專利名稱：治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種用于治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝。
為達到上述目的，本發明采用的技術方案是1)hEDN編碼基因的擴增及測序1.1根據hEDN基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH I和Sac I酶切位點；1.2擴增目的基因在5×106～10×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol，反復吹打，在15℃～30℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在15℃～30℃下放置2-3分鐘后在2℃-8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在15℃～30℃下放置10分鐘后在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次；2)HBVc編碼基因的擴增及測序2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac I和Hind III酶切位點；2.2擴增目的基因向2.2.15細胞加入1ml/10cm2的Trizol，在15℃～30℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml Trizol的氯仿，劇烈震動15秒，再在15-30℃下放置2-3分鐘后，在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1ml Trizol的異丙醇，15-30℃下放置10分鐘，2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次，得到PCR產物；
2.3克隆與測序將hEDN和HBVc的產物PCR經1.0-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleic Acid Purification Kit試劑盒，進行純化回收；將回收產物分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后純化回收，分別與用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鑒定；序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III雙酶切，將真核表達載體經BamH I和Hind III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；將復性后的產物經1.5-2％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經BamH I和Sac I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經BamH I和Sac I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；將p/LHBV以BamH I酶切，Klenow補平，Hind III酶切后，純化回收小片斷LHBV；融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。
本發明的另一特點是HL-60細胞的總RNA，是在5×106～10×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol提取HL-60的總RNA，將HL-60的總RNA在-5℃～-20℃下保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃-8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中；2.2.15細胞的總RNA，是在2.2.15細胞中加入1ml/10cm2的Trizol，提取2.2.15細胞的總RNA；將2.2.15細胞的總RNA在-5℃～-20℃保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃-8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
本發明首先通過分子生物學的手段，構建人嗜酸性粒細胞來源的神經毒素(hEDN)與HBV多聚酶末端蛋白結構域(DNAPTP)或核心蛋白的融合蛋白(該融合蛋白即為構建的靶向核糖核酸酶)，本融合蛋白可以采取基因治療或蛋白質藥物的方式，治療人的乙肝病毒的感染。
具體實施例方式
實施例11)hEDN編碼基因的擴增及測序1.1根據hEDN基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH I和Sac I酶切位點；1.2擴增目的基因在5×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol，反復吹打，在15℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在15℃下放置2分鐘后在2℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在15℃下放置10分鐘后在2℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；將HL-60的總RNA在-5℃下保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMVReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55℃下30s、72℃延伸1min分別循環25次；
2)HBVc編碼基因的擴增及測序2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac I和Hind III酶切位點；2.2擴增目的基因向2.2.15細胞加入1ml/10cm2的Trizol，在15℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml Trizol的氯仿，劇烈震動15秒，再在15℃下放置2分鐘后，在2℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1ml Trizol的異丙醇，15℃下放置10分鐘，2℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；將2.2.15細胞的總RNA在-5℃保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55℃下30s、72℃延伸1min分別循環25次，得到PCR產物；2.3克隆與測序將hEDN和HBVc的產物PCR經1.0％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleic Acid Purification Kit試劑盒，進行純化回收；將回收產物分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后純化回收，分別與用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鑒定；序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III雙酶切，將真核表達載體經BamH I和Hind III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；將復性后的產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經BamH I和Sac I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經BamH I和Sac I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；將p/LHBV以BamH I酶切，Klenow補平，Hind III酶切后，純化回收小片斷LHBV；融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。
實施例21)hEDN編碼基因的擴增及測序1.1根據hEDN基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH I和Sac I酶切位點；1.2擴增目的基因在10×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol，反復吹打，在30℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在30℃下放置3分鐘后在8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在30℃下放置10分鐘后在8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；將HL-60的總RNA在-20℃下保存于75％的乙醇中，臨用前在8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、65℃下30s、72℃延伸10min分別循環40次；2)HBVc編碼基因的擴增及測序2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac I和Hind III酶切位點；2.2擴增目的基因向2.2.15細胞加入1ml/10cm2的Trizol，在30℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml Trizol的氯仿，劇烈震動15秒，再在30℃下放置3分鐘后，在8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1ml Trizol的異丙醇，30℃下放置10分鐘，8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；將2.2.15細胞的總RNA在-20℃保存于75％的乙醇中，臨用前在8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、65℃下30s、72℃延伸10min分別循環40次，得到PCR產物；2.3克隆與測序將hEDN和HBVc的產物PCR經1.5％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleic Acid Purification Kit試劑盒，進行純化回收；將回收產物分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后純化回收，分別與用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鑒定；序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III雙酶切，將真核表達載體經BamH I和Hind III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；將復性后的產物經2％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經BamH I和Sac I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經BamH I和Sac I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；將p/LHBV以BamH I酶切，Klenow補平，Hind III酶切后，純化回收小片斷LHBV；融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。
