專利名稱：多臂樹杈型功能化聚乙二醇制備方法及它在藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及高分子合成，更具體地說通過單鏈聚乙二醇與小分子化合物反應制備多臂樹杈型功能化聚乙二醇的方法。
背景技術(shù)：
目前，抗腫瘤藥物的種類繁多，就其分子量大小來分，一般可分為兩大類一類分子量較低，通常在1000以下，絕大多數(shù)為常用的化學合成藥物和一些天然藥物，如氮芥，順鉑，5-氟尿嘧啶，紫杉醇等都屬此列；另一類則分子量較大，絕大多數(shù)由基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽藥物則屬第二類。但是無論小分子藥物還是大分子藥物，都存在著毒性大，溶解性差，半衰期短等缺點。對蛋白質(zhì)和多肽藥物來說，還存在一個免疫性的問題。
把藥物高分子化是解決這些問題的一個途徑。Caliceti，T.等在J.BioactiveCompatible Polym.10103-120(1995)報道了用聚乙烯基吡咯烷酮修飾超氧化物歧化酶的反應；Uren，J.R.等在Cancer Res.39，1927-1933(1981)則報道了多聚DL-丙氨酸對L-天冬酰胺酶的修飾反應。文獻和專利中報道最多的則是用各種活化的聚乙二醇(PEG)對各種藥物進行的修飾反應。如Nandini，K在Eur.Pat.87304703.9，Mike.A在PCT/US98/00683等描述了腫瘤壞死因子(TNF)和PEG的反應；Gilbert，C.W等在美國專利US5951974，US5981709以及US6042822報道了PEG對干擾素-α的修飾反應。類似的反應如白介素-2(Prakash，R.K.，US 6251866)和PEG，粒細胞巨噬細胞集落因子(GM-CSF)和PEG[Knusli，C等，Br.J.Haematl，82(4)，654-663(1992)；Malik，F(xiàn).等，Exp.Hemaol，20(8)，1028-1035(1992)]，生長激素和PEG等，在眾多的文獻和專利中都可以找到。
在PEG的修飾反應中，用得最多的活性基團有琥珀酰亞胺的酯基，醛基，三氟磺酸酯基，對硝基苯碳酸酯基以及苯并三唑碳酸酯基等。而常用的PEG有線型的，和帶兩臂的分叉型兩種，其分子量在2,000～60,000之間，其中的一端被烷基化[Monfardini，C.et al.Bioconjugate Chem.662-69(1995)]。
眾所周知，藥物高分子化后的性能和所用高分子材料的結(jié)構(gòu)、分子量、分子量分布以及高分子的構(gòu)型有關。同一結(jié)構(gòu)，不同分子量的高分子在修飾藥物后，會產(chǎn)生不同的性質(zhì)；同一結(jié)構(gòu)，相同分子量，但構(gòu)型不同的高分子在修飾藥物后，也會產(chǎn)生很大的差異。以往在對蛋白質(zhì)或者其它藥物進行聚乙二醇化時存在的幾個問題使得所制備的聚乙二醇/蛋白質(zhì)或者藥物的結(jié)合物的優(yōu)點難以實現(xiàn)。其一是由于偶合反應缺乏選擇性，蛋白質(zhì)的活性部位很可能被反應，從而失去生物活性。其二是對于有多個反應點的蛋白質(zhì)而言，要很好地控制反應的部位一般來說是比較困難的，這使得結(jié)合物的質(zhì)量很難控制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設計和合成一系列帶各種活性官能端基的多臂樹杈型PEG，和相同分子量的線型和兩臂PEG比較，多臂樹杈型PEG的靜態(tài)粘度小，流體力學體積大，預計對蛋白質(zhì)藥物能產(chǎn)生更為有效的生理作用。
本發(fā)明通過三官能團小分子化合物和相應的化學反應將一定分子量的PEG結(jié)合在一起，形成一種新型的多臂樹杈型功能化PEG。該功能化PEG記為RPEGzCOX，其中R為10個碳以下的直鏈烷烴，異丙基或芐基；z代表臂數(shù)；X表示功能基團。PEG與三官能團小分子化合物以共價鍵連接，連接基團選自酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、巰基、碳水化合物及其組合。其中所用的三官能團小分子化合物為下列結(jié)構(gòu)之一 其中，n為1-9的整數(shù)，m為0-6的整數(shù)。例如當其中所用的三官能團小分子化合物為H2N(CH2)nCH(NH2)CO2H(n為1～9的整數(shù))，連接基團為酰胺基或者氨基甲酸酯時，八臂樹杈型功能化聚乙二醇(RPEG8COX)的結(jié)構(gòu)式如下 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴，異丙基或芐基，優(yōu)選地為甲基；n為1～9的整數(shù)；k為0～6的整數(shù)；s，t，o，p為10～2,000的整數(shù)；W為O、S或者NH之一；X為下列結(jié)構(gòu)之一 其它臂數(shù)的樹杈型活性PEG具有與上述RPEG8COX類似的結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)將根據(jù)具體臂數(shù)而有所不同。例如，在七臂PEG的結(jié)構(gòu)中，將會有一個單鏈PEG取代八臂PEG結(jié)構(gòu)中的一個二臂結(jié)構(gòu)，而在六臂PEG的結(jié)構(gòu)中，則含有六個單鏈PEG，依次類推。其中，每臂的分子量為400～80,000。
