一種無細胞短棒狀桿菌制劑的制作方法

專利名稱：一種無細胞短棒狀桿菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫調(diào)節(jié)劑，特別是一種無細胞短棒狀桿菌制劑(NCP)，所述NCP是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎制備的無細胞制劑，屬于生物制品領(lǐng)域。
CPP具有激活單核吞噬細胞系統(tǒng)的能力。CPP對免疫系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在激活單核巨噬細胞、使NK細胞活性增強、促進機體對多種抗原產(chǎn)生IgG和IgM、誘生干擾素、白細胞介素-2等，因此具有抗腫瘤和抗感染作用。
CPP的抗腫瘤作用已為許多實驗和臨床研究所證實。對實驗動物接種腫瘤前后應(yīng)用CPP，能顯著抑制某些實體瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型腫瘤及白血病的生長。腫瘤消退的動物對于再次攻擊的腫瘤細胞有特異性的抵抗力。CPP對腫瘤轉(zhuǎn)移亦有抑制作用。
CPP抗腫瘤及抗感染的核心是通過激活巨噬細胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高，激活的巨噬細胞可將腫瘤細胞及感染的微生物殺死。
CPP作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤及其它疾病的治療已有數(shù)十年的歷史，其通過激活單核巨噬細胞系統(tǒng)抗腫瘤、抗感染的效果已被公認(rèn)。CPP作為一種非特異性免疫增強劑，其有效性是至今為止發(fā)現(xiàn)的最好的制品之一。但由于存在一定的副作用，如發(fā)燒、胸痛、注射局部易產(chǎn)生腫痛、硬結(jié)等副作用，限制了其應(yīng)用。
由于CPP是一種優(yōu)良的非特異性免疫增強劑，如果通過新的技術(shù)手段降低其副作用，將會有著廣泛的應(yīng)用前景。
CPP為革蘭氏陽性菌，本身無內(nèi)毒素亦稱脂多糖(LPS)，但目前CPP經(jīng)鱟試劑法測定含有較多LPS，這主要是由于現(xiàn)有CPP制造及檢定規(guī)程對其沒有限量要求所致。
CPP是CP經(jīng)甲醛滅活制成的死菌苗，殘留有微量甲醛。由于甲醛對機體具有較強的刺激性，況且甲醛也是國際上公認(rèn)的致癌物質(zhì)，雖然CPP中甲醛殘留量很少，但仍會對人體較為敏感的胸膜產(chǎn)生刺激性。
研究表明，藥物加工到納米級之后，可顯著提高吸收度、擴散度，有利于降低藥物的某些副作用，提高藥效。
通常微生物細胞的破碎技術(shù)為機械法、非機械法兩種。機械法包括高壓勻漿器、高速珠磨機、超聲波震蕩器，非機械法包括化學(xué)法、酶解法、滲透壓沖擊法、凍融法和干燥法。雖然細胞破碎的方法很多，但都難以將細胞破碎到粒度均一的納米級。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種NCP，是由CP經(jīng)破碎制備的無細胞制劑，粒度小于100nm。
其中所述的CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)菌號為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
本發(fā)明所述的NCP的熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選本發(fā)明NCP的熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
本發(fā)明NCP的粒度優(yōu)選為10-50nm。
本發(fā)明所述的NCP是通過下述步驟制備的1).CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2).收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3).無菌試驗合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4).菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5).將懸液加熱滅菌，得到NCP。
其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，且為低熱原培養(yǎng)基。
步驟1)中培養(yǎng)條件為36-37℃培養(yǎng)。
優(yōu)選所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
其中步驟3)中所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為50-500億/ml。
所述破碎裝置是將菌體破碎到小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm的超高壓射流對撞機。
其中所述菌體破碎是在無菌條件下進行。
其中步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次。
步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4℃-室溫，6000-12000rpm離心30-150分鐘。
步驟5)中所述的加熱為在60-65℃加熱0.5-2小時。
本發(fā)明的制備方法中，進一步包括將步驟5)得到的NCP分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為經(jīng)過0.22μm或μm0.45μm膜過濾的低熱原培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的制備方法中，還包括將步驟5)得到的NCP冷凍干燥，得到NCP的凍干制劑。
