幽門螺桿菌抑制劑的制作方法

專利名稱：幽門螺桿菌抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及衍生自猴菇菌的分離物，更具體地，本發明涉及衍生自猴菇菌的、可用作幽門螺桿菌抑制劑的分離物。
背景技術：
自1982年Marshall和Warren從胃炎患者中分離出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)之后，世界各國的科學家對幽門螺桿菌的生物學特性、致病機理、診斷和治療進行了廣泛的研究，現已確認幽門螺桿菌是慢性胃炎的主要致病因子，與消化性潰瘍的發病密切相關，WHO和國際癌研究組織已將其列為第一類致癌因子。
臨床上，應用單一抗生素很難根除幽門螺桿菌的感染，因此采用了不同的藥物組合，比如以鉍劑為基礎的二聯和三聯療法。雖然這種組合療法的效果明顯，但其應用仍然遇到了一些困難，主要不表現為副作用大；耐藥性增加；腸道內有益菌的數量和種類減少，菌群失衡。因此，尋找治療簡單、安全無副作用、治愈率高的藥物是醫藥研究者孜孜以求的目標，幽門螺桿菌感染的治療也趨于多元化。
猴菇菌(Hericium erinaceum，He)也稱為猴菇菌，可用來治療慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌等疾病已得到廣泛的認可，上海市中藥制藥三廠的猴菇菌片已在臨床應用多年。雖然眾多的報道認為猴菇菌中含有多糖、生物堿、萜類等生物活性成分，但這些成分對幽門螺桿菌是否有抑制作用尚未見報道。
因此，本領域迫切需要開發衍生自猴菇菌的、對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。

發明內容
本發明人經過多年深入研究，對猴菇菌中抗幽門螺桿菌的成分進行了提取分離，獲得了有效抑制幽門螺桿菌生長的分離物，并研制成幽門螺桿菌抑制劑。在此基礎上完成了本發明。
在本發明的第一方面，提供了一種分離物，它包括猴菇菌子實體堿醇提取物經薄層層析分離到的Rf值在0.15-0.6之間的組分。
在一優選例中，所述的分離物選自下組物質(1)猴菇菌子實體堿醇提取物中經硅膠柱層析分離得到的四環三萜酸FrIII-3，Rf值為0.50±0.05；(2)FrIII-4和5，Rf值為0.4±0.05和0.45±0.05(3)FrIII-6和7，Rf值分別為0.30±0.05，0.20±0.05；或它們的混合物。
在另一優選例中，所述的分離物是猴菇菌子實體堿醇提取物中經硅膠柱層析分離得到的四環三萜酸FrIII-3，其分子式為C34H52O7。
在另一優選例中，所述的分離物的結構式為 在本發明的第二方面，提供了一種獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法，它包括步驟(a)將猴菇菌子實體和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小時；(b)過濾得到濾渣；(c)向濾渣加入堿性乙醇，回流提取5-50小時；(d)過濾得到濾液；(e)濃縮濾液；(f)用酸酸化濾液至pH為2-4；(g)放置5-100小時，過濾獲得沉淀。
在一優選例中，堿性乙醇的pH為8-10，體積為濾渣的5-20倍或更多，較佳地為濾渣的10-15倍。
在另一優選例中，在步驟(c)中回流條件是回流提取3-8次，每次2-6小時。
在另一優選例中，步驟(f)中，用2-8N鹽酸酸化至pH 2.5-3.5。
在另一優選例中，所述的方法還包括步驟(h)對沉淀進行硅膠柱層析，從而獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
在本發明的第三方面，提供了一種幽門螺桿菌抑制劑，它含有本發明上述的分離物。