二臂樹杈型PEG的合成方法在本領域中已有描述，例如，Yamsuki等，Agric.Bio.Chem.1988,52,2185-2196；Monfardini等，Bioconjugate Chem.1995,6,62-69。在此將這些文獻公開，全部引入本文作為參考。
不同臂的樹杈型功能化PEG的制備方法類似，下面分別列出三臂和四臂樹杈型功能化PEG的反應路線來予以說明。當W為NH，n為4，k為0，X為對硝基苯酚時，可按下列反應路線來制備不同臂的樹杈型活性PEG，其中所用到的單臂和雙臂的活性PEG可根據(jù)上述Monfardini等人的方法來制備。 上述路線中是通過對硝基苯酚酯來活化羧基的，也可以用生成其它活性酯的方法來對羧基來進行活化，如丁二酰亞胺酯。用對硝基苯酚酯來活化羧基時，每一次只能引入一條臂，優(yōu)點是通過該路線可以控制終產(chǎn)物中每條臂的分子量。如果用丁二酰亞胺酯來活化羧基，則一次可以同時引入兩條臂，缺點是這兩條臂只能是相同的。當然，若對三官能團小分子化合物中的一個胺基與羧基先予以保護，也能實現(xiàn)對每臂分子量的控制。例如，當用于二酰亞胺酯來活化羧基時，也可以用下述路線來制備三臂和四臂的功能化PEG。其中(Lys)2Cu根據(jù)Wiejak等人的方法合成(S.Wiejak等，Chem.Pharm.Bull.，1999，47，1489-1490)。 顯然，依據(jù)上面的路線，只需在制備過程中根據(jù)需要對反應條件予以適當控制，就可以較容易地制備出其它多臂樹杈型PEG。結(jié)合本發(fā)明的公開，這一點對于本領域的熟練技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
本發(fā)明中的多臂樹杈型活性PEG，可廣泛用于小分子藥物，蛋白質(zhì)和多肽藥物的修飾，如小分子抗腫瘤藥物中的苯丁酸氮芥、順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素和甲氨喋呤蛋白質(zhì)藥物中的干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、生長因子、集落刺激因子、促紅細胞生成素和超氧化物歧化酶。具體的操作可參照單鏈PEG的方法，這在本領域已有描述。如，Greenwald等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Caliceti等，IL Farmaco，1993,48,919；Zalipsky與Lee，《聚乙二醇化學生物技術(shù)與生物醫(yī)學應用》，J.M.Harris編，Plenum Press，N.Y，1992。在此將這些文獻公開，全部引入本文作為參考。結(jié)合本發(fā)明的公開，這對于本領域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明的某些優(yōu)點可以從下面幾點體現(xiàn)出來。其一，由于多臂樹杈型PEG的流體力學體積大，當它與蛋白質(zhì)上的某個部位結(jié)合后，由于空間位阻的作用，其它部位就很難與另一分子的多臂樹杈型PEG反應，從而提高了對結(jié)合部位的選擇性。其二，通過控制多臂樹杈型PEG的臂數(shù)及分子量來控制其流體力學體積，使得其難接近蛋白質(zhì)的活性部位，這樣所得到的聚乙二醇/蛋白質(zhì)結(jié)合物可以保持較高的生物活性。其三，由于多臂結(jié)構(gòu)的存在，使得多臂樹杈型PEG將會比線性PEG或者二臂分叉PEG更為有效地阻止接近蛋白質(zhì)表面的大分子或者細胞，從而進一步提高結(jié)合物在體內(nèi)循環(huán)的時間，減少免疫反應的發(fā)生。
實施例1不同臂長mPEG3CO2PhNO2的制備將賴氨酸(439mg，3mmol)溶于20mL pH值在8.0-8.3的水中，然后在3小時內(nèi)向其中分批加入mPEG2CO2PhNO2(二臂mPEG對硝基苯酚酯，分子量10,000，其中一臂為7,000，另一臂為3,000，10g，1mmol)，同時用0.2N的NaOH來維持體系的pH值在8.3。在室溫攪拌過夜后，將反應物冷卻到0℃，并用2N的鹽酸將體系的pH值調(diào)節(jié)到3。先用乙醚從水中提取出雜質(zhì)，再用氯仿連續(xù)提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚，得白色沉淀，所得沉淀經(jīng)乙醇兩次重結(jié)晶后，得到mPEG2單取代的賴氨酸(mPEG2-mono-Lysine)。產(chǎn)物經(jīng)胺基滴定，GPC及MALDI表征，其純度達99％。
