專利名稱：作為造血刺激物的成骨生長寡肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種相當于OGP C-末端部分的寡肽的應用，該寡肽可作為造血刺激物。更具體地說，上述寡肽能增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量，尤其是在化療和放療后。此外，本發明還提供一些應用上述寡肽及含有上述寡肽的藥物組合物的方法。
背景技術：
骨與骨髓之間的生物學和生物化學相互作用尚遠未被完全了解。但是，新近研究確定了骨髓衍生的成骨細胞在支持造血細胞發育中的作用[Teichman，R.S.，et al.，Hematol.4421-426(2000)]。
骨髓移植研究證實了上述兩個系統間雙向的相互作用。骨髓切除或放療損傷可引發初期的局部短暫性的成骨反應[Amsel，S.，et al.，Ana t.Rec.164101-111(1969)；Patt，H.M.，and Maloney，M.A.，Exp.Hematol.3135-148(1975)]。在該成骨階段中，小梁在骨髓腔中形成。小梁的存在是暫時的，并且在造血骨髓的重建過程中被再吸收。此外，在人骨髓捐贈者中，在切除了髂骨骨髓的大部分后，可記錄到血清中骨形成標志骨鈣素和堿性磷酸酶的增加[Foldes，J.，etal.，J.Bone Miner.Res.4643-646(1989)]。人成骨細胞支持人造血祖細胞的假說是相當引人感興趣的這些細胞在不添加外源性生長因子的情況下即可產生直接刺激造血集落形成的因子。事實上，成骨細胞分泌多種細胞因子，包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)以及白介素6(IL-6)。除此之外，培養的成骨細胞還有助于維持造血干細胞中的未成熟的表型[Taichman，et al.，Blood 87518-524(1996)]。
若干這些生長因子能夠在高劑量的化療后能夠增強體內的骨髓再增殖和外周干細胞的動員。其中，G-CSF、GM-CSF、IL-3(白介素3)以及SCF(干細胞因子)已經被詳盡地評價過了[Bungart，B.，et al.，Br.J.haematol.76174(1990)；Lant，T.，et al.，Blood 85275(1995)；Brugger，W.，et al.，Blood 791193(1992)；Molinex，G.，et al.，Blood 78961(1991)]，而許多其他一些生長因子，如FLT-3，目前正處于臨床應用的研究中[Ashihara，E.，et al.，Europ.J.Haematol.6086(1998)]。近年來，該領域中取得的一些進展使得了解骨髓的若干生理學方面的功能成為可能。此外，調控造血前體分化和增殖的活性是更具創新性的療法的依據，這些療法包括外周血干細胞移植、基因轉染，以及離體的干細胞擴增等。盡管有這些重大的進步，但干細胞生理學的諸多方面還沒有完全被闡明，并且有些因子，包括可溶性因子或細胞膜相關因子，都被認為可能參與骨髓細胞的生理學或病理學的增殖/分化。數量不斷增加的顯示出能夠調節造血作用的藥劑證明了關于造血調節物的冗余性和微妙性的關鍵問題[Metcaff，D.，et al.，Blood 823515(1993)]。
除了經典定義的生長因子的作用外，一些生物學試劑和細胞類型也能夠改善或修飾體內和體外的治療策略。人骨髓衍生的內皮細胞可以支持髓細胞和巨核細胞祖細胞的長期增殖和分化[Rafii，S.，et al.，Blood 863353(1995)]；輔助細胞可有助于骨髓移植后的血液恢復[Bonnet，D.，et al.，Bone Marrow Transpl.23203(1991)]；以及，對當前目標來說更讓人感興趣的是，成骨細胞可以增強小鼠中HLA非相關的骨髓移植后的植入[EL-Badri，N.S.，et al.，Exp.Hematol.26110(1998)]。
現已研究了許多化學結構以估計其在骨髓生理學上的可能作用。舉例來說，粘多糖的作用已經在白血病衍生的細胞系中[Volpi，N.，etal.，Exp.Cell Res.215119(1994)]和在人臍帶血衍生的干細胞的克隆源性試驗中[Da Prato，I.，et al.，Leuk.Res.231015(1999)]得以評價。甚至已經合成出一些短肽用以獲得血液調節和多譜系的作用，這些作用可能是通過增加基質細胞產生的細胞因子來實現的[King，A.G..，et al.，Exp.Hematol.20(4)531(1992)；Pelus，L.M.，etal.，Exp.Hematol.22239(1994)]。
特發性骨髓纖維化(IMF)是極為少見的并導致最壞的慢性骨髓纖維化疾病的預后。最初的發病過程是純系造血干細胞的失調，其結果是導致貧血、非典型巨核細胞增生、脾腫大以及各種程度的髓外造血。相比之下，典型的基質增殖是一種反應性的現象，是由不恰當的釋放巨核細胞/血小板衍生的生長因子導致的，這些因子包括血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)以及鈣調蛋白[Groopman，J.，Ann.Intern.Med.92857-858(1980)；Chvapil，M.，Life Sci.161345-1361(1975)]。IMF患者的存活中值約為4年。IMF的治療策略仍然主要是輔助地和直接地針對減輕癥狀和改善生活質量。最常用的方法是輸血法、雄性激素和諸如羥基脲等減細胞劑。骨髓移植正日益被考慮到，但該技術仍然被認為是一種試驗性方法。干擾素α(IFN-α)已經在IMF的高度增殖早期顯示出很好的結果，但在該疾病的較晚期卻沒有或只有很小的療效。
一些發明者以前已經證實，成骨生長肽(OGP)，一種含有14個氨基酸的高度保守的H4組蛋白相關肽，能夠增加小鼠血液和骨髓的細胞含量，并增進骨髓移植物的植入[Bab，I.A.，Clin.Orthop.31364(1995)；Gurevitch，O.，et al.，Blood 884719(1996)和美國專利5,461,034]。已經從切除后骨髓再生的成骨階段分離出OGP[Bab，I.，et al.，Endocrinology，128(5)2638(1991)]，并且在生理條件下大量存在于血液中，主要與α2-巨球蛋白(α2-M)作為一種復合物存在[Gavi sh，H，et al.，Biochemistry，3614883-14888(1997)]。體內給藥后，OGP可增進骨形成和增加小梁骨量；體外給藥后，OGP可刺激成骨細胞系的增殖和其中堿性磷酸酶的活性；此外，還可增強成骨細胞的有絲分裂[Grennberg，Z.，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1178273(1993)]。除了在骨再生、造血細胞激活和成纖維細胞增殖方面的活性外，OGP在體內還能夠誘導白細胞(WBC)計數的平衡增加，并且誘導接受骨髓清除輻射和同源或半同源的骨髓移植的小鼠中全部骨髓的細胞含量[Gurevitch，O.，et al.，ibid(1996)]。
OGP C-末端的五肽，命名為OGP(10-14)，該五肽可能是從與α2-M的失活的復合物上解離的全長OGP通過蛋白水解產生的，以高水平存在于哺乳動物的血清和成骨細胞培養物中[Bab，I.，et al.，J.Pept.Res.54408(1999)]。
N-末端經修飾的OGP在細胞增殖方面保留了類似OGP的劑量依賴性效應，并且現在認為羧基末端的五肽負責與可能的OGP受體結合[Gr ennberg，Z.，et al.，ibid(1993)]。此外，發明者之前已經證實在成骨MC3T3 E1細胞中，OGP(10-14)而非OGP的促有絲分裂劑量能夠以時間和劑量依賴性方式增強MAP的激酶活性。這些發現表明OGP(10-14)負責下游信號傳遞[Gabarin，et al.，J.Cell Biol.81594-603(2001)]。此外，還證明了OGP的活性形式是其羧基末端的五肽OGP(10-14)。讓人感興趣的是，OGP(10-14)不與α2-M或其它OGPBP(OGP結合蛋白)形成復合物[Bab，I.，J.Peptide.Res.54408-414(1999)]。
因此，本發明中對合成的類似于天然OGP C-末端區域的寡肽可能存在的造血活性進行了評價。有關一些此類具有成骨活性的特定肽的描述參閱美國專利5,814,610。sOGP(10-14)被認為具有阿片或其鎮痛劑的活性[Kharchenko et al.，Vepr.Med.Khim.，5(2)106-109，(1989)]。
重要的是，本發明證實了先前已知的成骨活性寡肽能夠作為造血系統的刺激物。舉例來說，合成的OGP衍生的被命名為OGP(10-14)的五肽在小鼠中具有多種性質，例如增加血液和骨髓的細胞含量，并增進骨髓移植的植入。在環磷酰胺(CFA)誘導再生障礙后，該五肽在外周血細胞恢復過程中顯示出顯著活性，并且該五肽在干細胞動員中也顯示出顯著活性。此外，來自IMF患者的骨髓組織樣品中也可檢測到合成OGP(10-14)的離體活性，并證實其離體活性能夠增強造血細胞數量顯著的總體增加。此外，OGP(10-14)的效應強度與IMF的嚴重程度直接相關。這些結果表明OGP(10-14)可能會刺激血細胞形成和挽救造血作用。
因此，本發明的一個目標是將OGP衍生的寡肽作為紅細胞生長因子加以應用。本發明的這一目標和其它目標將在以下部分詳細說明。
發明概述在第一個方面，本發明涉及一種藥物組合物，該組合物包含至少一種作為有效成分的寡肽，該寡肽具有刺激造造血的活性。根據本發明，所使用的寡肽的分子量為200-1,000Da，并且該寡肽包含Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一種氨基酸序列。本發明的藥物組合物可任選包含一種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
在本方面的一項優選實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的五肽(命名為OGP(10-14))，以及一種可藥用載體。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-His-Gly的五肽。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是一種分子式為Gly-Phe-Gly-Gly的四肽，以及一種可藥用載體。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種含有氨基酸序列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的寡肽和一種可藥用載體，其中優選的是，將蛋氨酸殘基酰基化，即該寡肽的分子式為Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
