專利名稱：肝癌超抗原免疫基因治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術，特別涉及一種肝癌超抗原免疫基因治療劑。
為了實現上述目的，本發明所采取的技術方案是從甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌細胞中分離細胞基因組總DNA，設計特異性引物，通過PCR方法擴增AFP啟動子和順式增強子序列；分別從腸葡萄球菌場毒素A標準菌株FRI100基因組中通過PCR擴增SEA基因全序列和蛋白編碼序列，定點突變葡萄球菌場毒素A(SEA)基因位點，同時從人B細胞通過反轉錄PCR分別擴增共刺激分子B7.1基因編碼胞外區序列(B7.1exc)和跨膜區序列(B7.1tm)；將上述片段克隆至載體pLXSN(Clontech公司產品，屬逆轉錄病毒真核表達載體，非本研究專用載體)中，分別構建以AFP啟動子和增強子為調控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆轉錄真核表達載體；將目的基因逆轉錄病毒載體在病毒包裝細胞系PA317、φ2中進行包裝；以包裝好的缺陷病毒顆粒感染人肝癌細胞，表達出SEA-B7.1融合蛋白；以視黃素、地塞米松、雌激素等藥物對SEA-B7.1的表達進行調控，同時通過檢測AFP水平來判斷治療效果。
利用AFP特異性調控序列調控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表達，通過設計特異性引物5’CGCAACTTAGGGACAAGT3’CGGAAAATCATGCTGAAA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG3’GGAGACCAGTTAGG AAGT，通過PCR方法擴增AFP啟動子和順式增強子序列，其序列如下AFP啟動子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCAFP增強子序列GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC，其特點是將所獲得的調控序列置于目的基因上游，特異性調控目的基因的表達。
在肝癌細胞特異性表達超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1；設計特殊引物，分別從腸葡萄球菌場毒素A標準菌株FRI100基因組中通過PCR擴增SEA基因全序列和蛋白編碼序列，擴增引物分別為5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTAYTATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATA AATATAT，以單點或組合的突變方式，定點突變葡萄球菌場毒素A(SEA)基因位點(H81、H187、H225、D227)，設計特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGC GGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)從人B細胞通過反轉錄PCR分別擴增共刺激分子B7.1基因編碼胞外區序列(B7.1exc)和跨膜區序列(B7.1tm)；分別構建獲得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因；構建以AFP啟動子和增強子為調控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆轉錄真核表達載體。
本發明通過基因工程和細胞生物學手段在肝癌細胞表面建立甲胎蛋白(AFP，alpha-Fetoprotein)增強子和啟動子特異性調控的利用超抗原分子葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)和共刺激分子B7.1雙信號免疫激活系統，使肝癌細胞特異性表達強抗原信號SEA的同時，賦予抗原信號共刺激分子B7.1，通過介入方式導入癌區。
采用本發明可有效提高肝癌細胞誘導免疫排斥反應的能力；同時利用體外經60Co照射的轉染SEA-B7.1的AFP高表達肝癌細胞誘導自身T淋巴細胞進行過繼免疫治療，輔助癌區免疫治療，以增強療效、治療轉移病灶和預防復發，以達到理想的治療目的。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
