細胞、人口腔鱗癌KB細胞、小鼠肝癌H22細胞的免疫結合能力，結果顯示3D6-LDM偶聯物保留了單抗3D6與IV型膠原酶(圖3)以及上述各種腫瘤細胞的結合能力(圖4)。實施例2單抗3D6在不同人腫瘤組織的免疫組織化學染色單抗3D6在對多例人結直腸癌、盲腸癌、食管癌、胃癌等消化道腫瘤組織進行免疫組織化學染色時，呈現較高的陽性反應率(表1)。實驗中的組織切片均設有空白對照(以PBS替代單抗3D6)、陰性對照(以無關的抗力達霉素單抗F9替代單抗3D6)，染色結果均為陰性，證明單抗3D6的免疫組織化學染色為針對組織中IV型膠原酶的特異性染色結果。免疫組織化學染色結果表明，單抗3D6在人體結直腸癌、盲腸癌、食管癌、胃癌等消化道腫瘤組織中均有不同程度的陽性染色。在消化道腫瘤組織樣本中，單抗3D6的染色多位于腺細胞樣腫瘤細胞頂端和基底以及侵襲入基質或血管的腫瘤細胞內，并呈強陽性染色，陽性率達80％(32/40)，顯示IV型膠原酶在腫瘤細胞破壞和穿透基底膜的過程中起作用。
表1 單抗3D6在不同人腫瘤組織中的免疫組織化學染色腫瘤樣本 陰性染色例數 陽性染色例數染色陽性率(％)結腸癌 1 21 95.2盲腸癌 1 3 75.0食管癌 2 3 60.0胃癌 4 5 55.6另外，觀察5例結腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學染色，正常組織中染色為陰性，而結腸癌組織顯示不同程度的陽性染色(表2)，腫瘤細胞內棕色深染顆粒位于腺上皮細胞樣腫瘤細胞的頂端，個別病例見于周圍間質內(圖5，圖6)。結果顯示了IV型膠原酶在結腸癌組織中表達的特異性。
表2 半定量分析單抗3D6在結腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學染色結腸癌病例序號 結腸癌組織染色情況 鄰近正常組織染色情況1 ++++ -2 +++ -3 + -4 ++++ -
5 ++ -實施例33D6-LDM偶聯物對腫瘤細胞的殺傷作用用四氮唑藍(MTT)法測定3D6-LDM偶聯物及游離力達霉素對體外培養的結腸癌C26細胞和肝癌H22細胞的殺傷作用，結果游離力達霉素對兩種細胞的IC50分別為4.8×10-11mol/L和6.2×10-11mol/L，3D6-LDM偶聯物表現出比游離力達霉素更強的體外細胞毒性，對兩種細胞的IC50分別為4.3×10-12mol/L和5.1×10-12mol/L。力達霉素及3D6-LDM偶聯物濃度依賴性地抑制H22細胞的增殖(圖7，表4)。
表3 MTT法測定力達霉素和3D6-LDM在體外對肝癌H22細胞的殺傷作用A560(％對照)藥物濃度(mol/L×10-12)LDM3D6-LDM100027.73 18.63100 53.44 26.2910 74.80 60.041 78.40 64.180.1 80.41 78.670.0182.41 83.02實施例43D6-LDM偶聯物靜脈注射對小鼠結腸癌C26的療效 取體內傳代的小鼠結腸癌C26瘤塊，勻漿后以生理鹽水按1∶3的比例稀釋，然后按0.2ml/只接種于BALB/c小鼠腋窩皮下，接種72小時后靜脈注射給藥，對照組給予生理鹽水，共給藥一次，實驗第10天測量各組動物的腫瘤體積，并以瘤體積計算抑瘤率。結果表明，3D6-LDM偶聯物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.10mg/kg劑量的抑瘤率分別為54.5％，70.3％和81.2％，而0.05mg/kg力達霉素的抑瘤率為56.4％，顯著低于等劑量的偶聯物(表4)。
表4 3D6-LDM靜脈注射給藥對小鼠移植結腸癌C26的生長抑制作用動物數 體重(g) 瘤重(mg)藥物劑量(mg/kg) 抑瘤率(％)開始/結束開始/結束Xaver±SD對照 10/1018.4/18.21.01±0.193D6 0.75 10/1018.0/17.90.75±0.2025.7LDM0.0510/10 18.1/18.3 0.44±0.1656.4*3D6+LDM0.75+0.05 10/10 18.5/18.1 0.62±0.1338.6*3D6-LDM0.025 10/10 18.2/17.9 0.46±0.0954.5*3D6-LDM0.0510/10 18.1/16.4 0.30±0.0670.3**3D6-LDM0.1010/10 18.6/16.3 0.20±0.0681.2**皮下接種腫瘤，第3天靜脈注射給藥一次；*P＜0.01與對照組比較，**P＜0.01與力達霉素組比較發明效果本發明的優點與積極效果是在于確定了抗IV型膠原酶單抗3D6與力達霉素偶聯物的制備方法，觀察到單抗3D6與結腸癌等消化道腫瘤之間的免疫組織化學反應，為單抗3D6-LDM偶聯物用于結腸癌等消化道腫瘤的治療提供了實驗依據。