本發明的藥物組合物意在用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物意在用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量，尤其是在接受化療或放療的患者中。
本發明的藥物組合物中所用的寡肽增加循環的多譜系祖細胞的百分比。這些多譜系祖細胞是循環的早期前體CD34陽性細胞。
此外，本發明的藥物組合物中所用的作為有效成分的寡肽可以增強未成熟細胞和單核細胞的恢復，并且能夠選擇性地增加BFU-E和GEMM中任一項的集落形成單位(CFU)。
因此，本發明的藥物組合物意在用于增加白細胞(WBC)、循環的造血干細胞，以及總體的骨髓和血液的細胞含量。
在一項特別優選的實施方案中，本發明的組合物意在用于支持骨髓移植。該作用是由于寡肽在增加造血干細胞數量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加整個骨髓的細胞含量方面的活性。
根據另一項特別優選的實施方案，本發明的藥物組合物意在用于對患有血液病、實體腫瘤、免疫病和/或再生障礙性貧血等疾病的接受骨髓移植的病人進行治療。更具體地說，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病以及骨髓增生性疾病。具體地說，骨髓增生性疾病可以是特發性骨髓纖維化(IMF)。
在第二個方面，本發明涉及一種寡肽在藥物組合物的制備中的應用，該寡肽包含Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，該組合物意在用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量。
在一項特定實施方案中，本發明的寡肽被用于制備一種藥物組合物，該藥物組合物意在用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量，尤其是在接受放療或化療的受試者中。
根據一項優選實施方案，上述特定寡肽被用于制備本發明的藥物組合物以增加循環的多譜系祖細胞的數量。這些多譜系祖細胞是循環的早期CD34陽性前體細胞。
此外，用于制備本發明的藥物組合物的寡肽可以增強未成熟細胞和單核細胞的恢復，并選擇性地增加BFU-E和GEMM中任一種集落形成單位(CFU)。
因此，這種寡肽可用于制備藥物組合物，該藥物組合物意在用于增加白細胞(WBC)、循環的造血干細胞的數量，和/或總體的骨髓細胞含量。
更具體地說，本發明提供這些寡肽在制備一種藥物組合物中的應用，該藥物組合物用于支持骨髓移植。該作用是由于寡肽在增加干細胞數量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的細胞含量方面的活性。
根據另一項特別優選的實施方案，本發明涉及將上述寡肽用于制備一種藥物組合物，該藥物組合物意在用于對患有血液病、實體腫瘤、免疫病和/或再生障礙性貧血等疾病的受試者進行治療。更具體地說，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病或骨髓增生性疾病，尤其是特發性骨髓纖維化(IMF)。
在第三個方面，本方面提供一種用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及增加循環干細胞數量的方法。該方法包括將有效量的一種寡肽或本發明的組合物給藥于有需要的受試者的步驟，該寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。可以根據一項用于增進接受放療或化療的患者中骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及增加循環干細胞數量的優選實施方案來應用本發明的這種方法。
根據這一方面的特定實施方案，本發明涉及一種用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病或再生障礙性貧血等病痛的受試者的方法。本發明的這種方法包括將治療有效量的一種寡肽或一種含有相同成分的組合物給藥于病人，該寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。
在另一項特定實施方案中，該方法可用于幫助對受試者進行的骨髓移植治療。
更具體地說，上述血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病或骨髓增生性疾病，尤其是是特發性骨髓纖維化(IMF)。
一項優選實施方案涉及一種增加造血干細胞/前體細胞數量的方法。根據本發明，該方法包括將上述細胞暴露于有效量的一種寡肽或一種含有該寡肽的組合物的步驟。該寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。
在一項特別優選的實施方案中，本發明的方法意在用于增強CD34陽性細胞的增殖。
在一項特別優選的實施方案中，上述細胞存在于細胞培養物中，并且該方法可離體或體外應用。
作為選擇，本發明的方法可作為優選的是哺乳動物，尤其是人的體內治療方法。
接受治療的受試者是患有或易于血細胞水平降低的受試者，該疾病可能是由化療、放射性療法或骨髓移植療法導致的。
在另一項優選實施方案中，本發明涉及一種用于在體外或離體維持和/或擴增存在于血樣中的造血干細胞的方法。該方法包括從血樣中分離外周血細胞、富集表達CD34抗原的血液祖細胞、在適宜條件下分散已富集的血液祖細胞，以及用前文所述的具有刺激造造血活性的一種寡肽或含有該寡肽的一種組合物處理上述細胞。
根據本發明，體內治療涉及一種用于再增殖哺乳動物中的血細胞的方法。該方法包括將治療有效量的一種寡肽或含有該寡肽的一種組合物給藥于上述哺乳動物的步驟，該寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。這些造血細胞可以是紅細胞系、髓細胞系或淋巴細胞系的細胞。
附圖簡述
圖1在接受聯合清除性放射療法/BMT后的小鼠中，用sOGP(10-14)預處理對股骨髓細胞總數的一種劑量依賴性效應將OGP(10-14)以指示劑量對雌性C57 BL小鼠每天進行皮下注射，為期12天。在開始OGP(10-14)治療后的第8天，上述小鼠接受900Rad的X射線輻射，然后將105個同源的未經選擇的骨髓細胞對其進行靜脈給藥。在開始治療后第14天，將上述小鼠處死并將其股骨髓細胞沖洗到磷酸鹽緩沖液中。通過將制品多次抽吸以使其穿過分級注射器針頭來制備單細胞懸液。用血細胞計數器進行細胞計數。對C-對照小鼠僅用磷酸鹽緩沖液進行注射。由每一條件下的至少7只小鼠中獲得的平均值±SD來記錄數據。
縮寫Fem(股骨)，MarrC(骨髓細胞)，D(天)，mou(小鼠)，premed(術前用藥)，stimu(刺激)和cellu(細胞含量)。
圖2A-C在造血組織受到化學清除的小鼠中，OGP(10-14)以劑量和時間依賴性方式刺激血細胞計數用環磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的劑量對每只稱重為25gm的雄性ICR小鼠進行化學清除，在第0天和第一天每天進行一次腹膜內注射。將OGP(10-14)溶解在“注射用滅菌水”中，并且分別在第-7至-1天和第+2至+8天，每天在頸背處以0.1ml的指示劑量或僅以水(載體)進行皮下給藥。由每一條件下的20只動物中獲得的平均值+SD來記錄數據。*顯著超過CFA+載體，P＜0.05；**顯著超過1nmol的OGP(10-14)組，P＜0.05。
圖2A顯示總白細胞的計數。
圖2B顯示總單核細胞計數。
圖2C顯示總未成熟細胞計數。
縮寫cout(對照，未處理)，veh(載體)，ce(細胞)，T(時間-天)圖3在造血組織受到化學清除的小鼠中，OGP(10-14)刺激循環的CD34+/Sca-1+雙陽性細胞的數量用環磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的劑量對每只稱重為25gm的雄性ICR小鼠進行化學清除，在第0天和第一天每天進行一次腹膜內注射。將OGP(10-14)以100nmol/ml的濃度溶解在“注射用滅菌水”中，并且分別在第-7至-1天和第+2至+8天，每天在頸背處以0.1ml的該溶液或僅以水(載體)進行皮下給藥。以第+2至+8天經106UI/0.1ml的G-CSF進行CFA清除的小鼠作為陽性對照。由每一條件下的33只動物中獲得的平均值±SD來記錄數據。
縮寫veh(載體)，T(時間-天)，*顯著超過CFA+載體，P＜0.01。
圖4A-COGP(10-14)治療方案對來自造血組織受到化學清除的小鼠的骨髓的離體的集落形成單位的影響用環磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的劑量對每只稱重為25gm的雄性ICR小鼠進行化學清除，在第0天和第一天每天進行一次腹膜內注射。將OGP(10-14)以100nmol/ml的濃度溶解在“注射用滅菌水”中，并且在指示期內，每天在頸背處以0.1ml的該溶液或僅以水(載體)進行皮下給藥。在第9天收集骨髓并分析其集落形成單位。由每一條件下的10只動物中獲得的平均值±SD來記錄數據。
圖4A顯示CFU-GM圖4B顯示CFU-GEMM圖4C顯示BFU-E縮寫Colo/di(集落/平皿)，veh(載體)圖5A-B骨髓活體解剖的顯微攝影圖5A顯示，在不含OGP(10-14)的情況下經過14天的離體培養，來自特發性骨髓纖維化(IMF)患者骨髓標本的兩個部分的顯微攝影。
圖5B顯示，在含有10-8M OGP(10-14)的條件下經過14天的離體培養，來自特發性骨髓纖維化(IMF)患者骨髓標本的兩個部分的顯微攝影。注意經OGP(10-14)培養的標本中細胞密度增加。
圖6A-B骨髓活體解剖的顯微攝影圖6A顯示，在不含OGP(10-14)的情況下經過14天的離體培養，來自特發性骨髓纖維化(IMF)患者骨髓標本的兩個部分的網狀組織染色切片的顯微攝影。
