專利名稱：抑癌基因pinx1及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程和醫學領域。更具體地，本發明涉及利用抑癌基因PINX1基因及其編碼產物診斷和治療髓母細胞瘤等癌癥的方法，以及含有PINX1基因和/或蛋白的藥物組合物。
背景技術：
髓母細胞瘤是兒童期顱內最常見的惡性腫瘤，發病率占腦瘤總數的五分之一。它不僅惡性程度高且極具侵犯性，易發生脊髓轉移，患者長期存活率低，是嚴重人類生存的重要疾病。
細胞原癌基因的過度表達、抑癌基因的失活和DNA錯配修復基因的缺陷是各種腫瘤、癌癥發生和發展的重要原因。有所不同的是，眾多研究顯示原癌基因的活化、擴增和過表達在髓母細胞瘤中并不常見，而是多表現為以等位基因雜合性缺失(LOH)為特征的抑癌基因失活。
然而，迄今為止，尚沒有揭示髓母細胞瘤產生和發展的確切原因，也沒有揭示髓母細胞瘤與某種抑癌基因及其編碼蛋白存在直接的相關性。此外，本領域也缺乏早期診斷髓母細胞瘤的有效方法以及除手術和放療以外的治療髓母細胞瘤的有效手段。
PINX1又稱為PIN2相互作用蛋白1，它是一種已知蛋白，基本信息如下英文Homo sapiens PIN2-interacting protein 1 PINX1(hepatocellular carcinoma-related putative tumor suppressor)NCBIContigNT_008010mRNAHomo sapiens PIN2-interacting protein 1(PINX1)，mRNAgi|16975485|ref|NM_017884.1|[6975485]PINX1的DNA序列如SEQ ID NO1所示，ORF位于第90-1073位，編碼一個全長328個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)。PINX1的其他信息可以從Http//www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。
曾有研究表明，8號染色體短臂是許多癌癥和腫瘤組織中發生雜合性缺失的熱點區域，強烈提示此處存在著在各類腫瘤及癌癥中發揮重要作用的抑癌基因。同時有報道說，定位于8P23區域的PIN2蛋白相互作用蛋白1(PINX1)可能與細胞端粒酶活力和細胞凋亡有關。但人們對于PINX1的功能還了解甚少，不知其與髓母細胞瘤等癌癥的相關性。
因此，本領域迫切需要開發新的診斷和治療髓母細胞瘤的有效方法，以及相關的治療藥物，診斷技術和試劑。
發明內容
本發明的一個目的就是提供一種新的診斷(尤其是早期診斷)髓母細胞瘤等癌癥的方法及檢測試劑盒。
本發明的另一目的是提供一種新的治療癌癥，尤其是髓母細胞瘤的方法。
本發明的再一目的是提供一種治療癌癥，尤其是髓母細胞瘤的藥物組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種對個體的癌癥，尤其是髓母細胞瘤易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的PINX1基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的PINX1基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患癌癥，尤其是患髓母細胞瘤的可能性高于正常人群。
較佳地，被檢測的是PINX1的基因或轉錄本，并與正常PINX1核苷酸序列比較差異。更佳地，所述的差異選自SEQ ID NO1中第162位G162變為A162；SEQ ID NO1中第367位C367變為T367。
在本發明的第二方面，提供了一種治療癌癥，尤其是髓母細胞瘤的方法，它包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白。較佳地，PINX1蛋白被局部施用于腫瘤組織。
在本發明的第三方面，提供了一種PINX1蛋白在制備藥物組合物方面的的用途以及相應的藥物組合物，它含有安全有效量的人PINX1蛋白以及藥學上可接受的載體。較佳地，它是靶向藥物。
在本發明的第四方面，提供了一種檢測癌癥，尤其是髓母細胞瘤的試劑盒，它包括特異性擴增PINX1基因或轉錄本的引物。較佳地，它還含有與突變部位結合的探針。
在本發明的第五方面，提供了一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在選自下組的單核苷酸多態性G162→A162和C367→T367。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1顯示了PINX1基因中的序列變化，其中第162位G162變為A162；第367位C367變為T367。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次發現和證明了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)是一抑癌基因，與髓母細胞瘤等癌癥密切相關，它的改變將促進髓母細胞瘤和其它癌癥的產生和發展，是導致癌癥的直接原因之一。在此基礎上完成了本發明。
通過對32例髓母細胞瘤標本和部分對照血樣的研究，已發現多例體細胞PINX突變。進一步的研究表明，人PINX1與髓母細胞瘤密切相關，它的正常表達是抑制癌癥特別是髓母細胞瘤發生和發展，維持正常生理狀態的關鍵。根據蛋白同源性比較，人類PIN2相互作用蛋白1(PINX1)在物種間有較高保守性，作用重要。同時，表達研究顯示，PINX1基因在人體許多重要組織中表達。因此人類PIN2相互作用蛋白1(PINX1)的突變是導致人類癌癥特別是髓母細胞瘤的重要原因，根據此基因及其表達產物設計的藥物和診斷治療技術，可用于診斷和治療人類髓母細胞瘤等癌癥。
