專利名稱：β－內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因其表達產物其組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗生素耐藥酶基因的分離，其融合基因的制備，及耐藥酶基因及融合基因表達產物的分離，含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物，及其在醫學和環境保護中的應用。具體的，本發明涉及β-內酰胺酶，氨基糖苷鈍化酶的編碼基因的分離，β-內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的制備，及其表達產物的分離，含有該耐藥酶蛋白融合蛋白的組合物，及其在醫學和環境保護中的應用，涉及抗生素治療過程中，保護腸道、陰道、口腔、呼吸道等微生態區域的穩定性，消除特定環境，如醫療場所，藥廠中藥物的污染，以及作為動物源食品的預處理添加劑，以降解其中所含有的抗菌藥物。更具體的，本發明涉及β-內酰胺酶，氨基糖苷乙酰基轉移酶的編碼基因的分離，β-內酰胺酶/氨基糖苷乙酰基轉移酶融合基因的制備，該基因及其融合基因表達產物的分離，含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物及其在醫學和環境保護中的應用。具體而言，保護微生態區域的正常微生態菌群(如陰道、腸道、口腔等)不被治療藥物所殺滅、避免微生態菌群失調所致的抗菌素伴聯性疾病(如偽膜性腸炎、陰道炎、口腔炎以及其它亞臨床性疾病)，并防止因藥物誘導產生耐藥菌株、以及其它毒副作用的發生；對某些特定環境(如醫療場所、藥廠等)中殘留的抗菌藥物進行降解與清除，消除抗菌藥物所造成的化學性與生物性污染(如環境耐藥菌的增加與傳播等)，同時，還包括以上述酶制劑作為動物源食品的預處理添加劑，以降解其中所含有的抗菌藥物(如人工飼養的動物源食品的預處理等)。
背景技術：
1、機體微生態菌群及其耐藥性正常微生物群寄居于機體的體表與體腔內，形成了完整的微生態體系(Microeologic system)。
抗生素治療已是最常用的醫療防治措施。但是在這一過程中，抗菌藥物的代謝是全身性的，即腸道、陰道、口腔、呼吸道等微生態區域也有足以抑制或殺滅其敏感菌株的藥物濃度。這些防治藥物同樣能夠大量抑制或殺滅上述區域正常的非致病性菌群，從而導致局部或全身的微生態平衡失調，誘發各種各樣的抗菌素伴聯性疾病如艱難芽孢梭菌(Clostridium difficile)過度繁殖引發的偽膜性腸炎、抗菌素伴聯性腹瀉、陰道炎和某些亞臨床性疾病等。這些非感染部位對抗菌素敏感的菌群被大量地殺滅，留下了耐藥性菌群，今后一旦發生內源性感染，其治療難度的增加是無法預期的，這是目前嚴重困擾醫學界的難題之一。簡言之，在以抗菌素進行預防和治療期間，抗菌藥物對非感染部位的微生態菌群既有大量殺滅而誘發各種并發癥的危險，也有使這些區域微生物菌群耐藥性大幅度增加的作用。
二.環境微生態菌群及其耐藥性外環境的微生態菌群構成十分復雜，不同區域存在構成各異的微生態環境，其微生物種群的組成和生物學特征不盡相同。例如，在醫療和藥廠等特定環境中的微生物群表現出對藥物的耐受性高于其它外環境者，主要原因是由于這些區域的抗菌藥物殘留量高于其它環境。防止醫院內感染和減少特定環境中藥物的污染已成為全球性的公共衛生和環保問題。
與環境相關的如食品、飼料等也與機體和環境微生態菌群的失調與耐藥性形成有著密切的關系，例如，在人工飼養各類動物(如禽類、豬、牛、羊、魚、鱉、蝦、蟹等)的飼料中，大多具有較高含量的不同抗菌藥物，因此，這些動物的排泄物中含有大量的耐藥性微生物菌群與抗菌藥物，既對環境造成了生物性和化學性污染、也引發了環境微生態菌群中的耐藥性菌株大量增加，再者，這些飼養性動物一旦加工成食品，因其具有較高含量的抗菌藥物，對人體的微生態菌群也構成了平衡失調和耐藥性菌株增加的潛在威脅。所以，各種食品、飼料的抗菌藥物殘留量控制，已是發達國家制定質量標準的主要指標。
三.抗生素耐藥酶及其對于抗生素分子的失活作用然而，任何一種抗生素使用不久，針對此種抗生素的耐藥機制隨即出現。其中耐藥酶是主要機制。
抗菌素耐藥酶是以其功能定義的各種酶的統稱，通過水解、酯化、乙酰化、磷酰化、核苷化等作用，使抗菌藥物分子失去抗菌活性。這類酶可以由質粒介導和染色體編碼，具有不同的基因型，同一菌體內可以同時存在不同機制的編碼或介導酶，可以是位于菌細胞外層周質區的“胞內酶”，也可以是排泌至菌細胞外的“胞外酶”。
目前已經發現的抗菌素耐藥酶主要有對β-內酰胺類藥物有滅活作用的β-內酰胺酶(β-lactamase，BLA)，對氨基糖苷類藥物(Aminoglycosides)有滅活作用的某些鈍化酶(modifyingenzymes，AME)、如乙酰轉移酶(acetyltransferases，AAC)、核苷轉移酶(adenylyltransferases或nucteolidyl transferases，AAD)、磷酸轉移酶(Phosphotransferases，APH)，對氯霉素有滅活作用的乙酰轉移酶(Chloramphenicol acetyltransferases，CAC)；對紅霉素(Erythromycin)、林可霉素(Lincomycin)等具有滅活作用的酯化酶(Macrolides esterase，MES)等。
四.現有技術狀況WO 88/07865，A61K 35/74公開了一種藥物組合物，其中加入能夠產生β-內酰胺酶樣活性物質的活大腸埃希菌。該活性菌來源于經體外培養的人類糞便分離株，所用活菌在體外培養能產生β-內酰胺酶，以保護腸道正常菌叢不被β-內酰胺藥物破壞，該專利忽略了耐藥菌對人體腸道所造成的耐藥菌增加、耐藥性傳播等生物污染問題。
WO 93/13795，A61K 37/54公開了以天然菌株產生的β-內酰胺酶或酰胺酶(amidases)制成腸溶性緩釋膠囊，在β-內酰胺類抗菌素治療期間，用以保護腸道正常菌群和防止藥物的毒副作用。
發明內容
一.發明概述及機制本發明涉及耐藥性菌株的篩選，特別是具備β-內酰胺酶，或氨基糖苷鈍化酶，特別是氨基糖苷乙酰轉移酶活性的耐藥性菌株的篩選。來自耐藥性菌株的β-內酰胺酶或氨基糖苷鈍化酶，特別是氨基糖苷乙酰轉移酶的編碼基因的分離；含有該編碼β-內酰胺酶，及氨基糖苷鈍化酶基因的表達質粒及含有β-內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的表達質粒的構建及其在受體細胞中的表達，其表達產物的純化，該表達產物及分離自天然抗性株的耐藥酶作為工具酶，在兩種及兩種以上抗菌素的聯合治療期間，通過耐藥酶對非感染部位抗菌藥物的水解，乙酰化、磷酸化、核苷化、酯化等作用，使到達這些部位的抗菌藥物得到減少或清除。應用于特定外環境，以消除其中的抗菌藥物(如醫療場所、藥廠等特定區域)。在將含有高劑量抗菌藥物人工動物飼料喂養動物加工成食品之前，給予抗菌素耐藥酶制劑，以消除其中的抗菌藥物。
本發明所涉及的抗菌藥物耐藥酶，可以是天然菌或重組的工程菌發酵液獲取的胞外酶、也可以是發酵后濃集菌獲取的胞內酶；還可以是富含這些耐藥酶的生物性組織或細胞的提取酶。耐藥酶的表達菌株(或生物性組織、或細胞)，可以是天然篩選株，也可以是通過基因工程重組或改造株。其編碼基因所表達的酶既可以是染色體酶(Chromosomal enzymes)，也可以是質粒酶(Plasmid enzymes)，酶蛋白表達形式可以是單一的純化酶，也可以由重組基因所編碼的融合酶蛋白形式。(一)β-內酰胺酶及其作用機制凡能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中內酰胺環的酶，均為β-內酰胺酶。目前為止，在β-內酰胺酶的家族中已發現約200余種亞型(種)。可按多種分類標準對其分類，例如，基于底物輪廓或底物譜、基因編碼位置、氨基酸序列、等電點(Isoelectric point，pI)、理化性質等分類，各種分類方法均有應用和引述，例如，按照其底物譜可分為青霉素酶(penicillnase)、頭孢菌素酶(cephalosporinase)、廣譜酶(broad-spectrum enzymes)和超廣譜酶(extended-spectrum enzymes)；Ambler，RP等根據酶的氨基酸序列差異，將其分為A、B、C、D四種類型Bush，K等根據底物譜、分子類型、抑制特性等，將其分為1、2、3、4群，其中，2群和3群又可以分成許多亞群，大部分的超廣譜酶屬于2be群和Ambler A類。簡要表述于表1。