上述方法制備的NCP熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選上述方法制備的NCP熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
上述方法制備的NCP粒度小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm。
本發(fā)明中所述的無菌檢驗合格是指按照《中國生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢驗不得有任何細菌生長。
本發(fā)明中由于采用低熱原培養(yǎng)基，特別是硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)控，以及整個生產(chǎn)過程中無菌低熱原操作，保證了最終產(chǎn)品低熱原和無雜菌的污染。
本發(fā)明通過超高壓射流對撞機將CP破碎至納米級，通過選擇不同的離心力(轉(zhuǎn)速)，確定了離心提取條件，獲得的沉淀部分為NCP，經(jīng)多次動物試驗證明，該制劑與全菌體具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，上清部分則無脾激活及抑瘤作用，表明本發(fā)明的NCP具有良好的生物學(xué)活性。
為了消除CPP中殘留甲醛對機體的刺激性，尤其是對敏感胸膜的刺激性，本發(fā)明中采用加熱滅活替代了甲醛滅活。動物實驗表明，加熱滅活的NCP、CPP較甲醛滅活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性。
超高壓射流對撞機的工作原理是將混有被加工物的液體用高壓泵(工作壓力為10-3000kgf/cm2)加壓后分成兩股，以高速射流進入兩片直徑為8MM人造金剛石晶片組成的通道中，相向?qū)ψ埠罅鞒觥Ｓ捎谝后w的速度很高，流體相向?qū)ψ矔r產(chǎn)生很強的沖擊波，使金剛石晶片產(chǎn)生高頻、高強超聲波。大功率高頻超聲波使被加工物顆粒瞬間粉碎、超微化。
本發(fā)明的制備過程中，為更好地破碎菌體，采用超高壓射流對撞機，在菌體濃度為50-500億/ml，工作壓力為800-1500kgf/cm2的條件下破碎，破碎后的菌體懸液在4℃-室溫下，6000-12000rpm離心30-150分鐘，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水溶液洗滌0-5次后制成懸液，在60-65℃加溫0.5-2小時，無菌試驗合格后合并，經(jīng)配制、分裝，分裝后安瓿在60±2℃加熱15-60分鐘，得到高質(zhì)量、粒度和均一性良好的目的產(chǎn)品。
本發(fā)明的NCP是將CP的細胞破碎至納米級，經(jīng)離心去除無效的上清部分，收集沉淀部分制備的，產(chǎn)品具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫制劑。
根據(jù)需要，本發(fā)明的NCP可以制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成凍干粉針或適合藥用的其他劑型。
本發(fā)明的NCP為免疫調(diào)節(jié)劑，可以用于癌性胸水、結(jié)合手術(shù)治療早、中期肺癌，乳腺癌、鼻咽癌、晚期肺癌、黑色素瘤以及癌癥體表轉(zhuǎn)移灶的治療，亦可用于牛皮癬、再生障礙性貧血、女陰白斑、感染性哮喘、結(jié)核病的治療或輔助治療。
下面結(jié)合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明，所述的實施例用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。


附圖1是現(xiàn)有技術(shù)的CPP的電鏡照片。
附圖2是本發(fā)明的NCP的電鏡照片。
實施例1參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進行細菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
本實施例中采用的培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司出品的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，成分為胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸鈉0.5g/l。使用前將培養(yǎng)基用0.22μm膜過濾。
啟開CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771(見《中國生物制品規(guī)程》)菌種管，每管含菌60億，用毛細管吸取約0.2-0.3ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，加在菌種管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培養(yǎng)基8-10ml混合，置37℃培養(yǎng)2天。取菌液用上述培養(yǎng)基(菌液∶培養(yǎng)基體積比＝1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)的菌液用上述培養(yǎng)基(按1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)3天，收獲菌液。逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之。合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸15分鐘，用超高壓射流對撞擊(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號NMG-75-200)在1000kgf/cm2壓力下破碎菌體3次；破碎后的懸液在室溫、6000rpm離心90分鐘，收集沉淀，用無菌生理鹽水洗滌沉淀3次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為0.5mg/ml的懸液，60℃加熱1小時，得到NCP。