圖6B顯示，在含有10-8M OGP(10-14)的條件下經過14天的體外培養，來自特發性骨髓纖維化(IMF)患者骨髓標本的兩個部分的網狀組織染色切片的顯微攝影。注意經OGP(10-14)處理過的組織的正常外觀。
圖7對IMF的回歸分析特發性骨髓纖維化(IMF)患者中，血紅蛋白水平和用OGP(10-14)處理的比上未處理的樣品中的造血細胞數量的離體比率(T/C比)之間進行回歸分析，表明IMF的嚴重程度與OGP(10-14)的作用具有直接關系。
縮寫Hem(血紅蛋白)，Hemato(造血的)，rat(比率)，cellu(細胞含量)發明詳述由于許多細胞生物學領域和肽化學領域的方法已為本領域技術人員所熟知，在此就不進行詳細描述了。這些方法包括肽合成和結構分析、差示細胞計數、細胞分類分析、集落形成試驗，等等。關于此類方法描述的教科書有，例如，《免疫學最新技術》，Coligan etal.(eds)，John Wiley & Sons.Inc.，New York，NY，以及Stewart，J.M.and Young J.D.的《固相肽合成》，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，pp.1-175(1984)上述出版物在此完整引入作為參考。此外，由于許多免疫學技術已為本領域技術人員所熟知，在此就不一一進行詳細描述了。
文中使用的縮寫詞如下OGF(s)-成骨生長多肽OGPBP(s)-成骨生長多肽結合蛋白sOGF-合成的成骨生長多肽WBC-(白細胞)PBL-(外周血)CFA-(環磷酰胺)
BMT-(骨髓移植)IMF-(特發性骨髓纖維化)若干細胞藥劑或可溶性藥劑能夠在骨與骨髓細胞的相互作用中起作用。這種相互作用可能對造血干細胞和祖細胞的定型、增殖以及分化非常重要。
OGP能夠增強成骨作用和增加骨髓的細胞含量[Greenberg，Z.，etal.，ibid.(1993)；Gurevitch，O.，et al.，ibid.(1996)]。此外，OGP對成骨細胞、成纖維細胞以及骨髓基質細胞來說是一種強有絲分裂原[Greenberg，Z.，et al，J.Cellular Biochem，65359-367(1997)；Robinson，D.，et al.，J.Bone Min.Res.，10690-696(1995)]。
新近報導，在成骨細胞系中，通過百日咳毒素敏感的G蛋白，OGP能夠激活有絲分裂原活化的蛋白激酶。這些活性可能限制在C-末端五肽OGP(10-14)中，因此認為OGP(10-14)是OGP的生物活性形式[Bab，I.，et al.，ibid(1999)]。鑒于上述肽在體內應用的可能性，考慮到其沒有免疫原性和毒性，以及相對簡單的生產方法和操作，OGP(10-14)是非常引人矚目的。
以前的研究已經證實，用0.1-10nmol的OGP每日對正常小鼠進行為期兩周的皮下注射后，該肽可誘導WBC計數增加50％以上，并可使總體的骨髓細胞含量增加大約40％[Gurevitch，O.，et al.，ibid.，(1996)]。不同細胞類型的比例不會因處理而發生改變，這一點證明對造血的多譜系活性。有趣的是，文中描述的試驗中，在將CFA(環磷酰胺)給藥以誘導出可逆的發育不全后，用OGP(10-14)處理過的小鼠比僅以安慰劑注射的小鼠恢復地更快，并且在所用劑量下未檢測到任何毒性。
因此，在第一個方面，本發明涉及一種藥物組合物，該組合物包含至少一種作為有效成分的寡肽，該寡肽具有刺激造造血的活性，并且優選的是該寡肽包含用SEQ ID Nos1，2，3和4表示Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly或Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，以及一種可藥用載體通過骨髓中細胞的分裂而使得紅細胞和白細胞更換的血細胞形成過程就稱為造血作用。有關造血的綜述參閱Dexter and Spooncer[Ann.Res.Cell Biol.，3423-441(1987)]。
血細胞有許多種不同的類型，這些類型屬于各種不同的細胞系。在各種細胞系中，這些細胞處于不同的成熟階段。成熟的血細胞被特化以執行不同的功能。例如，紅細胞涉及O2和CO2的運輸；T淋巴細胞和B淋巴細胞分別涉及細胞和抗體介導的免疫應答；血小板是負責血液凝集；而粒細胞和巨噬細胞通常作為體內的清道夫和輔助細胞。粒細胞還能夠進一步分為嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞。
在本發明的一項特別優選的實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ IDNO1表示的五肽。該五肽在整個本申請書中都被稱為OGP(10-14)。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是分子式為Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2表示的五肽。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是分子式為Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3表示的四肽。
在另一項實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種寡肽，該寡肽是分子式為Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO4表示的六肽，其中蛋氨酸殘基可以被酰基化。
上述這些作為本發明藥物組合物的有效成分的寡肽是根據已知的有機化學方法合成的。有關這種合成方法的描述參閱，例如，上述美國專利5,814,610。
根據本發明的一項優選實施方案，本發明的藥物組合物意在用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量。
根據另一項實施方案，本發明的藥物組合物意在用于增進接受化療和放療的受試者中骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環干細胞的數量。
造血干細胞提供終生產生全部血細胞系的能力是通過在干細胞的可塑性，即產生能夠生成特定血細胞系的定向祖細胞，和干細胞在未分化階段的復制(自我更新)之間的平衡來實現的。很難確定體內調控造血干細胞的可塑性和自我更新的機制。但是，主要的作用因子都表明了細胞內在因素和環境的聯合影響[Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210302-10306(1995)]。通過使用長期的骨髓培養系統證實了造血作用微環境的重要性，該系統中，在基質組織上培養造血細胞以維持HSCs的生長，雖然頻率較低[Fraser，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)；Wineman，et al.，Blood81365-372(1993)]。
造血細胞能夠在培養基中維持生長的確定，使得研究工作致力于鑒定候選的“干細胞”因子。研究造血細胞因子在干細胞維持生長中的作用的方法是，在體外的干細胞群培養物中直接添加純化的因子，然后將該培養細胞移植[Meunch，et al.，Blood 813463-3473(1993)；Wineman et al.，ibid.(1993)；Rebel，et al.，Blood83128-136(1994)]。大多已知的“早期作用”細胞因子，如IL-3、IL-6和KL，已經被證實能夠刺激更定型的祖細胞的增殖，并同時維持能夠長期多譜系再增殖的細胞的生長，但不能增強其增殖[綜述見Williams，Blood 81(12)3169-3172(1993)；Muller-Sieburg andDeryugina，Stem Cells，13477-486(1995)]。盡管這些結果顯示細胞的可塑性和再增殖功能可能是通過細胞因子的作用保持的，但是增強這些多能細胞自我更新的分子仍然是未知的。
用于本發明的藥物組合物的多肽被證實能夠增加循環的多譜系祖細胞的百分比。這些多譜系祖細胞是循環的早期前體CD34陽性細胞。
在人和小鼠中，原始的成熟造血祖細胞經鑒定屬于一類表達被命名為CD34的表面抗原的細胞。這些細胞被稱為CD34陽性細胞。在小鼠中，CD34+/Sca±雙陽性細胞是一種CD34陽性造血細胞的早期亞類。在人中，類似的Sca-1細胞表面抗原是F1k2。因此，可以認為人的CD34+/F1k2雙陽性細胞等同于小鼠的CD34+/Sca±雙陽性細胞。
本文中，表達CD34抗原和/或F1k2受體的人造血祖細胞被稱為“原始祖細胞”。相反的，既不表達CD34抗原也不表達F1k2受體的造血細胞被稱為“成熟祖細胞”。因此，作為優選的實施方案，多譜系祖細胞是循環的早期前體CD34/F1k2雙陽性細胞。
在此使用的“祖細胞”是指任何具有通過分化和增殖產生完全分化的、功能性的后代的能力的體細胞。祖細胞包括來自任何的組織或器官系統的祖細胞，包括，但不局限于，血液、神經、肌肉、皮膚、腸道、骨、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺，等等。祖細胞不同于“分化細胞”，分化細胞的定義是可以具有或可以不具有增殖，即自我復制能力的細胞，但在正常的生理條件又不能經過進一步的分化以形成不同細胞類型。此外，祖細胞與異常細胞諸如癌細胞，特別是淋巴細胞也不相同，異常細胞可以增殖(自我復制)，但通常不再進一步分化，盡管表現出未成熟或未分化的狀態。
祖細胞是根據其后代細胞進行定義的，例如，粒細胞/巨噬細胞集落形成祖細胞(GM-CFU)分化成為嗜中性粒細胞或巨噬細胞；原始紅細胞母細胞形成單位(BFU-E)分化成為紅細胞集落形成單位(CFU-E)，后者再產生成熟的紅細胞。類似地，Meg-CFU、GEMM-CFU、Eos-CFU和Bas-CFU的祖細胞能夠分別地分化成為巨核細胞、粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。
