用于治療過敏癥的含過敏原的乳的制作方法

專利名稱：用于治療過敏癥的含過敏原的乳的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療過敏癥的含過敏原的乳，具體地，本發明涉及將包括異源非乳過敏原的乳組合物給予個體以抑制該個體中過敏原特異性IgE的產生。
螨過敏與哮喘、過敏性鼻炎和特應性皮炎等疾病的關系是公知的。臺灣、澳大利亞和西歐的主要螨種類是Dermatophagoidespteronyssinus，而Dermatophagoides farinae則是美國、日本和歐洲大陸等許多區域的主要螨種類。
對螨過敏的患者血清中的IgE與許多成分反應。如通過Western印跡所確定，這一相互作用可導致從1或2個至超過14個不同螨種類的特異性結合。Der p1，Der p2和Der p5過敏原通常以高滴度與約80％的過敏血清反應，并經cDNA克隆以及與單克隆抗體的結合及其它免疫化學程序鑒定。
目前主要的療法即過敏原免疫治療針對過敏癥的病因而修飾或負調節免疫應答。如果使用正確，過敏原免疫治療既有效又相對安全，并且是過敏癥管理的必需部分。
過敏原免疫治療典型通過過敏原注射劑而施予，其它施用途徑如口服、舌下、鼻內和支氣管途徑也已經嘗試。給予實驗動物的口服和舌下免疫治療表明攝取過敏原可誘導耐受。另外，舌下免疫治療已顯示降低可減輕過敏癥狀和/或藥物需求。其功效與在兒童中進行的皮下注射免疫治療類似。
在免疫治療中，具有真三級結構的重組過敏原顯示與天然存在的過敏原類似的功效和安全性分布圖。
因此，本發明涉及一種轉基因哺乳動物，其遺傳組成包括一核酸序列，該核酸序列包括(1)編碼過敏原的編碼序列，和(2)可操縱地與該編碼序列連接的異源啟動子。該啟動子指導編碼序列在乳腺細胞中表達。過敏原可以是來自通常的塵螨的過敏原，如來自Dermatophagoides pteronyssinus，D.fdrinae，D.microceras，Tyophagusputesentiae，Lepidoglyphus domesticus，L.destructor，Acarus siro，Euroglyphus maynei，和Biomia tropicalis的過敏原；或其它空氣傳播的過敏原(氣源性過敏原)如花粉，霉菌，動物皮屑，和昆蟲。過敏原可以是具有與SEQ ID NO1，2或3有至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或99％相同性的氨基酸序列的多肽。過敏原可以是Der p1，Der p2和Der p5蛋白可用于表達過敏原的啟動子包括α-乳清蛋白，β-乳清蛋白，乳清酸性蛋白，α-、β-、γ-、或κ-酪蛋白的基因的啟動子。啟動子也可被間接控制以指導編碼序列在乳腺細胞中表達。例如，啟動子可以是誘導型啟動子，例如四環素激活啟動子。例如，當也存在四環素時，可在乳腺細胞中選擇性地表達四環素調控的轉錄因子以表達編碼序列。核酸序列可整合入染色體。
轉基因哺乳動物的遺傳組成可包括至少第二種核酸序列，例如編碼第二種過敏原以在乳腺細胞中表達。
在某些情況下，轉基因哺乳動物每升乳可產生至少100mg、500mg、1g、10g或20g過敏原。
轉基因哺乳動物可以是雄性或雌性的。在雄性轉基因哺乳動物的情況下，核酸能夠指導過敏原在該雄性轉基因哺乳動物的雌性后代的乳腺細胞中表達。在雌性轉基因哺乳動物的情況下，核酸能指導過敏原在雌性轉基因哺乳動物的乳腺細胞中表達，或在該雌性轉基因哺乳動物的雌性后代的乳腺細胞中表達。
本發明還涉及哺乳動物生殖細胞，例如卵細胞或精細胞，其遺傳組成包括本文所述核酸序列。
本發明還涉及含有非乳異源過敏原和酪蛋白即內源性酪蛋白的乳。所述乳還可含有足夠減輕個體的呼吸道炎癥和高反應性的過敏原。所述乳還可含有至少第二種過敏原。所述酪蛋白可以是例如天然存在的牛或羊酪蛋白，即來自奶牛或山羊的乳。所述乳可得自本文所述的轉基因哺乳動物，或者當將過敏原多肽作為分離的多肽組合物加入到乳中時，所述乳可以得自非轉基因哺乳動物。
