專利名稱：新的人心肌特異的蛋白激酶及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明為一個與心肌細胞收縮、能量代謝、二惡英(dioxin)受體信號傳導通路有關的基因/蛋白p93，涉及生物醫學高技術中心血管病相關新基因的克隆及其蛋白的開發與應用領域。
心肌病是由心臟疾病導致死亡的一個重要死因。心肌病是指僅累及心肌細胞本身的一類心臟疾病，從功能上可分三類①擴張性②肥厚性③限制性。近年來研究發現，家族性心肌病的疾病基因有以下兩類①與心肌能量代謝有關的基因，包括參與脂肪酸氧化和線粒體氧化磷酸化的酶。②與心肌肌小節收縮蛋白和細胞骨架蛋白有關的基因。而且，肥厚性心肌病主要與肌小節組分突變有關，擴張性心肌病主要與肌小節和細胞骨架組分有關。
大部分心肌病是繼發性的，在對由心肌肥大引起的繼發性心肌病的研究中，發現了包括β-腎上腺素受體、MAPK級聯等在內的一系列可引發心肌肥大的信號傳導通路。然而闡明由肌小節收縮蛋白和/或細胞骨架缺陷引起的心肌病對進一步闡明繼發性心肌肥大非常關鍵，因為這些機制才是導致典型的心肌肥大最重要的機制，所以研究肌小節、細胞骨架、心肌能量代謝信號傳導通路缺陷引發心肌肥大成為當前心血管病分子生物學研究的熱點、難點。
先天性心臟病是另外一類與心臟發育有關的先天性畸形。研究發現90％的先心病屬多因素遺傳(即遺傳和環境因素相互作用)，除遺傳因素外，諸如風疹、飲酒、反應停、三甲雙酮等許多環境因素(即所謂致畸因子)可導致胎兒心血管發育畸形。心臟的正常發育受一系列信號傳導通路的精確調控，其通路中任何一個環節—包括通路本身基因突變和外界致畸因子影響，都有可能導致先天性心臟病的發生。
芳香烴受體(Aryl Hydrocarbon Receptor，AhR)，又稱二惡英(dioxin)受體，是一類在進化上高度保守的、結構上與果蠅的發育調節因子Sim及Per有共同特征的轉錄因子，可誘導一系列包括細胞色素P450、已醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)、苯醌還原酶(quinone reductase)在內的各種藥物代謝酶基因的表達，并主要參與對外界致畸因子反應的信號傳導通路。對先心病的遺傳學研究發現，作為環境致畸因子的受體，二惡英受體參與了心臟發育和心肌病的發生。對雞胚胎心臟發生的研究表明，作為AhR外源配基，環境致畸因子2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)可誘導心肌肥大和心臟間隔缺損的發生；敲除AhR基因的小鼠，全部出現伴有心肌肥大和局部纖維化的心肌疾病。然而作為孤兒受體，由AhR介導的這些信號傳導通路尚未闡明。
發明目的克隆鑒定上述信號傳導通路中的關鍵激酶p93，闡明其在心臟發育、心肌病等心臟疾病中的重要作用，從而為心血管病的診斷和治療提供新的思路。內容與要求應用生物信息學、cDNA文庫構建、DNA序列測定、分子克隆、Northern Blot、Dot Blot、基因免疫、原核和真核蛋白表達與純化、激酶活性體外分析、酵母雙雜交技術等，克隆編碼p93蛋白的新基因全長cDNA，獲知其在核酸水平的表達譜，獲得該基因的兔源多克隆抗體和有活性的目標蛋白，通過酵母雙雜交尋找與其相互作用的蛋白，以闡明目標蛋白的信號傳導通路和功能。該基因/蛋白達到的技術指標為1.p93的cDNA全長約3400bp，相應編碼的蛋白質有845aa。2.p93的編碼蛋白含3個蛋白結構域，N端為錨蛋白重復(ankyrin repeats)結構域，靠近C端有一激酶結構域，C末端為富含絲氨酸結構域(ser-rich)。3.該基因在心肌細胞特異表達。4.該基因編碼蛋白的激酶結構域具有激酶的自我磷酸化活性。5.