其中CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌65103(77-1)或771。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)，本發(fā)明的NCP熱原20EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為10％(g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖未測出。電鏡測定粒度為60-100nm。
分裝后，安瓿在60±2℃加熱20分鐘。
實施例2參照實施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)(使用前將培養(yǎng)基用0.45μm膜過濾)中，36-37℃培養(yǎng)6天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸60分鐘，用超高壓射流對撞機在1500kgf/cm2壓力下破碎菌體5次；破碎后的懸液8000rpm離心1小時，用無菌生理鹽水洗滌沉淀5次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為2.0mg/ml的懸液，65℃加熱60分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)，NCP熱原160EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為20％(g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖可能未測出。電鏡檢測粒度為10-50nm。參見圖2，粒度均勻。圖1為現(xiàn)有技術(shù)的CPP的電鏡照片。
分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
實施例3參照實施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36-37℃培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對撞機(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號AQUA300)800kgf/cm2壓力下破碎菌體10次；破碎后的懸液12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中華人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為1.0mg/ml的懸液，65℃加熱100分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)NCP熱原60EU/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為16％(g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖未測出。電鏡檢測平均粒度為40-80nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
實施例4其他同實施例1，不同之處在于破碎后的懸液在8000rpm離心1小時后，用凍干機凍干，得到粉針劑。
比較例1采用2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771連續(xù)3次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)中36-37℃培養(yǎng)5天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體分別加熱煮沸30、60分鐘進行無菌試驗，無菌試驗合格的菌液經(jīng)離心后，用新鮮無菌生理鹽水溶液洗滌沉淀3次并制成懸液，60-65℃加熱1小時，無菌檢測合格后分裝，安瓿在60±2℃加熱30分鐘，經(jīng)檢測兩種樣品每瓶含菌為6.0×109。
比較例2其他同比較例1，不同之處在于采集之無雜菌污染的菌體加入甲醛溶液至最終濃度約為0.5％(ml/ml)殺菌48小時，經(jīng)檢測每瓶含菌為6.0×109，游離甲醛含量為0.06g/L。
實驗例1由比較例2看出，CPP中殘留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白質(zhì)，殺死細菌，但對機體具有較強的刺激性。CPP中甲醛殘留量雖然很少(應(yīng)不高于0.06g/l)，但仍會對人體，尤其是對敏感的胸膜產(chǎn)生刺激性。
本發(fā)明中按照2000版《中國生物制品規(guī)程》中第240-241頁中CPP制造及檢定規(guī)程中規(guī)定的方法對比較例1、2制備的CPP的脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進行了試驗，結(jié)果見表1。
