專利名稱：口蹄疫病毒抗原保存技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于獸醫生物制品保存技術領域，具體說是一種口蹄疫病毒抗原保存技術。
(二)技術背景口蹄疫是世界上最重要的動物疫病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類疫病之首，素有“政治經濟病”之稱，世界各國極為重視，是廣泛研究和防制的重點。為了有效控制和預防口蹄疫，國際上一些消滅或正在控制口蹄疫的國家已建立了區域聯防或自己國家的口蹄疫疫苗/抗原庫。我國雖然于二十世紀80年代末研制成功了豬、牛口蹄疫O型滅活疫苗并用于實際防疫，但其質量和數量遠遠不能滿足實際防疫的需要，也尚未建立自己國家的疫苗/抗原庫。
口蹄疫病毒屬小RNA病毒科，不僅極易變異，而且免疫原性弱。而疫苗的免疫效力與其所含的有效抗原-140s顆粒(完整口蹄疫病毒顆粒)直接相關。因此，為避免疫苗中抗原不足引致的免疫失敗，提高疫苗效力，減少接種劑量及建立疫苗/抗原庫，研究建立一種適合于疫苗工業化生產的口蹄疫病毒抗原濃縮、保存、稀釋技術是當前生產急需解決的問題。
口蹄疫病毒抗原保存技術是口蹄疫疫苗工業化大生產和建立疫苗/抗原庫的關鍵技術之一。迄今，國內尚無這方面的專門技術，一般是將病毒抗原在-20℃下凍存，這種保存條件雖然成本低廉、符合我國國情，但由于口蹄疫病毒對不良理化因素耐受性很差，尤其對溫度十分敏感，因此，容易造成有效病毒抗原的降解和丟失。國際上已建立口蹄疫區域聯防或自己國家的疫苗/抗原庫的國家如加拿大、墨西哥、美國、澳大利亞、新西蘭、愛爾蘭、英國、挪威、瑞典、荷蘭、芬蘭、德國、法國、意大利、泰國、糧農組織亞泰區域動物生產與保健委員會等主要是對病毒抗原首先高倍濃縮，然后直接在液氮(-196℃)中予以保存，這種方法對口蹄疫病毒抗原的損傷很小，用其保存1年的抗原制備疫苗，仍有很好的免疫原性，但這套技術對整個生產工藝、系統、設施的要求嚴格，而且造價昂貴，保存量很小，不適宜于我國目前及近期的疫苗工業化生產。
發明內容本發明的目的在于提供一種可操作性強、保存量大、對口蹄疫病毒抗原進行有效保存，能滿足口蹄疫疫苗工業化大生產和建立疫苗/抗原庫要求的口蹄疫病毒抗原保存技術。上述目的是通過以下技術措施實現的通過三因子、三水平、雙重復正交實驗研究確定了一種對口蹄疫病毒有效抗原具有良好保護性能的保護劑，將保護劑加入口蹄疫病毒抗原液中保存。即一種對口蹄疫病毒有效抗原具有良好保護性能的保護劑，是用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混勻后，10～15磅高壓滅菌15min，無菌檢驗陰性后方可使用。
一種使用上述保護劑對口蹄疫病毒抗原進行保存的方法是給待保存的口蹄疫病毒液中加入50％的保護劑后，置-20℃～-70℃下或液氮(-196℃)中保存。
本發明提供的上述口蹄疫病毒抗原保存技術，是在國家攀登計劃和中國農業科學院蘭州獸醫研究所所長基金的資助下，對口蹄疫病毒抗原進行深入研究而確立的。該保存技術方法簡單、便捷，對生產工藝、系統、設施的要求不嚴，保存量大，可操作性強，能滿足口蹄疫疫苗工業化大生產的要求，為口蹄疫疫苗/抗原庫的建立和應用提供不可或缺的重要技術支撐。
(四)具體實現方式
②效果分析將實施例1配制的保護劑，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并設未加保護劑的對照病毒，然后將它們同時在37℃下分別靜置40hr和50hr，測定病毒的感染性滴度(TCID50)，結果，加入保護劑的口蹄疫病毒液，對敏感細胞TCID50的仍可分別達到10-6.0和10-3.0，而未加保護劑的對照病毒則分別降至10-1.67和0。眾所周知，口蹄疫病毒對溫度十分敏感，60℃15分鐘就可使其完全失活，所以我們選擇了37℃下靜置40和50小時這一容易使口蹄疫病毒降解的環境來驗證保護劑對口蹄疫病毒的保護性能。