專利名稱：一種能識別腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體及制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種能識別腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體及其制備和應用。
1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出均一性的單克隆抗體。雜交瘤技術的誕生被認為是抗體工程發展的第一次質的飛躍，也是現代生物技術發展的一個里程碑。利用這種技術制備的單克隆抗體在疾病診斷、治療和科學研究中得到廣泛的應用。其產生的雜交瘤細胞具有雙重特性既能無限生長，又能產生B淋巴細胞的抗體。單克隆抗體應用十分廣泛，被人們譽為對付癌癥的“生物導彈”。如采用抗癌細胞的單克隆抗體與放射性同位素、化學藥物或毒素相結合，注入體內同癌細胞結合，能在原位殺死癌細胞，而不損傷其它正常細胞。
21世紀，生物技術將與信息技術一道為全球經濟發展提供強大的動力，“成為全社會最重要并可能改變未來工業和經濟格局的技術”。抗體工程技術隨著現代生物技術的發展而不斷完善，并且是生物技術產業化的主力軍，尤其在生物技術制藥領域占有重要地位。至2000年底為止，在美國藥品市場上生物技術藥物有76種，其中抗體藥物有15種；正處于臨床研究階段的369種生物技術藥物中，抗體藥物有70種。我國自1986年實施“國家高技術研究與發展(863)計劃”以來，生物技術的研究和開發都取得了非常大的進展，而抗體工程項目一直得到“863”計劃的重點支持，已經具備了一定的科研基礎和出現了產業化的良好發展勢頭。
本發明所要解決的技術問題是提供一種能識別腫瘤細胞表面抗原的鼠源性單克隆抗體，該抗體對腫瘤抗原的選擇性強，抑瘤效果顯著。
本發明公開的能識別腫瘤細胞表面抗原的鼠源性單克隆抗體是一種以人或動物腫瘤組織提取獲取的總蛋白為抗原，同時用培養后的腫瘤細胞鋪板，對得到的抗體進行篩選而得的抗體。
本發明所要解決的另一技術問題是公開上述單克隆抗體的制備方法。
本發明公開的單克隆抗體的制備方法包括下列步驟一、單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備(1)取患腫瘤的人或動物的腫瘤組織，用高速組織破碎機切碎后離心，獲取總蛋白；將腫瘤細胞破碎后離心，獲取細胞總蛋白。總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時可加強免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細胞懸液，與骨髓瘤細胞按一定的比例(細胞數量比0.5-1.5∶10)混合，并在融合劑(PEG1450)作用下進行細胞融合，產生雜交瘤細胞。然后細胞培養至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內用完全培養液培養腫瘤細胞，每孔細胞數以8,000-10,000。CO2孵箱培養24～48小時，待細胞長成單層。棄去培養液，向各孔內加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時后，-20℃貯存備用。
(5)從-20℃取出細胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時。用PBS-Tween洗三次，并吸干液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS-Tween洗三次。加入已標記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應。
(7)測96孔板上各孔內的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標準。
(8)重復步驟4-7，繼續篩選至陽性率為100％，復核一次后，擴大培養。
二、單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細胞數1,000,000-5,000,000)的細胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時間，然后取小鼠腹水；在細胞培養瓶中培養細胞直至數量達到10,000,000后，取其上清液。
2)將腹水或上清過Protein G柱，進行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，3000-5000rpm離心至少10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。
b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態，控制流速在1-2ml/min。
c)樣品上柱并收集最后1-2ml溶液(用以檢測是否達到飽和)。