本發明還包括一種在接觸過敏原的個體中降低IgE產生的方法，其包括給予該個體含有足夠量的非乳異源過敏原的乳，從而口服攝取所述乳的個體將變得對所述過敏原耐受。因此，當個體在隨后接觸過敏原時會抑制過敏原特異性IgE的產生。在某些實施方案中，個體缺乏完全發育的免疫系統，例如個體是新生兒或嬰兒。本發明還涉及減輕個體支氣管肺部充血的類似方法。
在另一方面，本發明涉及提供來自轉基因哺乳動物的乳的包括非乳過敏原的制劑的方法，包括從轉基因哺乳動物中獲得乳以獲得所述制劑，該轉基因哺乳動物在其種系中引入了一種非乳過敏原蛋白編碼序列，該編碼序列與一種啟動子序列可操縱地連接，從而導致該蛋白編碼序列在乳腺上皮細胞中表達，由此將該非乳過敏原分泌進該哺乳動物的乳中。所述方法進一步包括從乳中分離過敏原或者對乳進行加工，例如巴氏滅菌、濃縮或干燥。
“過敏原”是指一種導致I型中間高反應性反應的物質。
“氣源性過敏原”定義為至少具有以下特性引起活性反應素應答的特異性抗原定群，與其環境接觸水平即可導致敏感個體體內明顯組織變化。氣源性過敏原是經空氣傳播的顆粒，可導致呼吸道，皮膚或結膜過敏癥。例如豚草花粉的水溶部分可影響呼吸道和結膜粘膜，豚草花粉的脂溶部分可對接觸的皮膚產生典型的接觸性皮炎。
“分離的核酸”是具有非天然存在序列的核酸，或具有部分或全部天然存在基因的序列，但是不含天然存在該感興趣基因的生物體的基因組中側翼于該感興趣的天然存在基因的基因的核酸。因此該術語包括摻入載體、自主復制質粒或病毒、或原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA。
本文所用“同源性”或“相同性百分比”是指兩個多肽分子之間的序列相似性，或兩個核酸分子之間的序列相似性。當第二個序列的相應位置被與第一個序列的該位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據時，則這兩個分子在該位置是同源的(即本文所用氨基酸或核酸“同源性”相當于氨基酸或核酸“相同性”)。兩個序列之間的同源性百分比是這些序列共享的相同位置數的函數(即，％同源性＝相同位置數/總位置數×100)。通常是在兩個序列進行排列以給出最大同源性或序列相同性的情況下進行比較。
序列比較和確定兩個序列之間的同源性百分比可用數學算法進行。用于比較序列的數學算法的一優選非限制性例子是Karlin andAltschul的算法(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68，其修改見Karlin and Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-77。這種算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12進行，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3進行，以獲得與本發明的蛋白質分子同源的氨基酸序列。為獲得缺口序列對比用于比較目的，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述用缺口(Gapped)BLAST進行。當使用BLAST和缺口BLAST程序時，可使用相應程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
“在嚴格條件下雜交”是指與固定化參考核酸在含有0.2×SSC(1.75g/lNaCl，0.88g/l二水合檸檬酸三鈉，pH7.0)和0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉的雜交溶液中于68℃經堿基配對而進行的特異性非共價平衡結合。如果需要洗滌以實現平衡，則洗滌用雜交溶液進行。