圖1是本發明獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的流程圖。
圖2是檢測CagA基因的電泳圖。其中各泳道分別是1-陰性對照；2-陽性對照；3-分子量標準；4-滬東97；5-P44；6-12908。
圖3顯示了本發明的分離物對幽門螺桿菌的抑制作用。
具體實施例方式
如本文所用，Rf值指各成分在薄層層析板上斑點的位置，稱作比移值。其計算公式如下Rf＝展開后，起始線至斑點中心的距離/展開后，起始線至溶劑前沿的距離可用于本發明原料沒有特別限制，只要是猴菇菌即可。較佳地為固體培養的猴菇菌子實體。
在本發明的分離方法(參見圖1)中，首先將猴菇菌子實體(宜為粉碎形式)與一定量的水混合。水的體積沒有特別限制，通常為猴菇菌子實體體積的5-20倍或更多，較佳地為10-15倍。
然后，將水的混合物在90-100℃(較佳地95-100℃)回流提取。回流時間特別特別限制，通常為5小時以上，較佳地為5-100小時。可以分段進行，例如回流提取3-8次，每次2-6小時(更佳地3-5小時)。
回流處理過的混合物，經過濾后得到濾渣。
接著，向濾渣加入堿性乙醇，進行回流提取。堿性乙醇的pH為8-10，濃度越高越好，例如99.9％，體積為濾渣的5-20倍或更多，較佳地為10-15倍。回流時間特別特別限制，通常為5小時以上，較佳地為5-100小時。可以分段進行，例如回流提取3-8次，每次2-6小時(更佳地3-5小時)。
對回流處理過的混合物進行過濾，得到濾液。再用常規方法，例如真空濃縮濾液。通常至少濃縮為原體積的1/2以上。
接著，用酸酸化濾液。其中，采用的酸沒有特別限制，可以是鹽酸，硫酸等無機酸或乙酸等有機酸，較佳地是鹽酸，其濃度通常2-8N。通常將pH調節為2-4，較佳地pH 2.5-3.5即可。
最后，放置一段時間(通常為5小時以上，例如5-100小時)，對產生的沉淀進行過濾即可獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
在另一優選例中，還可獲得的分離物進一步地進行硅膠柱層析，獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的級分FrIII3-7。
本發明的分離物可用作幽門螺桿菌抑制劑，抑制幽門螺桿菌的生長。因此，可作為藥物活性成分用于藥物組合物，例如治療胃病的藥物組合物。此外，還可作為添加劑用于食品或保健品。在本發明的抑制劑中，可以添加各種常規的載體、賦形劑、稀釋劑、添加劑、香料、防腐劑等物質，只要它們不干擾本發明分離物的抑制幽門螺桿菌的活性。此外，還可與治療胃病等消化性潰瘍或改善腸胃的物質聯用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的提取和純化以固體培養的猴菇菌子實體為原料，按圖1所示的流程進行提取。其中，粉碎后的子實體和10倍水的混合物在是100℃下回流3小時，共5次；濾渣與12倍堿性乙醇溶液(pH10)的混合物回流3小時，共5次；濾渣與10倍酸性乙醇(pH3-5)溶液的混合物回流3小時，共5次。
制得組分FrI、FrII、FrIII和FrIV。各組分的提取率見表1。
表1 100g猴菇菌子實體或菌絲體中各組分的提取率