鑒于人類PINX1的變異是導致髓母細胞瘤的直接原因之一。因此，根據此基因及其表達產物設計的藥物和診斷治療技術，可用于診斷和治療人類的癌癥，尤其是髓母細胞瘤。
本發明的人PINX1核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據PINX1的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
將PINX1編碼序列插入合適的表達載體，再轉入宿主細胞，就可以分離出PINX1蛋白。
基于本發明的新發現，PINX1蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療PINX1蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如各種腫瘤，尤其是髓母細胞瘤)，和用于篩選促進PINX1蛋白功能的物質，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人PINX1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人PINX1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人PINX1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人PINX1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人PINX1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人PINX1蛋白的分子，也包括那些并不影響人PINX1蛋白功能的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人PINX1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人PINX1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發明的抗體包括能阻斷人PINX1蛋白功能的抗體以及不影響人PINX1蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人PINX1基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PINX1基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人PINX1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人PINX1蛋白。一種優選的抗PINX1抗體是不識別正常PINX1但識別突變PINX1(如SEQ ID NO4)的抗體，或者識別正常PINX1但不識別突變PINX1的抗體。利用該抗體對正常和異常PINX1蛋白的特異性差異，可以方便地進行蛋白質水平的髓母細胞瘤易感性檢測。
利用本發明PINX1蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與PINX1蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明PINX1蛋白可在施用(給藥)給患者。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、靜脈內、皮下、或局部給藥(包括瘤內給藥)。較佳地是局部給藥，例如瘤內給藥。
正常的PINX1多肽可直接用于疾病治療，例如，用于髓母細胞瘤方面的治療。在使用本發明PINX1蛋白時，還可同時使用其他治療腫瘤的藥劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明PINX1蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如針劑、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的PINX1蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
人PINX1蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于PINX1蛋白的無表達或異常/無活性的PINX1蛋白的表達所致的細胞增殖異常。構建攜帶PINX1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，etal.)。另外重組人PINX1基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織(如腫瘤組織)中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明還涉及定量和定位檢測人PINX1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測檢測樣品中是否存在PINX1蛋白的方法是利用PINX1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與PINX1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在PINX1蛋白。
PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于PINX1蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，PINX1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測PINX1蛋白的表達與否或在疾病狀態下PINX1蛋白的異常表達。如PINX1 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷PINX1蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達和基因診斷。用PINX1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測PINX1蛋白的轉錄產物。
本發明還提供了一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性(SNP)。具體SNP例子包括G162→A162C367→T367。
檢測PINX1基因的突變也可用于診斷髓母細胞瘤。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。PINX1蛋白突變的形式包括與正常野生型PINX1 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1確定PINX1突變是導致髓母細胞瘤的直接原因1.1對象收集32例髓母細胞瘤的石蠟包埋標本及部分患者外周血。
1.2病理檢查對患者病理組織石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。所取組織片中80％以上為癌細胞。
1.3個體鑒定利用6對微衛星多態標記對患者病理組織和外周血進行個體鑒定。患者病理組織和其外周血的基因分型完全一致。
1.4候選基因篩選及檢測經研究，將在8號染色體短臂上PIN2相互作用蛋白1(PINX1)定為一個重要的候選基因。該基因在腦等各種重要組織中表達。
用DNA抽提試劑盒(Qigen公司)從石蠟包埋的病理組織中抽提基因組DNA，將其作為模板。同時設計并合成了九對引物。這些引物覆蓋了該基因所有外顯子，內含子與外顯子的邊際，部分操作子的序列
利用這九對引物采用PCR擴增、直接測序的方法，對髓母細胞瘤病理標本進行PINX1基因突變檢測。
經過對32例髓母細胞瘤病理組織和部分外周血DNA的PINX1基因測序，發現其中PINX1-2，PINX1-4兩對引物檢測到病理組織中PINX1基因與正常不同。全自動測序儀檢測突變結果如下cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc 60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgaca tgtctatgct ggctgaacgt cggcggaagc 120agaagtgggc tgtggatcct cagaacactg cctggagtaa tGacgattcc aagtttggcc 180agcggatgct agagaagatg gggtggtcta aaggaaaggg tttaggggct caggagcacg 240gagccacaga tcatattaaa gttcaagtga aaaataacca cctgggactc ggagctacca 300tcaataatga agacaactgg attgcccatc aggatgattt taaccagctt ctggccgaac 360tgaacaCttg ccatgggcag gaaaccacag attcctcgga caagaaggaa aagaaatctt 420ttagccttga ggaaaagtcc aaaatctcca aaaaccgtgt tcactatatg aaattcacaa 480aagggaagga tctgtcatct cggagcaaaa cagatcttga ctgcattttt gggaaaagac 540agagtaagaa gactcccgag ggcgatgcca gtccctccac tccagaggag aacgaaacca 600cgacaaccag cgccttcacc atccaggagt actttgccaa gcggatggca gcactgaaga 660acaagcccca ggttccagtt ccagggtctg acatttctga gacgcaggtg gaacgtaaaa 720gggggaagaa aataaataaa gaggccacag gtaaagatgt ggaaagttac ctccagccta 780aggccaagag gcacacggag ggaaagcccg agagggccga ggcccaggag cgagtggcca 840agaagaagag cgcgccagca gaagagcagc tcagaggccc ctgctgggac cagagttcca 900aggcctctgc tcaggatgca ggggaccatg tgcagccgcc tgagggccgg gacttcaccc 960tgaagcccaa aaagaggaga gggaagaaaa agctgcaaaa accagtagag atagcagagg 1020acgctacact agaagaaacg ctagtgaaaa agaagaagaa gaaagattcc aaatgaatcc 1080ttcccagccg gggccttccg accactcagc tgtcagggca ctgcgggggc agacacctct 1140ggcctgaagt cacagcagag ttcaccccag agcgcctggg cgcatcttgt ggcatgccca 1200tgggctgccg agtcctgccc tctcgccaca tttcccccaa gttacattcc caggaggacc 1260tttttaatgt tctcaatcgt ggctctcaga cacaaataaa tttttttgta aactctgaaa 1320aaaaaaaaaa aa 1332(SEQ ID NO1)如上所示，正常人序列“…aatGacg…”在1例髓母細胞瘤病理組織中純合變化為“…aatAacg…”，這一變化直接導致了其編碼產物SEQ ID NO2中第25位由天冬氨酸(D)變為天冬酰胺(N)(外顯子2，mRNA編碼序列中第162位的G162→A162，見圖1A)。