“可操縱地連接”是指基因與調節序列之間的連接關系，以此方式當適當的分子(例如轉錄激活蛋白)與調節序列結合時，基因能得以表達。
“啟動子”是一種核苷酸序列，例如當其在細胞中可操縱地連接于異源序列時，其能以至少一種前后序列效應指導轉錄。換而言之，啟動子可不需下游待轉錄序列而存在，只要當以不同前后序列置于異源序列的上游時，啟動子序列能指導轉錄即可。
本文所用術語“個體”包括人和非人動物。所述個體典型是人，例如患有過敏性疾病的病人。
“耐受”是指哺乳動物在接觸一或多種過敏原時不發生過敏性免疫反應的狀態。
本文所用術語“轉基因”是指一種DNA序列，其包括一或多個選擇的DNA，該DNA部分或全部異源于轉基因動物，或部分或全部同源于轉基因動物的內源性基因，但其被設計為插入動物基因組的與天然基因不同的位置。一個轉基因包括一或多個啟動子和表達所選擇的DNA所需的任何其它DNA如內含子，其均與所選擇的DNA可操縱地連接，并可包括增強子序列。
“轉基因的”是指包括一種DNA序列的任何細胞，該DNA序列人工插入細胞，并成為從該細胞發育成的生物體基因組的一部分。
本文所用術語“轉基因哺乳動物”是指包括一種轉基因的哺乳動物或這種哺乳動物的后代，該轉基因插入胚胎細胞并成為從該細胞發育成的哺乳動物的至少某些細胞的基因組的一部分，“乳”和“乳組合物”包括哺乳動物乳腺的分泌物或其任何衍生物，例如干燥的組合物如乳粉、濃縮乳等。
可由本發明治療的過敏性疾病包括但不限于鼻炎，鼻竇炎，哮喘，過敏性肺炎，外源過敏性牙齦炎，結腸炎，風疹，濕疹，皮炎，過敏反應，血管神經性水腫，過敏性偏頭痛，和涉及由IgE介導的過敏癥的某些胃腸道疾病。
通過以下詳細闡述和所附權利要求書，將顯而易見本發明的其它特點和優點。
發明詳細描述本發明涉及可治療性用于治療過敏性疾病的轉基因乳。
使用乳腺特異性啟動子，在嚙齒動物、豬和乳制品業動物中已表達了許多感興趣的生物藥物蛋白(Echeland(1996)Current Opinionin Biotechnology 7536；Houdebine(2000)Transgenic Research 9505；Meade et al.(1999)Chapter 14 in Gene Expression SystemsUsing Naturefor the Art of Expression Academic Press，page399)。將包含與乳啟動子基因融合的編碼感興趣靶蛋白的基因的表達載體通過微注射導入單細胞胚胎的原核中。經過種系整合和表達，所述轉基因成為顯性孟德爾遺傳特征，而遺傳給建立者動物的子代。
轉基因后代表達該靶蛋白，產生含有每升含量高至幾克量級的靶蛋白的乳。最通常的是靶蛋白呈可溶乳清蛋白形式。哺乳動物乳腺上皮細胞能夠進行具有翻譯后修飾和折疊的復雜蛋白合成。轉基因家畜的乳成為人用診斷或藥物活性和治療性蛋白質的起始材料，這些蛋白質可用熟知技術進行純化。
通過轉基因對乳組合物進行操作主要集中于將乳腺作為生物反應器而生產隨后被純化的藥物。本發明的改進卻是利用乳腺機制生產本身對消費者即有益的治療乳。因此，可完全避免蛋白質純化所需時間和成本。另外，由于治療包含在乳中，因此其可被輸送至個體，而個體完全不知其存在。
待表達以治療特定過敏癥的特異過敏原當然基于該不希望的免疫應答是否針對蛋白質過敏原。如果已經鑒別了觸發此類應答的蛋白質過敏原，熟練技術人員可將編碼該過敏原的核苷酸序列克隆入乳特異性表達載體中，然后將此表達載體用于產生轉基因哺乳動物并獲得雌性個體。這種雌性的乳被給予個體，以改善或預防隨后的過敏癥特征性癥狀(例如皮炎或支氣管肺炎)。評價和定量呼吸道高反應性的實驗方法見下述。本領域熟知評價支氣管肺炎的其它方法。過敏性哮喘特點是呼吸道高反應性和炎癥均存在。呼吸道高反應性可通過肺部試驗改變測定(介入或非介入方法)。呼吸道炎癥可通過呼吸道中炎性細胞尤其嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞的浸潤，及通過病理學改變測定。