該基因編碼蛋白的富含絲氨酸結構域能與下列三類蛋白發生相互作用①肌小節蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin；②轉錄因子芳香烴受體(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)復合物組分芳香烴受體相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，ALP)；③心肌脂肪酸結合蛋白3(H-FABP3)和心肌線粒體參與脂肪酸β-氧化的羥脂酰CoA脫氫酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亞單位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme Athiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，beta subunit)。6.由酵母雙雜交結果提示，該基因及其編碼的蛋白與心肌細胞收縮、能量代謝和二惡英受體信號傳導通路有關，該基因及其編碼蛋白與心臟發育、心肌病和心力衰竭等心臟疾病密切相關，可用于心臟疾病的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設計與開發。
提取純化正常成人心臟mRNA，構建高質量的cDNA文庫。cDNA文庫鋪盤(200-500個克隆/150mm盤)，挑取單個噬菌斑轉入含有500μl SM緩沖液和20μl氯仿的滅菌離心管中。室溫置2h后震搖，短暫離心后，取5μl上清，應用插入片段兩端的載體引物進行PCR擴增。反應總體積為50μl，擴增參數為94℃，3min，再94℃5min，57℃30sec，72℃3min，共進行30個循環后，再72℃3min。每個PCR產物經瓊脂糖凝膠鑒定質量后，取2μl的PCR產物，用熒光素標記的cDNA 5’端載體引物進行測序PCR擴增反應。反應總體積為8μl，擴增參數為94℃，2min后，94℃30sec，50℃15sec，72℃1min，進行20個循環，再94℃，30sec，72℃1min，15個循環，最后72℃5min。PCR反應結束，取6μl用自動測序儀(PharmaciaALFDNA Sequencer)進行ESTs序列測定。ESTs測序結果用美國國立生物技術信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)軟件，將每個cDNA克隆的EST與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫進行同源性比較分析。根據分析結果，將相應的ZAP噬菌體克隆環化為pBK-CMV質粒，擴增后應用QIAGEN公司的″QIAprep Spin Miniprep Kit″提取質粒DNA，在ABI377自動測序儀上進行序列測定。2.分離編碼p93的全長克隆在EST大規模測序中，發現來自克隆H498的EST序列含有與ILK相似的錨蛋白重復及激酶結構域，隨后將含H498 cDNA的pBK-CMV噬菌體通過ExAssist/XLOLR輔助噬菌體系統(Stratagene)從ZAP表達載體中切出。具體步驟取250μl ZAP噬菌體，1μl輔助噬菌體(ExAssist helper phage)共感染感受態的XL1-Blue MRF宿主菌，37℃培養15min.后，加3ml NZY液體培養基，37℃再培養2.5-3hr，65℃-70℃加熱20min.，于4℃離心(1000×g，15min.)。取含pBluescript phagemid的上清100μl轉化200μl感受態的XLOLR。37℃溫育15min.后，加300μl NZY液體培養基，再37℃培養45min.，涂布卡那抗性LB培養盤，37℃過夜。挑取單克隆，堿裂解法提取質粒，H498克隆序列全長經ABI377自動測序儀測定。3.新全長cDNAs的生物信息學分析ESTs測序結果的同源性比較采用NCBI的BLAST軟件，核酸數據庫為GenBank(Release124.0)/EMBL(Release 67)/DDBJ(Release 45)。在得到H498克隆全長cDNA后作進一步分析時，通過SRS(Version 6.0.7.3)查詢SWISS-PROT(Release 39.22)、TrEMBL(Release 17.0)。氨基酸序列多重排列采用Clustal X軟件。