一種使用cd137結合激動劑增強免疫應答的方法

專利名稱：一種使用cd137結合激動劑增強免疫應答的方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫調節方法，具體地說，本發明涉及一種調節T細胞免疫應答的方法。
背景技術：
哺乳動物T淋巴細胞能夠識別結合在抗原遞呈細胞(APC)表面的主要組織相容性復合體(MHC)分子上的抗原肽，其中的抗原肽可由APC中的蛋白抗原降解產生。T細胞與APC的相互作用以及隨后的T細胞應答反應由于T細胞表面受體、可溶性介質和APC表面的配基之間的相互作用而產生不同的變化。

發明內容
本申請的發明人發現，使用一種鼠CD137特異性激動抗體和一種由腫瘤表達的多肽的片段處理攜帶弱免疫原性腫瘤的小鼠，可導致腫瘤消退。使用同樣的CD137抗體和體外由腫瘤細胞初次激活的自體樹突細胞處理攜帶次級弱免疫原性腫瘤的小鼠，也可使腫瘤消退。
因此，本發明的目的是提供一種增強哺乳動物免疫應答的方法，給哺乳動物患病個體(如癌癥病人)施加(1)一種激發免疫原性刺激物，如腫瘤相關肽-抗原決定簇；(2)CD137結合激動劑，如CD137特異抗體。
本發明的另一個目的是提供一種在體外增強T細胞應答的方法，將包含T細胞的一組細胞與(1)一種激發免疫原性刺激物，如感染微生物的肽-抗原決定簇；(2)一種CD137配基共同培養。
本發明還提供了一種在體內增強患病個體免疫應答的方法，給患病個體施加(1)一種激發免疫原性刺激物；(2)一種CD137結合激動劑。
本發明的方法針對的對象可以是人，如癌癥患者。本發明的方法所增強的應答可以是T細胞應答，如CD8+T細胞或CD4+T細胞的應答。
本發明還提供了一種在體外活化T細胞的方法，包括
(1)準備一組包含T細胞的細胞；(2)將細胞與激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑共同培養。
本發明的方法中，CD137結合激動劑可以是(1)結合CD137的抗體；(2)CD137的天然配基(CD137L)或其功能片段。激發免疫原性刺激物可以是(1)一種腫瘤相關抗原(TAA)；(2)一條TAA的功能性片段，可以是一條多肽。其中TAA包括但不限于由白血病、淋巴組織瘤、神經系統瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、腦頸癌、胃腸癌、肝癌、胰腺癌、生殖系統癌、前列腺癌、腎癌、骨癌或血管細胞產生的分子。激發免疫原性刺激物還可以是具有結合了肽-抗原決定簇的主要組織相容性復合體(MHC)的樹突細胞。其中的肽-抗原決定簇是TAA的一個片段或感染微生物產生的多肽的一個片段；其中的MHC分子可以是MHCI分子或MHCII分子。激發免疫原性刺激物也可以是雜種細胞，如腫瘤細胞與樹突細胞的融合產物。激發免疫原性刺激物還可以是腫瘤細胞、腫瘤細胞溶解物、TAA、TAA的肽-抗原決定簇或能結合到由腫瘤細胞表達的蛋白的肽-抗原決定簇上的熱休克蛋白。激發免疫原性刺激物還可以是與腫瘤細胞、腫瘤細胞溶解產物、TAA、TAA的肽-抗原決定簇或能結合到由腫瘤細胞表達的蛋白的肽-抗原決定簇上的熱休克蛋白一起培養的樹突細胞。當激發免疫原性刺激物是腫瘤細胞、APC或雜種細胞時，該細胞可以轉染或轉化入編碼細胞因子或生長因子的核酸，如粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
激發免疫原性刺激物還可以是一種由感染微生物產生的分子，例如病毒、細菌、真菌或原生動物的寄生物產生的分子。
這里所述的“增強免疫應答”是通過同時施加激發免疫原性刺激物和CD137結合激物劑獲得的。在不給予CD137結合激動劑的情況下，激發免疫原性刺激物將不激發免疫應答，或激發比CD137結合激動劑存在條件下明顯降低的應答。
這里所述的“CD137結合激動劑”是一種通過結合到靶細胞(如T細胞)的CD137分子上，從而使靶細胞對于激發免疫原性刺激物的應答增強的物質。
這里所述的“腫瘤相關抗原(TAA)的功能片段”是一種TAA的片段，比全長的TAA鏈短，在CD137結合激動劑存在或不存在的情況下，具有全長TAA至少10％的活化免疫應答能力。這里的“全長TAA”是指成熟TAA，即去掉了天然信號序列的多肽。
這里所述的“肽-抗原決定簇”是一種多肽的片段，能夠結合到MHC分子上，與MHC分子形成復合物，被T細胞的抗原特異受體(TCR)識別。這里的MHC分子可以是MHC I或MHC II分子。
本發明中“多肽”和“蛋白”都是指肽連接鏈。
本發明基于發現使用鼠CD137特異性激動抗體和由腫瘤表達的多肽處理攜帶弱免疫原性腫瘤的小鼠，可導致腫瘤消退，使用同樣的CD137抗體和體外由腫瘤細胞初次激活的自體樹突細胞處理攜帶次級弱免疫原性腫瘤的小鼠，也導致腫瘤消退。這些發現表明，使用結合CD137分子的激動劑和腫瘤或感染微生物特異性的激發免疫原性刺激物處理患有癌癥或感染疾病的哺乳動物患病個體，可以使免疫應答增強，這種免疫應答增強可以用于預防和治療相應的疾病。
本發明提供的活化哺乳動物免疫應答的方法中，給免疫系統細胞施加激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑，激發免疫原性刺激物的施加可以在CD137結合激動劑之前、之中或之后。
本發明的方法所涉及的應答可以是任何免疫應答，特別是T細胞應答。由于B細胞的抗體反應依賴于活化的CD4+T細胞的輔助，CD4+T細胞應答的增強可以間接地增強B細胞的抗體反應。同樣地，免疫系統其它一些細胞的活性也是由T細胞調節的，如單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、天然殺傷細胞(NK)。本發明的方法對于所有這些細胞型的免疫應答都是有效的。
這里所述的“激發免疫原性刺激物”是一種借助表達于T細胞表面的抗原特異性受體(TCR)，遞送到T細胞的刺激物，這種刺激物以TCR特異性抗原的形式存在。這些抗原通常是蛋白，也可以是糖類、脂類、核酸或由兩種或多種分子型組成的雜種分子，如糖蛋白、脂蛋白。激發免疫原性刺激物也可以由其它激動TCR配基提供，如TCR元件的特異性抗體(如TCRα鏈或β鏈可變區)或TCR/CD3復合體特異性抗體。本發明的方法所指的激發免疫原性刺激物不包括抗原非特異性刺激物，如細胞因子、生長因子，共刺激分子或粘附分子，這些刺激物可以在本發明的方法中使用，但不構成本發明所要求的激發免疫性刺激物。對于激發免疫原性刺激物有用的抗原包括異種抗原，如抗原遞呈細胞(APC)上的異種抗原，APC可以是樹突細胞(DC)、巨噬細胞、單核細胞或B細胞等。本發明中所用的DC是交錯樹突細胞，而不包括非濾泡樹突細胞，從血液、骨髓、脾或淋巴結等組織中分離DC的方法是本技術領域公知的技術。作為激發免疫原性刺激物同樣有效的還有多肽抗原和肽-抗原決定簇。未加工的多肽經APC處理后成為肽-抗原決定簇，與APC表面的MHC形成分子復合物，可被遞呈到相應的T細胞。作為激發免疫原性刺激物有用的還包括可作為抗原來源的腫瘤細胞或感染微生物感染細胞的溶解產物。預先用抗原多肽、多肽的肽-抗原決定簇或腫瘤、感染細胞處理(如共培養)過的APC也可以作為激發免疫原性刺激物，進行共培養之前，腫瘤或感染細胞最好先經過輻照或加熱處理。此外，APC，尤其是DC，也以被總RNA、mRNA或分離的TAA編碼RNA初次激活。