關于過敏原及其生理作用的進一步闡述見Aas等，Allergy333，1978；Goldin等，Br.J.Nut.80S203-S207，1998；和Kailasapathy等，J.Immunol.Cell Biol.7880-88，2000。
通常，過敏原在一核酸構建體中可操縱地與乳啟動子連接以提供用于口服免疫治療的過敏原。所述構建體還包括用于經乳腺上皮細胞分泌過敏原的信號序列，和其它序列如轉錄終止子，內含子，5＇非翻譯區或聚腺苷酸化位點。所述構建體可包括附加的標記以促進哺乳動物細胞的轉化，例如用于陽性和/或陰性選擇的標記。
所述構建體隨后被導入細胞，例如成纖維細胞或胚胎干細胞，并使構建體整合進細胞的基因組中。例如，將所述構建體微注射進哺乳動物胚胎的原核中，隨后將胚胎轉移進假孕雌性中。用PCR篩選和Southern印跡雜交，鑒別具有轉基因的后代。在與正常哺乳動物交配后，產生F1雌性后代。這些雌性后代產生的轉基因乳可用于治療過敏性疾病。另外，轉基因乳也可用于一級預防，即將其給予由于其父母一方或雙方患有過敏性疾病而高危患過敏性疾病的嬰兒。
轉基因動物也可用于繁殖轉基因，例如形成動物群。可用已知方法從這種動物群的雌性個體中常規獲得乳。
涉及構建體的通常方法可包括下述特征細節過敏原任何一或多個多肽過敏原可用本文提供的方法輸送。例如，多肽過敏原可以是植物、真菌或動物編碼的多肽。植物過敏原通常是花粉、汁液、葉和植物毒素(例如有毒長春藤分泌物等)。真菌過敏原包括曲霉或其它霉菌產生的多肽。動物過敏原包括例如昆蟲產生的多肽，例如塵螨的排泄物過敏原，和哺乳動物產生的多肽，例如貓的皮屑。
編碼過敏原的核酸序列可用各種方法鑒別。可用來自過敏個體的IgE篩選cDNA表達文庫(Lin et al(1994)J Allergy Clin Immunol94989-96)，鑒別陽性克隆并測序。可鑒別編碼區并進行翻譯而確定過敏原的多肽序列。編碼區可用于在本文所述核酸中表達過敏原。
多肽過敏原的特定例子包括Dermatophagoides pteronyssinus的Der p過敏原。Der p5多肽序列如下MKFIIAFFVATLAVMTVSGEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTIIAMIDGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV(SEQID NO1)，也見于Lin等，J Allergy Clin Immunol 94989-96(1994)。
Der p1多肽序列如下MKIVLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL(SEQ ID NO2)Der p2多肽序列如下MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD(SEQ ID NO3)。乳特異性啟動子目前有許多優先激活在乳腺上皮細胞中的轉錄的轉錄啟動子，這些啟動子包括控制編碼乳蛋白如酪蛋白、β-乳球蛋白(Clark etal.(1989)Bio/Technology7487-492)、乳清酸性蛋白(Gordon etal.(1987)Bio/Technology 51183-1187)和乳清蛋白(Soulier et al.(1992)FEBS Letts.29713)的基因的啟動子。酪蛋白啟動子可衍生自任何哺乳動物物種的α-、β-、γ-、κ-酪蛋白基因；優選的啟動子衍生自山羊β-酪蛋白基因(DiTullio(1992)Bio/Technology 1074-77)。
