專利名稱：一種流感病毒基因工程表位疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種流感疫苗，特別是用生物工程的方法得到的流感疫苗。
2.目前國外兒童正在使用的是流感病毒亞單位疫苗。該疫苗是利用基因重組的病毒表面抗原誘導免疫保護，也需要隨流感毒株抗原性變異及時改變基因重組的病毒表面抗原。
流感的最主要特性之一是流感病毒亞型的多樣性和病毒抗原的高變異性，所以使得上述正在使用的流感疫苗不能有效預防不同流感病毒亞型或不同變異株引發的流感的發生和流行。
在流感的免疫預防中，病毒編碼蛋白上的中和表位(如KAYSNCYPYDVPDY；ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEG；GLFGAIAGFIEG；WTGVAQD；HHPITDSDQTRLY等；)能誘導很強的對付相對應的病毒株的免疫防護。(PNAS 1992，898995-8999；PNAS 1982，79569-573；Vaccine 1995，13927-932；Eur.J.Immunol.1997，273105-3114；Nature Medicine 1999，51157-1163)。
本發明的發明人于1999年在世界上首次提出了用表位疫苗對付病毒及其病毒變異的觀點(Immunology Today 1999，20588-589；Immunology Letters 773-6)。表位疫苗可含有多個病毒亞類的多個抗原表位(包括中和表位和CTL表位)，從而能夠誘導多個表位特異性的抗體應答和CTL應答，顯示出較強的抗病毒變異的能力。本發明的發明人在研究艾滋病表位疫苗時發現多表位的表位多肽能夠誘導高滴度的、預先定義的、多中和表位特異性的中和抗體，該理論對研究制造流感疫苗具有指導意義。此外，本發明的發明人在研究流感合成肽表位疫苗時發現流感合成肽表位疫苗誘導的高滴度的預先定義的中和表位特異性的抗體能夠抑制流感病毒感染靶細胞(Int.Arch.Allergy Immunology，論文正在印刷)。因此表位疫苗可能成為疫苗研究的一個重要發展方向，有可能成為對付病原體變異的關鍵手段。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠有效抗御流感病毒變異的基因工程表位疫苗。
流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成員中的一個或多個連接而成的肽段1) 至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位；2) 至少一個流感病毒的T細胞表位；3) 至少一個流感病毒的CTL細胞表位。
所述中和表位和變異表位可以是下列成員之一ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYKNEWGCRCNDSSDKETPIRNEWGSLLTEVETVETPIRNERNEWGCRCEWGCRCNDGWTGVAQDGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGKAYSNCYGKAFSNCYG所述T細胞表位可以是下列成員之一TYQRTRALVRTGRLIQNSLTIERMVLS所述CTL細胞表位可以是下列成員之一TMVMELIRMIKTMVMELVRMIK為了適于注射所述疫苗中還包括醫學上可接受的藥用佐劑，如鋁佐劑等。
本發明的另一個目的是提供編碼上述流感病毒基因工程表位疫苗的DNA序列。由于基因的簡并性，編碼相同肽段的DNA序列不是唯一的，但均應屬本發明的保護范圍。
本發明的又一目的是提供制備流感病毒基因工程表位疫苗的方法。
制備流感病毒基因工程表位疫苗的方法，是利用聚合酶鏈式反應和限制性核酸內切酶將編碼至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位或/和至少一個流感病毒的T細胞表位或/和至少一個流感病毒的CTL細胞表位的DNA序列重復串聯或組合重復后串聯，成為一個人工基因，并將該基因在表達載體系統中表達后純化，得到流感病毒基因工程表位疫苗。
欲串聯在一起的包括至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位或/和至少一個流感病毒的T細胞表位或/和至少一個流感病毒的CTL細胞表位的寡核苷酸片段的兩端包含一對能夠產生匹配末端的內切酶。
為了便于操作，對所選表位給予標記，在表位序列后，導入一標簽DNA片段。
本發明在設計上巧妙地將多個流感病毒亞型的多個中和表位、T細胞表位和CTL細胞表位組合在一起，形成了能夠刺激人體對流感病毒產生多種中和抗體和細胞免疫應答的基因工程表位疫苗，極大地提高了疫苗抗病毒變異的能力。
本發明的疫苗具有以下優點1、該疫苗含有流感病毒不同亞型的多種表位，能刺激產生細胞免疫和體液免疫，有效對付病毒的變異，進而克服已有常規滅活疫苗或減毒疫苗預防效果差甚至無效的缺點；2、該疫苗中的表位多肽，沒有流感病毒的遺傳物質，不會產生因遺傳物質誘發的副作用，也沒有流感滅活疫苗或減毒疫苗可能的危險。3、在流感病毒變異后，能夠迅速地進行相應表位的調整，不需進行長時間的試驗，降低成本。該技術將對預防醫學研究產生重大影響，并且將帶來巨大的經濟效益和社會效益。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gac ggctgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 15’gc gga tcc tgg acc gga 3’Primer 25’aga tct tga gct cga g tcg 3’2、通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈，得到相對應的、分別含有酶切位點的雙鏈寡核苷酸鏈。將PCR產物分別克隆到T載體中，并在其后連入一個標簽片段，得到相對應的重組克隆。