依照本發明的技術方案，從甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌細胞中分離細胞基因組總DNA，設計特異性引物5’GCAACTTAGGGACAAGT 3’GGAAAATCATGCTGA AA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3’GGAGACCAGTTAGGAAGT，通過PCR擴增反應，分別獲得AFP啟動子和順式增強子序列，其序列如下AFP啟動子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCAFP增強子序列GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC設計特殊引物，分別從腸葡萄球菌場毒素A(SEA)標準菌株FRI100基因組中通過PCR擴增SEA基因全序列和蛋白編碼序列，擴增引物分別為5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTATATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATAAATATAT，以單點或組合的突變方式，定點突變葡萄球菌場毒素A(SEA)基因位點(H81、H187、H225、D227)，設計特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)從人B細胞通過反轉錄PCR分別擴增共刺激分子B7.1基因編碼胞外區序列(B7.1exc)和跨膜區序列(B7.1tm)；將上述片段克隆至載體pLXSN(Clontech公司產品，屬逆轉錄病毒真核表達載體，非本研究專用載體)中，分別構建以AFP啟動子和增強子為調控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆轉錄真核表達載體；將目的基因逆轉錄真核表達載體轉染至病毒包裝細胞系PA317、φ2中進行包裝(MillerAD & Buttimor C.(1986)Mol Cell Biol.6，2895-2902.Mann R，mulligan RC &baltimore D.(1983)Cell 33，153-159.)；包裝細胞培養上清經分離純化后獲得缺陷病毒顆粒，并以這種缺陷病毒顆粒通過經皮穿刺注射、介入或靜脈注射等方式注入瘤區，感染人肝癌細胞，表達出SEA-B7.1融合蛋白；通過視黃素、地塞米松、雌激素等藥物調控AFP的表達，從而達到對SEA-B7.1的表達進行調控，同時通過檢測AFP水平來判斷治療效果；藥劑質控達到國家規定標準。
本發明的肝癌超抗原免疫基因治療劑具有以下優點(1)安全性，即該治療劑進入機體后只在處于分裂期的肝癌細胞進行表達，不傷及正常細胞；(2)靶向性，利用肝癌細胞特異性AFP啟動子和增強子進行靶向調控；(3)可控性，通過視黃素、地塞米松、雌激素等藥物調控AFP的表達，從而達到對目的基因表達進行調控；(4)滅癌高效性，利用超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1雙信號免疫激活系統，使肝癌細胞特異性表達強抗原信號SEA的同時，賦予抗原信號共刺激分子B7.1，有效提高肝癌細胞誘導免疫排斥反應的能力；同時利用體外誘導自身T淋巴細胞進行過繼免疫治療，輔助癌區免疫治療，以增強療效、治療轉移病灶和預防復發。實施例(具體操作及應用)(一)以AFP啟動子和增強子為調控元件的治療用的目的基因SEA和B7.1及其質粒的組建1.選擇AFP高分泌肝癌細胞，分離細胞基因組總DNA，設計特異性引物，通過PCR的方法擴增位于第4號染色體上AFP啟動子和順式增強子的序列，通過CAT(氯霉素轉乙酰基酶)報告系統在CHO細胞中檢測調控活性及能力；2.套式PCR定點突變SEA的H81、H187、H225、D227等位點，采用單點或組合突變方式，突變產物插入pCDNA3.1載體中，轉染CHO細胞，檢測表達產物與MHCII分子的結合能力及免疫激活狀況；3.通過計算機軟件二維和三維結構輔助分析線性和空間結構特征，選擇B7.1基因和SEA基因的最佳連接方式，將SEA編碼基因插入人B7.1基因編碼胞外區序列和跨膜區序列之間或直接與B7.1跨膜序列連接，獲得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因，連接后的基因行序列測定；4.將上述片段克隆至載體pLXSN(Clontech公司產品，屬逆轉錄病毒真核表達載體，非本研究專用載體)中，分析和選擇AFP增強子和啟動子在編碼基因上游LTR中的功能定位，構建以AFP啟動子和增強子為調控元件的SEA-B7.1目的基因逆轉錄真核表達載體。(二)基因導入系統的組建和工作細胞庫的建立及質控1.采用缺陷型逆轉錄病毒顆粒為導入系統，將目的基因逆轉病毒載體在病毒包裝細胞系PA317、2中進行包裝，以NIH3T3細胞為待測細胞進行滴度測定；2.建立相應的種子細胞庫和工作細胞庫，以標記挽救法和RT-PCR檢測復制型病毒；3.最終病毒制劑的質控，包括病毒滴度及最終制劑所含病毒量檢測、內毒素檢測、無菌試驗、過敏試驗和異常毒性試驗等項目，達到國家有關規定標準；(三)病毒介導的體內免疫基因治療和T細胞進行過繼性細胞免疫治療1.缺陷病毒顆粒通過經皮穿刺注射、介入或靜脈注射等方式注入瘤區，感染人肝癌細胞，表達出SEA-B7.1融合蛋白；2.通過外周血AFP水平來監測治療水平，同時通過視黃素、地塞米松和雌激素等藥物調節AFP的表達以調整治療方案；3.分離提取患者肝癌活檢組織或外周血T淋巴細胞，擴大培養后，以目的基因高表達肝癌克隆株進行體外誘導后回輸，鞏固體內免疫基因治療的療效，同時治療轉移病灶并預防復發；4.綜合考慮治療效果、單次和累計治療劑量、急性和長期毒副作用、免疫耐受情況等因素，制定相應的聯合免疫治療方案。
權利要求