已經對其它多種造血祖細胞進行了性質鑒定。例如，造血祖細胞包括那些能夠進行連續的分化和增殖周期以產生出八種不同的成熟造血細胞系的細胞。在造血譜系的最原始或未分化端，造血祖細胞包括造血“干細胞”。這些稀少的細胞，在骨髓中每10,000-100,000個細胞中存在一個，均具有產生超過1013個所有譜系的成熟血細胞的能力，并且在生物體生命的全過程負責維持血細胞的生產。它們在骨髓中最初是以靜止狀態存在，并且可通過所謂的自我更新產生完全相同的后代細胞。由此，這種未定型的祖細胞可以被描述為“全能性”細胞，即同時具有產生所有類型成熟血細胞的必要條件和充分條件。保留了產生所有血細胞系的功能，但不能夠進行自我更新的祖細胞被稱為“多潛能性(pluripotent)”細胞。能夠產生某些血細胞系，但不能產生所有的血細胞系和不能進行自我更新的細胞被稱為“多能性(multipotent)”細胞。
本發明所使用的寡肽可有效用于保持任何上述祖細胞，包括單能性祖細胞、多潛能性祖細胞和/或全能性祖細胞。上述寡肽，尤其是OGP(10-14)，已被證實對保持造血祖細胞特別有效。
在另一項優選實施方案中，作為本發明藥物組合物中的有效成分的寡肽能夠增強未成熟單核細胞的恢復，并選擇性地增加EFU-E和GEMM中任意一種的集落形成單位(CFU)。
下文的實施例3對來自OGP(10-14)處理小鼠的造血集落形成和對照處理小鼠的造血集落形成的離體評定進行了描述。其結果表明，來自OGP(10-14)處理小鼠的培養物與僅以載體處理的對照小鼠的培養物相比，GEMM-CFU和BFU-CFU均有所增加，而陽性的G-CSF對照誘導出GM-CFU的顯著增加。似乎只有當治療開始于化學清除之前7天，處理小鼠的培養物中集落形成才會增加。用OGP(10-14)得出的體內和離體結果證實了以前報導的全長OGP與各種細胞因子相比的多譜系活性。與其他的生長因子和動員因子不同[Fleming，W.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903760(1993)]，sOGP(10-14)能夠增加外周血中造血干細胞的數量，并且不會減少骨髓干細胞的腔隙。
因此，本發明的藥物組合物意在用于增加白細胞(WBC)和循環的造血干細胞的數量，以及總體的骨髓細胞含量。
在一項特別優選的實施方案中，本發明的藥物組合物意在用于幫助骨髓的移植。該作用是由于寡肽在增加造血干細胞數量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加整個骨髓的細胞含量方面的活性。
如實施例1中的描述，本發明的寡肽被發現具有增進強骨髓移植物的植入，并增強造血作用的重建。骨髓移植(BMT)已經逐漸并迅速地成為治療惡性血液病的選擇，這些惡性血液病包括淋巴瘤、霍奇金病、急性白血病以及實體腫瘤，尤其是黑體瘤和乳腺癌。最近，BMT逐漸被考慮用來治療諸如IMF(特發行骨髓纖維化)的骨髓增生性疾病。隨著技術的進步，可能BMT還可以用來治療其他災害性疾病-AIDS、再生障礙性貧血以及自身免疫病。所有BMT的目的都是替換宿主因化療、放療或疾病而損傷的造血干細胞、全能性細胞和多潛能性細胞。這些干細胞可能夠反復復制并分化產生所有的存在于血液中的各種細胞，即紅細胞、血小板和WBC，WBC又包括淋巴細胞、單核細胞和噬中性細胞。此外，定居的巨核細胞和成骨細胞也是來自造血全能干細胞。隨著干細胞的分化，它們逐漸定向定型于特定的譜系，直到這些細胞只能夠形成一種上述細胞為止。
因此，根據另一項特別優選的實施方案，本發明的藥物組合物可用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病或再生障礙性貧血的骨髓移植病人。更具體地說，上述血液病可以是淋巴瘤、霍奇金病或急性白血病以及骨髓增生性疾病，尤其是特發性骨髓纖維化(IMF)。
在IMF中，骨髓的紅細胞發生出現進行性障礙，而異位造血發展并增長。纖維的病理性鈣化和骨小梁的結構變化可能導致成骨細胞分泌的因子的絕對或相對不足，因此至少部分地造成骨髓功能受損。
在實施例4中描述的結果有力地證明了OGP(10-14)能夠增加IMF患者骨髓片斷培養物中骨髓造血細胞的密度，如此短的時間內，未改變纖維化。細胞的增加似乎是平衡的，但不是由于非典型細胞的增殖造成的。當然，有一點不能排除，與沒有用五肽培養的樣品中發現的結果相比，OGP(10-14)的確保持了培養物中IMF樣品的骨髓結構和細胞含量。但是，與天然樣品中發現的結果相比，在某些OGP(10-14)培養的樣品中保持或甚至增加的細胞含量證實上述肽的增殖活性。但是現在還不是很清楚，究竟OGP是直接作用于血液前體細胞還是經由基質細胞或不同的細胞群，但是，至少在形態學水平上，其活性可能不依賴于微環境的顯著重構。
事實上，該觀察結果的一個結論就是OGP(10-14)能夠體外增強人造血細胞的三種譜系的擴增。
本發明的藥物組合物包含一種存在于可藥用載體、賦形劑或穩定劑中的作為有效成分的前文所述的寡肽或該寡肽的混合物，以及任選的其它治療性組分。可接受載體、賦形劑或穩定劑在所用的劑量和濃度上對受體是無毒的，并且包括緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖鹽水和類似的生理可接受緩沖液，以及本領域已知的更常用的所有適當的載體、賦形劑和穩定劑，例如，為了在藥物組合物中加入味道、顏色、潤滑度等目的而添加的載體、賦形劑和穩定劑。
載體可以包括淀粉及其衍生物，纖維素酶及其衍生物，例如微晶纖維素酶、黃原膠，等等。潤滑劑可以包括氫化蓖麻油等。
優選的緩沖液是磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)，該溶液仍需要調節摩爾滲透壓濃度。
優選的藥物制劑不包含載體。優選的是，通過包括靜脈內注射在內的注射將該劑型用于給藥。
藥物組合物的制備為本領域所熟知，并在很多文章和教科書中都有描述，參閱，例如，《雷明頓藥物科學》，Gennaro A R.ed.，MackPublishing Company，Eastan，Pennsylvania，1990，尤其是其中的第1521-1721頁。
可以將本發明的藥物組合物以單位劑型配制。該劑型還可以包括持續釋放裝置。可以用藥學領域所熟知的任何方法制備上述組合物。這類劑型包括既無內源毒性也無療效的生理相容性載體。這類載體的實例包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、外源凝集素、血清蛋白，如人血清白蛋白、緩沖物質，如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、中和植物脂肪酸的不飽和甘油酯、水、鹽，或電解質，如硫酸精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素酶的物質，以及PEG。用于這些寡肽的局部或基于凝膠的形式的載體包括多糖，如羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸脂、聚氧乙烯嵌段聚合物、PEG，以及木醇。對所有的給藥來說，適合使用傳統的儲存形式。這些儲存形式包括，例如，微膠囊、納米膠囊、脂質體、膏劑、吸取形式、鼻噴劑、舌下片劑和持續釋放的制劑。
適當的持續釋放的制劑的實例包括含有本發明寡肽的半滲透的固態疏水性聚合物基質，該基質以成形物的方式存在，例如，薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠、如美國專利No.3,377,919描述的聚交酯、L-谷氨酸與γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LupronDepotsTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。某些水凝膠釋放蛋白的時間較短，而諸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠使分子的釋放時間超過100天。當膠囊包裹后，肽能夠在體內可維持很長時間，肽暴露在37□的潮濕條件下可發生變性或聚集，導致其生物活性的喪失并有可能改變其免疫原性。可根據涉及的機制設計合理的策略以維持蛋白穩定性。例如，如果發現聚集機制是通過巰基-二硫鍵互換形成分子間S-S鍵所導致，獲得穩定性的方法有，通過對含有巰基的殘基進行修飾、從酸性溶液中凍干、控制濕度、使用適當的添加劑，以及開發特殊的聚合物基質組合物。
此外，持續釋放的寡肽，特別是sOGP1-14組合物還可包括脂質體捕獲的多肽。包含這些多肽的脂質體可由本領域已知的方法進行制備，例如，在Eppstein，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA823688-3692(1985)；Hwang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA774030(1980)；美國專利Nos.4,485,045和4,544,545中的描述。通常，脂質體是小(大約200-800埃)單層型，其中的脂含量大于約30mol.％膽固醇，根據最適的多肽療法來調整所選擇的比例。美國專利No.5,013,556中公開了具有延長的循環時間的脂質體。
制備用于儲存的上述寡肽的治療性制劑的方法是，將具有所需純度的這些寡肽與任選的生理可接受載體、賦形劑或穩定劑混合[《雷明頓藥物科學》，第16版，Osol，A，Ed.，(1980)]為凍干塊形式或水性溶液形式。可接受載體、賦形劑或穩定劑在所用的劑量和濃度下對受者是無毒的，并且包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于大約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；鹽形成反離子，如鈉；和/或非離子型表面活性劑，如Tween、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
此外，在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中，或者在巨乳劑中，還可以將上述寡肽捕獲在微囊體中，方法是，例如，通過凝聚技術或界面聚合(例如，分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊體)。這類技術公開于《雷明頓藥物科學》，ibid中。
優選的是，將該藥物組合物每日為所需受試者使用一次，并且優選的是，包含活性成分的劑量約為0.001-50nmol，更優選的是約為0.05-25nmol，最優選的約為0.1-10nmol。
