專利名稱：一種水產養殖動物的細菌疫苗制備方法
技術領域：
本發明涉及一種水產養殖動物的細菌疫苗制備方法。
細菌性病害是危害水產養殖動物的一類主要疾病，每年給世界各國水產養殖業造成巨大的經濟損失，如何有效的防治細菌性病害是水產病害研究者急待解決的課題。受人體和家畜(禽)免疫防治的啟示，人們將水產養殖的動物的某些病原菌用化學或物理的方法進行滅活或者減毒，制成疫苗后接種到動物體內，發現疫苗同樣可以刺激水產養殖動物(魚、鱉等)產生免疫保護力，防止某些病原對水產動物的感染，最終達到防治的目的。迄今為止，人們在制作細菌疫苗時采用多種滅活方法，包括使用福爾馬林、苯酚、氯仿等試劑進行化學滅活和經加熱、紫外線照射等進行物理滅活，但是使用化學藥劑不僅存在藥物污染和殘留，而且會破壞保護性抗原的分子結構，降低疫苗的免疫原性，從而影響使用效果。而加熱，紫外線處理方法存在耗能大，并且也存在對保護性抗原的破壞等問題。
本發明的目的是克服已有技術的不足，提供一種水產養殖動物的細菌疫苗制備方法，以減少由于化學藥物處理、加熱或紫外照射引起的疫苗免疫原性降低的缺點，提高疫苗的免疫保護率。
本發明是通過滲透壓和外部高壓相結合將疫苗菌進行滅活制備水產養殖細菌性疫苗的方法。將發酵培養的疫苗菌液經離心處理除去培養液加入5-20倍菌體體積的0.85％的生量鹽水洗滌沉淀，除去上清液后用高濃度鹽溶液洗滌沉淀，混均后放入菌塑料袋置于靜水壓儀中加壓處理，處理后取出菌液，再進行一次離心、去鹽和高靜水壓處量，取出后包裝或經真空凍干成粉劑再經包裝而成，本方法涉及多種病原細菌，可廣泛應用于魚類或海豚等水生動物，方法簡便，經濟實用，便于推廣。
制備的疫苗可通過注射、口服、浸泡和噴霧等各種途徑對水產養殖動物進行免疫。
本發明的具體方法是將發酵培養的疫苗用菌液經離心，除去培養液后加入5～20倍菌體體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮洗滌沉淀；再經離心，除去上清液，加入5～20倍菌體體積的5～10％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，容器的容量以300～1000ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中高壓處理，處理后取出菌液再經離心。而后用5～20倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，排凈空氣，再放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中進行高壓處理。處理完畢后取出，可直接包裝以用于水產養殖動物的免疫治療或經真空凍干成粉劑再經包裝，用于水產養殖動物的免疫防治。上述離心的工藝取離心力為3000～7000rpm，離心時間為15～30min；靜水壓處理取壓力100MP～250MP，處理時間為30～60min。
下面以一個最佳實施例，即海水魚類弧菌疫苗的制備進一步說明本發明。
取海水養殖的鱸魚、牙鲆的病原菌鰻弧菌和哈維氏弧菌發酵液，5000rpm離心30min，收集活菌體，加入10倍體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮混勻沉淀，再經5000rpm離心，30min，除去上清液，加入10倍菌體體積的8％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，容器的容量以650ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，操作壓力為225MP，處理時間為45min。處理后取出菌液經5000rpm離心30min，之后用10倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如入無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，排凈空氣，放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，壓力200MP，處理時間為60min，制成相應的疫苗。應用時只要將滅活處理的菌液對30克左右的鱸魚和牙鲆魚進行腹腔注射107～108CFU劑量，免疫50天后檢測免疫魚血清的相應抗體效價，其中對鰻弧菌的免疫效價達27～28。對哈維氏弧菌的免疫效價可達26～27。在免疫后60天對免疫后的魚用鰻弧菌和哈維氏弧菌攻毒，免疫保護率在70％～93％之間。
該發明應用于除蝦、貝類以外的高等水生動物如，魚、龜鱉類以及海豚、海豹等大哺乳類動物，由于該方法是通過對活菌體進行高滲和高壓處理相結合滅活的環保高效的疫苗制備方法，涉及水生動物的多種病原菌，如多種病原弧菌、氣單胞菌、愛德華氏菌、耶爾森菌、發光桿菌、巴斯德菌、屈撓桿菌和鏈球菌等，適用范圍廣，因此本發明是應用于水產養殖動物的細菌性病害疫苗制備的一種經濟實用的優良方法，便于推廣使用，
權利要求
1.一種水產養殖動物的細菌疫苗制備方法，將發酵培養的疫苗用菌液經離心，除去培養液后加入5～20倍菌體體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮洗滌沉淀；再經離心，除去上清液，加入5～20倍菌體體積的5～10％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，容器的容量以300～1000ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中高壓處理，處理后取出菌液再經離心。而后用5～20倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，排凈空氣，再放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中進行高壓處理。處理完畢后取出，可直接包裝以用于水產養殖動物的免疫治療或經真空凍干成粉劑再經包裝而成。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是上述離心的工藝取離心力為3000～7000rpm，離心時間為15～30min。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是靜水壓處理取壓力100MP～250MP，處理時間為30～60min。
4.如權利要求1所述的方法，其特征是取海水養殖的鱸魚、牙鲆的病原菌鰻弧菌和哈維氏弧菌發酵液，5000rpm離心30min，收集活菌體，加入10倍體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮混勻沉淀，再經5000rpm離心，30min，除去上清液，加入10倍菌體體積的8％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質的容器中，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，操作壓力為225MP，處理時間為45min，處理后取出菌液經5000rpm離心30min，之后用10倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如入無菌的高強度的塑料袋排凈空氣，放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，壓力200MP，處理時間為60min，制成相應的疫苗。
全文摘要
一種水產養殖動物的細菌疫苗制備方法，將發酵培養的疫苗菌液經離心處理除去培養液加入5－20倍菌體體積的0.85％的生量鹽水洗滌沉淀，除去上清液再用高鹽溶液洗滌沉淀，混均后放入菌塑料袋置于靜水壓儀中加壓處理，處理后取出菌液再施行一次離心去鹽和靜壓處理，取出后包裝或經真空凍干成粉劑再經包裝而成，涉及多種病原細菌，可廣泛應用于魚或海豚等哺乳動物，方法簡便，經濟實用，便于推廣。
文檔編號A61P31/04GK1449824SQ0211026
公開日2003年10月22日 申請日期2002年4月9日 優先權日2002年4月9日
發明者陳剛, 包振民 申請人:青島海洋大學