許多這些啟動子的DNA序列是可獲得的，例如在GenBank和在科學出版物中，如Richards et al.(1981)J.Biol.Chem.256，526-532(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell et al.(1984)Nucleic Acids Res.128685-8697(大鼠WAP)；Jones et al.(1985)J.Biol.Chem.2607042-7050(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen(1983)J.Biol.Chem.25810794-10804(大鼠γ-酪蛋白)；Hall(1987)Biochem.J.242，735-742(人α-乳清蛋白)；Stewart(1984)Nuleic Acid Res.12，389(牛αsl和κ-酪蛋白cDNA)；Gorodetsky et al.(1988)Gene 6687-96(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，Eur.J.Biochem.178395-401(1988)(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，(1977)FEBS Lett.188，48-55(牛αs2酪蛋白)；Jamieson etal.，(1987)Gene61，85-90，Ivanov et al.，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler369，425-429，Alexander et al.，(1989)Nuleic Acid Res.17，6739(牛β-乳球蛋白)；Vilotte et al.，(1987)Biochimie 69，609-620(牛α乳清蛋白)。也參見Mercier & Vilotte(1993)J.Dairy Sci.76，3079-3098的綜述。為了額外的調控或嚴格性，可用這些啟動子序列作探針篩選基因組文庫而從這些基因或其它哺乳動物同源基因中獲得其它調節序列，例如相鄰序列。信號序列核酸構建體還可包括信號序列，特別是乳特異性基因的信號序列。乳特異性信號序列可以是用于該構建體的所選乳特異性啟動子天然存在的信號序列，如下所述。例如，可使用來自編碼酪蛋白，例如α-、β-、γ-、κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，乳清酸性蛋白和乳清蛋白的基因的信號序列。轉基因轉基因哺乳動物也可通過將導入感興趣核酸例如編碼過敏原的核酸的轉基因細胞系核轉移至胚胎干細胞而產生。將外源DNA導入哺乳動物的方法包括微注射和核移植方法。例如，目前已有生產轉基因山羊、豬、大鼠、奶牛和綿羊的方案，例如參見，Ebert et al.(1994)Bio/Technology 12699；PCT申請WO98/30683；White and Yannoutsos，Current Topics in Complement Research64thForum in Immunology，pp.88-94；US專利5,523,226；US專利5,573,933；PCT申請WO93/25071；PCT申請WO95/04744；Bader and Ganten，Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology，Supp.3S81-S87，199；US專利5,741,957，PCT申請WO98/30683；Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，ed.，Carl A.Pinker，Academic Press，Inc.；PCT申請WO97/07669；Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，ed.，Carl A.Pinker，Academic Press，Inc.