d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。
e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。
f)取50-100ul的管中溶液，測定O.D.280和O.D.260，計算出其中單克隆抗體蛋白的濃度。
本發明所述的人或動物腫瘤組織、腫瘤細胞包括肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實體瘤的組織、細胞。
本發明單克隆抗體的制備使用了腫瘤組織或腫瘤細胞中的總蛋白作為抗原進行免疫，使得產生的單克隆抗體可識別腫瘤細胞相關蛋白。此外，本發明利用培養后的腫瘤細胞對單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行篩選，使得篩選出的細胞株產生的單克隆抗體針對于腫瘤細胞表面蛋白。所以，本發明獲得的單克隆抗體和腫瘤具有密切的相關性，經過嚴格的鑒定方法后，可作為治療相關腫瘤的臨床藥物的原料。
本發明的單克隆抗體蛋白一般經過以下三種方法的鑒定，可認為其具有用于腫瘤臨床治療的潛在價值a)單克隆抗體蛋白與腫瘤組織抗原進行WESTERN實驗。
又稱免疫印跡法，通過電泳鑒定單克隆抗體蛋白的純度以及交叉反應的程度。
b)免疫組織化學實驗。
利用免疫學中的抗原抗體反應，借助可見的標記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常見的免疫組織化學方法有熒光免疫和酶免疫組化技術、金標免疫組化技術和免疫電鏡，該技術特點是對細胞涂片、印片、組織切片進行處理和染色鏡檢。
c)動物抑瘤實驗。
利用接種相應腫瘤細胞并已致瘤的裸鼠作為動物模型，研究不同濃度的單克隆抗體動物體內對腫瘤抑制的效果，按下式計算抑瘤率。 本發明所要解決的再一技術問題是公開上述單克隆抗體作為制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發明公開的單克隆抗體可直接作為治療各種相應腫瘤的靶向藥物，如肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實體癌。
本發明公開的單克隆抗體可以用來分子制備人源化抗體。
本發明公開的單克隆抗體或人源化抗體也可與放射性核素、藥物或毒素形成單抗偶聯物，作為更有效的抗腫瘤藥物。
本發明公開的單克隆抗體或人源化抗體與放射性核素、藥物或毒素形成的單抗偶聯物，可通過口服、注射、滴注等方式使單抗藥物與發生腫瘤的部位接觸，單抗藥物與腫瘤細胞表面抗原結合，阻礙或消除腫瘤細胞的繁殖，起到治療腫瘤的作用。
本發明公開的單克隆抗體對腫瘤細胞針對性強，不損傷其他正常細胞，在開發抗腫瘤靶向藥物前景廣闊，具有極大的社會效益和經濟效益。
其中1為蛋白Marker，2為正常肝組織的總蛋白，3為肝癌組織的總蛋白圖2肝癌組織的免疫組化結果圖3正常組織的免疫組化結果圖4單克隆抗體蛋白與食道癌組織及相應的正常食道組織總蛋白的Western實驗結果。
其中1為蛋白Marker，2為正常食道組織的總蛋白，3為食道癌組織的總蛋白圖5食道癌組織的免疫組化結果圖6正常組織的免疫組化結果實施例1 可識別肝癌細胞表面抗原的單克隆抗體的制備、純化和鑒定一、可識別肝癌細胞表面抗原的單克隆抗體的制備(1)取人的肝癌組織，用高速組織破碎機切碎后離心，獲取總蛋白；總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時可加強免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細胞懸液，與骨髓瘤細胞按細胞數量比1∶10的比例混合，并在融合劑(PEG 1450)作用下進行細胞融合，產生雜交瘤細胞。然后細胞培養至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內用完全培養液培養腫瘤細胞，每孔細胞數為10,000。CO2孵箱培養24～48小時，待細胞長成單層。棄去培養液，向各孔內加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時后，-20℃貯存備用。
(5)從-20℃取出細胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時。用PBS-Tween洗三次，并吸于液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS-Tween洗三次。加入已標記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應。
(7)測96孔板上各孔內的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標準。
(8)重復步驟4-7一次，陽性率達到100％，復核一次。