作為激發免疫原性刺激物的抗原可以以細胞的形式提供，如腫瘤細胞或感染細胞；激發免疫原性刺激物也可以以融合了APC與腫瘤細胞或感染細胞的雜種細胞的形式提供[參見Gong et al.(2000)Proc.Ntal.Acad.Sci.USA97(6)2716-2718]。融合細胞技術是本技術領域公知的技術，例如，聚乙烯二醇、電融合等。在雜種細胞中，腫瘤或感染細胞部分為激發免疫原性細胞(IC)。作為免疫原性刺激物的細胞或細胞雜種可以不經處理，也可以先進行代解抑制處理，如輻照或絲裂霉素處理。不論是其本身作為激發免疫原性刺激物，還是用于制備雜種細胞，這里使用的腫瘤細胞或感染細胞優選的是與T細胞來源于相同供體的細胞。如果來源的供體是不同的，優選與T細胞有相同的MHC單型的細胞。同樣，用于產生雜種細胞的APC優選與T細胞來源于相同供體的APC。用于制備雜種細胞的APC或IC，優選與T細胞具有相同供體或是MHC相容性的細胞。
作為激發免疫原性刺激物有用的還有一些熱休克蛋白，它們能結合到抗原(如腫瘤相關抗原或感染微生物產生的抗原)的肽-抗原決定簇上，熱休克蛋白和抗原肽形成的復合物能促進APC對于抗原肽的攝取。這里所說的熱休克蛋白包括但不限于糖蛋白96(gp96)、熱休克蛋白(hsp)90、hsp70、hsp110和葡萄糖調節蛋白70(grp70)。激發免疫原性刺激物可以包括一個或多個從腫瘤細胞或感染細胞中分離的熱休克蛋白。
激發免疫原性刺激物可以從許多感染微生物中獲得，比如細菌、真菌、酵母、病毒、寄生物。相應的微生物蛋白包括但限于大腸桿菌的熱不穩定腸毒素B亞基、Y.enterocolitica熱休克蛋白60和M.tuberculosis熱休克蛋白hsp60及hsp70、B.Burgdorferi外表面蛋白GP63等。
激發免疫原性劑刺激物還可以是許多類型的腫瘤細胞、腫瘤細胞初次激活的APC、雜種細胞、TAA、TAA的肽-抗原決定簇和TAA或TAA的肽抗原決定簇初次激活的APC。這里的“TAA”指由腫瘤細胞表達的分子，具有與普通細胞表達的相應分子不同的性質，或者在腫瘤細胞中比在普通細胞中具有更高水平的表達。因而，TAA可能是與普通細胞表達的相應分子不同或相同的分子，本方法優選的是不能在普通細胞中表達的TAA。當一個TAA在腫瘤細胞和普通細胞中均可表達時，要求其在腫瘤細胞中的表達至少2倍高于普通細胞中的表達。這些腫瘤包括但不限于血液癌、神經系統癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、骨細胞癌、胰癌、前列腺癌、陰莖癌、骨癌和血管癌。TAA包括但不限于癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、MAGE(黑素瘤抗原)-4，6和12、粘蛋白(MVC)、酪氨酸酶、MART(黑素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列、PRAME(黑素瘤抗原)、MUM-1-B(黑素瘤泛素基因突變產物)、GAGE(黑素瘤抗原)2-10、C-ERB2(Her Z/neu)、EBNA(Eptein-Barr病毒核抗原)1-6、gp75、人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6和E7、P53、LRP Bcl-2和Ki-67。
為了測定CD137結合激動劑的有效性，給實驗動物施加致病原，如腫瘤細胞、感染微生物或感染了致病原的細胞，其致病原本身不會產生本發明的方法所指的激發免疫原性刺激物。此外，在給攜帶致病原的實驗動物施加4-1BB結合激動劑的過程中，其致病原本身不會產生本發明的方法所指的激發免疫原性刺激物。
CD137結合激動劑可以是CD137特異性抗體，不僅包括完整的抗體分子，還包括抗原結合片段，如Fab、F(ab’)2、FV和單鏈FV片段，還包括嵌合抗體。這些抗體可以是單克隆抗體(mAb)或多克隆抗體。CD137結合激動劑也可以是天然的CD137配基(CD137L)或CD137功能片段。CD137功能片段是指短于全長的、成熟的CD137的片段，具有全長的、成熟的CD137至少10％的增強T細胞應答能力。檢測和比較特定分子對T細胞應答的增強能力的方法是本領域技術人員公知的。
CD137結合激動劑可以加入到包含T細胞的介質中(如血液或培養基)，CD137結合激動劑也可由鄰近T細胞的細胞分泌或表面表達，如遞呈異種抗原或結合到其表面MHC分子上的肽-抗原決定簇的APC，或腫瘤細胞、感染細胞和它們的雜種細胞。分泌或表面表達CD137結合激動劑的細胞可以但不必須與遞呈異種抗原或結合到MHC分子的肽-抗原決定簇到T細胞的細胞相同。本發明的方法主要是提供一種外源的CD137結合劑，因此本發明特指的CD137結合激動物是由細胞如APC、腫瘤細胞、感染細胞或雜種細胞分泌或表達的，不包括由這些細胞天然表達的CD137(如CD137L)結合激動劑。
如果活化作用發生在體外，CD137結合劑能夠附著到培養容器的底部。
在本發明的方法中，CD137結合激動劑一般結合到T細胞表面的CD137上。但是，由于CD137還能在T細胞以外的細胞中表達，如天然殺傷細胞(NK)和單核細胞，CD137結合激動劑還可以結合到這些非T細胞上，并且促進其分泌輔助細胞因子或使其表面表達共刺激分子或粘附分子，從而使T細胞或T細胞輔助的其它細胞的應答增強。
氨基酸短序列可以作為信號肽，將蛋白(如激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑)輸送至特定的細胞部位。本技術領域技術人員都知道輸送到ER上的蛋白的氨基末端含有疏水信號肽，KFERQ短肽可將多肽輸送到溶酶體，還有一些序列可將多肽輸送到核內體。上述信號肽都可以用于輸送激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑到相應的細胞部位。其它有用的信號肽還包括但不限于來源于HIVtat轉導區域、成纖維生長因子、HSV-1結構蛋白VP22的信號肽。編碼包含定位信號的多肽的DNA可以通過聚合酶鏈反應(PCR)或其它遺傳工程技術、合成技術獲得。