表1 細菌β-內酰胺酶分類方案Bush-被抑制Jacoby- 分子優先底物 代表酶Medeiros 類型 CA EDTA群革蘭陰性菌產生的AmpC酶；MIR 1，1C頭孢菌素 --MOX 1，CMY 1，BIL 1 LAT 12aA 青霉素 +- 革蘭陽性菌產生的青霉素酶2bA 青霉素、頭孢菌素 +- TEM 1，TEM 2，SHV 1TEM 3-TEM 29，TEM 42，TEM 43，青霉素、窄譜和超TEM 46-TEM 52，SHV 2-SHV 9，PER2be A 廣譜頭孢菌素及 +-1單酰胺類CTX-M1，產酸克雷伯氏菌K1TEM 3-TEM 41，TEM 44，TEM 45，TRC2br A 青霉素 ±-12cA 青霉素、羧芐西林 +- PSE 1，PSE 3，PSE 42dD 青霉素、氯唑西林 ±- OXA 1-OXA 21，PSE 2(OXA 10)2eA 頭孢菌素 +- 普通變形菌產生的誘導頭孢菌素酶青霉素、頭孢菌 陰溝腸桿菌的NMC 1和IMI 1，粘2fA +-素、碳青霉烯類 質沙雷菌的Sme 1大部份β-內酰嗜麥芽假單胞菌的L1，脆弱擬桿菌3aB 胺類、包括碳青霉 -+的CcrA，粘質沙雷菌的IMP 1烯類嗜水氣單胞菌的CphA，芳香黃桿菌3bB 碳青霉烯類 -+的PCM 14 ND 青霉素 -？ 洋蔥假單胞菌的青霉素酶注CA克拉維酸；EDTA乙二胺四乙酸；ND未測定；
目前已經確認的200余種β-內酰胺酶中，理化性質上表現為分子量范圍約為1.3-5.0萬道爾頓，等電點(pI)范圍約為4.3-0.5，表現出同功酶的特征(如TEM1和TEM2型僅在第39位由賴氨酸取代谷氨酰胺)，酶動力學特征(水解底物的速率服從于V＝Vmax×[S]/Km+[S])，以及酶抑制劑特征等。(二)氨基糖苷類抗菌素及其耐藥酶氨基糖苷類抗菌素的分子結構中都有一個氨基環醇和一個或數個氨基糖分子，由配糖鍵相連。該類藥物可由微生物發酵獲取，如鏈霉菌屬發酵產生的鏈霉素、小單孢菌發酵產生的慶大霉素等等，也有化學合成的如卡那霉素的半合成衍生物丁胺卡那霉素(Amikacin)等，臨床廣泛應用的達數十種之多，如鏈霉素(Streptomycin)、卡那霉素(Kanamycin)、慶大霉素(Gentamicin)、妥布霉素(Tobramycin)、丁胺卡那霉素(Amikacin)、新霉菌(Neomycin)、核糖霉素(Ribostamycin)、巴龍霉素(Paromomycin)、福提霉素(Fortimicin)、地貝卡星(Dibekacin)、異帕米星(Isepamicin)、達地米星(Dactimicin)、小諾霉素(Micronomicin)、大觀霉素(Spectinomycin)等等。這類抗菌素的性質穩定、抗菌譜廣，抗菌機制是作用于細菌體內的核糖體，抑制蛋白質合成，既有抑菌作用，又有強大的殺菌作用。這類藥物又稱為靜止期殺菌劑。
在微生物對該類藥物的耐藥性機制中，產生鈍化酶是重要原因，主要有三類酶，每類酶又包括多種異構酶，總數已高達數十種之多。這些酶在底物譜(或底物輪廓)、pI、分子量、酶活中心的氨基酸序列、編碼基因等方面存在一定的差異，但是，在功能上均是通過鈍化氨基糖苷類分子中的游離羥基或游離氨基而使藥物分子失去抗菌活性，表現為乙酰轉移酶(AAC)-使藥物分子中的游離氨基乙酰化，核苷轉移酶(AAD)-使藥物分子中的游離羥基核苷化，磷酸轉移酶(APH)-使藥物分子中的游離羥基磷酸化。氨基糖苷類藥物主要鈍化酶的種類和底物譜見表2，并將上述兩類耐藥酶的機制綜述于表3
表2主要氨基糖苷類鈍化酶的種類及其作用底物鈍化酶種類酶標記(異構)底物譜乙酰轉移酶AAC(2’) 慶大霉素、妥布霉素、奈替米星AAC(6’) 卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、奈替米星AAC(3) 慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、西索米星核苷轉移酶AAD(4’) 妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素AAD(2”) 慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、西索米星AAD(3”) 鏈霉素、大觀霉素AAD(6) 鏈霉素磷酸轉移酶APH(3’)-I，II， 卡那霉素、新霉素IIIAPH(3”) 鏈霉素APH(2”) 慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、西索米星APH(5”) 核糖霉素APH(6) 鏈霉素APH(2’) 慶大霉素、丁胺卡那霉素表3 主要抗菌藥物的耐藥性機制藥物類型 主要耐藥機制 耐藥酶舉例耐藥酶滅活 β-內酰胺酶類，如青霉素β-內酰胺類青霉素結合蛋白(PBP)的低親 酶、頭孢菌素酶、廣譜酶、
合力 超廣譜酶等。
外膜孔蛋白(通道蛋白)變異耐藥酶滅活 乙酰轉移酶氨基糖苷類核糖體(靶位)耐受 磷酸轉移酶藥物轉運不當 核苷轉移酶等二.發明詳述菌株本發明的一方面提供了具有耐藥性的菌株。
發明人從臨床樣本獲取的大腸埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、銅綠假單胞菌(P.aeruginose)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、弗勞地枸椽酸菌(C.freundii)等二十余株多重耐藥性抗生素抗性菌株中，篩選出具有高表達的β-內酰胺酶活性或氨基糖苷鈍化酶活性菌株，特別是氨基糖苷乙酰轉移酶活性的菌株。
多核苷酸(一)本發明的一個目標是提供編碼β-內酰胺酶多肽的多核苷酸，特別是編碼此處命名為ESBL的多肽的多核苷酸。
在本發明一個特別優選的實施方案中，所述多核苷酸包括一段陳述于SEQ ID NO1，的序列，或者其編碼基本具有β-內酰胺酶活性的活性多肽的變體。
SEQ ID NO1的多核苷酸，是來自肺炎克雷伯菌菌株編碼超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)的多核苷酸。
本發明編碼β-內酰胺酶多肽的多核苷酸，例如陳述于SEQ IDNO1的多核苷酸序列，可以通過使用標準的克隆和篩選方法得到，例如使用本發明的肺炎克雷伯菌菌株細胞作為起始材料，從細菌中分離總DNA，用來自部分序列的放射性標記的寡聚核苷酸探測總DNA克隆文庫。然后，通過雜交條件，可以辨別出攜有與探針DNA同源的DNA的克隆。通過使用按多核苷酸序列設計的測序引物，對經雜交鑒定的單個克隆進行測序，有可能對多核苷酸序列向兩個方向進行擴增，以確定全長基因序列。例如，方便起見，使用由質粒克隆制備的變性的雙鏈DNA進行測序。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLONE，A LABORATORYMANUAL)，第二版；冷泉港實驗出版社，冷泉港，紐約(1989)中對合適的方法進行了描述。
此外，陳述于SEQ ID NO1的DNA序列，包含編碼蛋白質的開放閱讀框架，該蛋白質具有陳述于SEQ ID NO2中的大約氨基酸殘基數目，本領域技術人員可以方便地推導其分子量。
本發明提供的一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列組成(a)一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列與SEQ ID NO1就SEQ ID NO1全長而言，分別有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選有85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者完全同一；或者(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ IDNO2的氨基酸序列分別就SEQ ID NO2全長而言有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選至少85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者100％同一。