向溶有上述產(chǎn)品(9g，0.9mmol)的無水二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(TEA)直至PH值達到8時。mPEGCO2PhNO2(單臂mPEG對硝基苯酚酯，分子量5000，5.025g，1.05mmol)在3個小時之內(nèi)分批加入反應液中，同時用TEA維持體系的pH值在8左右。反應物回流72小時后，被冷至室溫，濃縮后，過濾，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重結(jié)晶。過量的mPEGCO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3緩沖液中攪拌過夜后被水解，溶液被冷至0℃。并用2N的鹽酸將體系的pH值調(diào)節(jié)到3。然后通過乙醚提取溶液中的對硝基苯酚。再用氯仿連續(xù)提取三次，提取液經(jīng)干燥，濃縮后用無水乙醚沉淀，然后用無水乙醇重結(jié)晶。所得產(chǎn)物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼砂緩沖液)進一步純化，得mPEG3CO2H。產(chǎn)物經(jīng)羧基滴定，GPC及MALDI表征，純度達99％。
在0℃，向溶有上述mPEG3CO2H(三臂mPEG羧酸衍生物9g.0.6mmol)的無水二氯甲烷(20mL)中加入對硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.4g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得純的產(chǎn)物mPEG3CO2PhNO2。產(chǎn)物經(jīng)水解后，于堿性條件下測定對硝基苯酚負離子的紫外吸收，表明活性酯含量達98％以上。
在0℃，向溶有上述mPEG4CO2H(12g，0.6mmol)的無水二氯甲烷(25mL)中加入對硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得產(chǎn)物mPEG4CO2PhNO2，純度98％。
向溶有上述(mPEG2Lys)2Cu(20g，2mmol)的丙酮(40mL)中加入8-羥基喹啉(4.2mmol)和Na2CO3水溶液(10％，20mL)，室溫攪拌1小時后，向其中加入mPEGCO2Su(單臂mPEG丁二酰亞胺酯，分子量5,000，10g，2mmol)，同時用NaOH溶液來維持體系的pH值在8.0。室溫攪拌反應4小時后，過濾，用草酸調(diào)節(jié)濾液的pH值到3，然后用二氯甲烷連續(xù)提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚中，得白色沉淀，所得沉淀經(jīng)乙醇兩次重結(jié)晶后，得到mPEG3CO2H。所得產(chǎn)物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼砂緩沖液)進一步純化，得mPEG3CO2H。產(chǎn)物經(jīng)羧基滴定，GPC及MALDI表征，純度達99％。
將上述mPEG3CO2H(9g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(20mL)中，冷卻至0℃后，向其中加入N-羥基丁二酰亞胺(0.138g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得純的產(chǎn)物mPEG3CO2Su，產(chǎn)物中活性酯的含量經(jīng)紫外光譜方法測定，為98％。
將賴氨酸鹽酸鹽(365mg，2mmol)溶于100mL pH值在8.0的硼砂緩沖液中，然后向其中加入mPEG2CO2Su(分子量20,000，80g，4mmol)，同時用0.2N的NaOH來維持體系的pH值在8.0。在室溫攪拌24小時后，將反應物用去離子水稀釋到400mL，用草酸調(diào)節(jié)濾液的pH值到3，然后用二氯甲烷連續(xù)提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚中，得白色沉淀，所得沉淀經(jīng)乙醇兩次重結(jié)晶后，得到mPEG4CO2H粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)DEAE Sephadex FF柱分離后，得純的mPEG4CO2H，產(chǎn)率92％。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振，GPC及MALDI質(zhì)譜證實。