應該明白的是，除了描述的寡肽外，本發明的移植支持組合物還可以任選包括其它治療性組分。這類組分可以是一種或多種已知的細胞因子，例如，IL-3、IL-4、IL-5、G-CSF、GM-CSF(粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子)。當上述另外的組分摻入到組合物中時，該組合物在支持骨髓移植方面的作用能夠協同增強。
作為第二個方面，本方面涉及上文所述的任一寡肽，具體為分別用SEQ ID Nos1、2、3和4表示的Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gl、Gly-Phe-Gly-Gly或Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，在制備用于增進骨髓移植物的植入、造血作用重建、骨髓再增殖以及增加循環的干細胞數量的藥物組合物中的應用。
此外，在此描述的寡肽還可用于制備藥物組合物，該藥物組合物用于加速骨髓移植物的植入、增強移植干細胞的增殖，并由此增加包括紅細胞在內的全部造血細胞類型的可獲得性，從而避免至少要在數周內為宿主提供這些細胞的要求；該藥物組合物還可通過增加基質細胞數目和/或增強來自基質細胞的造血輔助因子的表達來改善基質造血的微環境；該藥物組合物還可以增強造血干細胞表達針對造血輔助因子的受體；增強靜脈給藥的骨髓移植物“回巢”至宿主骨髓；增強BMT后血液細胞含量的恢復；使得可用更少的細胞數成功進行移植，從而(成倍地)減少來自供體的骨髓提取物數量，使得用少至10-15ml的移植物(替代以往的1000ml)成為可能；增加了供體外周血中造血全能性干細胞和/或多潛能性干細胞的數量，從而增加移植來自外周血的干細胞的可行性；增加了用作為移植物的體外長期骨髓培養物中造血干細胞的數量，并且還提供一種方法，用于抑制白血病患者自體移植物中腫瘤細胞的生長；增強化療和/或放療后骨髓和血液細胞含量的內源性恢復；并且還可增強BMT或化療和/或放療后定居的巨噬細胞種群的恢復。
當然，寡肽或本發明的藥物組合物的治療劑量的大小可隨受試者的類群(年齡、性別等)和所要治療疾病的性質而變化，劑量大小還可隨具體使用的寡肽及其給藥途徑而變化。無論如何，治療劑量都要由主治醫師來進行確定。
可采用任何適宜的給藥途徑將本發明多肽的一種有效劑量提供給哺乳動物，特別是人。優選的是靜脈給藥、皮下給藥以及口服給藥。
作為一種優選的具體實施方案，這些寡肽被用來制備藥物組合物以增加循環的多譜系祖細胞的百分比。這些多譜系祖細胞是循環的早期前體CD34陽性細胞，而優選的是，CD34/F1k2雙陽性細胞。
以上說描述的“造血干細胞/祖細胞”或“原始造血細胞”是一種能夠進行分化從而形成更為定型或更加成熟的血細胞類型的細胞。“造血干細胞”或“干細胞”是一種具有使受到致死性放療的宿主進行長時間移植物植入功能的細胞。
“CD34+細胞群”可對造血干細胞進行富集。CD34+細胞群可由臍帶血或骨髓中獲得，例如，可根據生產商的指導，使用Miltenyi(Calforina)所銷售的免疫磁珠來篩選人臍帶血CD34+細胞。
此外，用于制備本發明的藥物組合物的寡肽還可增強未成熟細胞和單核細胞的恢復，并還可選擇性地增加BFU-E和GEMM中任意一種的集落形成單位(CFU)。
由此，可將上述寡肽應用于制備增加白細胞(WBC)和循環造血干細胞數量以及總體的骨髓細胞含量的藥物組合物。
更特別的是，本發明提供了上述多肽在制備支持骨髓移植的藥物組合物中的應用。這一效應是由于寡肽增加干細胞數量、加速骨髓移植中造血功能的重建以及增加骨髓細胞含量的活性。
根據另一特定優選實施方案，本發明涉及上述寡肽在用以治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病以及再生障礙性貧血的患者的藥物組合物的制備中的應用。更具體的是，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病以及骨髓增殖性疾病，特別是特發性骨髓纖維化(IMF)。
在第三個方面，本發明提供了一種方法用于增強骨髓移植物的植入、造血功能的重建，骨髓的再增殖以及增加循環干細胞的數量。該方法包括以有效量的具有上文中所描述的對造血具有刺激活性的一種寡肽或本發明藥物組合物對有需要的受試者進行給藥。
根據本發明的另一特定實施方案，本發明還提供了一種方法用以增強接受了化療或放療的患者骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再殖以及增加患者循環干細胞的數量。
在另一項實施方案中，在哺乳動物中，可應用有效量的本發明的寡肽或藥物組合物，于由其外周血獲得造血祖細胞之前，增強骨髓移植中移植物的植入或刺激造血干細胞的動員和/或擴增。
根據此方面的一個特定實施方案，本發明涉及到一種以治療有效量的對造血細胞具有刺激效應的寡肽或包含該寡肽的藥物組合物對受試者進行給藥來治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病以及再生障礙性貧血的受試者的方法。
在另一特定實施方案中，可使用此方法支持通過骨髓移植受試者的治療。
在治療性應用中，可將本發明的寡肽或藥物組合物以生理可接受的劑型，包括可作為藥丸形式或在一段時間內連續輸注對人進行靜脈內給藥的劑型來對哺乳動物，優選的是人進行給藥。可選的給藥途徑包括有肌肉內途徑、腹膜內途徑、腦脊髓內途徑、皮下途徑、關節內途徑、滑膜內途徑、鞘內途徑、口腔途徑以及局部途徑。本發明的寡肽或藥物組合物還適用于以腫瘤內途徑、腫瘤周圍途徑、病變內途徑或病變周圍途徑進行給藥或對淋巴進行給藥來發揮局部和全身的治療性效應。
用于進行體內給藥的寡肽或藥物組合物必須是無菌的，這一要求可以通過在凍干和重配之前或之后，使用無菌的濾膜進行過濾而容易地實現。可將寡肽儲存于溶液中。治療性寡肽組合物通常可放置于帶有無菌入口的容器中，例如，一種帶有可被皮下注射針頭可穿透的塞子的靜脈溶液袋或藥瓶。
在治療中所使用的任何一種本發明的寡肽或藥物組合物的“有效量”依賴于，例如，治療對象、給藥途徑以及患者的情況。因此，治療師有必要對劑量進行濃度測定和根據要求調整給藥途徑以得到最適的治療效果。典型的是，臨床醫生可將寡肽進行給藥直到達到獲得所需的治療效果的劑量。根據前文提及的因素，用于全身治療的標準的每日劑量可以是約0.001nmol/Kg-50nmol/Kg或更多。
另一特定實施方案涉及對攜帶移植物的患者進行的治療，其中中可采用一種離體方法。在這一方法中，在將意在用于移植的細胞進行移植前，將其暴露于有效量的本發明的寡肽或組合物。
為獲得足夠量的用于進行移植的造血干細胞，現在可采用的最通常的方法是在供體骨的多個位點用針頭和注射器抽提1升或更多的骨髓組織，這是一個要求進行全身麻醉的復雜過程。異源BMT供體通常是組織類型相容的患者同胞，有時還可以是與受體HLA表型相匹配的無血緣供體。自體移植可免除HLA匹配的要求，可用于治療為根除實體腫瘤而接受清除性化放療的患者。還可在出生時由臍帶血中獲得自體干細胞，并對其進行保存以用于未來的給藥中。
在移植后和供體衍生的功能性骨髓建立之前，接受骨髓移植的患者會出現短暫而顯著的全血細胞減少癥，這使得患者易受感染。細菌感染和真菌感染的發病率與全血細胞減少癥的嚴重程度和持續時間有關系[Slavin，S.Nagler，A.，《移植》(1992)]。由于同樣的原因，還可使CSF不能支持紅細胞生成和血小板形成。
能夠支持造血的寡肽在其它方面也被證實是有效的。一些研究者已經發現，將外周血干細胞添加到骨髓干細胞中可顯著地增加移植物植入的比率。由外周血中提取足夠數量的干細胞是一個復雜的過程。可將上述多肽給藥于供體以增加由外周血移植干細胞的可行性[Golde，D.W.，Sci.Am.36 December(1991)]。
造血和由此成功的MBT的前提是功能性基質細胞和基質組織的存在，基質細胞和基質組織能夠調和造血微環境、保證注射的干細胞由循環到骨髓的回巢以及支持造血[Watson，J.D.和McKenna，H.J.Int.J.Cell Clong 10144(1992)]。骨髓衍生的基質組織還能夠為在體外進行的長時間骨髓培養提供條件以用來維持干細胞。目前這一技術已足夠用來維持干細胞的存活。將適宜的造血寡肽添加到這些培養基中可以在體外幫助擴增干細胞群，這樣可提高用于移植細胞的數量。
體外/體內的組合方法可以為前景策略的提供基礎，前景策略是關于(i)由供體的血液或骨髓中獲得小量的干細胞制品以及(ii)健康的個體擁有自身的干細胞直到可能需要用這些細胞來治療一種嚴重的疾病，由此可回避應用異源MBT所帶來的復雜性。
因此，應用小肽諸如本申請中所描述的寡肽的治療價值在于其可通過在體內、離體以及體外增強主要成分為纖維性組織、骨以及骨細胞的造血微環境來刺激BMT后造血功能的重建。這些肽還能夠支持天然存在的或誘導的骨髓抑制狀態下的造血，該狀態下不一定涉及BMT。
本申請中所描述的寡肽和優選的五肽OGP(10-14)似乎直接作用于早期造血祖細胞(也就是說，造血干細胞/祖細胞)水平。這一擴增的干細胞群可以作為髓細胞生成、紅細胞生成(例如，脾臟紅細胞生成)以及淋巴細胞生成的細胞來源。因此，可在體外或體內，用這些寡肽來刺激和/或維持造血干細胞/祖細胞的增殖(例如，用來治療血液病或血液病癥)。
因此，一種優選實施方案涉及一種用來增強造血干細胞/祖細胞的增殖的方法。根據本發明，此方法包含將造血干細胞/祖細胞暴露于有效量的對造血干細胞具有刺激活性的寡肽或上文所描述的含有該寡肽的組合物的步驟。根據本發明，這樣的暴露有效地增強上述細胞的增殖。
術語“增強細胞增殖”包括在體外或體內增加細胞相對于未處理的細胞的生長和/或增殖的程度的步驟。可通過在細胞暴露于所關注分子之前和之后對細胞數量進行計數來檢測細胞培養物中細胞增殖的增長情況。可通過對匯合程度的顯微鏡檢測來對增殖的程度進行定量。還可通過胸腺嘧啶核苷或BrdU摻入分析對細胞增殖進行定量。
在一項特別優選的實施方案中，本發明的方法意在用于增強一種CD34陽性細胞，優選的是F1k2陽性細胞的增殖。
本發明的寡肽或組合物可以用于在哺乳動物體內或離體增加造血干細胞/祖細胞的數目、和/或增強造血干細胞/祖細胞的增殖和/或分化、和/或維持造血干細胞/祖細胞、擴增這些細胞以及增強這些細胞和多譜系血細胞的增殖。
在一項特別優選的實施方案中，上述細胞處于細胞培養物中，因此該實施方案可以作為一種離體/體外的方法。
可選擇的，本發明的方法可在被治療細胞存在于哺乳動物中的病例中，作為一種體內的治療方法。
“治療”指的是治療性療法以及保護性或預防性措施。有需要的對象包括已經具有疾病或病癥的個體和將要對疾病或病癥進行預防的個體。