本發明提供了一種多核苷酸序列，其全長與SEQ ID NO1的編碼序列(開放閱讀框架)同一。本發明也提供了一段編碼成熟多肽或者其片段的序列本身，以及閱讀框架中有另一段編碼序列，例如編碼前導序列或者分泌序列，前蛋白質序列，或原蛋白質序列，或前原蛋白質序列的序列的編碼成熟多肽或者其片段的編碼序列。本發明的多核苷酸也包括至少一段非編碼序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非編碼序列，例如轉錄但并不翻譯的序列，終止信號(例如rho-依賴的終止信號和rho-不依賴的終止信號)，核糖體結合位點，Kozak序列，穩定mRNA的序列，內含子，以及多腺苷酸化信號。
多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一段有助于純化融合多肽的標記序列。在本發明的特定實施方案中，標記序列是6xHN標記物，有助于純化與之融合的多肽序列。
本發明的多核苷酸也包括但不局限于，包含結構基因和控制基因表達的天然結合序列的多核苷酸。
本發明還包括這樣的核苷酸序列，其因為遺傳密碼的簡并性而編碼SEQ ID NO2的超廣譜β-內酰胺酶多肽的核苷酸序列，換言之，它可以是一段編碼SEQ ID NO2的多肽的序列，該序列是遺傳密碼簡并的結果。
(二)本發明的一個目標是提供編碼氨基糖苷鈍化酶，特別是乙酰轉移酶多肽的多核苷酸，特別是編碼此處命名為aaC2的多肽的多核苷酸。
在本發明一個特別優選的實施方案中，所述多核苷酸包括一段陳述于SEQ ID NO3，的序列，或者其變體。
SEQ ID NO3的多核苷酸，是來自大腸埃希菌菌株編碼乙酰轉移酶多核苷酸。
本發明編碼乙酰轉移酶多肽的多核苷酸，例如陳述于SEQ ID NO3的多核苷酸序列，可以通過使用標準的克隆和篩選方法得到，例如使用本發明的大腸埃希菌菌株細胞作為起始材料，從細菌中分離總DNA，用來自部分序列的放射性標記的寡聚核苷酸探測總DNA克隆文庫。然后，通過雜交條件，可以辨別出攜有與探針DNA同源的DNA的克隆。通過使用按多核苷酸序列設計的測序引物，對經雜交鑒定的單個克隆進行測序，有可能對多核苷酸序列向兩個方向進行擴增，以確定全長基因序列。例如，方便起見，使用由質粒克隆制備的變性的雙鏈DNA進行測序。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLONE，A LABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港實驗出版社，冷泉港，紐約(1989)中對合適的方法進行了描述。
此外，陳述于SEQ ID NO3的DNA序列，包含編碼蛋白質的開放閱讀框架，該蛋白質具有陳述于SEQ ID NO4中的大約氨基酸殘基數目，本領域技術人員可以方便地推導其分子量。
本發明提供的一種分離出的多核苷酸，該多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列組成(a)一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列與SEQ ID NO3就SEQ ID NO3全長而言，分別有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選有85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者完全同一；或者(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO4的氨基酸序列分別就SEQ ID NO4全長而言有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選至少85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者100％同一。
本發明提供了一種多核苷酸序列，其全長與SEQ ID NO3的編碼序列(開放閱讀框架)同一。本發明也提供了一段編碼成熟多肽或者其片段的序列本身，以及閱讀框架中有另一段編碼序列，例如編碼前導序列或者分泌序列，前蛋白質序列，或原蛋白質序列，或前原蛋白質序列的序列的編碼成熟多肽或者其片段的編碼序列。本發明的多核苷酸也包括至少一段非編碼序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非編碼序列，例如轉錄但并不翻譯的序列，終止信號(例如rho-依賴的終止信號和rho-不依賴的終止信號)，核糖體結合位點，Kozak序列，穩定mRNA的序列，內含子，以及多腺苷酸化信號。
多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一段有助于純化融合多肽的標記序列。在本發明的特定實施方案中，標記序列是6xHN標記物，有助于純化與之融合的多肽序列。
本發明的多核苷酸也包括但不局限于，包含結構基因和控制基因表達的天然結合序列的多核苷酸。
本發明還包括這樣的核苷酸序列，其因為遺傳密碼的簡并性而編碼SEQ ID NO4的氨基糖苷乙酰轉移酶多肽的核苷酸序列，換言之，它可以是一段編碼SEQ ID NO4的多肽的序列，該序列是遺傳密碼簡并的結果。
多肽(一)本發明一方面提供了肺炎克雷伯菌的超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)多肽，以及其基本具有β-內酰胺酶活性的變體。
本發明進一步提供了(a)一種分離出的多肽，或其基本具有β-內酰胺酶活性的片段，該多肽包含一段氨基酸序列，這段氨基酸序列與SEQ ID NO2有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選有至少85％同一性，更優選有至少90％的同一性，更優選至少95％的同一性，最優選至少97-99％的同一性或者完全同一；(b)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽，或其基本具有β-內酰胺酶活性的片段，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，這段多核苷酸序列與SEQ ID NO1，就SEQ ID NO1全長而言，分別有70％同一性，優選有80％同一性，更優選有至少85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者完全同一；(c)上述多肽的變體，即通過保守氨基酸置換而與原多肽不同的多肽，由此一個殘基被另一個具有相似特性的殘基所置換。典型的這種置換發生在丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸之間；絲氨酸和蘇氨酸之間；酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間；天冬酰胺和谷氨酰胺之間；以及堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間；或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
優選的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO2氨基酸序列或其變體的截斷多肽，例如一系列包含氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基。由宿主細胞或者在宿主細胞中產生的本發明多肽的降解形式也是優選的。