激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑的氨基酸序列可以與其天然序列相同，其中的一些氨基酸也可以由其它保守氨基酸替代。可相互替換的氨基酸，比如甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天門冬酰氨和谷氨酰氨；天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸；苯氨酸和酪氨酸。
在體內條件下，本發明的方法所使用的多肽還必須經過適當的處理，在其氨基末端和/或羧基末端加上阻滯劑，使多肽在體內更加穩定，避免在被相應細胞攝取之前其肽末端被蛋白酶降解。可以使用的阻滯劑包括但不限于可以結合到多肽氨端和/或羧端的相關或不相關的肽序列。可以采用化學方法，在肽合成過程中施加阻滯劑，也可以采用本領域技術人員公知的重組DNA技術施加阻滯劑。在進入體內之前，肽化合物可以先共價地或非共價地耦連到藥物載體蛋白上。
本發明的方法還可以使用根據所需多肽的氨基酸序列設計的肽聚擬態化合物。肽聚擬態化合物是合成的具有與相應的肽相同的三維構象(肽結構域)的化合物。其所包含的肽結構域使肽聚擬態化合物具有活化免疫應答(發揮激活免疫原性刺激物的功能)和增強免疫應答(發揮CD137結合激動劑的功能)能力。肽聚擬態化合物在體內還具有其它用途，如增強細胞滲透性和延長生物半衰期。
典型的肽聚擬態化合物的骨架可以是部分或完全非肽的，但是含有與其模擬的肽相同的側鏈基團。在構建抗蛋白酶的肽聚擬態化合物時，可采用一些化學鍵，如酯鍵、硫醚鍵、硫酰胺鍵和亞甲基酮鍵來取代肽鍵，這是本技術領域公知的技術。
可作為激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑的分子可以采用本技術領域公知的許多技術獲得，它們也可以由天然狀態純化而來。短肽(低于100個氨基酸)和其它非蛋白分子可以通過本技術領域公知的化學方法方便地合成。此外，多肽和肽都可以通過體外DNA重組技術和體內轉基因技術獲得。構建包含相應編碼序列和相應轉錄/翻譯調節因子的表達載體的方法也是本技術領域公知的。
前述的轉錄/調節因子包括但不限于誘導和非誘導啟動子、增強子、操縱子和其它本技術領域公知的啟動或調節基因。這些調節因子包括但不限于SV40腺病毒的早期或晚期啟動子，lac系統、trp系統、TAC系統、TRC系統，噬菌體A的主要操縱子和啟動子區域，fd外殼蛋白的控制區域，3-磷酸甘油酸鹽激酶啟動子，磷酸酶啟動子、酵母α-交配因子啟動子。
本發明所使用的表達系統包括但不限于(1)生物，如細菌。可以建立包含有編碼激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體，將它轉化入微生物中。
(2)酵母。可以建立包含有編碼激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸的重組酵母表達載體，將它轉化入酵母。
(3)昆蟲細胞系統。可以建立包含有編碼激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸的重組病毒表達載體，將它感染昆蟲細胞系統。
(4)植物細胞系統。可以建立包含有編碼激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸的重組病毒表達載體，將它感染植物細胞；或者可以建立包含有編碼激發免疫原性刺物或CD137結合激動劑的核酸的重組質粒表達載體，將它轉化入植物細胞。
(5)哺乳動物細胞系統，如CDS，CHO，BHK，VERO，Hela等。可以建立包含來源于哺乳動物細胞基因組或哺乳動物病毒的啟動子、并且包含有編碼激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸的重組病毒表達載體，將它轉化入哺乳動物細胞。
其它可用的宿主細胞還有直接來源于哺乳動物的初級或次細胞，以及由質粒載體轉染或由病毒載體感染的初級或次級細胞。
轉染或轉導了本發明所述的表達載體的細胞可以用于在體外大規模或小規模生產激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑，采用的方法是本技術領域公知的，還包括在適當條件下培養細胞，以獲得最多量的多肽，并且從細胞或培養介質中分離這些多肽。
在本發明的方法中，經常需要進行激發免疫原性刺激物和/或CD137結合激動劑的純化。純化生物微分子的方法是本技術領域公知的技術，純化程度可以通過適當的方法檢測，如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法。
通過本發明的方法增強應答的T細胞可以是CD4+T細胞或CD8+T細胞。本發明包括但不限于(1)有特定表型(如CD4+T或CD8+T)或功能的T細胞；(2)將T細胞限定為特定類型的MHC分子。絕大多數具有細胞毒活性的T細胞是CD8+T細胞，能識別結合到MHCI分子上的肽-抗原決定簇，也有能識別結合到MHCII分子上的抗原肽的CD4+CTL，還有極少能識別結合到MHCI分子上的肽的CD4+CTL以及能識別結合到MHCII分子上的抗原肽的CD8+CTL；大多數具有輔助和/或免疫分化活性的T細胞能識別結合到MHCII上的抗原肽，也發現MHCII分子限制的CD8+T細胞具有該活性的；大多數免疫抑制T細胞是CD8+T細胞，也有CD4+T細胞具有該活性的。本發明的方法包括增強所有這些T細胞的應答，特別是MHC I限制的CTL和MHC II限制的CD4+輔助/免疫分化T細胞的應答，更特別是MHCII限制的CTL應答。
本發明的方法可以在體外或體內進行。
(1)體外方法本發明提供的體外方法適用于免疫機制的基本科學研究、活化的T細胞的制備。可以從患病個體中提取T細胞，在體外加入CD137結合激動劑檢測其對抗原免疫能力。
本發明提供的體外方法，可將從哺乳動物體內提取的由T細胞組成或包含T細胞的淋巴細胞與激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑共同培養。供給淋巴細胞的動物可以預先施加相關抗原，也可以不必經過抗原處理。細胞培養液中可以加入一種或多種細胞因子或生長因子，包括但不限于白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15，γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
(2)體內方法。