治療目標的“哺乳動物”指的是可歸類為哺乳動物的任何動物，包括人、家養和農場動物以及動物園動物、體育運動動物或寵物，例如狗、馬、貓、牛等。優選的哺乳動物是人。
在一項特定的實施方案中，應用本發明的方法進行治療的哺乳動物是患有或易患血細胞水平減少的動物，血細胞水平可能是由于進行化療、放療、骨髓移植治療或任何醫原性因素或自然因素所導致的。
在癌癥患者中，化療和放療可引起血細胞群的顯著減少。每年在美國和歐洲至少有500,000癌癥患者接受化療和放療，另外在日本每年有200,000癌癥患者接受化療和放療。對再生障礙性貧血、原發性免疫缺陷以及急性白血病和實體腫瘤(接受全身放療后)有價值的骨髓移植治療已經日益為醫療團體所廣泛實踐。每年至少有15,000名美國人接受了骨髓移植。其它一些疾病可引起全部血細胞系或選擇的某些血細胞系的減少。這些狀況的例子包括貧血(包括巨細胞貧血和再生障礙性貧血)、血小板減少癥、免疫性(自體免疫)血小板減少性紫癜(ITP)以及HIV誘導的ITP。
所需的藥物制品能夠增強這些患者的血細胞群的重建。
因此，本發明的一個目標是提供一種方法以用于增強原始造血細胞的增殖和/或分化和/或維持。這一方法可用于增強造血干細胞的增殖，并可以使血細胞系成熟。該方法對因疾病、放療或化療而導致造血細胞或成熟血細胞減少的哺乳動物是令人滿意的。該方法還可用于由這些造血細胞離體產生這些干細胞和成熟血細胞系的擴增細胞群。
在另一項更為優選的實施方案中，本發明涉及一種方法以用于在體外/離體維持和/或擴增干細胞。該方法包括由血樣中分離外周血細胞、富集表達CD34抗原的血液祖細胞、在適宜的條件下分散已富集的血液祖細胞，以及使用對造血細胞具有刺激活性的寡肽，或使用本發明的包含有作為有效成分的對造血細胞具有刺激活性的寡肽的組合物，對上述細胞進行處理。
在一項特定的實施方案中，本發明的方法可包括進一步的將已處理細胞與細胞因子接觸的步驟。作為非局限性的例子，這些細胞因子可選自TPO(血小板生成素)、EPO(紅細胞生成素)、M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、IL-1(白介素-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、LIF(白血病抑制因子)以及KL(kit配體)。
作為一項用于體內治療的實施方案，本發明涉及一種方法以用于在哺乳動物中增殖血細胞。該方法包括使用有效量的對造血細胞具有刺激活性的本發明的寡肽或組合物對上述的哺乳動物進行給藥的步驟。這些造血細胞可以是紅細胞系、髓細胞系以及淋巴細胞系的細胞中的任意一種。
“淋巴細胞系”是指可以分化從而形成淋巴細胞(B-細胞或T-細胞)的造血祖細胞。同樣的，“淋巴細胞生成”是指淋巴細胞形成的過程。
“紅細胞系”是指可以分化從而形成紅細胞的造血祖細胞，而“造血”是指紅細胞形成的過程。
“髓細胞系”，在此包括除上文定義的淋巴細胞系和紅細胞系之外全部的造血祖細胞，而“髓細胞生成”包括血細胞的形成(除淋巴細胞生成和紅細胞生成之外)。
應該理解，由于程序步驟和材料可以略為變動，本發明所公開和描述的內容不局限于文中所公開的特定的實施例、程序步驟和材料。還應該理解，由于本發明的范圍僅可通過所附權利要求及等同物加以限定，文中所使用的術語僅意在對特定的實施方案進行描述，而不意味著僅限與此。
還應該注意的是，除非額外明確規定的內容，說明書和權利要求中所使用的單數形式“一個”、“一種”以及“該”包括復數的對象。
貫穿下面的說明書和權利要求，除非額外要求的內容，單詞“包括”以及其變形如“包含”和“包含有”，應被理解成僅意味著包含有一種確定的整數或步驟，或包含有一組確定的整數或步驟，但不排除包含有任何其它整數或步驟，也不排除包含有任何其它一組組分或步驟。
下文的實施例是發明者在實現本發明的各個方面時所使用的具有代表性的技術。應該意識到，所有這些技術都是用于本發明實踐的具有代表性的優選實施方案，依據現有公開內容，本領域技術人員應可意識到，在不偏離本發明的精神和預期范圍的基礎上可對這些技術進行大量的改進。
實施例試劑1.成骨生長肽的C-末端五肽(10-14)[sOGP(10-14)]Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly；M.W.499.7(SEQ ID NO1)由PolypeptidesLaboratories Inc.(Torrance，California 90503，USA Batch No.9712-006)提供。
2.CFA-環磷酰胺(CFA，SIGMA，5mg/小鼠)用于誘導骨髓清除。
3.類Dexter培養基含有12.5％胎牛血清(FBS，Hyclone，Holland)、12.5％馬血清(HS，Sigma，St Louis，MO)、0.8％必需氨基酸和0.4％非必需氨基酸(Gibco-Life technologies，USA)、1％谷氨酰胺(Sigma，St Louis，MO)、包括膽堿、葉酸、肌醇、煙堿、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、D-泛酸鈣在內的0.4％維生素(Gibco-Life technologies，USA)、1％兩性霉素B(Fungizone，Bristol-Myers Squibb)、1％慶大霉素和10-6M氫化可的松的McCoy’sMedium(Gibco-Life technologies，USA)，以及存在重組人干細胞因子(50ng/mL rhSCF，Calbiochem，USA)、重組人粒細胞-單核細胞集落刺激因子(rhGM-CSF 10ng/mL，Calbiochem，USA)重組人白介素-3(rhIL-310ng/mL，Calbiochem，USA)和重組人促紅細胞生長素(rhEpo2單位/mL，Sigma，St Louis，MO)，含有或不含10-8MsOGP(10-14)(Abiogen Pharma SpA Research Laboratories)的McCoy’s培養基(Gibco-Life technologies，USA)。
4.E.D.T.A酸性緩沖液(Miedodec，Bio Optica，Milan，Italy)動物*ICR雄性小鼠購自Charles River’s(Italy)，并且在特定的無病原體的條件下飼養。
*CV57Black雌性小鼠購自Hebrew Universith Medical School的動物研究室(Jerusalem，Israel)。每株小鼠在到達本發明人的實驗室時稱量體重為25g。
統計分析利用Fisher’s PLSD、階乘或重復測定的方差分析(ANOVA)對組之間的差異進行比較。對集落測定使用Mann-Whitney檢驗。
實施例實施例1OGP(10-14)對骨髓移植物的植入的作用材料和方法用CV57 Black雌性小鼠來研究OGP(10-14)對骨髓移植物植入的可能作用。12天內每日將10μl的溶解于磷酸鹽緩沖液的OGP(10-14)通過皮下注射進行給藥。日劑量為每只小鼠0.001-10nmol。對照小鼠僅僅接受磷酸鹽緩沖的鹽水。在OGP(10-14)治療開始后第8天，使用60Co鈷源，令小鼠接受全身的單次900拉德劑量的X-射線輻射(PickerC-9，102.5拉德/分鐘)。接著立即將105個隨意選定的同源骨髓細胞進行靜脈注射。在OGP(10-14)治療開始后第14天處死動物，切開其股骨并除去干骺端。在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中清洗骨髓。通過以帶有刻度的注射針頭對制劑進行數次抽吸制備單細胞懸浮液，并在血細胞計數器中對細胞進行計數。
結果圖1顯示OGP(10-14)對放療后/移植后全部股骨髓細胞數量的刺激性作用。該作用表現出劑量依賴性，在三種最高的劑量下，統計結果顯著，與PBS對照相比，細胞計數增加2倍。
實施例2OGP(10-14)毒性評定如上所示，OGP(10-14)被發現可增強骨髓移植物的植入。因此，接下來在對上述肽的藥學活性進一步詳細分析前，對上述肽可能存在的毒性進行評定。
在10nmol/小鼠劑量下經過15天皮下給藥的55只小鼠被用來對OGP(10-14)可能存在的相關毒性進行評定，將結果與由30只用安慰劑進行治療的對照小鼠中獲得的結果相比較。沒有發現存活率、行為、體重增加和肉眼可見的相關差異。在造血功能參數方面，用該肽的報導劑量進行給藥不會誘導白細胞(WBC)數量、紅細胞(RBC)數量、血小板(PLT)數量或血紅蛋白(Hb)水平任何顯著的改變。
實施例3在骨髓化學清除后OGP(10-14)刺激造血功能恢復材料和方法在這一組試驗中，通過連續兩天(稱為“第0天”和“第一天”)在腹膜內注射環磷酰胺(CFA，SIGMA，5mg/小鼠，溶解在150ml無菌的PBS中)來誘導骨髓清除。該方法已被證實能夠誘導強烈的可逆的L.D.＜30的白細胞減少癥[Spangrude，G.J.et al，Science，24158(1988)]。在第一次注射后6天記錄骨髓的最低細胞計數。
通過每日皮下注射0.1ml不含OGP(10-14)的載體或包含不同劑量的OGP(10-14)的載體來處理小鼠，如圖2所示，用以評定OGP(10-14)對WBC差示細胞計數的影響，并且確定在進一步實驗中使用的OGP(10-14)的“選擇劑量”。留出一組參考基線對照不進行處理，并且既不接受CFA，也不接受含有或不含OGP(10-14)的無菌水載體(圖2)。在第-12、-4、+3、+7、+14、+14、+21和第+24天通過眶后出血收集血樣(圖2C)。使用Coulter計數器(Sysex微細胞計數器F-800)進行差示細胞計數。
從第-7天至第+7天，每日用10nmol OGP(10-14)處理CFA清除的小鼠，將第+5、+7和+15天所采集血樣接受流式細胞測量術以檢測OGP(10-14)與G-CDF相當的對血液中CD34+/Sca-1+雙陽性細胞的作用。在第+2-+8天將G-CSF給藥。
對于細胞流式術，將從小鼠中得到的三組血樣合并，并通過梯度離心得到單核細胞，將其以1×106/ml的濃度重懸在PBS中。然后，在存在特異性單克隆抗體(終稀釋度1∶10)的條件下4℃孵育細胞30分鐘。純化的大鼠抗小鼠的單克隆抗體(Pharmingen，Ram34)作為底層用以檢測CD34+細胞。三次清洗后，將細胞重懸于PBS，并以一種FITC多克隆山羊抗大鼠抗體(Pharmingen)孵育細胞。將樣品在PBS中進一步清洗三次，并以來自Caltag的大鼠抗小鼠Sca-1(Ly.6A.2)FE行孵育。用一種無關的免疫球蛋白替代第一抗體來作為特定的對照。使用Lysis II軟件，用FAC-Scan(tm)(Becton Dickinson)流式細胞儀對數據采集和分析進行評價(圖3)。