3、利用BamHI/BgII內切酶酶切得到陽性克隆，回收帶有標簽的表位DNA片段和沒有標簽DNA的載體片段。利用末端匹配的性質，將表位片段重復連接，獲得免疫原基因。
4、將得到的免疫原基因插入表達載體大腸桿菌JM109中進行表達，得到流感病毒重組表位疫苗的免疫原。
5、將純化的免疫原與福氏佐劑混合制備成單表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗。
實施例2、制備多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗1、人工合成與WTGVAQD，KAYSNCYPYDVPDYGK和HHPITDSQTRLY相對應的、包含一對匹配末端的BamHI/BgII內切酶位點的重復核苷酸序列，同時合成相應的引物。
A5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gacggc tgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 15’ gc gga tcc tgg acc gga 3’B5’gga tcc aaa gct tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tat ggcaaa gct tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tataga tcttga gct cgag tcg 3’Primer 25’gt gga tcc aaa gct tac 3’C5’gga ttc cac cac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tat ggc caccac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tataga tcttga gct cga gtcg 3’Primer 35’gt gga tcc cac cac ccg agt 3’共用下游引物Primer5’aga tct tga gct cga g tcg 3’2、通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈，分別得到相對應的、分別含有酶切位點的雙鏈寡核苷酸鏈。將PCR產物分別克隆到T載體中，并在其后連入一個標簽片段，得到相對應的重組克隆。
3、利用BamHI/BgII內切酶，分別酶切得到陽性克隆，回收帶有標簽的表位DNA片段和沒有標簽DNA的載體片段。利用末端匹配的性質，將不同表位片段連接獲得免疫原基因，連接方式為An-Bn-Cn(也可以是Bn-An-Cn，Cn-An-Bn，Bn-Cn-An，An-Cn-Bn，n.≥1)。
4、將得到的免疫原基因插入表達載體細菌中進行表達，得到流感病毒重組表位疫苗的免疫原。
5、將純化的免疫原與藥用鋁佐劑混合制備成多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗。
實施例3、利用中和表位和T細胞表位制備多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗
1、人工合成與WTGVAQD，HHPITDSQTRLY和GFVFTLTVPSER相對應的、包含一對匹配末端BamHI/BgII的內切酶位點的重復核苷酸序列，同時合成相應的引物。
A5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gacggc tgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 15’gc gga tcc tgg acc gga 3’B5’gga ttc cac cac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tat ggc caccac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tataga tcttga gct cga gtcg 3’Primer 35’gt gga tcc cac cac ccg agt 3’C5’gga tcc ggc ttc gtg ttt acg ctc aca gta ccc tca gag cgc ggc ggc ttcgtg ttt acg ctc aca gta ccc tca gag cgc aga tct tga gct cga g tcg 3’Primer 25’gc gga tcc ggc ttc gtg 3’共用下游引物Primer5’aga tct tga gct cga g tcg 3’2、通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈，分別得到相對應的、分別含有酶切位點的雙鏈寡核苷酸鏈。將PCR產物分別克隆到T載體中，并在其后連入一個標簽片段，得到相對應的重組克隆。
3、利用BamHI/BgII內切酶，分別酶切得到陽性克隆，回收帶有標簽的表位DNA片段和沒有標簽DNA的載體片段。利用末端匹配的性質，將不同表位片段連接獲得免疫原基因，連接方式為An-Bn-Cn(也可以是Bn-An-Cn，Cn-An-Bn，Bn-Cn-An，An-Cn-Bn，n.≥1)4、將得到的免疫原基因插入表達載體pET-28a進行表達，得到流感病毒重組表位疫苗的免疫原。
5、將純化的免疫原與藥用鋁佐劑混合制備成多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗。
實施例4、利用中和表位、T細胞表位和CTL細胞表位制備多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗1、人工合成與WTGVAQD，HHPITDSQTRLY和TMVMELVRMIK相對應的、包含一對匹配末端的BamHI/BgII內切酶位點的重復核苷酸序列，同時合成相應的引物。