為進一步驗證保護劑對口蹄疫病毒的保護性能，將加入保護劑的病毒和未加保護劑的對照病毒分別在-20℃下保存8個月后，未加保護劑的病毒其140s抗原含量比加保護劑的下降了13.67％，對敏感細胞的半數感染量下降了10倍；動物試驗表明，用加入保護劑后-20℃下保存300天的病毒抗原配制的疫苗免疫豚鼠的中和抗體效價(log10SN50)2.4，比未加保護劑的高0.6個滴度，實驗表明，加入保護劑后-20℃下保存8個月的病毒抗原仍然具有良好的免疫原性；-20℃下保存3年的已滅活超濾濃縮病毒其140s抗原含量比液氮中保存的下降了6.45％。以上表明，加入保護劑后口蹄疫病毒的保存效果明顯優于未加保護劑的，液氮保存效果略優于-20℃保存的，若將二者結合起來，即加入保護劑后在液氮中保存，保存效果更佳。
②效果分析將實施例2配制的保護劑，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并設未加保護劑的對照病毒，然后將它們同時在37℃下分別靜置40hr和50hr，測定病毒的感染性滴度(TCID50)，結果，加入保護劑的口蹄疫病毒液，對敏感細胞TCID50的仍可分別達到10-4.5和10-2.3，而未加保護劑的對照病毒則分別降至10-1.67和0。
②效果分析將實施例3配制的保護劑，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并設未加保護劑的對照病毒，然后將它們同時在37℃下分別靜置40hr和50hr，測定病毒的感染性滴度(TCID50)，結果，加入保護劑的口蹄疫病毒液，對敏感細胞TCID50的仍可分別達到10-5.0和10-1.5，而未加保護劑的對照病毒則分別降至10-1.67和0。
權利要求
1.一種對口蹄疫病毒有效抗原具有良好保護性能的保護劑配制方法，其特征在于用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混勻后，10～15磅高壓滅菌15min，無菌檢驗陰性后方可使用。
2.根據權利要求1所述的保護劑配制方法，其特征在于用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入4％的甘油、4％的蛋白胨和10％的蔗糖，充分混勻后，12磅高壓滅菌15min，無菌檢驗陰性后方可使用。
3.一種使用權利要求1配制的保護劑對口蹄疫病毒抗原進行保存的方法，其特征在于給待保存的口蹄疫病毒液中加入50％的保護劑后，置-20℃～-70℃下或液氮(-196℃)中保存。
全文摘要
一種口蹄疫病毒抗原保存技術，即將口蹄疫病毒液中加入一種對口蹄疫病毒有效抗原具有良好保護性能的保護劑中進行保存。該保護劑的配制方法及口蹄疫病毒抗原保存方法是用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混勻后，10～15磅高壓滅菌15min，無菌檢驗陰性后，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，置－20℃～－70℃下或液氮(－196℃)中保存。該保存技術是在國家攀登計劃和中國農業科學院蘭州獸醫研究所所長基金的資助下，對口蹄疫病毒抗原進行深入研究而確立的。其方法簡單、便捷，對生產工藝、系統、設施的要求不嚴，保存量大，可操作性強，能滿足口蹄疫疫苗工業化大生產的要求，為口蹄疫疫苗/抗原庫的建立和應用提供了不可或缺的重要技術支撐。
文檔編號A61K39/125GK1413733SQ02124649
公開日2003年4月30日 申請日期2002年6月19日 優先權日2002年6月19日
發明者王永錄, 張永光, 方玉珍, 蔣守田 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所