正常人序列“…acaCttg…”在1例髓母細胞瘤病理組織中純合改變為“…acaTttg…”，這一變化直接導致了其編碼產物SEQ ID NO2中第93位由蘇氨酸(T)變為異亮氨酸(I)(外顯子4，mRNA編碼序列中第367位的C367→T367，見圖1B)。
含有G162→A162和C367→T367突變(SNP)的PINX1序列示于SEQ IDNO3，其編碼的突變蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。應指出，這些序列代表了含有G162→A162和/或C367→T367突變，以及含有Asp25→Asn25和/或Thr93→Ile93突變的序列。
此外，為了驗證突變位點對髓母細胞瘤發生的特異性，隨機檢查了300個沒有親源關系的人在所述位點的情況，沒有發現有任何突變。這說明所述位點的突變并非人群中的多態性所致，而是髓母細胞瘤的特異性突變位點。因此表明了PINX1與人類的髓母細胞瘤的發生密切相關，此基因及其編碼產物可對人類的髓母細胞瘤起重要作用。
1.5 PINX1基因的等位基因雜合性缺失(LOH)利用位于8P22位點的微衛星多態標記D8S1130對發生G162→A162突變的患者病理組織和外周血進行基因分型，發現等位基因雜合性缺失現象。此外，該患者病理標本PINX1基因外顯子3的測序結果進一步證明了LOH的存在(見圖1C)。
討論G162→A162的體細胞純合性突變，使得PINX1蛋白在25位由天冬氨酸(D)變為天冬酰胺(N)。在對三百個正常人的該序列比較中，均未發現此變化。結構預測表明該區域是PINX1蛋白的磷酸化位點，天冬氨酸到天冬酰胺的變化可能影響蛋白二級結構的正常形成。此外，經過與其它物種同源比較，該突變處的氨基酸有高度保守性，且位于關鍵的G-PATH邊緣區域，提示25位的天冬氨酸是維持蛋白功能的基礎。此外，該對樣本8P22位點處微衛星多態標記D8S1130的基因分型顯示在病理組織中存在等位基因的雜合性缺失(LOH)。病理樣品PINX1基因外顯子3的測序結果也進一步證實了LOH的出現。
PINX1 mRNA上C367→T367的純合突變，直接導致了其編碼產物93位點由蘇氨酸(T)變為異亮氨酸(I)。該位點在小鼠中呈現保守性，在三百個正常人PINX1序列比較中也未出現相同變化，提示93位的蘇氨酸對維持蛋白的功能起重要的作用。
總之，本發明首次公開了PIN2相互作用蛋白1(PINX1)與人類癌癥特別是髓母細胞瘤的發生和發展密切相關，此基因及其編碼產物對人類的癌癥特別是髓母細胞瘤起重要作用。
此外，8號染色體短臂是許多癌癥和腫瘤組織中發生雜合性缺失(LOH)的熱點區域。這強烈提示此處存在著在各類腫瘤及癌癥中發揮重要作用的抑癌基因。PINX1正是定位于該區域內。已有的研究表明，該基因與細胞端粒酶活力和細胞凋亡有關，暗示了其與癌癥、腫瘤發生和發展的相關性。
本發明首次揭示了PINX1與髓母細胞瘤密切相關，它的改變將促進髓母細胞瘤的產生和發展。由于PINX1基因在心臟、腦、腎、肺、胃、肝、胰腺、前列腺、卵巢、皮膚、子宮、食道、肌肉等眾多人體重要組織中均有較高表達，廣泛的表達范圍從另一個側面證實了該基因的重要性，并暗示PINX1的功能缺失是導致除髓母細胞瘤以外的多種癌癥、腫瘤的直接原因之一。這些癌癥包括(但并不限于)胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、膀胱癌等。
實施例3髓母細胞瘤診斷檢測試劑盒的制備制備一試劑盒，它含有
抽取待檢測病人的血液3ml或腫瘤組織20-30mg，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液或組織中提取DNA。將髓母細胞瘤檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。使用檢測試劑盒所提供的PRC產物純化盒對PCR產物進行純化。將純化的產物進行測序反應后直接進行測序。觀測所得到的擴增序列是否存在點突變G162→A162和/或C367→T367。
實施例4藥物組合物的制備將PINX1所編碼的正常蛋白與常規的醫用緩沖液溶液一起配制成針劑，其中PINX1蛋白含量為0.5％。該針劑可補充病灶處的PINX1編碼蛋白，使病人的生理狀況得到改善，從而達到治療的目的。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
參考文獻1.Liao C，Zhao M，Song H，Uchida K，Yokoyama KK，Li T.(2000).Identification ofthe gene for a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequencyloss of heterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellularcarcinoma.Hepatology 32721-727.