將上述mPEG4CO2H(24g，0.6mmol)溶于無水二氯甲烷(20mL)中，冷卻至0℃后，向其中加入N-羥基丁二酰亞胺(0.138g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室溫攪拌過夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得純的產(chǎn)物mPEG4CO2Su，產(chǎn)物中活性酯的含量經(jīng)紫外光譜方法測定，為96％。
權(quán)利要求
1.一種記為RPEGzCOX的多臂樹杈型功能化聚乙二醇，其中R為C1～C10的直鏈烷烴，異丙基或芐基；z為臂數(shù)；X為功能基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇，其特征在于當R為C1～C10的直鏈烷烴，異丙基或芐基時，z為臂數(shù)1～8，X為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇，其特征在于當采用的三官能團小分子化合物為下列結(jié)構(gòu)時， 其中n為1～9的整數(shù)八臂樹杈型功能化聚乙二醇(RPEG8COX)的結(jié)構(gòu)式如下 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴，異丙基或芐基，優(yōu)選地為甲基；n為1～9的整數(shù)；k為1～6的整數(shù)；s，t，o，p為10～2,000的整數(shù)；W為O、S或者NH之一；X為下列結(jié)構(gòu)之一
4.如權(quán)利要求1所述的多臂樹杈型功能化聚乙二醇的制備方法，其特征在于通過單鏈聚乙二醇與三官能團小分子化合物反應獲得功能化聚乙二醇，記為RPEGzCOX的多臂樹杈型功能化聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇的制備方法。其特征在于三官能團小分子化合物的活性基團為羧基和兩個氨基或者羧基和兩個羥基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇的制備方法。其特征在于在官能團小分子化合物為下列結(jié)構(gòu)之一。 其中，n為1-9的整數(shù)，m為0-6的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇的制備方法。其特征在于通過單鏈聚乙二醇與三官能團小分子化合物反應，其聚乙二醇每臂的分子量為400-80,000，通過控制反應來制備3臂、4臂、5臂、6臂、7臂、8臂的多臂樹杈型功能化聚乙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇的制備方法。其特征在于聚乙二醇與三官能團小分子化合物連接，連接基團為酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、巰基、碳水化合物以及它們的組合。
9.如權(quán)利要求1所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇，其特征在于通過功能基團與小分子藥物、多肽和蛋白質(zhì)藥物結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇。其特征在于小分子藥物為苯丁酸氮芥、順鉑、5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素和甲氨喋呤。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述多臂樹杈型功能化聚乙二醇。其特征在于蛋白質(zhì)藥物為干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、生長因子、集落刺激因子、促紅細胞生成素、超氧化物歧化酶。
全文摘要
本發(fā)明設計和合成了一種新型的多臂樹杈型帶活性端基的聚乙二醇,可廣泛用于小分子藥物,蛋白質(zhì)和多肽藥物的修飾,用于改進藥物的溶解性,穩(wěn)定性和免疫原性,以延長藥物的半衰期,提高療效。
文檔編號A61K31/519GK1381512SQ0210167
公開日2002年11月27日 申請日期2002年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月15日
發(fā)明者黃駿廉, 黃兆華, 張海濤 申請人:泛亞生物技術(shù)有限公司