實施例2對組分FrIII的進一步分離A.薄層層析(TLC)及結果分別以下述系統為展開劑，以硫酸∶甲醇(1∶1)為顯色劑，進行薄層層析。
系統1—正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)系統2—正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚(1∶1∶1)系統3—氯仿∶乙醚∶乙酸乙酯(9∶1∶1)系統4—甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)結果表明，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑時效果最好。在猴菇菌子實體乙醇提取物中有10個左右的斑點。
B.硅膠柱層析條件及結果硅膠200-300目洗脫劑∶氯仿∶甲醇＝9∶1，8∶2，1∶1展開劑∶甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5流速快速分離，400ml/15分鐘每管體積15ml上樣量22g(FrIII)。
經一次硅膠柱層析后得到FrIII-1～2混合物(氯仿∶甲醇＝9∶1)1.15g，FrIII-3～5混合物(氯仿∶甲醇＝8∶2)2.24g，FrIII-6～7混合物(氯仿∶甲醇＝1∶1)12.5g。將FrIII-3～5混合物再次硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯體系，洗脫程序正己烷100％20ml→90％20ml→80％20ml→70％20ml→60％20ml→50％20ml；減壓層析法，保持流速約1.2ml/min；每5ml分管收集，顯色劑同上)，得到FrIII-3(80％正己烷部分，1.09g)和FrIII-4～5的混合物0.86g。
實施例3對各組分或級分的定性鑒定(1)FrI和FrII利用蒽酮硫酸顯色的方法。上述沉淀取少量，溶于去離子水中，取1ml溶液，加入4ml蒽酮硫酸試劑(1g蒽酮溶于500ml的濃硫酸中)，煮沸10分鐘，呈藍綠色，證明含有多糖。
(2)FrIIIA.利用醋酐-硫酸反應(Liebermann-Burchard反應)取實施例1中的濃縮液各1ml蒸干，加醋酐1ml溶解，后滴加濃硫酸2滴，呈黃色→紫紅色→墨綠色轉變，說明含有皂甙和三萜類。
B.利用TLC按實施例2中所述的方法進行TLC，結果表明，子實體中FrIII組份中有5個斑點的Rf值在0.15～0.60之間，另外有2個斑點的Rf值在0.60～0.70之間。在實驗中觀察到FrIII-3～5(Rf＝0.56～0.40)先顯亮紅色，然后變為紫色；FrIII-6～7(Rf＝0.40～0.17)則由橙色變為紫色，這表明這些級份中都可能含有萜酸，且具不飽和特性，否則呈黃色并逐漸褪色。
FrIII-3，FrIII-4，FrIII-5，FrIII-6，FrIII-7的Rf值分別為0.50±0.05；0.4±0.05，0.45±0.05，0.30±0.05，0.20±0.05。
C.光譜分析(i)紫外光譜FrIII-3的最大吸收(λmax)在254nm；FrIII-4～5的最大吸收(λmax)在246nm、FrIII-6～7在223nm左右。
(ii)紅外光譜FrIII-3～7在3000～3500cm-1的有強吸收峰表明含有羥基；2400cm-1處的弱吸收峰表明是三萜酸；在1740cm-1～1760cm-1沒有出現五元環酮的特征吸收，表明C15位無羰基。1200～1400cm-1的兩個吸收峰(1305cm-1，1400cm-1)是多氫菲環的特征吸收，是四環三萜最為有力的證明。
(iii)核磁共振對FrIII-3和FrIII-4～5進行了13CNMR分析，數據如表2和3所示表2 FrIII-3的13CNMR數據

表3FrIII-4和FrIII-5的13CNMR采集到的主要數據

D.質譜分析經ESI-MS檢測到FrIII-3的分子離子峰(m/z)比較明顯在572(M+)，570(M+-2H)，535(M+-2H2O)。因此推測FrIII-3的分子式為C34H52O7，其可能的分子結構如下 (3)FrIV利用1％三氯化鋁顯色反應。取組分FrIV溶液1ml，滴加1％三氯化鋁溶液，呈黃色反應，證明含有黃酮類物質。
實施例4各組分和級分的抑菌效果檢測(一)材料實驗材料1、培養基營養瓊脂，改良布氏瓊脂，巧克力瓊脂，蛋黃瓊脂2、新鮮脫纖維馬血、羊血3、混合抗生素萬古霉素(Vancumycin)，多粘菌素B(Polymyxin B)，黃胺增效劑(TMP)4、實驗菌株幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)三株，編號為12908(常用的標準株)，滬東97，F44(臨床分離菌株)(二)、結果與討論1、幽門螺桿菌培養采用不同培養基，不同培養方式和不同厭氣條件進行培養。
表4不同培養基對幽門螺桿菌生長的影響

-不生長。+，++，+++生長能力依次遞增。下同表5不同培養方式對幽門螺桿菌生長的影響

由表4、表5可以看出在布氏瓊脂、巧克力瓊脂上，以及在三氣(5％O2，10％CO2，85％N2)條件下幽門螺桿菌生長良好；這說明幽門螺桿菌是一種專性微需氧菌，在大氣中和絕對厭氧環境中均不能生長。
2、幽門螺桿菌鑒定按常規方法進行包括形態特征、生化反應和PCR分型的鑒定。結果如下表6幽門螺桿菌的鑒定

+陽性；-陰性雖然幽門螺桿菌對臨床微生物實驗中常用于鑒定腸道細菌的大多數經典生化實驗不起反應，但幽門螺桿菌均能產生尿素酶(Urease)、觸酶(Catalase)和氧化酶(Oxidase)。因此以它們作為幽門螺桿菌生化鑒定依據，但這些酶的測定對幽門螺桿菌的分型毫無幫助。而研究認為在幽門螺桿菌菌株中，含有毒素相關蛋白基因(Cytotoxin associated gene A，CagA)的菌株(I型菌)具有較強的毒性，與十二指腸潰瘍及胃癌的發生密切相關。因此對三株幽門螺桿菌的CagA基因進行了PCR檢測，有一株(滬東97)具有CagA基因，其電泳見圖2。然后，主要以滬東97為實驗菌，對猴菇菌提取物進行了抑菌作用實驗。
3、猴菇菌提取物對幽門螺桿菌的抑制作用用不同濃度或稀釋度的各組份，通過常規的濾紙擴散法測抑菌圈大小和倍比稀釋培養法進行藥敏實驗。
表7猴菇菌提取物對幽門螺桿菌的抑制作用