結構域分析采用瑞士專家蛋白分析系統(ExPASy)的PROSITE數據庫(Release 17.0)和EMBL的SMART軟件(version 3.3)。PCR引物設計采用Informax，Inc的Vector NTITMSuite軟件包。4.胎兒、成人Northern blot和76種組織的多組織點陣分布分析提取環化質粒pBK-CMV-p93，經NotI、EcoRI雙酶切，以獲得的p93全長cDNA作為模板，應用“Prime-a-Gene Labeling System”(Promega)隨機引物試劑盒進行探針標記。胎兒多組織雜交膜的制備提取8個月流產胎兒骨骼肌、腦、心臟、肝臟、肺和腎臟等6種組織的總RNA，經紫外分光光度計定量后，每個泳道上樣量為30μg，甲醛變性膠電泳、轉移并固定至尼龍膜，同常規。成人多組織雜交膜(MTNTM)(Clontech)及其含76種組織MTETM(Clontech)進行了多組織點陣分布分析，操作按說明書進行。5.多克隆抗體的制備及鑒定為原核表達p93，設計5’引物CTGGATCCAAATGGGAAATTATAAATCTAGACC，3’引物CGTCGACTGTCGTAAGCCCGCCGGCGAT，其中5’和3’引物分別含BamH I和EcoR I酶切位點。以含p93的pBK-CMV質粒為模板，用pfuTurboTM DNA聚合酶(Stratagene)將p93全編碼框克隆入原核表達載體pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia)。經測序驗證所有構建子讀碼框正確無誤，PCR也未引入新的突變后，將pGEX-p93導入大腸桿菌BL21中進行原核表達，其表達蛋白用于檢測核酸免疫法制備的多克隆抗體的效價及特異性。
用BamH I和EcoR I將p93編碼框從載體pGEX-5X-1中切出，直接亞克隆至pSecTag(Invitrogen)，構建成真核表達載體pSecTag-p93。堿裂解法大量提取質粒約3mg，經PEG純化后，分三次用電針介導免疫家兔，每次間隔約兩周，第三次免疫后8天取抗血清，用Western blot方法和原核表達的細菌總蛋白(含p93蛋白)檢測免疫前后的家兔血清。6.免疫組化取8個月流產胎兒心臟組織及猝死的正常成人心臟組織進行石蠟切片。置切片于3％H2O2中10min，滅活內源性過氧化物酶。抗原修復采用雙暴露法，先用拘櫞酸修復液(pH8.0)于微波爐煮30min，降至室溫后，再用0.1％Trypsin消化30min.10％血清封閉。以二步法行抗體標記，用抗體稀釋液(美國Zymed)以1∶20稀釋的p93抗血清覆蓋切片，4℃過夜，直接加二抗、三抗混合的PictureTM工作液，室溫1hr，行DAB染色8-10min。Hrarris蘇木素淺染細胞核，脫水，封片。7.p93在COS-7真核細胞中的表達及其活性分析用BamH I和EcoR I將p93全編碼框從載體pGEX-5X-p93中切出，直接亞克隆至真核表達載體pcDNA4/HisMax(A)(Invitrogen)構建成真核表達載體pcDNA4-p93。pcDNA4含有6×His以備純化和XpressTMEpitope以備用抗體檢測。用于真核細胞轉染的質粒經CsCl超速離心純化，并用脂質體Lipofectamine(Gibco BRL)或DOSPER(Roche)介導轉染COS-7細胞。為了檢測蛋白表達，細胞溶于含1％SDS和10mM EDTA的10mM Tris緩沖液(pH7.4)中。抗體為Anti-XpressTM單抗(Stratagene)。用ECL法(enhanced chemiluminescence)檢測Westernblot結果，Luminol試劑購自Santa Cruz。