特別優選的是其中的幾個，5-10，1-5，1-3，1-2或1個氨基酸以任意組合被置換、刪除或者添加的變體。
本發明的多肽，可以以“成熟的”蛋白質形式存在或者以其例如前體形式存在。包含一段額外的氨基酸序列常常是有利的，這種額外的氨基酸序列包括分泌或者前導序列，原序列(pro-sequence)。
本發明的多肽可以用任何合適的方式制備。這樣的多肽包括分離出的天然存在的多肽，重組產生的多肽，合成產生的多肽，或者這些方法結合產生的多肽。制備這些多肽的方法在本領域是熟知的。
其中的幾個，少數，5-10個，1-5個，1-3個，2個，1個氨基酸或沒有氨基酸，以任意組合被置換、修飾，刪除和/或添加。其中特別優選的是不改變ESBL多肽的性質和活性的沉默置換、刪除和添加。
(二)本發明一方面提供了大腸埃希菌菌株的氨基糖苷乙酰轉移酶多肽，以及其變體。
本發明進一步提供了(d)一種分離出的多肽，或其基本具有氨基糖苷乙酰轉移酶活性的片段，該多肽包含一段氨基酸序列，這段氨基酸序列與SEQ IDNO4有至少70％同一性，優選有80％同一性，更優選有至少85％同一性，更優選有至少90％的同一性，更優選至少95％的同一性，最優選至少97-99％的同一性或者完全同一；(e)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽，或其基本具有氨基糖苷乙酰轉移酶活性的片段，該多核苷酸包含一段多核苷酸序列，這段多核苷酸序列與SEQ ID NO3，就SEQ ID NO3全長而言，分別有70％同一性，優選有80％同一性，更優選有至少85％同一性，更優選至少90％的同一性，甚至更優選至少95％的同一性，更優選至少97-99％的同一性或者完全同一；(f)上述多肽的變體，即通過保守氨基酸置換而與原多肽不同的多肽，由此一個殘基被另一個具有相似特性的殘基所置換。典型的這種置換發生在丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸之間；絲氨酸和蘇氨酸之間；酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間；天冬酰胺和谷氨酰胺之間；以及堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間；或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
優選的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO4氨基酸序列或其變體的截斷多肽，例如一系列包含氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基。由宿主細胞或者在宿主細胞中產生的本發明多肽的降解形式也是優選的。
特別優選的是其中的幾個，5-10，1-5，1-3，1-2或1個氨基酸以任意組合被置換、刪除或者添加的變體。
本發明的多肽，可以以“成熟的”蛋白質形式存在或者以其例如前體形式存在。包含一段額外的氨基酸序列常常是有利的，這種額外的氨基酸序列包括分泌或者前導序列，原序列(pro-sequence)。
本發明的多肽可以用任何合適的方式制備。這樣的多肽包括分離出的天然存在的多肽，重組產生的多肽，合成產生的多肽，或者這些方法結合產生的多肽。制備這些多肽的方法在本領域是熟知的。
其中的幾個，少數，5-10個，1-5個，1-3個，2個，1個氨基酸或沒有氨基酸，以任意組合被置換、修飾，刪除和/或添加。其中特別優選的是不改變AAC多肽的性質和活性的沉默置換、刪除和添加。
融合蛋白另一方面，本發明涉及遺傳工程制備的包含本發明多肽或者其片段的融合蛋白，這些蛋白質可以化學結合，也可以作為重組融合蛋白表達，融合蛋白與非融合蛋白相比，可以增加在表達系統中的產量。
在本發明的一個實施例中，該融合蛋白通過遺傳工程制備，具體而言，發明人構建了包含氨基糖苷乙酰轉移酶及超廣譜β-內酰胺酶編碼基因的表達載體，通過將此載體轉化宿主細胞，通過本領域技術熟練者熟知的方法制備本發明的重組多肽。
組合物本發明也涉及這樣的組合物，該組合物包含此處討論的抗生素抗性菌和/或多核苷酸和/或多肽。例如，這種組合物包括，治療有效量的本發明的抗生素耐藥菌和/或多肽和/或多核苷酸以及可藥用載體或者賦形劑。
本發明藥物組合物可以以任何有效方便的方式給藥，例如其中包括局部用藥，口服，肛門用藥，陰道用藥，靜脈內用藥，腹膜內用藥，肌內用藥，皮下用藥，鼻內用藥或皮內用藥途徑，其形式可以是常用的無毒性的藥物上可接受的載體混合制成片劑、丸劑、膠囊、栓劑、溶液、乳劑、混懸劑、注射劑、軟膏、涂抹劑、滴眼液、洗劑、凝膠、霜劑和任意其它適用的劑型等等。這種載體可以包括但是不局限于鹽水，緩沖液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它們的混合物。制劑應當適合用藥的方式。
本發明的環保制劑包括液態、固態、粉劑、微膠囊劑、顆粒制劑。就其屬性而言，包括消毒劑、清洗劑等。
本發明的化合物可以組合藥學上可接受的緩釋基質例如生物可降解性聚合物以形成緩釋制劑。緩釋基質選自生物可兼容性材料例如脂質體、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(羥基乙酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共聚物)聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、多氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。優選的生物可降解性基質是聚丙交酯和聚乙交酯之一或者為聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共聚物)。
局部給藥方式包括給藥至皮膚、粘膜和肺以及眼睛的表面。局部給藥的組合物包括吸入劑，可以制備成干粉，所述干粉可以高壓密封，也可以不加壓。如果是對眼局部給藥，本發明的化合物在可藥用的眼用載體中釋放，可藥用的眼用載體包括例如軟膏、植物油或膠囊包封材料。
本發明的化合物可以加壓密封，并含有壓縮氣體例如氮氣和夜化氣體拋射劑。液化拋射劑基質和真正的總組合物優選這樣的形式活性成分不在非常大的程度上溶解。該加壓密封的組合物還可以含有表面活性劑例如液體或固體非離子表面活性劑或者可以是固體陰離子表面活性劑。優選應用鈉鹽形式的固體非離子表面活性劑。
直腸或陰道給藥組合物優選栓劑，其制備方式是將本發明的化合物同合適的非刺激性載體或輔料例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟，它們在室溫下為固體，但在體溫下為液體，因此在直腸或陰道中溶解，釋放出活性化合物。
陰道給藥組合物還優選泡騰劑。其制備方式是將本發明的化合物同合適的非刺激性載體或輔料及發泡劑，如碳酸氫鈉等在陰道環境下產生氣泡的藥劑混合。
本發明的組合物還含有助劑、穩定劑、增稠劑、增溶劑和著色劑以及香料。優選的，含有酶穩定劑。
圖1描述機體與環境微生態菌群的保護、耐藥性菌群，及其相互之間的關系。
圖2描述本發明所涉及的技術路線。
圖3表達載體質粒圖譜說明pPROTet.E 6×HN是Clontech公司產品，為融合蛋白原核表達系統。Plteto-1雜合型啟動子-操縱子；RBS核糖體結合位點；6×HN表位標志序列；EK site腸激酶酶切位點；T1轉錄終止序列；ColE1復制起始子；t0轉錄終止序列；Cmr氯霉素耐藥基因。該系統優點具有強效順式作用元件Plteto-1；融合蛋白中的6×HN tag可易被商品化的免疫親和層析試劑分離純化；可利用腸激酶得到天然蛋白；具有Cmr基因。
圖4、表達產物的SDS凝膠電泳照片。
以下實例是用標準技術進行的，這些技術，除了另外詳細描述的以外，對于本領域技術人員來說都是熟知的和常規的。實施例是說明性的，但是不限制本發明。