實施例31)hEDN編碼基因的擴增及測序1.1根據hEDN基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；
正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH I和Sac I酶切位點；1.2擴增目的基因在8×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol，反復吹打，在20℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在25℃下放置2.5分鐘后在6℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在18℃下放置10分鐘后在5℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；將HL-60的總RNA在-15℃下保存于75％的乙醇中，臨用前在4℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、60℃下30s、72℃延伸5min分別循環30次；2)HBVc編碼基因的擴增及測序2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac I和Hind III酶切位點；2.2擴增目的基因向2.2.15細胞加入1ml/10cm2的Trizol，在25℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml Trizol的氯仿，劇烈震動15秒，再在24℃下放置2.3分鐘后，在7℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1ml Trizol的異丙醇，28℃下放置10分鐘，7℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；將2.2.15細胞的總RNA在-12℃保存于75％的乙醇中，臨用前在3℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、60℃下30s、72℃延伸6min分別循環38次，得到PCR產物；2.3克隆與測序將hEDN和HBVc的產物PCR經1.3％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleic Acid Purification Kit試劑盒，進行純化回收；將回收產物分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后純化回收，分別與用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鑒定；序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III雙酶切，將真核表達載體經BamH I和Hind III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli JM109感受態細胞；
用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；將復性后的產物經1.7％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經BamH I和Sac I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經BamH I和Sac I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；將p/LHBV以BamH I酶切，Klenow補平，Hind III酶切后，純化回收小片斷LHBV；融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；
將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。
本發明以乙肝病毒的DNA多聚酶末端蛋白結構域與核心蛋白為靶向分子，利用它們對乙肝病毒前基因組RNA(pgRNA)的特異識別與包裹，使與靶向分子融合表達的效應分子——核糖核酸酶特異地與乙肝病毒pgRNA結合并切割，抑制乙肝病毒的復制。實驗結果表明，其所表達的融合蛋白在體外可抑制乙肝病毒的復制，但對正常細胞無毒性。本發明所針對的靶點為乙肝病毒的pgRNA，通過在受乙肝病毒感染的細胞內對pgRNA的降解抑制乙肝病毒的復制；選用人嗜酸性粒細胞來源的神經毒素，作為靶向核糖核酸酶中的效應分子，已經實驗證實對正常細胞無毒性(6)。而且由于其是人源性的蛋白，在人體不會誘發免疫應答，)選用的靶向分子為乙肝病毒的DNA多聚酶末端蛋白結構域與核心蛋白，通過比較，可以篩選出靶向性更強的分子；除使效應分子與靶向分子直接連接外，我們還設計了通過一段柔性的(Gly4Ser)3連接區連接效應分子與靶向分子，使效應分子與靶向分子可各自折疊成其天然的構象，確保了所形成的融合蛋白抑制乙肝病毒復制的高特異性和高效性。
實驗表明，本發明構建的靶向核糖核酸酶在體外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46％-59％，可以明顯抑制乙肝病毒的復制。具體的給藥途徑和給藥方式可參照目前已有的基因治療或蛋白質藥物的方案。
權利要求
1.一種治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，其特征在于1)hEDN編碼基因的擴增及測序1.1根據hEDN基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH I和Sac I酶切位點；1.2擴增目的基因在5×106～10×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol，反復吹打，在15℃～30℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在15℃～30℃下放置2-3分鐘后在2℃--8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在15℃～30℃下放置10分鐘后在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次；2)HBVc編碼基因的擴增及測序2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac I和Hind III酶切位點；2.2擴增目的基因向2.2.15細胞加入1ml/10cm2的Trizol，在15℃～30℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml Trizol的氯仿，劇烈震動15秒，再在15-30℃下放置2-3分鐘后，在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1ml Trizol的異丙醇，15-30℃下放置10分鐘，2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；應用One Step RNA PCR kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次，得到PCR產物；2.3克隆與測序將hEDN和HBVc的產物PCR經1.0-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleic Acid Purification Kit試劑盒，進行純化回收；將回收產物分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后純化回收，分別與用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鑒定；序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III雙酶切，將真核表達載體經BamH I和Hind III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；將復性后的產物經1.5-2％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Bam I和Sac I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經BamH I和Sac I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；將p/LHBV以BamH I酶切，Klenow補平，Hind III酶切后，純化回收小片斷LHBV；融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。
2.根據權利要求1所述的治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，其特征在于所說的HL-60細胞的總RNA，是在5×106～10×106的HL-60細胞中加入1ml的Trizol提取HL-60的總RNA，將HL-60的總RNA在-5℃～-20℃下保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃-8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
3.根據權利要求1所述的治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，其特征在于所說的2.2.15細胞的總RNA，是在2.2.15細胞中加入1ml/10cm2的Trizol，提取2.2.15細胞的總RNA；將2.2.15細胞的總RNA在-5℃～-20℃保存于75％的乙醇中，臨用前在2℃--8℃、7500g的相對離心力下離心5分鐘，干燥后溶于無RNA酶的純水中。
全文摘要
本發明公開了一種治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝,它通過分子生物學的手段,構建人嗜酸性粒細胞來源的神經毒素hEDN與HBV多聚酶末端蛋白結構域DNAPTP或核心蛋白的融合蛋白,該融合蛋白即為構建的靶向核糖核酸酶,本融合蛋白可以采取基因治療或蛋白質藥物的方式,治療人的乙肝病毒的感染。實驗表明,本發明構建的靶向核糖核酸酶在體外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46%－59%,可以明顯抑制乙肝病毒的復制。具體的給藥途徑和給藥方式可參照目前已有的基因治療或蛋白質藥物的方案。
文檔編號A61K38/46GK1364898SQ0211443
公開日2002年8月21日 申請日期2002年2月5日 優先權日2002年2月5日
發明者劉軍, 薛采芳 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學