瞬時轉染后2-3天，COS-7細胞用胰酶消化，離心(1000×g，1min)收集細胞。每106-107個細胞用1ml冰預冷的1×結合緩沖液洗兩次。結合緩沖液的制備如下0.5M NaCl，20mMTrisHCl pH7.9，5mM咪唑。細胞沉淀存于-70℃備用或準備裂解。將1×107個COS-7細胞溶于1ml裂解液中。裂解緩沖液的制備如下0.5M NaCl，20mM Tris HCl pH7.9，5mM咪唑，10％甘油，1％Triton X-100，不含EDTA的完全性蛋白酶抑制劑混合物一片(Roche)(complete，mini，EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets)，1mM PMSF，5mMβ-巰基乙醇；將溶液存于-70℃ 1min或于4℃放30min。隨后于4℃離心(10,000×g，30min)，移去細胞破碎物，上清用于純化蛋白。取50μl含20％乙醇的50％ProBondTMResin(Invitrogen)懸液，先用60μl的裂解液預濕，后將上清加至Resin，于4℃振蕩1-3hr。為分析激酶活性，在30μl體系中將純化蛋白與激酶緩沖液進行反應。激酶緩沖液配制如下20mM Tris HCl，pH7.0，10mM MnCl2，10mM MgCl2，2mM NaF，1mM Na3VO4，1-2mM DTT，10μCi[γ-32P]ATP，反應在30℃進行，30min。將反應樣品加Laemmli’s上樣緩沖液煮沸，6％SDS-PAGE電泳。蛋白轉移至NC膜并經放射自顯影。8.酵母雙雜交篩選構建pGBKT7-Ser-rich誘餌載體，首先確證其對酵母無毒性作用，隨后分析轉化子在His、Ade中的背景生長和對MEL1的激活，確證該構建子不會激活報告基因。于30℃倒置培養3-5天以使二倍體細胞形成可見克隆，計數培養板上的克隆，計算交配效率。
篩庫過程準備濃縮的AH109[pGBKT7-Ser-rich]過夜培養物，將其與1ml預轉化心臟cDNA文庫于2-L滅菌flask中，于30℃ 30-50rpm輕輕振蕩20-24hr。次日將交配混合物移至一滅菌的100ml離心管，1000×g離心10min沉淀細胞，隨后用2×YPDA/kan沖洗交配用flask二次，每次50ml。用兩次沖洗液懸浮最初得到的細胞團塊，再次1000×g離心10min沉淀細胞。于10ml 0.5×YPDA/kan中懸浮細胞團塊，測量細胞+培養基的總體積。取5μl文庫交配混合物，用0.5×YPDA/kan稀釋后于SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp培養板分別鋪100μl的1∶104、1∶102稀釋的交配混合物以測知交配效率。將剩余的交配混合物鋪于50個大的(150mm)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)培養板，每盤200μl。于30℃倒置培養8-21天直至克隆出現。在8-21天酵母生長過程中，逐步將陽性克隆挑至QDO網格盤，30℃生長1-2天后，依據克隆數多少，設立時間點進行印膜β-gal檢測初篩，將陽性克隆于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp盤上再次劃線2次后，將陽性克隆挑至QDO網格盤，30℃生長2天，依據克隆數多少，設立時間點進行印膜β-gal檢測進行再次篩選。
文庫滴定將5μl文庫稀釋104后涂布于SD/-Leu板，倒置平板于30℃孵育3-5天計算所含的克隆數及其文庫滴度。
計算酵母交配的效率和篩選的克隆數依據生長于SD/-Leu，SD/-Leu/-Trp培養皿中的克隆數計算交配效率，結合文庫滴度計算所篩選的克隆數。
陽性克隆歸類從酵母中分離質粒DNA，通過轉化電感受態DH5α以獲得陽性克隆質粒，PCR擴增AD/library插入子，并分別用Alu I和Hae III單酶切，電泳分析PCR及其酶切產物大小。
酵母體內再驗證將所有欲檢測的AD/library和AD質粒轉化AH109，鋪于SD/-Leu培養基，陰性對照質粒pGBKT7-Lam轉化Y187，鋪于SD/-Trp培養基，待上述克隆生長后，分別挑至SD網格盤進行劃線交配。將陰性克隆挑至SD/-Leu/-Trp培養盤，實驗組及其陽性對照克隆挑至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養盤，30℃生長4-5天，進行印膜β-gal檢測。
權利要求