實施例11、具有β-內酰胺酶活性肺炎克雷伯菌的篩選用E-Test方法(E-試驗試劑盒為瑞典AB Biodisc.Co.產品)對40株β-內酰胺酶和乙酰轉移酶陽性的多重耐藥性臨床分離菌株進行篩選，從病人樣本分離到肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株，發酵擴增并分離了部份BLA(參考文獻Edited byV.Lorian.Antibioticin Laboratory Medicine.2nd.Williams &Wilkins，Baltimore，1986，陸永綏、陳秀樞等，六種β-內酰胺酶定性試驗方法評價及其臨床應用，中華醫學檢驗雜志1993.16328；孫長貴、陳漢美等，評價三種篩選方法檢測超廣譜β-內酰胺酶及其臨床應用，中華醫學檢驗雜志1999.22228))，評價其底物譜與酶的比活力。結果證明，同一菌株可以表達不同的酶型，不同酶型之間的底物譜及其水解能力存在一定的差異。見表6。
表6、四類底物譜命名的β-內酰胺酶底物譜與活力底物 青霉素酶 頭孢菌素酶 廣譜酶超廣譜酶Penicillin 2+1+ 3+ 3+Oxacillin1+-1+ 3+Carbenicillin1+-1+ 3+Cephalothin 1+3+ 2+ 2+Cefuroxime - -1+ 2+Cefotaxime - -1+ 2+Moxalactam - -- 2+Aztreonam - -1+ 1+Imipenem - -- 3+注“1+”代表以各種藥物為底物、酶活力近似為1,000 IU/mg酶蛋白；國際單位定義為37℃、pH4.0-8.5的條件下，每分鐘水解或滅活1μmol底物為一個單位。
實施例2酶在體內滅活β-內酰胺藥物及其保護正常微生物菌群的效力，9只日本大耳白家兔，分三組(3只/組)。空白組不給藥，給予等體積的無菌生理鹽水；對照組和試驗組分別靜脈大劑量(0.3克/kg體重)給予頭孢氨噻肟(Cefotaxime)，每日兩次，連續三天；試驗組在使用抗菌素的同時，立即直腸給予β-內酰胺酶制劑(為廣譜和超廣譜酶的混合制劑)；三組受試兔同樣條件飼養與護理，于用藥當日起，每天采糞樣作腸道厭氧菌總數和腸桿菌總數的定量分析，連續四日；結果證明試驗組與空白組之間菌群總數定量結果差異不顯著(P＞0.05)；而對照組菌群總數定量明顯減少，與試驗組和空白組相比，差異非常顯著(P＜0.01)；上述結果證明，β-內酰胺酶混合酶制劑在藥物治療期具有顯著的保護腸道菌群與微生態平衡的作用。
實施例3.具有氨基糖苷類藥物鈍化酶活性的大腸埃希菌菌株的分離用E-Test方法對40株β-內酰胺酶和氨基糖苷酶陽性的多重耐藥性臨床分離菌株進行篩選，從臨床樣本中分離大腸埃希菌菌株，發酵擴增，分離獲取了乙酶轉移酶(AAC)、核苷轉移酶(AAD)和磷酸轉移酶(APH)，對其體外滅活該類抗菌藥物的能力進行實驗，結果見表7。
表7、三種氨基糖苷類藥物鈍化酶不同型別的底物譜抗 菌 藥物酶型 慶大霉素 卡那霉素妥布霉素 丁胺卡那霉素(Geniamicin)(Kanangcin)(Tobramycin) (Aamikacin)乙酰轉移酶AAC(2’) 2+ - + -AAC(6’) - 2++ 2+AAC(3’) 3+ 2+2+ 2+核苷轉移酶AAD(4’) - 2+2+ 2+AAD(2”) 2+ 2+2+ ±磷酸轉移酶APH(3’) - 2+- +APH(2’) 2+ + - 2+注“1+”代表以各種藥物為底物、酶活力近似為500 IU/mg酶蛋白；單位定義同表6。
實施例4酶在體內滅活氨基糖苷類藥物及其保護正常微生物菌群的效力，為了評價該類酶在體內滅活氨基糖苷類藥物的能力，我們以三組酶(AAC、AAD、APH)的混合酶制劑(包括不同類型)，對9只日本大耳白家兔進行平行對照試驗，分三組(3只/組)。設空白組不給藥，給予等體積的生理鹽水；對照組給藥，但不給予酶制劑；試驗組給藥后立即直腸給予酶制劑；給予藥物為丁胺卡那霉素(Amikacin)、靜脈給藥，每次2片，劑量為0.3克/kg體重，連續三天，于用藥當日起，每日采集糞樣作腸桿菌總數定量計數，連續四日。結果證明對照組與空白組、試驗組相比，腸桿菌總數非常顯著地減少(P＜0.01)，說明靜脈給藥已導致腸道的腸桿菌被大量被殺滅；而試驗組和空白組之間腸桿菌總數相差不顯著(P＞0.05)，說明酶制劑對靜脈用藥后的腸道菌群具有顯著地保護作用。
實施例5從耐藥菌肺炎克雷伯菌菌株分離超廣譜β-內酰胺酶ESBL基因1.從耐藥菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株提取總DNA(參考文獻《精編分子生物學實驗指南》，科學出版社，199939頁)。
2.用于擴增超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)基因的引物的設計根據美國gene bank of 027199 Kebsiella pneumoniae plasmidpkk50-2 EXTEND3ED SPECTRUM BETA-LACTAMATASE(BLAtem-52)genecompletete cds公布的信息，設計了以下一對引物上游引物218-2395’GGT GGTGGCGGCGGATCTAGTATTCAACATTTTCGTGTCG 3’(g gatcc)BamHI中間接頭(link)下游引物1040-10623’CGACTCTATCCACGGAGTGACTA TCTAGAGCA 5’XbaI(t ctaga)其中，下劃線的堿基表示限制性內切酶位點。
3.經PCR擴增獲得超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)基因取1微克步驟1中獲得的DNA，按照Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLONE，ALABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港實驗出版社，冷泉港，紐約(1989)的方法擴增ESBL基因。
實施例6從大腸埃希菌(Escherichia coli.)菌株分離氨基糖苷乙酰轉移酶aacC2-Link基因。
1.從大腸埃希菌(Escheri chia coli.)菌株分離總DNA，2.根據美國gene bankgi|45769|emb|X54723.1|PRAACC2E.coliR-plasmid aacC2 gene foraminoglycos ide-(3)-N-acetyl transferase設計用于擴增氨基糖苷乙酰轉移酶aacC2基因的引物aacC2-Link上游引物822-8435’ACGC CATACGCGGAAGGCAATAACGG3’SalI(g tcgac)下游引物1657-16793’CGAGAACGCTCGGAAGTCCAATCCCACCGCCACCTAGACCGCCACCA CCA 5’中間接頭(link) BamHI其中，連接aacC2和ESBL的中間接頭是一含15個氨基酸的短肽(Gly4Ser)3，在其編碼序列5′GGTGGCGGTGGATCTGGCGGTGGT GGTGGCGGCGGATCT3′中后部。設計出一個BamHI位點，(利用簡并性)aacC2-Link下游引物和ESBL上游引物的合成均起始于此位點4.經PCR擴增獲得氨基糖苷乙酰轉移酶aacC2-Link基因取1微克步驟1中獲得的DNA，按照Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆實驗手冊(MOLECULAR CLONE，ALABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港實驗出版社，冷泉港，紐約(1989)的方法擴增aacC2基因。
實施例7具有超廣譜β-內酰胺酶和氨基糖苷乙酰轉移酶活性的融合蛋白的生產1.質粒pPaacC2-L的構建將aacC2-link的SalI/BamHI酶切產物與pPROTet.E的BamHI/SalI酶切產物(大片段)按正確的讀碼框進行連接.
2構建質粒pPALE將重組質粒pPaacC2-L再進行BamHI/XbalI酶切，將其大片段與ESBL的BamHI/XbalI酶切產物進行連接，構建質粒pPALE。