本發明的方法對于在體內增強免疫應答是普遍適用的，可以用于預防或治療。然而，本發明的方法不限于具有預防或治療療效，其它作用包括但不限于(1)生產大量的活化T細胞，以進行T細胞活性的基礎科學研究；(2)增強哺乳動物(如兔、山羊、綿羊、馬)的T細胞應答，進而產生輔助活性。
本發明的體內方法可用于預防或治療感染性疾病或癌。對于易患癌癥的個體(如超過50歲的男性易患前列腺部、吸煙者易患肺癌、多痣者易患黑素癌)也可以起到預防的作用。此外，本發明的方法對于預防和/或治療細胞內微生物疾病，本方法是特別有用的。其中微生物疾病包括但不限于病毒(如流感病毒或HIV)、細菌(如M.Guberculosis)、原生動物(如P.falciparam)以及其它感染原引起的微生物感染。
本發明所述的“預防”是指對于疾病癥狀的完全防止、延緩疾病癥狀的發生以及對已發生的疾病后續癥狀的減輕。“治療”是指疾病癥狀的完全去除或使疾病癥狀的嚴重性降低。
本發明的方法適用于許多種類的動物，例如人、非人靈長目動物、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔子、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等。
在體內，一種或多種激發免疫原性刺激物和一種或多種CD137結合激動劑施加于任何一種前述的哺乳動物，兩種物質可以同時給藥，也可以分開給藥。給藥的可以是激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑本身，也可以是分泌或表面表達它們的重組細胞，但在進入體內之前都必須懸浮于一種藥物載體(如生理鹽水)中，通過口服、經皮吸收、注射或輸注的形式經由靜脈、皮下、肌肉、腹膜、陰道、鼻、胃、氣管或肺進入到體內。也可以直接進入到相應淋巴組織(如脾、淋巴結或粘膜相關淋巴組織)。劑量的不同取決于許多因素，包括給藥方法、疾病癥狀、動物大小、體重、體表面積、年齡、性別等。激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑合適的劑量范圍是0.01-100.0ug/kg，根據激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑的不同以及給藥途徑的不同，劑量有較大的不同。如口服比靜脈注射需要更大的劑量。給藥的劑量水平可以由本技術領域公知的技術進行調節和優化。將激發免疫原性刺激物和/或CD137結合激動劑包埋于適當的遞送載體(如多聚微粒)可以增強遞送效率，特別對于口服遞送尤為明顯。另外，可以將適當的佐劑與激發免疫原性刺激物同時使用，適合的佐劑包括霍亂霉素(CT)，大腸肝菌不耐熱毒素(LT)，突變CT(MCT)和突變LT(MLT)。突變后產生的MCT和MLT的毒性大大降低，但不影響其作為佐劑的活性。另外可用的佐劑還包括明礬、弗羅因德氏完全和不完全佐劑和RIPI。還可以使用一種或多種細胞因子或生長因子，在激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑之前、同時或之后施加于患病個體。此外，當腫瘤細胞、APC或雜種細胞作為激發免疫原性刺激物時，可以使這些細胞除了分泌或表面表達CD137結合激動劑以外，也分泌或表面表達一種或多種重組共刺激分子(如B7.1、B7.2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B2-DC)和/或一種或多種重組細胞因子或重組生長因子。
另外，也可將一條或多條含有編碼一條或多條激發免疫原性刺激物和/或一條或多條CD137結合激動劑的多核苷酸施加于患病個體，傳送到相應細胞。可以用多聚生物可降解微粒或微囊輸送多核苷酸，使它直接在患病個體的淋巴組織中表達。這里選用的多聚生物可降解微粒或微囊的大小適于被吞噬細胞如巨噬細胞吞噬，比如直徑為1-10um的PLGA微粒。包埋有多核苷酸的微粒被吞噬細胞攝取以后，微粒將逐漸被細胞生物降解，然后釋放出多核苷酸，在細胞中表達。多核苷酸還可以包括于另一種類型的微粒，其直徑是夠大，不能被吞噬細胞吞噬(大于5um，最好大于20um)。這種微粒可以作為核酸緩慢釋放的貯器，只有當做微粒被生物降解以后，核酸才能被細胞攝取。
另外的攝取核酸的途徑是脂質體輸送，載體可以直接或與組織特異性抗體共同進入到脂質體。也可以制備一種由質粒或載體通過靜電作用或共價作用附著到多聚-L-賴氨酸上形成的分子復合物，其中多聚-L-賴氨酸部分可以結合到一個能識別靶細胞受體的配基上。還可以使用淋巴組織特異性轉錄調節因子(TRE)來實現淋巴組織特異定位，其中可以使用的TRE如B淋巴細胞、T淋巴細胞或樹突細胞特異性TRE。
在一條多核苷酸(如表達載體)中，編碼相應激發免疫原性刺激物或CD137結合激動劑的核酸序列中還包含有一個起始Met和特異定位序列，與啟動子或增強子-啟動子聯合體相連。
啟動子是一種轉錄調節因子，一般位于轉錄起始位點上游100個堿基對之內。增強子與啟動子不同，在距離轉錄起始位點不同距離的位點皆可發揮功能，它也可以位于轉錄起始位點的下游，但必須有啟動子的存在才能起作用。為了得到一條啟動子控制的編碼序列，必須確定所需肽的翻譯閱讀框的翻譯起始位點，一般是啟動子下游的1個到50個核苷酸處。表達載體的編碼序列之后選擇性地連接一個轉錄終止位點。
對于本方法合適的載體包括質粒和病毒載體，如皰疹病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒、解毒的牛痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒和腺相關病毒。
多核苷酸可以加入到生物相容性的藥用載體中，如生理鹽水。通常給藥的劑量取決于許多因素，如患者的大小、體表在積、年齡、性別、時間、給藥途徑、健康狀況等。因此，給藥的劑量是不同的。本發明的方法一般使用含106到1012拷貝的多核苷酸分子，給藥的途徑和頻率可根據個體情況作出不同的選擇。
(2)體內與體外相結合(ex vivo)的方法本發明的ex vivo方法包括將包含T細胞(CD4+和/或CD8+T細胞)的淋巴細胞從體內分離出來。在體外用一個或多個激發免疫原性刺激物和一個或多個CD137結合激動劑共同處理，可以進行一次或多次處理，接著進行淋巴細胞免疫活性(如CTL活性)測定，一旦達到所需要的活性，將細胞重新導入供體或導入到其它個體。ex vivo方法的治療或預防療效取決于ex vivo處理后活化的淋巴細胞活性，還受中和作用和細胞毒的影響。