二、可識別肝癌細胞表面抗原的單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細胞數1,000,000-5,000,000)的細胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時間，然后取小鼠腹水；在細胞培養瓶中培養細胞直至數量達到10,000,000以上，取其上清液。2)腹水或上清過Protein G柱，進行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，4000rpm離心10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態，控制流速在1-2ml/min。c)樣品上柱并收集最后2ml溶液(用以檢測是否達到飽和)。d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，測定其O.D.280為2.41，按公式計算單克隆抗體蛋白的濃度為1.67mg/ml。
三、可識別肝癌細胞表面抗原的單克隆抗體的鑒定a)WESTERN鑒定。
取人的肝癌組織和相應的正常肝組織，分別用高速組織破碎機切碎后離心，獲取總蛋白。用單克隆抗體蛋白與上述總蛋白進行免疫印跡實驗，證實僅在分子量為6.5kd處出現一條帶。說明用肝癌組織總蛋白為抗原制備的單克隆抗體能與肝癌組織中某一特定蛋白有特異性結合能力(見
圖1)。
b)免疫組織化學實驗。
按常規方法進行免疫組化實驗，結果(圖2、圖3)表明，該抗體可結合在肝癌組織的多個部位，而不會與正常肝組織的蛋白相結合。
c)小鼠體內抑瘤實驗。
無菌操作，取人體肝癌組織，以生理鹽水制成勻漿，接種于裸鼠腋窩皮下，接種次日將小鼠隨機分為3組陰性對照組，腹腔注射等體積生理鹽水組；陽性對照組，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治療組，腹腔注射單克隆抗體50mg/m2、。隔日給藥1次，共6次。第14天處死動物，稱瘤重，計算抑瘤率。
實驗結果表明，單克隆抗體的抑瘤率為47.1％。
實施例2 可識別食道癌細胞表面抗原的單克隆抗體的制備、純化和鑒定一、可識別食道癌細胞表面抗原的單克隆抗體的制備(1)取人的食道癌細胞，破碎后離心，獲取細胞總蛋白；總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。
(2)將抗原注入小鼠腹腔進行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時可加強免疫。短程免疫的步驟為(a)向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(b)約一周后，向小鼠腹腔注射50μg的抗原(此抗原已和福氏完全佐劑等體積混合)；(c)約一周后，向小鼠腹腔注射5μg抗原；(d)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原；(e)一天后，向小鼠尾靜脈注射5μg抗原。
(3)末次免疫后第3天取小鼠脾制成細胞懸液，與骨髓瘤細胞按細胞數量比1∶10的比例混合，并在融合劑(PEG 1450)作用下進行細胞融合，產生雜交瘤細胞。然后細胞培養至少一周，取其上清。
(4)在96孔板內用完全培養液培養腫瘤細胞，每孔細胞數為10,000。CO2孵箱培養24～48小時，待細胞長成單層。棄去培養液，向各孔內加0.05％戊二醛(PBS為溶劑)100μl，室溫固定15分鐘。PBS洗三次后，每孔加封閉液100μl(1％BSA+0.1M甘氨酸)室溫封閉1小時后，-20℃貯存備用。
(5)從-20℃取出細胞板，于37℃融化后，棄去原來的封閉液，重新加封閉液至滿孔，37℃放置1小時。用PBS-Tween洗三次，并吸干液體。
(6)向96孔板中加入雜交瘤細胞的上清(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS-Tween洗三次。加入已標記HRP的羊抗鼠單抗(每孔100ul)，37℃放置1小時后，用PBS洗五遍。加已混合好的TMB(每孔100ul)，37℃放置15分鐘后，加入2M H2SO4(每孔50ul)終止反應。
(7)測96孔板上各孔內的O.D.450。選擇該值大于1.0者為陽性克隆的標準。
(8)重復步驟4-7二次，陽性率為100％，復核一次。