實施例8融合蛋白的原核表達將pPALE質粒轉化宿主菌DH5aPRO E.coli(Clontech公司產品)-，以LB+氯霉素(20微克/毫升)進行抗性篩選.選獲高效表達菌，命名為CWL888。通過發酵、色譜純化(Clontech公司產品TALONTMPurification Kit(#K1253-1)獲得純品(見圖8)，純化融合蛋白的分子量為65 KD、等電點為(pI)7.8、氨基酸序列如下述。該重組性融合酶以氨芐青霉素、丁胺卡那霉素為底物的比活分別為≥2,000IU/mg酶蛋白和≥1,000 IU/mg酶蛋白。
實施例9超廣譜β-內酰胺酶ESBL基因的測序測序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，以5’&3’PROTetSequencing Primers為測序引物，序列見SEQ ID No1。
實施例10AAC基因的測序測序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，5’& 3’PROTetSequencing Primers為測序引物，序列見SEQ ID No3。
實施例11本發明的融合基因的測序測序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，5’& 3’PROTetSequencing Primers為測序引物，序列見SEQ ID No5。實施例12.500mg的腸溶性膠囊，每個膠囊含有融合蛋白(BLA+AAC)4mg胰蛋白酶抑制劑 120mg低聚果糖(FOS)350mg硬脂酸鎂 26mg實施例13.500mg的陰道泡騰片，每片含有融合蛋白(BLA+AAC)2mg胰蛋白酶抑制劑 18mg硼酸 120mg碳酸氫鈉 60mg低聚果糖(FOS)200mg硬脂酸鎂100mg實施例14.500mg的陰道泡騰片，每片含有BLA 1mgAME 1mg胰蛋白酶抑制劑 18mg硼酸 120mg碳酸氫鈉 60mg低聚果糖(FOS)200mg硬脂酸鎂 100mg實施例15.20％微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm)，含融合蛋白(BLA+AAC)20g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實施例16.20％微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm)，含AME 20g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實施例17.20％微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm，含BLA 10gAME 10g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實施例18.急性經口毒性試驗一、材料和動物1.受試物實施例14的陰道泡騰片，樣品為淺乳黃色粉狀。
2.動物ICR小白鼠20只，體重18-22g，由昆明醫學院省重點天然藥物藥理試驗室提供(動物合格證號滇實動證第9806號)。二、方法1.檢驗依據《消毒技術規范》第三版第一分冊3.4急性經口毒性試驗。
2.試驗方法取20只動物，雌雄各半，灌胃前動物禁食12h，一次經口灌胃，連續觀察14天，記錄動物中毒癥狀及死亡情況。三、試驗結果陰道泡騰片對小鼠急性經口毒性試驗結果動物性別劑量 動物數 死亡動物數死亡率(mg/kg.bw) (只) (只)(％)雌 5000 100 0雄 5000 100 0受試動物在觀察期間，未見動物有明顯中毒癥狀，未見死亡。半數致死量LD50＞5000mg/kg.bw四、結論在本實驗條件下，受試物陰道泡騰片對受試動物小白鼠急性經口毒性試驗按急性毒性LD50劑量分級標準判定為實際無毒。
2.動物日本大耳白兔4只，雌雄各半，體重2.4kg-2.8kg，由昆明醫學院提供，合格證號云動管第9903號。二、方法1.檢驗依據《消毒技術規范》第三版第一分冊3.7眼刺激試驗。
2.方法取受試物0.1g濕潤后置于受試動物一側眼結膜囊內，使眼被動閉合4s，用生理鹽水沖洗5min。于滴眼后6h、24h、48h、4d、7d用肉眼觀察動物眼結膜、虹膜和角膜的損傷和恢復情況。另一側眼作為正常對照。三、實驗結果陰道泡騰片對大白兔眼睛刺激試驗結果動物 觀察 眼刺激性反應積分編號 部位 6h 24h 48h72h 4d 7d樣品 對照 樣品 對照 樣品 對照 樣品 對照 樣品 對照 樣品 對照角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 01結膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 02結膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 03結膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 04結膜4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0各時間積分指 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0數染毒后前7天最高積分指數 1四、結論在本試驗條件下，受試物陰道泡騰片對大白兔眼刺激試驗按眼刺激強度評價標準判定為無刺激性。
2.動物日本大耳白兔4只，雌雄各半，體重2.1kg-2.4kg，由昆明醫學院提供，動物合格證號云動管第9903號。二、方法1.檢驗依據《消毒技術規范》第三版第一分冊3.6皮膚刺激試驗。
2.試驗前24h，將大白兔背部脊柱兩側的毛剪掉，去毛范圍約3×3cm2。取受試物0.5g直接涂抹于預先潤濕的一側皮膚上。用潔凈紗布覆蓋，再用無刺激性膠布固定。另一側為空白對照。4h后取掉紗布，用溫水除去殘留受試物，于除去受試物后1h、24h、48h觀察皮膚局部反應，進行刺激反應評分。三、實驗結果陰道泡騰片對家兔皮膚一次刺激反應評分
在觀察期間，試驗動物經受試物作用部位未見紅斑，水腫和其它毒性作用。四、結論在本實施條件下，受試物陰道泡騰片對受試動物大白兔皮膚刺激試驗按皮膚刺激強度分級判定為無刺激性。實施例21 小鼠髓嗜多染紅細胞微核試驗一、材料和動物1.受試物實施例14的陰道泡騰片，樣品為淺乳黃色粉狀。
2.陽性物環磷酰胺。由上海華聯制藥有限公司生產。
3.動物昆明種小白鼠，由中科院昆明動物研究所提供(動物合格證號滇實動證第9712號)。二、方法1.檢驗依據《消毒技術規范》第三版第一分冊3.11.4小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗。
2.試驗方法，選用體重25-30g小白鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。設3個劑量組和陰性對照組及陽性對照組(環磷酰胺40mg/kg.bw)，采用30h二次灌胃法，于第二次染毒后6h取材，用小牛血清沖洗骨髓腔，常規制片染色鏡檢，每只小鼠計數1000個嗜多染紅細胞(PCE)中微核細胞數，計算不同性別動物微核率。三、試驗結果陰道泡騰片小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果
采用X2檢驗對結果進行統計，各劑量組微核細胞率與陰性對照組比較差異無顯著性，p＞0.05，各劑量組間無劑量反應關系。四、結論在本試驗條件下，受試物陰道泡騰片對小鼠骨髓嗜多染紅細胞無致微核作用。
