通過施用GnRH拮抗劑預防糖尿病的制作方法

專利名稱：通過施用GnRH拮抗劑預防糖尿病的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及通過對哺乳動物施用有效量的促性腺素釋放激素(GnRH)拮抗劑來降低糖尿病易感的哺乳動物(如小鼠、大鼠、人)中糖尿病發病率或延遲該病發作的方法。此類拮抗劑的施用在統計學上顯著降低糖尿病發病率和/或其發作。
現有技術描述美國有一千五百七十萬人(占總人口的5.9％)患有糖尿病。估計有一千零三十萬人被診斷患有糖尿病，并有五百四十萬人不知道他們患有此病。每天大約有2,200人被診斷出患有糖尿病。在美國糖尿病是第七大致死原因(第六大致死疾病)。糖尿病是一種無法治愈的慢性疾病。糖尿病是美國花費最大的健康問題。直接與糖尿病有關的保健和其它費用以及生產率損失的費用每年多達980億美元。
糖尿病是人體不能產生或正確使用胰島素的疾病，胰島素是一種需要的將糖、淀粉和其它食物轉化成日常生活所需能量的激素。糖尿病的原因是一個謎，盡管遺傳和環境因素如肥胖和缺乏鍛煉似乎與其有關。有兩種主要類型的糖尿病。
·I型。一種人體不能產生任何胰島素的自身免疫性疾病，大多數發生在兒童和青年中。患有I型糖尿病的人必須每天注射胰島素以維持生命。I型糖尿病占糖尿病總數的5-10％。
·II型。一種導致人體不能產生足夠胰島素或正確使用胰島素的代謝疾病。它是這種疾病最常見的形式。II型糖尿病占糖尿病總數的90-95％。由于美國老齡人數的增加以及肥胖和久坐的生活方式非常普遍，II型糖尿病的比例正在接近流行病。
I型糖尿病有兩種形式。免疫介導的糖尿病由自身免疫過程產生，其中有體的免疫系統攻擊并破壞胰腺的胰島素產生細胞。由于葡萄糖不能進入細胞，它在血液中積累和體細胞被逐漸餓死。第二種特發的I型糖尿病，是指原因不知的稀有類型的疾病。患有I型糖尿病的人必須每天注射胰島素以維持生命。
與男性相比，女性中某些自身免疫性疾病的發病率上升得非常快，這已被廣泛接受。盡管有證據表明雄激素和雌激素在自身免疫性疾病的發病機理中起作用，但性腺甾體在自身免疫性疾病中的確切作用尚不清楚。在實驗模型中進行的大量研究表明，性腺切除術會改變自身免疫性疾病包括糖尿病的表現。(Roubinian等，(1978)Effect of Castration and Sex Hormone Treatment on survival，Anti-nucleic Acid Antibodies，and Glomerulonephritis in Nzb/nzw F1 Mice.J.ExpMed，147，1568-83；Hawkins等，(1993)The Effect of Neonatal Sex Hormones onthe Inc idence of Diabetes in Nonobese Diabetic Mice.Proc.Soc.Exper.Biol.Med，202，201-205；Makino等，(1981)The Effect of Castration on the Appearanceof Diabetes in Nod Mouse，Exp Anim，30；和Fitzpatrick等，(1991)Influenceof Castration，along or Combined with Thyrmectomy，on the Development ofDiabetes in the Non-obese Diabetic Mouse.Endocrinology，129，1382-1390)。
然而，在體外進行了許多有關自身免疫中性別差異的研究，這里如性腺切除術或施用性腺甾體等操作必定改變下丘腦和垂體激素的反饋作用，現在已知其中一些與免疫調節有關。一種具有免疫調節特性的下丘腦激素是促性腺素釋放激素(GnRH)。已知GnRH通過其對性腺甾體的調節而具有間接的免疫調節特性。已知GnRH在體外和在性腺切除的大鼠體內發揮直接的免疫調節作用。GnRH激動劑可防止胸腺內卷，這通常發生在老齡大鼠中(Marchetti等，(1989)Luteinizing Hormone-releasing Hormone(Lhrh)Agonist Restoration of Age-associated Decline ofThymus Weight，Thymic Lhrh Receptors，and Thymocyte ProliferativeCapacity.Endocrinology，125，1037-45)。