本發明的ex vivo方法的另一種方式是從供體中獲取細胞，將編碼一個或多個激發免疫原性刺激物和一個或多個CD137結合激動劑的一條或多條多核苷酸轉染或轉化進入細胞，將該細胞重新導入到供體或其它個體。這里優選的細胞是生血細胞，如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞或B細胞。另外還可選擇其它類型的細胞，包括但不限于成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞或肌肉細胞。經過上述轉化或轉染以后回到動物體內后，這些細胞在體內存活期間一直可以作為激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑的來源。使用上皮細胞，包括前述的APC，尤其具有優勢，因為它們能直接定位到淋巴部位，如淋巴結或脾，產生高濃度的激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑。此外，如果使用APC來表達編碼一個或多個CD137結合激動劑的轉基因，這里表達外源基因的APC通常但不必須與遞呈異種抗原或抗原肽到相應T細胞的APC相同。CD137結合激動劑可由APC分泌或表面表達，在施加重組APC之前，可先施加特定的抗原或抗原肽。此外，腫瘤細胞或APC與腫瘤細胞融合而成的雜種細胞也可以轉染成轉化入一個或多個帶有多個CD137結合激動劑的載體，這些細胞通過一定途徑到達癌癥部位，分泌或表面表達CD137結合激動劑，從而刺激T細胞免疫應答。這里用于轉染或轉化編碼CD137結合激動劑的核酸的腫瘤細胞，可以從患病個體以外的個體中獲取。同樣，用于制備表達重組CD137結合激動劑的雜種細胞的腫瘤細胞，也可以從患病個體以外的個體中獲得。
本發明的ex vivo方法的主要步驟包括從供體提取細胞(如腫瘤細胞或APC)，培養細胞，在細胞內轉導入一種或多種表達載體，將細胞保存在適于激發免疫原性刺激物和/或CD137結合激動劑表達的條件下，這些方法都是分子生物學領域公知的。轉導的方法可采用ex vivo基因治療的標準方法，包括磷酸鈣法、電穿孔、病毒感染等。脂質體和多聚微粒也是可以使用的，本方法還包括篩選成功轉導的細胞，注射或灌輸入患病個體。本方法還包括制備雜種細胞的步驟，并將雜種細胞注射或灌輸入患病個體。
本發明的方法也可以是體內方法和ex vivo方法的結合。比如，激發免疫原性刺激物以肽-抗原決定簇的形式制備，而CD137結合激動劑以核酸編碼或攜帶編碼核酸的細胞分泌或表面表達的形式制備。
本發明的方法適用于本文涉及的任何疾病和物種，本方法所適用的檢測一種用藥方式對于某一疾病的治療或預防作用的方法是本技術領域公知的常規技術。
(4)CD137特異性抗體。
本發明還涉及特異性結合人和鼠CD137的抗體。這些抗體可以是經過CD137多肽或肽段免疫的動物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、綿羊、馬、山羊、牛或豬)的血清和漿液中的多克隆抗體。多克隆抗體可以通過本技術領域公知的技術從血清、漿液或腹水中分離。本發明的方法還包括結合CD137多肽或肽段的單克隆抗體(mAb)。制造和篩選單抗的方法是本技術領域公知的，首先選擇和克隆出產生所需抗體的雜交瘤，然后可使用本技術領域公知的許多體內或體外方法生產抗體。比如，可以在體外合適的條件下培養雜交瘤，一定時間以后在上層清液中收集所需抗體，培養時間的長短和培養液的選擇是易于確定的。
本發明還涉及CD137特異的重組抗體，如嵌合體和包含人源、非人源成份的人源化單抗。這些嵌合體或人源化單抗可以由本技術領域公知的重組DNA技術獲得。
本發明還涉及包含有抗原結合區域功能部位的CD137特異性抗體片段和衍生物。包含結合區域的抗體片段可以通過公知的技術獲得。這種抗體片段包括但不限于胃蛋白酶所消化抗體分子后獲得的F(ab’)2；降解F(ab’)2的二硫鍵后獲得的Fab；番木瓜蛋白酶和降解試劑處理抗體分子后獲得的Fab。抗體片段也包含Fv，如單鍵Fv(scFv)片段，即恒定區很小或沒有恒定區的抗體產物。svFv片段僅是一條多肽鏈，由抗體重鏈和輕鏈的可變區部分組成。


附圖1A mAb 2A結合狀況的流式細胞圖(FFC)。白色實線區域反映mAb 2A與T細胞的結合情況，白色虛線區域反映mAb 2A和CD137Ig同時與T細胞的結合情況，黑色區域反映對照抗體與T細胞的結合情況。白色實線區域和黑色區域的染色反應是在鼠CD137Ig融合蛋白不存在的情況下進行的；白色虛線區域的染色反應是在鼠4-1BB Ig融合蛋白存在的情況下進行的。
附圖1B mAb 2A結合狀況的FFC圖。標記“2A”的白色區域反映mAb 2A與T細胞的結合情況，標記“1AH2”的白色實線區域反映CD137特異性mAb與T細胞的結合情況，黑色區域反映同型對照抗體與T細胞的結合情況。
附圖1C3H-Tdr滲入法測定小鼠T細胞增殖線性圖，以每分鐘計算(cpm)。
附圖2 小鼠的腫瘤生長圖。皮下注射C3腫瘤細胞或EL4E7腫瘤細胞，7天后注射mAb 2A或大鼠IgG。
附圖3A 不同效應細胞和靶細胞對于靶細胞的溶細胞活性。小鼠皮下注射1×106C3或4×106EL4E7腫瘤細胞，第1天和第4天各注射100ug mAb 2A(白圓)或大鼠IgG(黑圓)。第7天將小鼠處死，收集腫瘤引流淋巴結(TDLN)，TDLN中得到的細胞體外用輻照過的C3細胞(圖3A)，或輻照過的EL4E7細胞(圖3B)刺激4天。將每中組中2-3只小鼠的TDLN集中起來，用標準4hr51Cr釋放試驗測定其對EL4、EL4E7、RMA-S、E7肽刺激的RMA-S或CS靶細胞的溶細胞活性。
附圖4A 一系列二維FFC圖，顯示CD8特異性mAb和結合E7(49-57)肽的H-2Db類分子四聚體(Db/E7)結合附圖所獲得的細胞的情況，閉合圓內區域顯示即結合CD8特異性mAb又結合Db/E7四聚體的細胞。
附圖4B 附圖4A中，既結合CD8特異性mAb又結合Db/E7四聚體的細胞相對數量圖。
附圖5A和5B 經處理后的小鼠淋巴結中同時結合CD8特異性mAb和Db/E7四聚體的細胞的相對數量圖附圖6 攜帶腫瘤的小鼠的死亡時間(周)圖。給所有小鼠皮下注射1×106C3細胞，第7天，1半小鼠用E7(49-57)肽皮下免疫，另一半小鼠用對照Vp2(121-130)肽皮下免疫。第7天和第10天腹腔注射100ug mAb 2A(標記“2A”)或大鼠IgG，每周測定腫瘤直徑，當直徑達15mm(白色圓)時將小鼠處死，第13周直徑仍小于15mm的小鼠用白色圓標記。圖上端黑色圓表示沒有形成可觸知腫瘤的小鼠。
附圖7 小鼠存活曲線。給小鼠靜脈注射TC-1細胞(圖7A)或1×105B16-F10細胞后，在第3天皮下注射對照OVA肽(圓)，E7(49-57)肽(圓7A中三角形)或trp-2肽(圖7B中三角形)，第3天和第6天注射100ug 2A mAb(“2A”)或大鼠IgG。每天觀察小鼠狀況，得到存活數據。