序列表<110>陳秀樞<120>β-內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶基因，其融合基因及表達產物，其組合物，在醫學及環境保護中的應用<130><140><141>2002/02/11<160>6<170>Patentln Vers.2.0<210>1<211>1620<212>DNA<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)<400>11 ataaaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgctta tttttatagg ttaatgtcat61 gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc121 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg181 gtaaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt ttcgtgtcgc241 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt301 gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct361 caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac421 ttttaaagtt ctgctatgtg gtgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact481 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttaag tactcaccag tcacagaaaa541 gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga601 taacactgct gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt661 tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga721 agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gacgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg781 caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat841 ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat901 tgctgataaa tctggagcca gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc961 agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga1021 tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc<210>2<211>268<212>PRT<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<400>2MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW<210>3<211>1620<212>DNA<213>大腸埃希菌(E.coli)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)1 tttggtactc tcagaatacc cttttgagtt cgtttttgtg ccaacagaac agcccgtagg61 taaatctcgg agcatttcag gaagtgtctg tgtgagttga atctgaatggcagttaatat121 tttagtggtc aaggtcttag gcgagttgaa tgcagggcga cctcgttttttggcaggcgg181 ttttacaaca ggagggagaa ctattttctc aacaccttcg cgtgctggaatcatggttgc241 atcacggact aatatgaccg attaacgtat ccgcaagatt ggacttcaccatctgctcat301 gaacgcgagt ggttagttta cgcgctgcaa attcagcaaa aacacggctaaatgtccctt361 cgctgggtag ttttttatac agattgaagc cgcaaattcg ccgcaatctacgatcaactt421 ctaggcgttc aatcaagccc cgtgtggtga cgataccaag ttcagcttttgcaataaaag
481 gcacatgcca aagcgcagcg gtcagcagga ggtcttccca cagcacacccttgatattgg541 tataccaagg attcgatgtc actccactcg agcacacgaa taatgcgttcgagctttgag601 ctgatgccgt cctaaatcgg ctgcgactaa aggaataagt tcgtattgtaaggcttgaaa661 ccgttgtttg agaaaagggc ttaatgtagt attcatgctg tagatgttagggtgttggtt721 tagaagctca ttttaacatc tacaactttt ttcaaaaaat gttaattcaggctgtttgtg781 gagttttgca agtgcctcga tttagaggag atatcgcgat gcatacgcggaaggcaataa841 cggaggcgct tcaaaaactc ggagtccaaa ccggtgacct attgatggtgcatgcctcac901 ttaaagcgat tggtccggtc gaaggaggag cggagacggt cgttgccgcgttacgctccg961 cggttgggcc gactggcact gtgatgggat acgcatcgtg ggaccgatcaccctacgagg1021 agactcgtaa tggcgctcgg ttggatgaca aaacccgccg tacctggccgccgttcgatc1081 ccgcaacggc cgggacttac cgtgggttcg gcctgctgaa tcagtttctggttcaagccc1141 ccggcgcgcg gcgcagcgcg caccccgatg catcgatggt cgcggttggtccactggctg1201 aaacgctgac ggagcctcac aagctcggtc acgccttggg ggaagggtcgcccgtcgagc1261 ggttcgttcg ccttggcggg aaggccctgc tgttgggtgc gccgctaaactccgttaccg1321 cattgcacta cgccgaggcg gttgccgata tccccaacaa acggcgggtgacgtatgaga1381 tgccgatgct tggaagcaac ggcgaagtcg cctggaaaac ggcatcggattacgattcaa1441 acggcattct cgattgcttt gctatcgaag gaaagccgga tgcggtcgaaactatagcaa1501 atgcttacgt gaagctcggt cgccatcgag aaggtgtcgt gggctttgctcagtgctacc1561 tgttcgacgc gcaggacatc gtgacgttcg gcgtcaccta tcttgagaagcatttcggaa1621 ccactccgat cgtgccagca cacgaagtcg ccgagtgctc ttgcgagccttcaggttaga1681 ggccgtcgac aatgataatc tggatcaacg gacctttcgg cgcgggaaagacgacgctcg1741 ctgagcggtt