2.Wang JC，Radford DM，Holt MS，Helms C，Goate A，Brandt W，Parik M，PhillipsNJ，DeSchryver K，Schuh ME，Fair KL，Ritter JH，Marshall P，Donis-KellerH.(1999).Sequence-ready contig for the 1.4-cM ductal carcinoma in situ loss ofheterozygosity region on chromosome 8p22-p23.Genomics 601-11.
3.Yin XL，Pang JC，Ng HK.(2002).Identification of a region of homozygousdeletion on 8p22-8p23.1 in medulloblastoma.Oncogene 211461-1468.
4.Zhou XZ，Lu KP.(2001).The Pin2/TRFl-interacting protein PinX1 is a potenttelomerase inhibitor.Cell 107347-359.
序列表<110>中國科學院上海生物工程研究中心<120>抑癌基因PINX1及其應用<130>023583<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1332<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(90)..(1073)<223><400>1cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc 60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgac atg tct atg ctg gct gaa cgt cgg 113Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg1 5cgg aag cag aag tgg gct gtg gat cct cag aac act gcc tgg agt aat 161Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn10 15 20gac gat tcc aag ttt ggc cag cgg atg cta gag aag atg ggg tgg tct 209Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser25 30 35 40aaa gga aag ggt tta ggg gct cag gag cac gga gcc aca gat cat att 257Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile45 50 55aaa gtt caa gtg aaa aat aac cac ctg gga ctc gga gct acc atc aat 305Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn60 65 70aat gaa gac aac tgg att gcc cat cag gat gat ttt aac cag ctt ctg 353Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu75 80 85gcc gaa ctg aac act tgc cat ggg cag gaa acc aca gat tcc tcg gac 401Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp90 95 100aag aag gaa aag aaa tct ttt agc ctt gag gaa aag tcc aaa atc tcc 449Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser105 110 115 120aaa aac cgt gtt cac tat atg aaa ttc aca aaa ggg aag gat ctg tca 497Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser125 130 135tct cgg agc aaa aca gat ctt gac tgc att ttt ggg aaa aga cag agt 545Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser140 145 150aag aag act ccc gag ggc gat gcc agt ccc tcc act cca gag gag aac 593Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn155 160 165gaa acc acg aca acc agc gcc ttc acc atc cag gag tac ttt gcc aag 641Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys170 175 180cgg atg gca gca ctg aag aac aag ccc cag gtt cca gtt cca ggg tct 689Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser185 190 195 200gac att tct gag acg cag gtg gaa cgt aaa agg ggg aag aaa ata aat 737Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn205 210 215aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg gaa agt tac ctc cag cct aag gcc 785Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala220 225 230aag agg cac acg gag gga aag ccc gag agg gcc gag gcc cag gag cga 833Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg235 240 245gtg gcc aag aag aag agc gcg cca gca gaa gag cag ctc aga ggc ccc 881Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro250 255 260tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc tct gct cag gat gca ggg gac cat 929Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His265 270 275 280gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac ttc acc ctg aag ccc aaa aag agg 977Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg285 290 295aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa cca gta gag ata gca gag gac gct 1025Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala300 305 310aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa aag aag aag aag aaa gat tcc aaa 1073Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys315 320 325tgaatccttc ccagccgggg ccttccgacc actcagctgt cagggcactg cgggggcaga 1133cacctctggc ctgaagtcac agcagagttc accccagagc gcctgggcgc atcttgtggc 1193atgcccatgg gctgccgagt cctgccctct cgccacattt cccccaagtt acattcccag 1253gaggaccttt ttaatgttct caatcgtggc tctcagacac aaataaattt ttttgtaaac 1313tctgaaaaaa aaaaaaaaa1332<210>2<21l>328<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1 5 10 15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg20 25 30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln35 40 45Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His50 55 60Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65 70 75 80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly85 90 95Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser100 105 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys115 120 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp130 135 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145 150 155 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe165 170 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys180 185 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu195 200 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val210 215 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225 230 235 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro245 250 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala260 265 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp275 280 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys290 295 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305 310 315 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys325<210>3<211>1332<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(90)..(1073)<223><400>3cgcacgtcct gattctcctg gagtctccag cccgcccagt ggccgcagtc acccaggtcc 60agaggcggcg gtatcacagg ctctccgac atg tct atg ctg gct gaa cgt cgg 113Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg1 5cgg aag cag aag tgg gct gtg gat cct cag aac act gcc tgg agt aat 161Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp Pro Gln Asn Thr Ala Trp Set Asn10 15 20aac gat tcc aag ttt ggc cag cgg atg cta gag aag atg ggg tgg tct 209Asn Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser25 30 35 40aaa gga aag ggt tta ggg gct cag gag cac gga gcc aca gat cat att 257Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile45 50 55aaa gtt caa gtg aaa aat aac cac ctg gga crc gga gct acc atc aat 305Lys Val Gln Val Lys Asn Ash His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn60 65 70aat gaa gac aac tgg att gcc cat cag gat gat ttt aac cag ctt ctg 353Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu75 80 85gcc gaa ctg aac att tgc cat ggg cag gaa acc aca gat tcc tcg gac 401Ala Glu Leu Asn Ile Cys His Gly Gln Glu Thr Thr Asp Set Ser Asp90 95 100aag aag gaa aag aaa tct ttt agc ctt gag gaa aag tcc aaa arc tcc 449Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser105 110 115 120aaa aac cgt gtt cac tat atg aaa ttc aca aaa ggg aag gat ctg tca 497Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser125 130 135tct cgg agc aaa aca gat ctt gac tgc att ttt ggg aaa aga cag agt 545Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser140 145 150aag aag act ccc gag ggc gat gcc agt ccc tcc act cca gag gag aac 593Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn155 160 165gaa acc acg aca acc agc gcc ttc acc atc cag gag tac ttt gcc aag 641Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys170 175 180cgg atg gca gca ctg aag aac aag ccc cag gtt cca gtt cca ggg tct 689Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser185 190 195 200gac att tct gag acg cag gtg gaa cgt aaa agg ggg aag aaa ata aat 737Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn205 210 215aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg gaa agt tac ctc cag cct aag gcc 785Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala220 225 230aag agg cac acg gag gga aag ccc gag agg gcc gag gcc cag gag cga 833Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg235 240 245gtg gcc aag aag aag agc gcg cca gca gaa gag cag ctc aga ggc ccc 881Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro250 255 260tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc tct gct cag gat gca ggg gac cat 929Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His265 270 275 280gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac ttc acc ctg aag ccc aaa aag agg 977Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg285 290 295aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa cca gta gag ata gca gag gac gct 1025Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala300 305 310aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa aag aag aag aag aaa gat tcc aaa 1073Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys315 320 325tgaatccttc ccagccgggg ccttccgacc actcagctgt cagggcactg cgggggcaga 1133cacctctggc ctgaagtcac