同時，本發(fā)明中按照下述方法對本發(fā)明實施例1-4的NCP脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進行了試驗，結(jié)果見表1。
脾激活試驗用體重18-20g純種小鼠(C3H、615或C57BL)，試驗組及對照組各10只，雌雄各半。試驗組每只小鼠腹腔分別注射CPP 0.5ml(含菌1.5×109)及實施例1-3的NCP制劑0.5ml(1-3的NCP固體含量都調(diào)整到1mg/ml)，對照組注射同量生理氯化鈉溶液。14天處死小鼠，分別稱體重、脾重、計算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。

抑瘤實驗(艾氏腹水瘤)用體重18-20g純種小鼠(C3H、615、C57BL、K-LACA或昆明鼠)，試驗組及對照組各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤細胞(5.0×106/ml)0.2ml(用傳代5-8天非血性腹水)。試驗組于注射瘤細胞前1天及注射后次日起，連續(xù)腹腔分別注射CPP 0.25ml(含菌1.5×109)及實施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固體含量調(diào)整到2mg/ml)5次，每次間隔1天。對照組注射同量生理氯化鈉溶液。對照組小鼠全部因癌性腹水死亡為起點計算試驗組小鼠存活率，觀察期30天，其存活率應(yīng)不低于70％。
表1

脾激活及抑瘤實驗可說明CPP或NCP的生物學(xué)活性及藥效。表1的結(jié)果表明，加熱煮沸30分鐘、加熱煮沸60分鐘、0.5％甲醛溶液滅活制備的CPP以及本發(fā)明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤實驗效果相同，無明顯差異，說明加熱煮沸滅活以及破碎提取對CPP及NCP的生物學(xué)活性及藥效無明顯影響。
實驗例2本實驗例涉及NCP的吸收性能及與CPP吸收性能的比較。
內(nèi)容家兔CPP及NCP皮內(nèi)吸收實驗。
家兔1500-2000克，雌雄各半。
分組分為CPP組及NCP組，每組各4只。
給藥每只兔背部皮內(nèi)注射，對照組CPP組0.2ml/只(150億/ml，相當(dāng)于2.5mg/ml)，NCP組0.2ml/只(2.5mg/ml)，觀察并測試注射局部，結(jié)果見表2。
表2

結(jié)論觀察72小時，NCP易于被吸收，未產(chǎn)生明顯紅腫、硬結(jié)，CPP不易被吸收，產(chǎn)生了明顯的紅腫、硬結(jié)反應(yīng)。此結(jié)果說明將比較例2的CPP的細胞破碎至納米級制備的NCP更有利于機體的吸收，并能減少副作用。
實驗例3本實驗例涉及NCP的動物急性毒性試驗。
藥物采用實施例1的方法制備，但NCP含量31.7mg/ml，由中國藥品生物制品檢定所提供。
動物昆明種小鼠，雌雄各半，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供。
最大給藥量測定，取上述健康小鼠40只，隨機分為兩組，雌雄各半，給藥組小鼠一次肌注最大濃度(31.7mg/ml)，最大體積(0.1m/每側(cè)×2)的NCP，對照組一次肌注等體積生理鹽水，記錄以上兩組給藥前后第三天及第七天的體重與臨床表現(xiàn)，結(jié)果見表3。
表3

上述結(jié)果表明，小鼠一次肌注最大劑量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出現(xiàn)死亡，未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的臨床表現(xiàn)，也未發(fā)現(xiàn)給藥對體重的影響，給藥劑量相當(dāng)臨床用藥量的452.9倍，說明人臨床擬用劑量是一個安全劑量。
實驗例4本實施例涉及NCP對結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠實驗?zāi)Ｐ偷乃幮W(xué)評價。以結(jié)核分枝桿菌感染的豚鼠為實驗動物模型，觀察了本發(fā)明NCP和對照藥免疫增強劑烏體林斯，化療藥利福平加異煙肼的治療效果。
一、藥物受試藥——參照實施例2的方法制備的NCP，固體含量15mg/ml。
對照藥——烏體林斯注射液(草分枝桿菌EU36)17.2μg/ml，成都金星健康藥業(yè)公司分裝(德國Sanum-Kehlbe公司原裝)，批號000321。
化療藥——異煙肼(INH)純粉，北京永康制藥廠提供，批號000313。
利福平(RFP)膠囊——四川制藥有限公司提供，批號000308。
二、動物普通級純白色健康豚鼠，體重350-400克，每組15只，雌7只雄8只，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號京許字071號。
三、菌株結(jié)核分枝桿菌H37RV，編號35810，中國藥品生物制品檢定所菌苗一室提供。
四、實驗方法1.攻擊菌的制備挑取接種于羅氏雞蛋培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)三周的結(jié)核分枝桿菌菌苔研磨后，以8uM硝酸纖維素膜過濾制備成單細胞菌懸液，分裝于小試管，-20℃冷藏，冷藏兩周后活菌計數(shù)待用。
2.模型對照及感染模型的制備(攻擊)取冷藏后的結(jié)核分枝桿菌菌懸液，融解后按已知活菌數(shù)稀釋至25000CFU/ml，于PPD皮試陰性豚鼠腹股溝部皮下注射0.2ml菌液。