附圖8 皮下注射了SCCVII腫瘤細胞后腫瘤生長狀況。注射腫瘤細胞后第4天將小鼠分成4個組，每組5只，第4天和11天，給第1組和第2組小鼠皮下注射體外SCCVII細胞初次激活的樹突細胞。第4、7、11和14天，第1組小鼠腹腔注射100ug大鼠IgG(上右圖)和100ug mAb 2A(上左圖)，測定腫瘤直徑。
附圖93H-Thy滲入法測定細胞增殖圖。測定用人CD3特異性刺激的尼龍毛純化的T細胞的增殖情況，其中人CD3特異性抗體包被在96孔組織培養板底。mAb5.9(“α-h41BB(5.9)”)、mAb5.10(“α-h41BB(5.10)”)，人CD137特異抗體(“α-h41BB”)及小鼠IgG(“mIgG”)都包被在96孔組織培養板的底部，濃度為10ug/ml。
附圖10 B6小鼠的存活曲線。給小鼠靜脈注射5×105B16-F10細胞后，第3、7和11天皮下注射輻照后的B16-F10細胞(表達重組GM-CSF的B16-10F(三角)和有表達重組GM-CSF的B16-10F(圓))。第4、7、10、12和15天，給小鼠注射100ug2A mAb(黑色圓和黑色三角)或大鼠IgG(白色圓和白色三角)。
具體實施例方式
E7肽(RAHYNIVTF)包含HPV-16E7蛋白的H-2Db-限制的CTL抗原決定簇[參見Feltkamp et al.(1993)Eur.J.Immunol.232242-2249]。trp-2肽(SVYDFFVWL)是H-2Kb限制的抗原決定簇。最先發現于B16黑素瘤細胞[參見Bloom et al.(1997)J.Exp.Med.185453-459]。Vp2對照肽(FHAGSLLVFM)包含一個H-2Db限制的CTL抗原決定簇，來源于Theiler’s鼠腦脊髓炎病毒[Johnson et al(1999).J.virol.733702-3708]。OVA(257-264)對照肽(SIINFEKL)是一個H-2Kb限制的CTL抗原決定簇，來源于雞卵清蛋白[參見Curtsinger et al.(1998)J.Immunol.1603236-3242；Moore et al.(1998)Cell54777-785]。所有肽都由Mayo Molecular Biology Core Facilty合成的，純度都大于95％，通過反相HPLC方法純化。
本實驗選用6-10周齡的雌性B6成熟小鼠，將1×106C3細胞和4×106EL4E7細胞加入0.1mlPBS中，注射到B6小鼠體內，使腫瘤在小鼠體內生長。腫瘤大小以兩處垂直直徑的平均值計算(mm)，每周測一次[參見Tamada et al.(2000)Nature Med.6283-289]。在肺轉移模型中，將含有1×104TC-1或1×105B16-F10細胞的Hank’s緩沖鹽溶液注射入小鼠尾靜脈。在攜帶皮下腫瘤的小鼠的腫瘤對側位置處使用50ug乳化于不完全弗朗德氏佐劑(IFA)的肽進行皮內免疫。對攜帶肺轉移腫瘤的小鼠使用100ug乳化于IFA中的肽進行雙側皮內免疫。抗體溶于0.5ml PBS中，通過腹腔注射進入小鼠。(2)抗體、四聚體和融合蛋白使用序列特異性引物和從刀豆球蛋白A活化的脾細胞中分離的RNA制備相應cDNA，并且擴增，獲得編碼鼠CD137胞外區的cDNA，在表達質粒pmIgV[參見Chapoval et al.(2000)Nature Med.6293-289]中與鼠IgG 2a的CH2-CH3區域融合，表達載體轉染入CHO細胞，在培養基中培養，培養基上清中的蛋白使用HiTrap蛋白G-Sepharose柱[Amersham Pharmacia Biotech]進行純化，使用去除脂-多糖復合物的PBS進行透析，最后得到CD137Ig融合蛋白。
鼠的抗CD137單克隆抗體(mAb)通過使用CD137Ig免疫Lewis鼠獲得。雜交瘤細胞由鼠脾細胞和鼠Sp2/0骨髓瘤細胞融合而成，培養上清由ELISA法篩選。雜交瘤2A在加有10％ IgG FBS和25mM HEPES的RPMI1640中生長，使用切線流微板濃縮器(Millipore)收集和濃縮，使用5ml(HiTrap蛋白G-Sepharose柱(Amersham Pharmacia Biotech)從濃縮上清中純化2A mAb，純化了的mAb進行PBS透析，使用Centriprep濃縮器(Millipore)濃縮。
純化的鼠CD3、CD28、CD137特異性mAB和異硫氰酸熒光素(FITC)共價結合的CD8mAb購于Pharmingen。FITC-共價結合的山羊抗鼠IgG抗體購于BiosourceInternational。
結合E7肽(H-2Db-E7)或Vp2肽(H-2Db-Vp2)的鼠H-2DbMHC四聚體可由已知的方法制備[參見Johnson et al.(1999)J.Virol.733702-2708]。簡單地說，是將H-2Db的α鏈和人β2微球蛋白從一個細菌表達系統中分離出來，在過量的肽中折疊，單聚復合物共價結合到熒光染料、藻紅蛋白(PE)標記物上，形成熒光四聚復合體。PE標記的四聚體使用凝膠濾過法純化。(3)T細胞共刺激試驗用于檢測mAb共刺激活性的方法是已知的[參見Tamada et al.(2000)Nature.Med.6283-289]，這里只作簡單描述。尼龍毛(NW)純化的鼠脾T細胞(2.5×106/ml)加入預先包被有抗CD3的mAb(0.1ug/ml)的96孔板，指示大鼠IgG或mAb2A的濃度。T細胞的增殖情況可由[3H]脫氧核苷攝入法測定，在3天的培養液加入1uCi/孔[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]-Tdr)，15小時后收集在纖維玻璃管，使用MicroBeta Trilux液體閃爍計數器測定滲入T細胞的[3H]-Tdr，即可知道增殖T細胞的多少。(4)熒光激活細胞分離器(FACS)分析使用FITC標記的抗CD4和CD8的mAb，包被有FITC特異性抗體的金屬微珠和磁鐵(miltenyi biotec)。進行T陽性細胞選擇。分離的T細胞的純度通常大于95％，可使用抗CD3的mAb通過流量細胞計數法檢測。將從鼠脾中純化的T細胞(2.5×106個/ml)加入包被有抗CD3(5ug/ml)和抗CD28(1ug/ml)的mAb的24孔組織培養板中，T細胞被激活，24小時后收集T細胞，與1ug mAb 2A共同加入到含5％FBS和0.02％疊氮化物的50ul PBS中，放置30分鐘。4℃下用FITC標記的鼠特異性山羊抗體洗滌和孵育30分鐘。洗滌后的細胞中滲入多聚甲醛和熒光素，接著進行FACS分析(Becton Dickinson)。S49.1細胞也可用相同的方法處理，1×106S49.1細胞用mAb 2A或CD137特異性mAb處理，洗滌后，用FITC標記的大鼠IgG特異性抗體處理，再洗滌滲入多聚甲醛和熒光素，進行FACS分析。