構建體可經常規轉化或轉染技術如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染或電穿孔等導入細胞(例如參見，Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)。
不用再詳細闡述，基于以上揭示本領域技術人員可使用下述轉基因乳進行有效治療，將本發明方法最佳程度地利用。以下實施例只是舉例說明技術人員怎樣能產生和使用轉基因動物來合成治療乳，無任何限制本發明之意。所引用的文獻以其全文并入參考。
將純化的轉基因(例如見

圖1)微注射進來自雜交繁殖ICR品系超排卵雌性小鼠的受精卵雄性原核中，并轉移至受體假孕雌性中，如Chen et al.，Science1994；2651237-40所述。經PCR擴增尾DNA而快速篩選所得幼仔中的轉基因，結果經Southern印跡分析進一步證實。
PCR篩選和Southern印跡雜交用限定跨越αLA啟動子和Der p5cDNA連接序列的一580bp區域的一套引物pαLA-124(+)5＇-CTCTCTTGTCATCCTCTTCC-3＇(SEQ ID NO8)和pDer p5(-)5＇-ACTCGAGTGATGAAGGCAAGAAG-3＇(SEQ ID NO9)進行PCR快速篩選。
分別用StuI和XbaI限制酶在37℃過夜消化10微克基因組DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，并轉移至Durose膜(Stratagene，LaJolla，CA)。用Der p5特異性cDNA的XhoI配對(0.5kb)作為放射性探針以雜交膜。印跡在-20℃冰箱中進行放射自顯影1周。
哺乳期小鼠乳腺組織的免疫組織化學分析將來自D15哺乳期轉基因和非轉基因小鼠的新鮮切下的乳腺根據Sasson et al.(1988)Development104155-164的方法在低聚甲醛中固定。
用蘇木精和曙紅B染料將組織切片(5-10微米)染色并在光學顯微鏡(Axiovert135；Carl Zeiss，德國)下照相。根據Gruskin-Lemerand Trinkaus-Randall(1991)Curr Eye Res1075-85所述進行免疫組織化學分析。將兔抗螨Der p5多克隆抗體1∶30稀釋(1％牛血清白蛋白(BSA)于磷酸緩沖鹽水(PBS)中)，取50微升與抗Der p5或正常兔血清(NRS；1∶10)在37℃保溫30分鐘。用10體積BSA-PBS緩沖液洗滌后，將乳腺玻片與1∶100稀釋(1％BSA于PBS中)的親和純化的綴合有異硫氰酸熒光素(FITC；Boehringer-Mannheim，德國)的山羊抗兔IgG抗體在37℃保溫30分鐘。洗滌后，玻片在裝配有落射熒光光學元件的Nikon Optiphot顯微鏡下觀察玻片。
轉基因小鼠乳免疫印跡分析如前所述(Simons et al.(1987)Nature328530-532)從哺乳期雌性中收集乳，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。在含有5％2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液中稀釋收集自不同哺乳期的在75mM Tris-HCl緩沖液pH6.8中10-20倍稀釋的乳，并在7.5％凝膠上電泳。為估計產量水平，在正常小鼠乳中將純化的重組Der p5標準稀釋至10微克/毫升，并與轉基因乳樣品一起電泳。將蛋白質從凝膠上電轉移至PVDF膜(NEN Life Science Products，Boston，MA)。用識別Der p5的2-10微克/毫升一級抗體探查印跡，并用含有0.1％Tween-20的磷酸緩沖鹽水(PBS-T)洗滌。印跡與0.2微克/毫升辣根過氧化物酶(HRP)綴合的二級抗體反應。隨后用化學發光ECLTM檢測系統(Amersham，UK)顯色印跡并在X-光膠片上曝光。通過光密度計比較條帶密度。