1.本發明涉及一個心肌特異表達的蛋白激酶p93，包括該基因的cDNA序列及其編碼蛋白質的氨基酸序列。其特征在于p93的cDNA全長約3400bp，相應編碼蛋白質有845aa。
2.根據權利要求1所述之p93基因/蛋白，其特征在于該蛋白含3個蛋白結構域，N端為錨蛋白重復(ankyrin repeats)結構域，靠近C端有一激酶結構域，C末端為富含絲氨酸結構域(ser-rich)。
3.根據權利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于其激酶結構域具有激酶活性。
4.根據權利要求1、2所述之p93蛋白/基因，其特征在于富含絲氨酸的C-末端可以與肌小節蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin、轉錄因子芳香烴受體(ArylHydrocarbon Receptor，AhR)復合物組分芳香烴受體相互作用蛋白(aryl hydrocarbonreceptor-interacting protein，AIP)、心肌脂肪酸結合蛋白3(H-FABP3)和心肌線粒體參與脂肪酸β-氧化的羥脂酰CoA脫氫酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亞單位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzyme A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase，βsubunit)發生特異而直接的相互作用。
5.根據權利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通過與肌小節蛋白cTnI、MyBP-C、心肌α-actin、成人骨骼肌α-actin發生相互作用而調節心肌細胞收縮。
6.根據權利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通過與芳香烴受體復合物組分相互作用而參與對心肌細胞異源生物素代謝(xenobiotic metabolism)酶基因轉錄的調控。
7.根據權利要求1、2、4所述之p93基因/蛋白，其特征在于p93通過與心肌脂肪酸結合蛋白3和心肌線粒體參與脂肪酸β-氧化的羥脂酰CoA脫氫酶/3-酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亞單位相互作用而參與調節心肌細胞的能量代謝。
8.根據權利要求1、2、3、4、5、6、7所述之p93基因/蛋白，其特征在于該基因及其編碼蛋白與心臟發育、心肌病和心力衰竭等許多心臟疾病密切相關，可用于心臟疾病的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設計與開發。
全文摘要
本發明涉及一個在心肌特異表達的、與肌小節蛋白cTnI、MyBP－C、心肌α－actin、成人骨骼肌α－actin、轉錄因子芳香烴受體復合物組分AIP、心肌脂肪酸結合蛋白3和心肌線粒體參與脂肪酸β－氧化的羥脂酰CoA脫氫酶/3－酮脂酰CoA硫解酶/烯酰CoA水化酶三功能合酶β亞單位相互作用的新蛋白激酶基因/蛋白p93，包括其cDNA序列、編碼蛋白質的氨基酸序列及組織、細胞定位和激酶活性測定。p93蛋白能通過和上述肌小節蛋白的相互作用調節心肌細胞收縮；通過與心肌脂肪酸結合蛋白和線粒體參與脂肪酸β－氧化的酶相互作用以調控心肌細胞的能量代謝；通過與AIP參與二惡英受體信號傳導通路，并調控心肌細胞色素氧化酶P450IA1、450IA2、己醛脫氫酶、苯醌還原酶等各種藥物代謝的酶基因轉錄。通過以上作用從而參與了心臟發育、心肌病、心衰等心臟疾病的發生。
文檔編號A61K38/43GK1445366SQ0210373
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月15日 優先權日2002年3月15日
發明者丁金鳳, 趙勇, 孟憲敏, 趙秀文, 劉冬青, 曹慧青 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院