二、可識別食道癌細胞表面抗原的單克隆抗體蛋白的純化1)用一定量(細胞數1,000,000-5,000,000)的細胞注射到Balb/C小鼠(腹腔注射0.5ml石蠟一周后)，等待一周左右的時間，然后取小鼠腹水；在細胞培養瓶中培養細胞直至數量達到10,000,000以上，取其上清液。3)腹水或上清過Protein G柱，進行親和層析，其步驟如下a)取腹水1ml，4000rpm離心10分鐘，取上清用PBS稀釋至10倍體積，再用0.45um的微孔濾膜過濾；細胞上清直接用0.45um的微孔濾膜過濾。b)用10倍體積的PBS過柱，使柱處于中性狀態，控制流速在1-2ml/min。c)樣品上柱并收集最后2ml溶液(用以檢測是否達到飽和)。d)用10倍體積的PBS過柱洗雜蛋白。e)用3-4ml甘氨酸洗脫并收集約1ml/管。f)取50-100ul的管中溶液，測定其O.D.280為2.78，按公式計算單克隆抗體蛋白的濃度為1.93mg/ml。三、可識別食道癌細胞表面抗原的單克隆抗體的鑒定a)WESTERN鑒定取人的食道癌組織和相應的正常食道組織，分別用高速組織破碎機切碎后離心，獲取總蛋白。用單克隆抗體蛋白與上述總蛋白進行免疫印跡實驗，證實僅在分子量20.5kd處出現一條帶。說明用食道癌細胞總蛋白為抗原制備的單克隆抗體能與食道癌組織中某一特定蛋白有特異性結合能力(見圖4)。b)免疫組織化學實驗按常規方法進行免疫組化實驗，免疫組織化學實驗結果(如圖5、圖6所示)表明該抗體可結合在食道癌組織的多個部位，而不會結合正常食道組織中的蛋白。c)小鼠體內抑瘤實驗無菌操作，取人體食道癌組織，以生理鹽水制成勻漿，接種于裸鼠腋窩皮下，接種次日將小鼠隨機分為3組陰性對照組，腹腔注射等體積生理鹽水組；陽性對照組，腹腔注射阿霉素20mg/m2；治療組，腹腔注射單克隆抗體60mg/m2、。隔日給藥1次，共6次。第14天處死動物，稱瘤重，計算抑瘤率。
抗食道癌單克隆抗體的小鼠體內抑瘤實驗結果(如下表所示)
實驗結果表明，抗食道癌單克隆抗體的抑瘤率為45.3％。
權利要求
1.一種能識別腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體，其特征在于該抗體是一種以人或動物腫瘤組織提取的總蛋白為抗原免疫小鼠，同時用培養后的腫瘤細胞鋪板，對得到的抗體進行篩選而得的抗體。
2.一種如權利要求1所述的能識別腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體的制備方法，其特征在于該抗體雜交瘤細胞株的制備方法包括下列步驟a)取患腫瘤的人或動物的腫瘤組織，用高速組織破碎機切碎后離心，獲取總蛋白；將腫瘤細胞破碎后離心，獲取細胞總蛋白。總蛋白作為制備單克隆抗體的抗原。b)將抗原注入小鼠腹腔進行免疫，免疫方式為短程免疫，必要時可加強免疫；c)取小鼠的脾臟制成細胞懸液，與骨髓瘤細胞按一定的比例混合，并在融合劑作用下進行細胞融合，產生雜交瘤細胞；進行細胞培養數日，獲得細胞上清；d)用腫瘤細胞鋪在96孔板底部進行培養，使其長成單層；將雜交瘤細胞的上清加入96孔板的各孔，用此96孔板對雜交瘤細胞進行篩選直至陽性率為100％，獲得具有穩定分泌單克隆抗體能力的雜交瘤細胞系；e)將上法制備的雜交瘤細胞在細胞培養瓶中進行培養，取細胞數為1,000,000-5,000,000的細胞注射到Balb/C小鼠，等待一周左右后取小鼠腹水；將上法制備的雜交瘤細胞在細胞培養瓶中進行培養直至數量達到10,000,000以上，取細胞上清；f)用Protein G的親和層析柱對小鼠腹水或細胞上清進行純化，得到純的單克隆抗體蛋白；g)測定單克隆抗體蛋白的O.D.280和O.D.260，計算出單克隆抗體蛋白的濃度。
3.一種如權利要求1所述的單克隆抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應用。
4.一種如權利要求3所述的單克隆抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于可以以該單克隆抗體為模式分子制備人源化抗體。
5.一種如權利要求3或4所述的單克隆抗體或人源化抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于該單克隆抗體或人源化抗體可單獨作為抗腫瘤藥物，也可與放射性核素、藥物或毒素形成單抗偶聯物作為抗腫瘤藥物。
6.一種如權利要求3或4所述的單克隆抗體或人源化抗體在作為制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于其中所述的腫瘤為肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、食道癌及其他實體瘤。
全文摘要
本發明涉及一種能識別體內腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體及制備方法及其在制藥領域的用途。本發明公開的單克隆抗體是一種以人或動物腫瘤組織經獲取的總蛋白為抗原進行免疫，同時利用培養后的腫瘤細胞對得到的單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行篩選，使得篩選出的細胞株產生體針對于腫瘤細胞表面蛋白的單克隆抗體。本發明還公開了該抗體的制備方法。本發明公開的單克隆抗體對腫瘤細胞針對性強，不損傷其他正常細胞，在開發抗腫瘤的靶向藥物方面前景廣闊，具有極大的社會效益和經濟效益。
文檔編號A61K39/395GK1443777SQ02110978
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優先權日2002年3月8日
發明者胡賡熙 申請人:胡賡熙