采集免疫7天的小鼠的腫瘤引流淋巴結(TDLN)，用PE標記的H-2D6-E7或H-2D6-VP2四聚體復合體以及FITC標記的CD8處理[參見Jonhson et al.(1999)J.Virol.733702-3708]。將5×106TDLN細胞與2.5×105UV輻照的C3細胞共同孵育4天。接著細胞用PE標記四聚體和FITC標記的CD8處理，洗滌后重新懸于含有750ng/ml propidium碘化物的PBS中。(5)CTL活性試驗將draining LN細胞與輻照后的C3細胞共同培養4天，得到效應細胞，從培養液中收集效應細胞，使用標準的4-hr51Cr釋放試驗，通過測定效應細胞和靶細胞的比率(E∶T)分析CTL活性。其中肽刺激的靶細胞是將靶細胞與10ug/ml肽28℃下共同培養18小時獲得的。(6)鼠DC的制備鼠DC從骨髓中獲得。將小鼠處死，并且浸入到70％乙醇(EtoH)中，移去EtoH，暴露股骨，從股骨頭處脫臼，去除肌肉，將剩下的股骨浸入70％ EtoH，然后加入到完全介質(CM)，介質中包括CM、RPM/1640、10％熱失活的FBS，二性霉素B(0.5ug/ml)、β-ME(2×10-5M)，丙酮酸鈣(1mM)，非必需氨基酸(0.1Mm)，盤尼西林和鏈霉素(100ug/ml)，谷氨酸(2mM)和慶大霉素(50ug/ml)。將股骨從頭處切開，露出骨髓，使用3cc注射器(充滿CM)和23號針頭將骨髓抽提出，與CM一起收集到10mm細胞培養皿中。在骨髓抽提后，通過鋼篩網和離心法將細胞從介質中分離，重新懸浮在1.0ml包含10ug/ml I-AbmAb、抗Mac3 mAb、抗CD8amAb(HO2.2)、抗CD45R(B220)mAb、抗CD3emAb和抗GR-1mAb的培養液中，在水上放置20分鐘，將細胞洗滌后重新懸浮在1∶30稀釋的兔血清中，濃度為107個細胞/ml，在37℃下培養45分鐘。然后將上述細胞洗滌，加入到10ml含有10mg/ml粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和1ng/ml干擾素4(IL-4)的CM中，置于37℃。第二天將沒有粘附的細胞從培養液中移走，第五天收集包含高度純化的DC的培養液。實施例2 抗CD137mAb 2A及其在體內對EL4E7淋巴組織瘤和C3上皮癌的抗腫瘤影響。
首先檢測抗CD137mAb的特異性。用單克隆抗體2A處理已經經過抗CD3和抗CD28mAb刺激24小時的大于80％純化的T細胞。結果表明，抗體的結合是特異性的，因為當加入小鼠CD137Ig時，結合被競爭性地抑制(圖1A)，當加入對照大鼠IgG抗體時卻不被抑制。此外，mAb 2A能夠特異性結合到表達CD137的小鼠的淋巴瘤T細胞S49.1上，當用1AH2處理后，可觀察到抗CD137mAb的結合(圖1B)，固定化的mAb 2A也能增強T細胞的繁殖能力，隨著劑量的不同而不同，并且需要一定量的抗CD3mAb的參與(圖1C)。因此，2A是一種共刺激mAb。
選擇EL4E7和C3兩種小鼠腫瘤檢測mAb對于腫瘤的影響。EL4E7是一種胸腺癌，轉染后表達HPV-16E7基因；C3是轉化3HPV-16和ras癌癥基因的胚胎上皮細胞系。由于兩種腫瘤系都表達HPV-16的E7基因，可用于測定CTL對于E7基因產物的反應。準備幾組攜帶EL4E7或C3腫瘤的小鼠，分別在患病第7天和第10天注射2A(100ug)。結果如圖2所示，在注射2A的小鼠中，直徑達到12mm的EL4E7腫瘤7天后完全消退；用對照大鼠IgG抗體處理的小鼠腫瘤繼續生長；攜帶C3腫瘤的小鼠僅僅是腫瘤邊緣受影響，5只小鼠中僅1只發生腫瘤生長延緩，其它4只小鼠的腫瘤繼續生長。可見，雖然mAb能夠消除EL4E7腫瘤，C3腫瘤還是難于消除，而且這種治療的抗性不是由于腫瘤的大小或不同腫瘤之間抗原差異導致的。實施例3 攜帶C3腫瘤的小鼠中，E7抗原對于CTL的不敏感與mAb 2A處理后產生的抗性相關。
為了研究C3腫瘤對于2A mAb產生抗性的原因和機制，本實驗對攜帶C3腫瘤的小鼠中腫瘤特異性CTL的活化狀態作了檢測。先給小鼠皮下接種C3細胞，3-7天后用mAb 2A或對照大鼠IgG處理。7天后采集TDLN，在體外用輻照后的C3細胞再刺激，從培養液中分離細胞，用標準的51Cr釋放法測定。測定結果如圖3A，EL4E7和C3都沒有被體外活化的TDLN溶解。這里沒有顯示CTL活性并非由于測定的不敏感，或CTL不能識別E7肽刺激的RMA-S細胞或EL4E7細胞，它們都是高度敏感的細胞。與之相反，從EL4E7小鼠中分離出的TDLN，可以測定出E7特異性CTL活性，而且在2AmAb處理后E7特異性CTL活性增強(圖3B)。在測定中，野生型RMA-S細胞發生非特異性溶解，這是由于EL4和RMA-S具有一種相同的抗原引起的[參見Van Hall et al.(2000)J.Immunol.165869-877]。
C3TDLN中E7特異性T細胞的頻率可由FITC標記的抗CD8mAb和PE標記的E7四聚體雙色標記染色法確定。與前述CTL活性測定結果相一致，即使在體外與輻照后的C3細胞共刺激以后，C3TDLN中低于0.1％的CD8+T細胞具有E7特異性，而且，2A mAb也不能增加C3TDLN中E7特異性CTL活性(圖4A、B)。相反，用輻照后的C3細胞再刺激和對照抗體處理后，EL4E7小鼠約有1％的CD8+T細胞是E7特異性的，在體內用mAb 2A處理后能增加E7特異性CTL活性，如圖4B所示，E7特異性T細胞頻率增加了4倍。因而E7特異性CTL的頻率與CTL活性是密切相關的。更為重要的是，上述結果還證明，缺少活化的E7特異性CTL不僅抑制了特異性CTL的細胞活性，而且影響了C3TDLN中2A mAb對于T細胞反應的增強能力。
為了排除C3鼠中E7特異性CTL消失的可能性，在用包含H-2D6限制的CTL抗原決定簇的E7肽免疫以后，對小鼠進行E7特異性CTL活性檢測。在肽免疫后第7天，收集draining LN，用輻照的C3細胞重新激活，使用免疫的E7四聚體測定E7特異性CD8+T細胞的密集度。E7肽的免疫有效地促進了細胞結合E7四聚體的能力，而用對照Vp2肽免疫后沒有發現上述情況。使用mAb 2A處理可以進一步增加E7特異性CTL的頻度(圖5A)。對na ve小鼠的免疫也獲得了相同的后果(圖5B)。因此，E7特異性CTL存在于攜帶C3的小鼠，但不會被C3細胞活化或去除，即E7特異性CTL對于C3腫瘤的抗原不敏感，而且單獨的抗CD137mAb不能打破這種不敏感狀態。實施例4 用E7抗原決定簇和抗CD137mAb 2A消除CTL不敏感狀態，使C3上皮癌消退。