A5’gga tcctgg acc gga gtg gcg cag gac ggc tgg acc gga gtg gcg cag gacggc tgg acc gga gtg gcg cag gacaga tcttga gct cga gtcg 3’Primer 15’gc gga tcc tgg acc gga 3’B5’gga ttc cac cac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tat ggc caccac ccg agt acg gac agt gac caa acc agc ata tataga tcttgagct cga gtcg 3’
Primer 25’gt gga tcc cac cac ccg agt’3C5’gga tcc aca atg gta atg gaa(g)ctc att cgt atg att aaa ggc aca atggta atg gaa(g)ctc att cgt atg att aaaaga tcttgagct cga gtcg 3’Primer 35’gt gga tcc aca atg gta 3’共用下游引物Primer5’aga tct tga gct cga g tcg 3’2、通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈，分別得到相對應的、分別含有BamHI/BgII的酶切位點的雙鏈寡核苷酸鏈。將PCR產物分別克隆到T載體中，并在其后連入一個標簽片段，得到相對應的重組克隆。
3、利用內切酶BamHI/BgII，分別酶切得到陽性克隆，回收帶有標簽的表位DNA片段和沒有標簽DNA的載體片段。利用末端匹配的性質，將不同表位片段連接獲得免疫原基因，連接方式為An-Bn-Cn(也可以是Bn-An-Cn，Cn-An-Bn，Bn-Cn-An，An-Cn-Bn，n.≥2)4、將得到的免疫原基因插入表達載體pET-28a進行表達，得到流感病毒重組表位疫苗的免疫原。
5、將純化的免疫原與鋁佐劑混合制備成多表位重復的流感病毒基因工程表位疫苗。
權利要求
1.流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成員中的一個或多個連接而成的肽段4) 至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位；5) 至少一個流感病毒的T細胞表位；6) 至少一個流感病毒的CTL細胞表位。
2.根據權利要求1所述的流感病毒基因工程表位疫苗，其特征在于所述中和表位和變異表位是下列成員之一ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYKNEWGCRCNDSSDKETPIRNEWGSLLTEVETVETPIRNERNEWGCRCEWGCRCNDGWTGVAQDGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGKAYSNCYGKAFSNCYG
3.根據權利要求1所述的流感病毒基因工程表位疫苗，其特征在于所述T細胞表位是下列成員之一TYQRTRALVRTGRLIQNSLTIERMVLS
4.根據權利要求1所述的流感病毒基因工程表位疫苗，其特征在于所述CTL細胞表位是下列成員之一TMVMELIRMIKTMVMELVRMIK
5.根據權利要求1或2或3或4所述的流感病毒基因工程表位疫苗，其特征在于所述疫苗中還包括醫學上可接受的藥用佐劑。
6.編碼權利要求1所述的流感病毒基因工程表位疫苗的DNA序列。
7.制備權利要求1所述的流感病毒基因工程表位疫苗的方法，是利用聚合酶鏈式反應和限制性核酸內切酶將編碼至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位或/和至少一個流感病毒的T細胞表位或/和至少一個流感病毒的CTL細胞表位的DNA序列重復串聯或組合重復后串聯，成為一個人工基因，并將該基因在表達載體系統中表達后純化，得到流感病毒基因工程表位疫苗。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于欲串聯在一起的包括至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位或/和至少一個流感病毒的T細胞表位或/和至少一個流感病毒的CTL細胞表位的寡核苷酸片段的兩端包含一對能夠產生匹配末端的內切酶。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于在表位序列后，導入一標簽DNA片段。
全文摘要
本發明的名稱為一種流感病毒基因工程表位疫苗及其制備方法。本發明的目的是提供一種能夠有效抗御流感病毒變異的基因工程表位疫苗。本發明的流感病毒基因工程表位疫苗，它基本上是包括由下列成員中的一個或多個連接而成的肽段1)至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位；2)至少一個流感病毒的T細胞表位；3)至少一個流感病毒的CTL細胞表位。制備流感病毒基因工程表位疫苗的方法，是利用聚合酶鏈式反應和限制性核酸內切酶將編碼至少一個流感病毒的中和表位及其變異表位或/和至少一個流感病毒的T細胞表位或/和至少一個流感病毒的CTL細胞表位的DNA序列重復串聯或組合重復后串聯，成為一個人工基因，并將該基因在表達載體系統中表達后純化，得到流感病毒基因工程表位疫苗。本發明的疫苗將對預防醫學研究產生重大影響，并且將帶來巨大的經濟效益和社會效益。
文檔編號A61K39/145GK1431020SQ0210003
公開日2003年7月23日 申請日期2002年1月8日 優先權日2002年1月8日
發明者陳應華, 李華, 劉祖強, 陸韻, 丁健, 劉萬里 申請人:清華大學