+，有活性；-，無活性。
提取物濃度FrI，FrII，FrIII，FrIV各為10mg/ml。
由實驗結果可以看出，FrIII對幽門螺桿菌具有抑制作用。測其最低抑菌濃度(MIC)，實驗結果見表8和圖3。
表8FrIII組分的MIC

*1∶1的濃度為10mg/ml。
由表8中可以看出，FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7的最低抑菌濃度分別為1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml和1.25mg/ml，而FrIII-1～2則無活性。
圖3為FrIII對幽門螺桿菌(滬東97)的抑菌圈，直徑為11mm。
此外，FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7對12908和P44有同樣的抑制作用。
實施例5幽門螺桿菌抑制劑的制備1、提取猴菇菌子實體6kg，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時，收集濾液，濃縮成浸膏0.25kg(FrI)，備用。濾渣加入240L堿性無水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小時，收集濾液，經真空濃縮到1.5L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到63g沉淀(FrIII)，備用。
2、配制產品配方淀粉 64％FrI(多糖)10％FrIII5％大豆蛋白 12％橘粉 9％將上述原料按比例進行干粉混合，混勻后，在60℃進行干燥3小時，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時，即為成品。
實施例6幽門螺桿菌抑制劑的制備1、提取猴菇菌子實體1kg，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時，收集濾液，濃縮成浸膏45g(FrI)，備用。濾渣加入25L堿性無水乙醇(pH10)回流提取，共5次，每次3～5小時，收集濾液，經真空濃縮到0.25L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到12g沉淀(FrIII)，備用。
2、配制產品配方淀粉 64％FrI(多糖) 15％
FrIII8％大豆蛋白 8％橘粉 5％將上述原料按比例進行干粉混合，混勻后，在60℃進行干燥3小時，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時，即為成品。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種分離物，其特征在于，它包括猴菇菌子實體堿醇提取物經薄層層析分離到的Rf值在0.15-0.6之間的組分。
2.如權利要求1所述的分離物，其特征在于，它選自下組物質(1)猴菇菌子實體堿醇提取物中經硅膠柱層析分離得到的四環三萜酸FrIII-3，Rf值為0.50±0.05；(2)FrIII-4和5，Rf值為0.4±0.05和0.45±0.05(3)FrIII-6和7，Rf值分別為0.30±0.05，0.20±0.05；或它們的混合物。
3.如權利要求2所述的分離物，其特征在于，它是猴菇菌子實體堿醇提取物中經硅膠柱層析分離得到的四環三萜酸FrIII-3，其分子式為C34H52O7。
4.如權利要求3所述的分離物，其特征在于，其結構式為
5.一種獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將猴菇菌子實體和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小時；(b)過濾得到濾渣；(c)向濾渣加入堿性乙醇，回流提取5-50小時；(d)過濾得到濾液；(e)濃縮濾液；(f)用酸酸化濾液至pH為2-4；(g)放置5-100小時，過濾獲得沉淀。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，堿性乙醇的pH為8-10，體積為濾渣的5-20倍。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中回流條件是回流提取3-8次，每次2-6小時。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(f)中，用2-8N鹽酸酸化至pH2.5-3.5。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，還包括步驟(h)對沉淀進行硅膠柱層析，從而獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
10.一種幽門螺桿菌抑制劑，其特征在于，它含有權利要求1所述的分離物。
全文摘要
本發明提供了一種衍生自猴菇菌的、可用作幽門螺桿菌抑制劑的分離物，它包括猴菇菌子實體堿醇提取物中經薄層層析分離到的Rf值在0.15－0.6之間的組分。本發明還提供了獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法，以及含所述分離物的幽門螺桿菌抑制劑。本發明的分離物和抑制劑可有效地抑制幽門螺桿菌的生長。
文檔編號A61K31/575GK1440978SQ0211090
公開日2003年9月10日 申請日期2002年2月27日 優先權日2002年2月27日
發明者李平作, 謝松, 趙國屏, 陳常慶 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心