3.試驗分組及給藥方法將感染豚鼠隨機分成下述6組(1)模型對照組 (生理鹽水)1ml/次/只(2)化療組 INH20mg+RFP3.3mg/kg/次(3)烏體林斯組 17.2μg/次/只(4)N.C.P組 3mg/次/只(5)N.C.P組 1mg/次/只(6)N.C.P組 0.33mg/次/只五、給藥方法(一)、NCP各劑量組及烏體林斯組于攻擊后3、10、17天時肌肉注射給藥，共3次。
(二)、化療組于攻擊后次日開始每周口服給藥5次至第九周解剖前終止，共8周40次。
(三)、遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)于攻擊后2、4、8周進行，豚鼠背部皮內(nèi)注射PPD10IU/0.2ml，注射后24小時測定皮膚硬結(jié)大小。
六、觀察指標(biāo)及結(jié)果(一)脾菌分離數(shù)(CFU)測定(此項測定作為評價結(jié)核分枝桿菌感染及治療效果的重要指標(biāo))實驗第5、7、9周時分三批解剖動物，取1/2脾臟置研磨器內(nèi)研磨，加入2ml生理鹽水混勻制成組織勻漿，接種前加入等量4％的硫酸以殺死雜菌，經(jīng)10倍稀釋制成10-3-10-8濃度的組織懸液，每管羅氏培養(yǎng)基內(nèi)接種0.1ml，每種濃度接種兩管。37℃培養(yǎng)4-9周，于5、7、9周進行活菌計數(shù)，活菌數(shù)以(CFU)表示，以10為底取對數(shù)后用T檢驗方法進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果見表5。
表5.豚鼠脾活菌數(shù)(CFU)分離結(jié)果豚鼠脾活菌數(shù)(CFU)對數(shù)值實驗分組給藥劑量 5周7周 9周N XSD N X SD N X SD模型對照組生理鹽水 36.53 0.13 3 7.52 0.08 7 8.27 0.25化療組INH20mg/kg/次3培養(yǎng)6周未見菌 3 培養(yǎng)6周未見菌 6 0.48 1.18+RFP3.3mg/kg/次 生長 生長烏體林斯組1.72μg/次 33.10 0.18 3 3.26 0.09 8 1.03 0.89NCP組3mg/次33.23 0.14 3 3.07 0.10 9 3.08 0.19NCP組1mg/次33.80 0.05 3 1.27 1.10 9 2.99 0.19NCP組0.33mg/次 33.70 0.20 3 3.44 0.28 8 2.96 0.25(二)結(jié)果1、化療組、烏體林斯組及NCP各劑量組與模型對照組比較在實驗5、7.9周時，CFUT檢驗均P＜0.05，有顯著性差異。
2、NCP各劑量組5、7、9周時比較，CFU T檢驗均P＞0.05，無顯著性差異。
3、NCP各劑量組療效與烏體林斯組相近，但低于化療組。
(三)遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)測量NCP各劑量組2、4、8周時PPD皮試后24小時的皮膚硬結(jié)大小，與化療組及烏體林斯組比較，觀察其對遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)的影響。結(jié)果見表2。
表6.豚鼠遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果(mm)實驗分組給藥劑量 2周 4周 8周N X SD N XSD N X SD模型對照組生理鹽水 15 5.130.23 14 9.58 0.97 7 14.490.96化療INH20mg15 4.711.32 13 7.02 1.25 6 10.700.96+RFP3.3mg/kg/次烏體林斯組17.2μg/次 15 4.961.19 15 10.92 1.39 8 10.931.43NCP組3mg/次15 5.521.31 15 8.01 2.12 9 12.684.25NCP組1mg/次15 5.211.02 15 7.96 2.60 9 11.872.08NCP組0.33mg/次 15 5.781.07 14 8.26 2.17 8 12.172.04皮試結(jié)果(測量值)＝橫徑+豎徑/2(四)結(jié)果1.2周時各實驗組未見明顯遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)。
2.化療組及NCP各劑量組4周和8周時遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)強度均低于模型對照組；P＜0.05有顯著性差異。
3.4周時NCP各劑量組遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)強度均低于烏體林斯組，P＜0.05有顯著性差異，至8周時兩者反應(yīng)強度相近，P＞0.05。
(五)病理切片動物解剖后脾作組織切片鏡下觀察，結(jié)果見表7。
(六)結(jié)果1.模型對照組在整個實驗期間，脾臟的鏡下組織學(xué)病理改變程度隨時間而加重，9周時最為嚴(yán)重。
2.實驗7周時，NCP各劑量組均未出現(xiàn)結(jié)核特異性病理改變，而烏體林斯組則66％出現(xiàn)+++結(jié)核特異性病理改變。
3.實驗9周時，NCP各劑量組及烏體林斯組鏡下均出現(xiàn)+--+++的病理改變，但除個別組外，均輕于模型對照組，化療組隨療程的延長病理改變有所好轉(zhuǎn)。
通過上述藥效實驗可以看出1.免疫調(diào)節(jié)劑NCP各劑量組對結(jié)核分枝桿菌感染的豚鼠模型經(jīng)過9周治療后，豚鼠脾菌分離數(shù)明顯低于模型對照組，但高于化療組，與對照藥烏體林斯組相近。表明NCP對結(jié)核分枝桿菌感染的豚鼠模型具有良好的治療作用。
2.實驗7周時，NCP各劑量組豚鼠脾臟鏡下病理改變比對照藥烏體林斯組為優(yōu)，均未出現(xiàn)結(jié)核特異性病理改變，而烏體林斯組66％出現(xiàn)結(jié)核特異性病理改變。但實驗9周時，二者相近。