1.肝癌超抗原免疫基因治療劑，其特征在于從甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌細胞中分離細胞基因組總DNA，設計特異性引物，通過PCR方法擴增AFP啟動子和順式增強子序列；分別從腸葡萄球菌場毒素A標準菌株FRI100基因組中通過PCR擴增SEA基因全序列和蛋白編碼序列，定點突變葡萄球菌場毒素A(SEA)基因位點，同時從人B細胞通過反轉錄PCR分別擴增共刺激分子B7.1基因編碼胞外區序列(B7.1exc)和跨膜區序列(B7.1tm)；將上述片段克隆至載體pLXSN中，分別構建以AFP啟動子和增強子為調控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆轉錄真核表達載體；將目的基因逆轉錄病毒載體在病毒包裝細胞系PA317、φ2中進行包裝；以包裝好的缺陷病毒顆粒感染人肝癌細胞，表達出SEA-B7.1融合蛋白；以視黃素、地塞米松、雌激素等藥物對SEA-B7.1的表達進行調控，同時通過檢測AFP水平來判斷治療效果；利用AFP特異性調控序列調控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表達，通過設計特異性引物5’CGCAACTTAGGGACAAGT 3’CGGAAAATCATGCTGAAA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3’GGAGACCAGTTAGG AAGT，通過PCR方法擴增AFP啟動子和順式增強子序列，其序列如下AFP啟動子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCAFP增強子序列GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC，其特點是將所獲得的調控序列置于目的基因上游，特異性調控目的基因的表達。
2.據權利要求1所述的肝癌超抗原免疫基因治療劑，其特征是在肝癌細胞特異性表達超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1；設計特殊引物，分別從腸葡萄球菌場毒素A標準菌株FRI100基因組中通過PCR擴增SEA基因全序列和蛋白編碼序列，擴增引物分別為5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTATAT AAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATAAATATAT，以單點或組合的突變方式，定點突變葡萄球菌場毒素A(SEA)基因位點(H81、H187、H225、D227)，設計特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC 3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)從人B細胞通過反轉錄PCR分別擴增共刺激分子B7.1基因編碼胞外區序列(B7.1exc)和跨膜區序列(B7.1tm)；分別構建獲得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因及以AFP啟動子和增強子為調控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆轉錄病毒真核表達載體。
3.據權利要求1所述的肝癌超抗原免疫基因治療劑，通過基因工程和細胞生物學手段在肝癌細胞表面建立甲胎蛋白(AFP，alpha-Fetoprotein)增強子和啟動子特異性調控的利用超抗原分子葡萄球菌腸毒素A(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)和共刺激分子B7.1雙信號免疫激活系統，使肝癌細胞特異性表達強抗原信號SEA的同時，賦予抗原信號共刺激分子B7.1，通過介入方式導入癌區，有效提高肝癌細胞誘導免疫排斥反應的能力；同時利用體外經60Co照射的轉染SEA-B7.1的AFP高表達肝癌細胞誘導自身T淋巴細胞進行過繼免疫治療，輔助癌區免疫治療，以增強療效、治療轉移病灶和預防復發，以達到理想的治療目的。
全文摘要
本發明公開了一種涉及基因工程技術的肝細胞癌(肝癌)超抗原免疫基因治療劑，其特征是制備肝癌細胞特異性調控序列介導的超抗原分子和共刺激分子在肝癌細胞進行靶向表達的治療劑，特異性增強癌細胞的免疫原性和與免疫效應細胞的識別作用。在體內，通過介入方式送到癌區，有效殺傷癌細胞，并可利用相關藥物調控該特異性調控序列的活性來調節上述兩種分子的表達，并通過該特異性調控序列調控的自身產物水平判斷療效。同時，在體外誘導自身T細胞進行過繼免疫治療，輔助體內治療，以增強療效、治療轉移灶和預防復發。本治療劑具有安全、靶向、可控和滅癌高效等特點，是一種很有前景的肝癌免疫基因治療劑。
文檔編號A61K48/00GK1401392SQ0211446
公開日2003年3月12日 申請日期2002年3月8日 優先權日2002年3月8日
發明者隋延仿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學