動物和研究方案年齡為21天的雌性LCR得自臺灣大學醫學院動物育種中心(源自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，將其分為3組進行每一實驗(表1)。將動物用含有Der p5的轉基因乳或僅用乳喂養4周。將動物通過腹膜內注射10μg用已知方法純化的重組Der p5而活性致敏。在致敏21天后，將動物接觸0.1％Der p5-谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白20分鐘或PBS的氣霧劑。在吸入攻擊8小時后，測定肺部抗性50分鐘，并收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清。
呼吸道反應性的非侵入性測定方法使用氣壓全身體積描記儀(WBP；Buxco，Troy，NY)，用常規方法對有意識的不受限制的小鼠吸入乙酰甲基膽堿的反應進行測定。在取讀數之前，將1ml空氣快速注射到主腔中，以從WBP裝置中獲得1mv信號，由此校準盒。通過確定吸氣初和吸氣末記錄吸氣和呼氣情況，作為在0點交叉的盒壓力/時間曲線。吸氣初是通過從盒壓力信號的上升吸氣相的兩個水平處繪制的直線外推確定的。吸氣時間(Ti)是指從吸氣初至吸氣末的時間。呼氣時間(Te)是指從吸氣末至下一吸氣初的時間。一次呼吸期間在正負方向發生的最大盒壓力信號，分別定義為峰值吸氣壓力(PIP)和峰值呼氣壓力(PEP)。記錄每10次呼吸推斷每分鐘的呼吸頻率。松弛時間(Tr)是指達到36％總呼氣壓力信號(在呼氣中盒壓力信號之下的區域)的時間。此閾值用于將體積信號的衰減時間常數與在被動呼氣中峰值體積衰減36％相關。間歇(pause)和增強的間歇(enhanced pause，Penh)限定如下間歇＝(Te-Tr)/TrPenh＝(PEP/PIP)×間歇測定Penh的增加作為呼吸道反應指數。測量小鼠并取3分鐘的平均值。將氣霧化鹽水，接著是增加濃度的乙酰甲基膽堿(從1-100mg/ml)噴霧吸入3分鐘。在每一噴霧后，取讀數并取3分鐘平均值。呼吸道反應性以每劑乙酰甲基膽堿的Penh表示。
統計學分析為評價Der p5攻擊后肺部抗性的改變、細胞因子濃度、IgE、IgG水平及BALF中的細胞，進行ANOVA重復測量，以對比各組之間的不同。通過方差分析，使用Duncan多范圍檢驗來區分實驗組和對照組之間的差異。p＜0.05認為有統計學意義。結果在體內抑制呼吸道高反應性(AHR)觀察到用轉基因乳口服喂養動物會抑制過敏原誘導的AHR。對氣霧化乙酰甲基膽堿的呼吸道應答是在最后吸入攻擊8小時后的有意識的不受限制的小鼠中測定的。對于所有小鼠，繪制對1-100mg/ml的乙酰甲基膽堿的完整劑量應答曲線。在所有組的小鼠中，基礎Penh值和氣霧化鹽水所致的Penh值沒有明顯不同。在模擬(C組)處理的小鼠中，與基礎值相比，Derp5吸入攻擊誘導明顯提高的對乙酰甲基膽堿的呼吸道反應性。相反，用轉基因乳處理(A組)Der p5致敏的小鼠意想不到地抑制10-100mg/ml乙酰甲基膽堿范圍的AHR。
表1三個實驗組的特征及每組所進行的程序組 處理a致敏b吸入攻擊cA含Der p5的乳 Der p5+B含Der p5的乳氫氧化鋁 +C 乳 Der p5+a用含有Der p5的乳喂養28天b用10ugrDer p5和4mg Al(OH)3腹膜內注射c0.1％Der p5吸入攻擊15分鐘在C組中隔片被大量炎性細胞(淋巴細胞、巨噬細胞和一些嗜酸性粒細胞)浸潤，特別是在細支氣管和毛細管周圍。肺部炎癥典型地是存在巨細胞。肺泡空間中充滿粘膜分泌物。炎性水平很嚴重。
另一方面，在A組中進行的組織病理學研究揭示僅有一些炎性細胞浸潤細支氣管和毛細管。隔片沒有增厚，肺泡空間是透明的。相應地炎性水平是輕度的。這些觀察還證實與僅用乳治療的動物相比，用含有Der p5的轉基因乳治療抑制Der p5誘導的特異性呼吸道炎癥的發展。其它實施方案應理解的是盡管本發明已結合上述詳細描述而闡述，但是上述描述僅是舉例性的，并非限制本發明范圍，本發明范圍由權利要求書的范圍限定。其它方面、優點和修改屬于權利要求書范圍。