在實施例3中，E7抗原決定簇的免疫能夠增強C3鼠中CTL密集度，這里首先測定E7肽的免疫是否影響C3腫瘤。選擇攜帶C3腫瘤7天的小鼠，用E7或對照Vp2肽免疫，接著至少觀察12周，在腫瘤達到15mm直徑時將小鼠處死。用E7肽處理后，11只小鼠中觀察到1只的腫瘤發生消退，因而E7肽免疫不足以消除C3腫瘤。然而，當用CD137mAb和E7肽共刺激(COPP)處理后，15只小鼠中有11只的腫瘤完全消失，而且沒有消失的腫瘤其生長速度也明顯慢于對照組小鼠的腫瘤(圖6)。10只對照小鼠中僅有2只在mAb 2A和對照Vp2肽處理后腫瘤發生消退。除了僅有1只小鼠在12周后腫瘤仍然小于15mm，用對照Vp2肽和大鼠IgG抗體處理的小鼠腫瘤8周內達到15mm直徑(圖6)。因此，COPP處理有效地誘導了C3腫瘤的消退。
本實驗還檢測了COPP處理對于巨大C3腫瘤有效性(表1)。患C3腫瘤14天的小鼠(腫瘤直徑5-8mm)進行COPP處理，觀察到38只小鼠中有16只腫瘤發生消退，約42％。與之相比，用E7肽、mAb 2A或對照Ig和Vp2肽分別處理小鼠，觀察到的腫瘤消退現象是0％、9％和0％。在21天后觀察，即使COPP處理后腫瘤沒有完全消退的小鼠，其腫瘤直徑明顯小于3種對照組小鼠。實施例5 TC-1肺癌和B16-F-10黑素瘤轉移模型中COPP處理的影響作用。
為了確定COPP處理對于其它弱免疫原性腫瘤是否更有效，制備兩種腫瘤模型，TC-1腫瘤系和B16-F10腫瘤系。TC-1腫瘤系從HPV-16E6、HPV-16E7和ras腫瘤基因共轉化的主要肺上皮細胞中獲得[參見Liu et al.(1996)Cancer Res.5621-6]。可用E7肽作為免疫原。B16-F10是一個高度轉移黑素瘤系，可用H-2Kb限制的trp-2肽作為免疫原[參見Dranaff et al.(1993)Prol.Natl.Acad.Sci.USA903539-3543]。給B6小鼠靜脈注射104TC-1細胞，建立肺轉移模型，3天后，給小鼠皮下注射E7肽，并且腹腔注射2A mAb(COPP)。與C3腫瘤中觀察到的相同，單獨注射mAb 2A不能延長小鼠的存活，所有小鼠在20天內均死亡；單獨的E7肽免疫延長了小鼠的存活，但所有小鼠在35天后死亡。COPP處理使小鼠的存活率明顯提高，所有小鼠都至少可存活35天(圖7A)，20％的小鼠長時期地存活。在第二個腫瘤模型中，給小鼠靜脈注射105B16-F10細胞，3天后用COPP處理。同樣地，單獨使用mAb 2A或trp-2肽沒有效果，而COPP處理明顯提高了小鼠的存活率，20％的小鼠存活時期大于90天。因此，用一條抗原性的MHCI限制的肽和抗CD137mAb對于弱免疫原性腫瘤具有治療作用。實施例6 mAb 2A增強樹突細胞疫苗的治療效果。
為了確定鼠CD137特異的激動mAb(mAb 2A)能否增強DC疫苗刺激的抗腫瘤免疫反應，需制備一個攜帶頭頸磷狀細胞癌的小鼠模型，本實驗使用的是弱免疫原性鼠(B6)磷狀細胞癌系(SCCVII)。將DC(5×106個/孔)與輻照過的SCCVII細胞(1×106個/孔)在24孔組織培養板上培養24小時，DC即被腫瘤抗原初次激活。給每組小鼠皮下注射2×105SCCVII細胞，4天后分別皮下注射下列疫苗第一組1×106DC、3×106輻照的SCCVII和大鼠IgG(100ug)第二組1×106DC、3×106輻照的SCCVII和2A mAb(100ug)第三組大鼠IgG(100ug)第四組2A mAb(100ug)各組小鼠分別注射上述疫苗2次，間隔為1周，每次注射疫苗3天后，給小鼠注射2A mAb或對照大鼠IgG，測定腫瘤生長。結果如圖8所示，第三組80％的小鼠腫瘤繼續生長，第一組與第四組的小鼠3/5有治療結果，而第二組的小鼠治療效果最明顯，所有小鼠的腫瘤發生消退。這些結果證明，CD137特異性抗體和腫瘤引發的DC疫苗共同作用能促進抗腫瘤免疫作用。實施例7 鼠抗人CD137mAb的生產。
人CD137特異性激動抗體的制備方法與前面使用的鼠CD137相同。建立由人CD137胞外部分和人IgG1 CH3-CH3區域組成的融合蛋白，用這種蛋白免疫的鼠產生CD137多克隆抗體。將該鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤細胞，用熒光流量血細胞計數法篩選，293個細胞轉染了編碼人4-1BB的cDNA。兩個雜交瘤細胞(5.9和5.10)產生表現人CD137特異性的IgG mAb。實施例8 鼠抗人CD137mAb的T細胞共刺激活性。
為了測定前述兩個抗人CD137mAb共刺激T細胞應答的能力，本發明人建立了一個標準的體外共刺激測定實驗。首先，將人CD3特異性抗體分別以不同的濃度包被在96孔板組織培養板的底部，將純化的人T細胞加入到上述96孔板中共同培養。培養48小時后，用3H-Tdr滲入法測定T細胞的繁殖情況(圖9)。每種抗人CD137都明顯刺激了T細胞的增殖，因而證明了這些抗體的T細胞共刺激潛力。實施例9 mAb增強輻照后的表達重組GM-CSF的腫瘤細胞的治療效果本實驗測定鼠CD137特異性激動mAb(mAb 2A)是否增強由表達重組細胞因子的腫瘤細胞刺激的抗轉移免疫反應。給4組、每組5只小鼠靜脈注射5×105B16-F10黑素瘤細胞，使它們產生分散的轉移腫瘤，在第3、7和11天給小鼠皮下注射4×106輻照過的B16-F10細胞免疫，其中B16-F10細胞預先轉染了編碼鼠GM-CSF(B16-GM-CSF)的cDNA，并能表達鼠GM-CSF。B16-GM-CSF細胞的制備方法可參見Dranoffet al.(1993)Proc.Natl.Acod.Sci.USA90(3539-3543)。在第4、7、10、12和15天分別給各組小鼠腹腔注射100ug大鼠IgG或mAb 2A。第一組大鼠IgG第二組mAb 2A第三組B16-GM-CSF和大鼠rat IgG第四組B16-GM-CSF和mAb 2A小鼠的存活情況見圖10，用B16-GM-CSF和mAb 2A免疫的小鼠比B16-GM-CSF和IgG免疫的小鼠的存活能力明顯增強。
權利要求
1.一種使患病個體增強免疫應答的方法，其特征在于給患病個體施加(1)腫瘤相關抗原的肽-抗原決定簇；(2)一種結合CD137的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種增強哺乳動物免疫應答的方法，包括給患病個體施加免疫原性刺激物和CD137結合激動劑。本發明還公開了一種在體外增強T細胞應答的方法，其中涉及將含有T細胞的淋巴細胞與激發免疫原性刺激物和CD137結合激動劑共同培養。
文檔編號A61K39/395GK1440812SQ0211090
公開日2003年9月10日 申請日期2002年2月27日 優先權日2002年2月27日
發明者陳列平, 王皓, 郭亞軍, 劉慶法 申請人:上海中信國健藥業有限公司