gcgcgatcgg cgttccaaat cgctgatctt tgaccccgaggaaatcgggt1801 tcgttgtgaa agaaacggtc cccatgccgg cgagcggaga ctatcaggatctcctattat1861 gcaattaatc caaaaactgc ccagaaagtt aataatctag aattctttcccttgagtatt1921 caaaggaact tctaataaat attattcaag aaaataaaca atctattcaaaaaattgaag1981 aaatattaca taccataata cctgttcagt tatctgaaga ttctgaaaatgaatatcaac2041 gagtgctgtc aaaatcaata aatgcagcat ttaaaaactg cggagccaaagaaggagaaa2101 ttattcaagg gcaacacata aataagttag tagaatgtct actagaagaattaactcctt2161 ggataaatca taacatcaag aaatagacca ttaattgaac caatttcttaaagttctagt2221 agtcacatct agctgctttg aaatttcaat attccccata ccctgctttt taa<210>4<211>491<212>PRT<213>大腸埃希菌(E.coli)“MHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPSG<210>5<211>1748<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<223>斜體下劃線為LinkCATACGCGGAAGGCAATAACGGAGGCGCTTCAAAAACTCGGAGTCCAAACCGGTGACCTATTGATGGTGCATGCCTCACTTAAAGCGATTGGTCCGGTCGAAGGAGGAGCGGAGACGGTCGTTGCCGCGTTACGCTCCGCGGTTGGGCCGACTGGCACTGTGATGGGATACGCATCGTGGGACCGATCACCCTACGAGGAGACTCGTAATGGCGCTCGGTTGGATGACAAAACCCGCCGTACCTGGCCGCCGTTCGATCCCGCAACGGCCGGGACTTACCGTGGGTTCGGCCTGCTGAATCAGTTTCTGGTTCAAGCCCCCGGCGCGCGGCGCAGCGCGCACCCCGATGCATCGATGGTCGCGGTTGGTCCACTGGCTGAAACGCTGACGGAGCCTCACAAGCTCGGTCACGCCTTGGGGGAAGGGTCGCCCGTCGAGCGGTTCGTTCGCCTTGGCGGGAAGGCCCTGCTGTTGGGTGCGCCGCTAAACTCCGTTACCGCATTGCACTACGCCGAGGCGGTTGCCGATATCCCCAACAAACGGCGGGTGACGTATGAGATGCCGATGCTTGGAAGCAACGGCGAAGTCGCCTGGAAAACGGCATCGGATTACGATTCAAACGGCATTCTCGATTGCTTTGCTATCGAAGGAAAGCCGGATGCGGTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCATCGAGAAGGTGTCGTGGGCTTTGCTCAGTGCTACCTGTTCGACGCGCAGGACATCGTGACGTTCGGCGTCACCTATCTTGAGAAGCATTTCGGAACCACTCCGATCGTGCCAGCACACGAAGTCGCCGAGTGCTCTTGCGAGCCTTCAGGTTAG AGTATTCAACATTTTCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGTGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTAAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGACGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCAGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT<210>6<211>583<212>PRT<213>人工序列<223>斜體下劃線為LinkHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPS IQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW
權利要求
1.一種β內酰胺酶基因，它是SEQ.ID.NO 1，及其能夠編碼具有β內酰胺酶活性的多肽的變體。
2.權利要求1的β內酰胺酶基因，它分離自肺炎克雷伯菌菌株。
3.一種氨基糖苷鈍化酶基因，它是SEQ.ID.NO 3，及其能夠編碼具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
4.權利要求3的氨基糖苷鈍化酶基因，它分離自權利要求大腸埃希菌菌株。
5.一種β內酰胺酶，它是SEQ.ID.NO 2，及其具有β內酰胺酶活性的多肽的變體。
6.權利要求5的β內酰胺酶，它分離自肺炎克雷伯菌菌株。
7.一種氨基糖苷鈍化酶，它是SEQ.ID.NO 4，及其具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
8.權利要求7的氨基糖苷鈍化酶，它分離自大腸埃希菌菌株。
9.由權利要求1或2的基因編碼的蛋白，及其具有β內酰胺酶活性的多肽的變體。
10.由權利要求3或4的基因編碼的蛋白，及其具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
11.β內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因，它是SEQ ID NO5，或其能夠編碼具有β內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶活性的變體.
12.一種融合蛋白，它由權利要求11的融合基因編碼，它是SEQ.ID.NO 6。
13.一種多肽，它是權利要求12的融合蛋白的具有β內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶活性的變體。
14.一種藥物組合物，它含有一種或多種權利要求5-13之任一的蛋白，及藥學上可接受的載體。
15.權利要求14的組合物在制備用于失活β內酰胺類和氨基糖苷類抗生素的制劑中的應用。
16.權利要求15的應用，該組合物是用于失活β內酰胺類和氨基糖苷類抗生素的陰道泡騰片。
17.權利要求15或16的應用，其中，該制劑用于保護非感染部位的正常微生物菌群免受殺滅。
18.權利要求15的應用，其中，該制劑用于特定環境中的殘留抗菌藥物的清除。
19.權利要求15的應用，其中，該制劑用于動物源食品的預處理，以降解其中所含的抗生素。
全文摘要
本發明涉及抗生素耐藥酶基因的分離，其融合基因的制備，及耐藥酶基因及融合基因表達產物的分離，含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物，及其在醫學和環境保護中的應用。具體的，本發明涉及β－內酰胺酶，氨基糖苷鈍化酶的編碼基因的分離，β－內酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的制備，及其表達產物的分離，含有該耐藥酶蛋白融合蛋白的組合物，及其在醫學和環境保護中的應用。
文檔編號A61P15/02GK1438315SQ02105038
公開日2003年8月27日 申請日期2002年2月11日 優先權日2002年2月11日
發明者陳秀樞 申請人:陳秀樞