如圖4所示，令化學清除小鼠每日接受OGP(10-14)的治療，用以評定OGP(10-14)不同的劑量方案。在第+15天處死小鼠，沖洗股骨髓，對單細胞懸浮液進行體外的祖細胞(集落形成)測定。將OGP(10-14)對CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E的作用與G-CSF對它們的作用進行比較(圖4)。
祖細胞測定所有組的骨髓細胞在CFA注射后+10天恢復。將細胞在含有2％FBS的Iscove’s改進的Dulbecco Medium(IMFM)中稀釋至2×106/ml，并根據制造商的建議(MethoCult，StemCell Technologies Inc，Vancouver，Canada)將細胞加入甲基纖維素培養基中。在每次鑒定中將2×104的細胞鋪板。使用M3434(適用于鼠CFU-GM和CFU-GEMM分析)和M3334(適用于鼠BFU-E分析)。用重組鼠白介素-3(rmIL-3，10ng/ml)、重組人白介素-6(rhIL-6，10ng/ml)、重組鼠干細胞因子(rmSCF，50ng/ml)和重組人促紅細胞生成素(rhEpo，3U/ml)補充M3434。在M3434中唯一包括因子是Epo。根據該方案流程，在14天的孵育后對每只小鼠的重復實驗進行盲試。
結果在所有CFA處理組中，于第+3天進行的總WBC計數和差示WBC計數表現出顯著減少(圖2)。在第7天，用載體處理的化學清除組的總WBC計數恢復約兩倍，這一數值仍大大低于未進行處理的對照組。另一方面，OGP(10-14)動物在所有測試劑量下表現出較高的值，而接受10nmol OGP(10-14)/天的小鼠中測量到最高計數。該組的計數接近未進行處理的對照組的記錄數值(圖2A)。在第7天進行的差示細胞計數也證實OGP(10-14)可通過劑量依賴性形式誘導單核細胞計數的增長和未成熟細胞計數的增長(圖2B，2C)。最高劑量(10nmol)下的單核細胞計數6倍高于正常對照(圖2A)；未成熟細胞的計數也顯著高于對照圖2C)。所有動物組的總WBC計數在第10天及之后是正常的(圖2B)。但是，單核細胞計數在第7天仍表現相同的趨勢，在第14天達到正常水平(圖2B)。盡管除0.01nmol劑量組外，在所有劑量組中，未成熟細胞計數均有所減少，但在10nmol組仍獲得最高數值。在14天及其后所有組的未成熟細胞計數都是正常的(圖2C)。
在每日以10nmol OGP(10-14)進行處理的化學清除小鼠中，第5天的CD34+/S ca-1+雙陽性細胞量5倍高于僅以載體進行處理的小鼠(圖3)。OGP(10-14)的該作用與G-CSF相似。在+7天和+15天完成的流式細胞測量證實了相似的CD34+/Sca-1+細胞數量。然而，在+15天，OGP(10-14)處理的小鼠的較以載體和G-CSF處理的小鼠顯示出顯著更高的CD34+/Sca-1+細胞數量(圖3)。
祖細胞試驗顯示，OGP(10-14)可顯著刺激CFU-GEMM和BFU-E，但不刺激CFU-GM。OGP的作用顯然僅出現在早于化學清除前7天開始的治療中(圖4)。OGP(10-14)對CFU-GM沒有作用與其對血粒細胞計數沒有顯著影響一致。G-CSF僅對CFU-GM有影響。
實施例4
OGP(10-14)恢復患有特發性骨髓纖維化的病人的離體樣品中造血骨髓的細胞含量材料和方法在來自患有特發性骨髓纖維化(IMF)的病人的離體骨髓樣品中研究OGP(10-14)的造血活性，以鑒定其對人的功效。
在簽署知情同意書后，五名IMF患者、一名硬皮病患者和兩名患有其它骨髓發育異常綜合征(MDS)的患者被募集加入研究。在標準的臨床學方法和血液病學方法的基礎上[Barosi，G.，et al.，Br.J.Haematol.104730-737(1999)]進行IMF的診斷。骨髓活組織檢查顯示纖維化是一個基本特征。在排除引起纖維化的其它可能原因和其它可能存在的骨髓增殖性疾病之后，最終確定IMF的診斷。具體地說，通過排除Ph染色體和bcr/abl重排的存在，可排除慢性髓細胞白血病的診斷。五名IMF患者中的三名已預先用低劑量的白消安每月給藥十天，并且每天1(g 1，25(OH)2D3。表1中概括了患者的資料。
表1IMF(A-E)患者和MDS(F-G)患者的臨床資料
*，正常值240-480U/L**，Ecografic測定用配備有可保證樣品盡可能不變形的一次性8號活組織檢查針頭(TraoSys-tem MDThech，USA)，從髂后上棘取得3mm長的骨髓樣品。將該樣品分割成3個1cm長的部分。隨機選擇一個部分進行初步的形態學鑒定。在37℃下、5％CO2氣中，于35mm組織培養皿中培養余下的兩個片斷，并用1ml含有rhSCF(50ng/ml)、rhGM-CSF(10ng/ml)、rhIL-3(10ng/ml)和rhEpo(2單位/ml)、含有或不含有10-8M OGP(10-14)的類Dexter培養基完全覆蓋。每次更換一半的培養基，7天后，除恢復細胞因子和OGP(10-14)的最初濃度外，不改變培養基的組分。再過7天培養后，對骨髓樣品進行組織學處理。簡言之，用改良的B5固定樣品，用E.D.T.A酸性緩沖液除鹽，并用Giemsa、蘇木精-伊紅或網狀組織的銀滲透對切片進行染色。用I-IV級來半定量地評估骨髓的變化。IV級用于表示同正常骨髓相當的富含細胞的骨髓樣品；III級代表降低的細胞含量及降低的核密度；II級樣品表現出陷窩擴大；I級樣品中的造血細胞極度缺乏，和/或骨髓區被陷窩區大量替代。使用整個切片區，對每個樣品的至少三個等間距的組織學切片進行檢測。此外，用計算機輔助的配有Leica.Qwin軟件的Leica顯微鏡對細胞密度進行自動評定，細胞密度即細胞計數和骨髓面積的比。用OGP(10-14)處理樣品的平均細胞密度與未處理樣品的平均細胞密度的比率(T/C比率)來表示對每位患者結果的評定結果。
結果培養14天后，用OGP(10-14)處理的骨髓樣品與來自相同患者的沒有用OGP(10-14)處理的骨髓樣品相比，造血細胞更加豐富(圖5、6)。在所有IMF患者中，半定量分級明顯提高(P＜0.05)。在非IMF患者中檢測不到OGP(10-14)處理的骨髓樣品和未處理的骨髓樣品間的差異。計算機輔助的細胞含量評定顯示在所有IMF病例中T/C比率＞1(P＜0.01)，該結果有力地表明在OGP(10-14)處理樣品中細胞數量增加。此外，在每對來源于各個病人的骨髓樣品中，T/C比都是統計顯著的(表2)。T/C比顯示出一種很高并與患者的血紅蛋白水平顯著的反向相關(圖7)。降低的血紅蛋白水平是IMF嚴重性的最重要的血清學指標。因此，該相關性有力證明了OGP(10-14)的作用在更嚴重的受影響的患者中最強。
表2計算機輔助的細胞密度評定
在用OGP(10-14)培養后，紅細胞系和髓細胞系細胞的比例未發生明顯變化。但是，半定量評定顯示來自IMF患者的樣品中巨核細胞的數量發生了1.5-10倍的減少。對于總體造血細胞含量，來源于非IMF患者的樣品中未發現這種差異。
序列表<110>耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司<120>作為造血刺激物的成骨生長寡肽<130>13361wo<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽序列<400>1Tyr Gly Phe Gly Gly1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽序列<400>2Tyr Gly Phe His Gly1 5<210>3<211>4<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽序列<400>3Gly Phe Gly Gly1<210>4<211>6<212>PRY<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽序列<400>4Met Tyr Gly Phe Gly Gly1 權利要求
1.一種用于刺激造血的藥物組合物，該組合物包含至少一種作為有效成分的寡肽，該寡肽對造血細胞具有刺激活性，所述寡肽的分子量為200-1,000Da，并且該寡肽具有分別用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-Hi s-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，以及一種可藥用載體。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述的寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO1的氨基酸序列表示的五肽。
3.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述的寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2的氨基酸序列表示的五肽。
4.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述的寡肽是一種分子式為Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3的氨基酸序列表示的四肽。
5.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述的寡肽包含SEQ IDNO4所表示的氨基酸序列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，可任選對其進行酰基化。
6.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述寡肽的分子式為Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
7.根據所述任一權利要求的藥物組合物，該組合物用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量。