agcagagttc accccagagc gcctgggcgc atcttgtggc 1193atgcccatgg gctgccgagt cctgccctct cgccacattt cccccaagtt acattcccag 1253gaggaccttt ttaatgttct caatcgtggc tctcagacac aaataaattt ttttgtaaac 1313tctgaaaaaa aaaaaaaaa1332<210>4<211>328<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1 5 10 15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asn Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg20 25 30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln35 40 45Glu His Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His50 55 60Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65 70 75 80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Ile Cys His Gly85 90 95Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser100 105 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys115 120 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp130 135 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145 150 155 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe165 170 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys180 185 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu195 200 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Ile Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val210 215 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225 230 235 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro245 250 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala260 265 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp275 280 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys290 295 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305 310 315 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys325<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5cctctagcca atgagcgaat 20<210>6<211>19<212>DNA<213>引物<400>6cgagcaggac aatcagagc19<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7tgccacatta tgagggaaca 20<210>8<211>22<212>DNA<213>引物<400>8aacaattttt gatttgggat ca 22<210>9<211>22<212>DNA<213>引物<400>9tgagtgctaa ttgatgcaga gg 22<210>10<211>20<212>DNA<213>引物<400>10acagtgccat gcattcaaag 20<210>11<211>20<212>DNA<213>引物<400>11ccaggaagcc cctttttaat 20<210>12<211>22<212>DNA<213>引物<400>12ttttaaatgc tcccaacaca aa 22<210>13<211>20<212>DNA<213>引物<400>13gcctggcctg atccatagta 20<210>14<211>20<212>DNA<213>引物<400>14cagtcaatgc gaagactcca 20<210>15<211>23<212>DNA<213>引物<400>15tgaaaaagtg ggtagaaagt cag 23<210>16<211>21<212>DNA<213>引物<400>16caaaagccaa acaccagaaa a21<210>17<211>19<212>DNA<213>引物<400>17ccgaccagaa gggagagag 19<210>18<211>20<212>DNA<213>引物<400>18gctcttcttc ttggccactc 20<210>19<211>20<212>DNA<213>引物<400>19tctgagagcc acgattgaga 20<210>20<211>21<212>DNA<213>引物<400>20gccacaggta aagatgtgga a 21<210>21<211>21<212>DNA<213>引物<400>21tgaatccaag ctattgcctc t 21<210>22<211>20<212>DNA<213>引物<400>22agggaagaaa aagctgcaaa 20
權利要求
1.一種對個體的癌癥易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的PINX1基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的PINX1基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患癌癥的可能性高于正常人群。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌癥是髓母細胞瘤，且檢測的是PINX1的基因或轉錄本，并與正常PINX1核苷酸序列比較差異。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中第162位G162變為A162；和SEQ ID NO1中第367位C367變為T367。
4.一種治療癌癥的方法，其特征在于，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常PINX1蛋白，或者將正常的PINX1基因靶向導入腫瘤組織，使其在腫瘤細胞中表達。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的癌癥是髓母細胞瘤，且所述的PINX1蛋白被施用于腫瘤組織。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的PINX1蛋白和藥學上可接受的載體。
7.一種檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增PINX1基因或轉錄本的引物。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的癌癥是髓母細胞瘤，且所述試劑盒還含有與突變部位結合的探針。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自SEQ ID NO1中第162位G162變為A162；SEQ ID NO1中第367位C367變為T367。
10.一種檢測人PINX1基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PINX1基因的SEQ ID NO1所示序列的第162和367位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在選自下組的單核苷酸多態性G162→A162和C367→T367。
全文摘要
本發明公開了一種診斷髓母細胞瘤等癌癥的方法，它包括檢測個體的PINX1基因、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患髓母細胞瘤等癌癥的可能性大于正常人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，以及治療癌癥尤其是髓母細胞瘤的方法和藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1465704SQ02112398
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月5日 優先權日2002年7月5日
發明者孔祥銀, 李靖, 胡蘭靛 申請人:中國科學院上海生命科學研究院