權利要求
1.一種制備轉基因哺乳動物的方法，包括將一種外源核酸導入哺乳動物，篩選獲得轉基因哺乳動物，所述外源核酸包括(1)編碼過敏原的編碼序列，和(2)可操縱地與該編碼序列連接的異源啟動子，其中該異源啟動子指導過敏原在該動物或其雌性子代的乳腺細胞中表達。
2.權利要求1的制備轉基因哺乳動物的方法，其中過敏原是塵螨過敏原。
3.權利要求2的制備轉基因哺乳動物的方法，其中塵螨是Dermatophagoides pteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
4.權利要求3的制備轉基因哺乳動物的方法，其中過敏原包括具有與SEQ ID NO1、2或3有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽。
5.權利要求4的制備轉基因哺乳動物的方法，其中過敏原包括具有與SEQ ID NO1、2或3相同的氨基酸序列的多肽。
6.權利要求1的制備轉基因哺乳動物的方法，其中啟動子是酪蛋白或乳清蛋白的啟動子。
7.權利要求6的制備轉基因哺乳動物的方法，其中啟動子是α-乳清蛋白啟動子。
8.權利要求1的制備轉基因哺乳動物的方法，其中該哺乳動物是奶牛、山羊或綿羊。
9.權利要求1的制備轉基因哺乳動物的方法，其中過敏原是蛋白質過敏原。
10.一種乳組合物，包括一種異源非乳過敏原；和一種酪蛋白，其中當口服給予該組合物時，其會降低在隨后接觸該過敏原的個體體內過敏原特異性IgE產生。
11.權利要求10的乳組合物，其中過敏原是昆蟲過敏原。
12.權利要求11的乳組合物，其中過敏原是塵螨過敏原。
13.權利要求12的乳組合物，其中塵螨是Dermatophagoidespteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
14.權利要求13的乳組合物，其中過敏原是Der p5，Der p1或Der p2。
15.權利要求10的乳組合物，其中酪蛋白是牛或羊酪蛋白。
16.權利要求10的乳組合物，其中該組合物是干態的。
17.權利要求10的乳組合物，其中過敏原是蛋白質過敏原。
18.權利要求10的乳在制備減輕呼吸道炎癥和高反應性的藥物中的應用。
19.權利要求12的乳在制備減輕呼吸道炎癥和高反應性的藥物中的應用。
20.權利要求13的乳在制備減輕呼吸道炎癥和高反應性的藥物中的應用。
21.權利要求15的乳在制備減輕呼吸道炎癥和高反應性的藥物中的應用。
22.權利要求10的乳在制備降低接觸過敏原的個體體內IgE產生的藥物中的應用。
23.一種核酸，包括(1)編碼過敏原的編碼序列；和(2)可操縱地與該編碼序列連接的異源啟動子，其中該異源啟動子指導過敏原在乳腺細胞中表達。
24.權利要求23的核酸，其中過敏原是塵螨過敏原。
25.權利要求24的核酸，其中塵螨是Dermatophagoidespteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
26.權利要求24的核酸，其中多肽具有與SEQ ID NO1至少70％相同的氨基酸序列。
27.權利要求25的核酸，其中過敏原包括具有與SEQ ID NO1、2或3相同的氨基酸序列的多肽。
28.權利要求23的核酸，其中啟動子是酪蛋白或乳清蛋白的啟動子。
29.權利要求28的核酸，其中啟動子是α-乳清蛋白啟動子。
30.權利要求23的核酸，其中過敏原是蛋白質過敏原。
31.哺乳動物生殖細胞，其是權利要求1的制備轉基因哺乳動物的方法制備的轉基因哺乳動物的生殖細胞，其中該生殖細胞包括該核酸。
全文摘要
本發明涉及將包括異源非乳過敏原的乳組合物給予個體以抑制該個體中過敏原特異性IgE的產生。
文檔編號A61K39/35GK1406467SQ0212021
公開日2003年4月2日 申請日期2002年5月16日 優先權日2001年6月8日
發明者許清祥, 鄭登貴, 陳全木 申請人:臺岳生物科技股份有限公司