力達霉素是一種迄今為止報道的具有最強細胞毒作用并有明顯體內抗腫瘤作用的抗腫瘤抗生素，目前正作為一類新藥處于研究開發階段。單抗3D6-LDM偶聯物在對小鼠移植性肝癌的治療中顯示出良好的療效，而關于其對結腸癌等消化道腫瘤的治療尚無報道。免疫組織化學染色實驗證明，單抗3D6在結腸癌等消化道腫瘤組織中呈現陽性反應，而在周圍正常組織中染色為陰性。酶聯免疫吸附實驗也表明，3D6-LDM偶聯物與小鼠結腸癌C26以及人結腸癌HT-29細胞之間存在較強的免疫結合活性。用3D6-LDM偶聯物治療小鼠移植性結腸癌C26表現出比游離力達霉素更強的抗腫瘤作用。因此，預期單抗3D6與力達霉素的偶聯物將有可能開發成為新型的抗腫瘤導向藥物用于臨床腫瘤治療，并取得良好的效果。
權利要求
1.抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達霉素(LDM)的免疫偶聯物，其特征是單抗3D6-LDM偶聯物是由單抗3D6蛋白分子上的氨基和LDM輔基蛋白分子上的氨基之間通過小分子的交聯劑作為接頭形成的單抗3D6和LDM分子比為1∶1的免疫偶聯物，偶聯物的分子量為160kDa左右，其中用于連接單抗3D6和LDM的小分子接頭可以是2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)和N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)，也可以是N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等其它小分子異型雙功能交聯劑。
2.一種抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達霉素(LDM)的免疫偶聯物的制備方法，其特征是所說偶聯物的制備是將力達霉素先以異型雙功能交聯劑如N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾，然后加入經2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)巰基化的單抗3D6，反應后經純化得到產物；或者是將力達霉素以其它異型雙功能交聯劑如N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或長鏈的N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)等異型雙功能交聯劑作為中介體與單抗3D6進行偶聯反應，反應后經純化得到產物。
3.抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達霉素(LDM)偶聯物在治療結腸癌等消化道腫瘤中的應用。
全文摘要
本發明涉及的抗IV型膠原酶單抗3D6,以2－亞胺基四氫噻吩(2－IT)和N－羥基琥珀酰亞胺基－間－(N－馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)或其它交聯劑分子作為中介體,與力達霉素(LDM)偶聯,獲得了單抗3D6－LDM的偶聯物,以單抗3D6對人的結腸癌、食管癌和胃癌等消化道腫瘤進行免疫組織化學染色,顯示IV型膠原酶在上述消化道腫瘤中的表達和活化增加,間接ELISA方法測定單抗3D6與鼠結腸癌26(C26)、人結腸癌HT－29、鱗癌KB、肝癌22(H22)的免疫結合活性,結果顯示,HT－29、C26細胞對單抗3D6具有較強的免疫結合能力,體內實驗用于治療小鼠結腸癌,3D6－LDM偶聯物顯示出比同等劑量的游離LDM更強的腫瘤生長抑制作用,因此,3D6－LDM偶聯物可能用于結腸癌及其它消化道腫瘤的治療。
文檔編號A61K39/395GK1389472SQ0212531
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月24日 優先權日2002年7月24日
發明者甄永蘇, 王風強, 李亮, 劉秀均, 尚伯楊 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所