8.根據所述任一權利要求的藥物組合物，該組合物可在接受放療或化療的受試者中增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量。
9.根據權利要求7和8任一項的藥物組合物，其中所述的寡肽增加循環的多譜系干細胞的數量。
10.根據權利要求9的藥物組合物，其中所述的多譜系干細胞是循環的早期前體CD34陽性祖細胞。
11.根據權利要求9的藥物組合物，其中所述的多譜系干細胞是循環的早期CD34/Flk2雙陽性祖細胞。
12.根據權利要求7和8任一項的藥物組合物，其中所述的寡肽增強未成熟細胞和單核細胞的恢復。
13.根據權利要求7和8任一項的藥物組合物，其中所述的寡肽選擇性地增加BFU-E和GEMM中任意一種的集落形成單位(CFU)。
14.根據權利要求7和8任一項的藥物組合物，該組合物增加白細胞(WBC)和循環的造血干細胞的數量，以及總體的骨髓細胞含量。
15.根據權利要求7和8任一項的藥物組合物，該組合物通過增加干細胞增殖、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的細胞含量來支持骨髓移植。
16.根據權利要求15的藥物組合物，該組合物用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病和再生障礙性貧血中任意一種疾病的骨髓移植受試者。
17.根據權利要求16中的藥物組合物，其中所述的血液病選自淋巴瘤、白血病、霍奇金病和骨髓增生性疾病。
18.根據權利要求16的藥物組合物，其中所述的骨髓增生性疾病是特發性骨髓纖維化(IMF)。
19.包含分別用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的任意一種寡肽在制備一種藥物組合物中的應用，該組合物用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量。
20.包含分別用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的任意一種寡肽在制備一種藥物組合物中的應用，該組合物用于在接受放療或化療的受試者中增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量。
21.根據權利要求19和20任一項的應用，其中所述的寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO1的氨基酸序列表示的五肽。
22.根據權利要求19和20任一項的應用，其中所述的寡肽是一種分子式為Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2的氨基酸序列表示的五肽。
23.根據權利要求19和20任一項的應用，其中所述的寡肽是一種分子式為Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO4的氨基酸序列表示的六肽。
24.根據權利要求19和20任一項的應用，其中所述的寡肽是一種分子式為Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3的氨基酸序列表示的四肽。
25.根據權利要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種用于增加循環的多譜系干細胞數量的藥物組合物中的應用。
26.根據權利要求25的應用，其中所述的循環的多譜系干細胞是循環的早期CD34陽性祖細胞。
27.根據權利要求25的應用，其中所述的循環的多譜系干細胞是CD34/Flk2雙陽性細胞。
28.權利根據要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種用于增強未成熟細胞和單核細胞恢復的藥物組合物中的應用。
29.根據權利要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種用于選擇性地增加BFU-E和GEMM中任意一種的集落形成單位(CFU)的藥物組合物中的應用。
30.根據權利要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種用于增加白細胞和循環的造血干細胞的數量，以及總體的骨髓細胞含量的藥物組合物中的應用。
31.根據權利要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種藥物組合物中的應用，該組合物用于通過增加干細胞增殖、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的細胞含量來支持骨髓移植。
32.根據權利要求19和20任一項的應用，所述應用為在制備一種藥物組合物中的應用，該組合物用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病和再生障礙性貧血任意一種疾病的受試者。
33.根據權利要求32的應用，其中所述的血液病是白血病、淋巴瘤、霍奇金病和骨髓增生性疾病中任意一種。
34.根據權利要求33的應用，其中所述的骨髓增生性疾病是特發行骨髓纖維化(IMF)。
35.一種用于增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量的方法，該方法包括將一種有效量的權利要求1-7中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于有需要的任何一種細胞或個受試者的步驟。
36.一種用于在接受化療或放療的患者中增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循環的干細胞的數量的方法，該方法包括將一種有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于有需要的任何一種細胞或受試者的步驟。
37.一種用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病和再生障礙性貧血中任意一種疾病的受試者的方法，該方法包括將一種治療有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于有需要的任何一種細胞或一個受試者的步驟。
38.一種用于治療患有血液病、實體腫瘤、免疫病和再生障礙性貧血中任意一種疾病的受試者的方法，該方法包括將一種治療有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于有需要的任何一種細胞或受試者的步驟，用以通過骨髓移植支持受試者的治療。
39.根據權利要求37和38任一項的方法，其中所述的血液病是淋巴瘤、白血病、霍奇金病和骨髓增生性疾病中的任意一種。
40.權利要求39的方法，其中所述的骨髓增生性疾病是特發性骨髓纖維化(IMF)。
41.一種用于降低骨髓移植受試者中的急性移植排斥的方法，包括將一種有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于所述受試者的步驟。
42.一種用于增進造血干細胞增殖的方法，包括將所述細胞暴露于一種有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物的步驟。
43.根據權利要求42的方法，其中所述的細胞是CD34陽性細胞。
44.根據權利要求43的方法，其中所述的CD34陽性細胞是Flk2陽性細胞。
45.一種用于在體外和/或離體維持和/或擴增血樣中的干細胞群的方法，包括從所述血樣中分離外周血細胞，富集表達CD34抗原的血液祖細胞，在適當條件下分散已富集的血液祖細胞，用一種權利要求1-8中任一所定義的對造造血具有刺激活性的寡肽處理所述細胞。
46.根據權利要求35-45中任一項的方法，該方法還包括將所述細胞暴露于至少一種細胞因子。
47.根據權利要求46的方法，其中所述的細胞因子選自TPO(血小板生成素)、EPO(紅細胞生成素)、M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、IL-1(白介素-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、LIF(白血病抑制因子)和KL(kit配體)。
48.根據權利要求41的方法，其中所述的細胞存在于細胞培養物中。
49.根據權利要求42的方法，其中所述的血樣是哺乳動物血樣。
50.根據權利要求49的方法，其中所述的血樣是人的血樣。
51.根據權利要求50的方法，其中所述的血樣來源于患有或易于患血細胞水平降低的哺乳動物。
52.根據權利要求51的方法，其中所述的血細胞水平降低是由化療、放療或骨髓移植治療所引起的。
53.一種用于在哺乳動物中再增殖血細胞的方法，包括將一種治療有效量的權利要求1-8中任一所定義的對造血細胞具有刺激活性的寡肽或含有作為有效成分的所述寡肽的藥物組合物給藥于所述哺乳動物。
54.權利要求53的方法，其中所述的血細胞是紅細胞系、髓細胞系和淋巴細胞系的細胞中的任意一種。
全文摘要
本發明涉及一種藥物組合物，該組合物包含作為有效成分的與OGPC－末端部分相同或相似的寡肽，該寡肽具有刺激造造血的活性。優選使用的寡肽有Tyr－Gly－Phe－Gly－Gly、Tyr－Gly－Phe－His－Gly、Gly－Phe－Gly－Gly或Met－Tyr－Gly－Phe－Gly－Gly。更具體地說，所述寡肽能增進骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及外周干細胞的動員，尤其是在化療和放療后。此外，本發明還提供一些治療方法和在制備藥物組合物中應用這些寡肽的方法。
文檔編號A61P41/00GK1551779SQ01823671
公開日2004年12月1日 申請日期2001年7月29日 優先權日2001年7月29日
發明者I·巴比, M·肖雷伊, A·斯特耶, A·穆赫拉德, N·曼蘇爾, O·古雷維特奇, Z·格里恩伯格, S·羅斯尼, S·特拉斯西亞迪, M·佩特里尼, I 巴比, 乩錟, 刮餮塹, 匾, 孜 仄, 斬 , 滓 , 綻, 鋃韃 , 鼓 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司, 耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公