3.實驗4周時，NCP各劑量組遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)強度均低于對照藥烏體林斯組，至8周時二者的反應(yīng)強度相近。
表7.豚鼠脾臟病理切片鏡下組織學(xué)分析脾臟病變鏡下分級百分比(％)實驗分組 5周 7周9周(給藥劑量) 分級N (％) N(％) N (％)模型對照組 + 33/3100 32/3 66.6 72/728.5(生理鹽水) ++28.5+++1/3 33.4 43.0化療組 + 33/3100 31/3 33.3 66/6100(INH20mg ++ 1/3 33.3+RFP3.3mg/kg/次) +++ 1/333.3烏體林斯組 + 33/3100 31/3 33.3 84/850.0(17.2μg/次) ++ 2/825.0+++2/3 66.72/825.0NCP組 + 33/3100 33/3 10094/944.4(3mg/次) ++ 2/922.2+++3/933.4NCP組 + 33/3100 33/3 10091/911.1(1mg/次) ++ 5/955.5+++3/933.3NCP組 + 33/3100 33/3 10084/850.0(0.33mg/次)++ 3/837.5+++1/812.5注釋病理分級標(biāo)準(zhǔn)+--有滲出性改變，++--有結(jié)核結(jié)節(jié)形成，+++--有廣泛干酪樣病理改變。其中++--+++為結(jié)核特異性病理改變。
權(quán)利要求
1.一種無細胞短棒狀桿菌制劑，簡稱NCP，是由短棒狀桿菌，簡稱CP制備的無細胞制劑，粒度小于100nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NCP，其中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為76-27、H-84或77-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NCP，熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％，核酸含量3-25％，其余為多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項所述的NCP， 粒度為10-50nm。
5.一種NCP，其特征在于所述的NCP是通過下述方法制備的1).CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2).收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3).無菌試驗合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4).菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5).將懸液加熱滅菌，得到NCP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的NCP，其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為76-27、H-84或77-1，培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液中的一種，且為低熱原培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的NCP，其中步驟1)中的培養(yǎng)條件為36-37℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的NCP，其中所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的NCP，其中步驟3)中所述的菌體是滅活菌，所述破碎裝置是將菌體破碎到小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm的超高壓射流對撞機，破碎在無菌條件下進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的NCP，其中步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次；步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4℃-室溫下，6000-12000rpm離心30-150分鐘；步驟5)中所述的加熱為在60-65℃加熱0.5-2小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的NCP，進一步包括將步驟5)得到的NCP分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無細胞短棒狀桿菌制劑(NCP)，是由短棒狀桿菌(CP)制備的無細胞制劑，熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10－40％(g/g)，核酸含量3－25％(g/g)，其余為多糖，粒度小于100nm。本發(fā)明的NCP是將CP破碎至納米級，經(jīng)離心去除無效的上清部分，收集沉淀部分制備的，熱原低、無雜菌污染、無殘留甲醛，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫調(diào)節(jié)劑。
文檔編號A61K35/66GK1465355SQ0212357
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者高尚先, 李守悌 申請人:中國藥品生物制品檢定所