GnRH激動劑的施用和大鼠中B和T細胞增殖反應的增加以及表達Il-2受體的T淋巴細胞數目的增加有關(Morale等，(1991)Blockade of Central and Peripheral Lutienizing Hormone-releasingHormone(Lhrh)Receptors in Neonatal Rats with a Potent Lhrh-antagonistInhibits the Morphofunctional Development of the Thymus and Maturation ofthe Cell-mediated and Humoral Immune Responses.Endocrinology，128，1073-85；和Batticane等，(1991)Luteinizing Hormone-releasing Hormone Signaling atthe Lymphocyte Involves Stimulation of Interleukin-2 Receptor Expression.Endocrinology，129，277-86)。此外，脾臟和胸腺制劑顯示含有GnRH的mRNA并可產生免疫反應性的GnRH(Emanuele等，(1990)Rat Spleen Lymphocytes Contain anImmunoactive and Bioactive Luteinizing Hormone-releasingHormone.Endocrinology，126，2482-6；和Maier等，(1992)Thymocytes Expressa Mrna That Is Identical to Hypothalamic Luteinizing Hormone-releasingHormone Mrna.Cell Mol Neurobiol，12，447-54)。最近的研究證實，當T細胞在體外被PHA活化時淋巴細胞的GnRH產生會增加(Azad等，(1993)ImmunoactivationEnhances the Concentration of Luteinizing Hormone-releasing HormonePeptide and its Gene Expression in Human Peripheral T-lymphocytes.Endocrinology，133，215-23)。因此，GnRH似乎通常對免疫系統有刺激作用。
發明簡述本發明涉及哺乳類糖尿病的問題，它提供了降低疾病發病率和/或延遲其在對糖尿病有易感性的冒風險的哺乳動物中發作的方法。概括地說，所述方法包括對此類易感哺乳動物施用有效量的GnRH拮抗劑。已發現這樣可明顯減緩疾病的發展或延遲疾病的發作。GnRH拮抗劑是抑制內分泌系統相關功能、GnRH的生物合成或GnRH體內作用的物質。
實踐中，易感哺乳動物如小鼠、大鼠和人可按照本發明治療。通常，有效的GnRH拮抗劑是反復施用的(通常通過皮下注射)以達到最佳效果。可使用許多已知的GnRH拮抗劑，如乙酰-β-[2-萘基]-D-Ala-D-p-氯代-Phe-β[3-吡啶基]-D-Ala-Ser-Nε-[煙酰]-Lys-Nε[煙酰]-D-Lys-Leu-Nε-[異丙基]Lys-Pro-D-Ala-NH2、Glu-Nal、Abarelix(PPI-149)和acyline(Gamick等，Abarelix(PPI-14)。一種新的和有效的GnRH拮抗劑，它可在近程治療(BT)和放射治療(XRT)之前導致迅速且顯著的前列腺體積減小(PGYR)和雄激素抑制，Poster Sessions，Endo 98，第265頁。另一些此類拮抗劑披露在美國專利6,156,772、5,156,767、6,150,522、6,150,352、6,147,088、6,077,858、6,077,847、6,025,366、6,017,944、6,004,984和5,998,432中。目前認為Abarelix-Depot(Albarelix的一種受控釋放形式)將是可供選擇的GnRH拮抗劑。
如本文使用的那樣，“糖尿病易感哺乳動物”是指與正常的非易感群體相比，對感染I型(自身免疫)糖尿病具有統計學上顯著素因的哺乳動物。這種素因可通過大量的遺傳和/或抗體篩選或試驗確定。例如，糖尿病易感人群通常顯示出至少一種，較好的是兩種或更多以下列舉的危險種類。易感人群的年齡在0-45歲之間，且
1.是患有I型糖尿病患者的同胞、后代或兩代或三代親屬(如侄女、侄子、伯母、伯父、堂兄北、孫)；或2.胰島細胞自身抗體(ICA)的滴度大于10幼年型糖尿病基礎(JDF)單位；或3.在血清篩選樣品中顯示有胰島素自身抗體。
附圖簡述

圖1是說明閹割的NOD小鼠中GnRH、GnRH拮抗劑和GnRH促激動劑對IgG水平作用的圖；和圖2是說明GnRH拮抗劑、載體和GnRH激動劑對性腺切除的雄性NOD小鼠中糖尿病的時間控制和發病的作用的圖(未患糖尿病的小鼠百分比對一天中時間)。
優選實施例的詳細描述以下實施例列出了用糖尿病易感小鼠進行的一系列試驗，這里的小鼠用已知的GnRH拮抗劑處理。應理解提供這些實施例僅是為了闡述，且其中的任何內容都不能作為是對本發明內容的限制。
實施例在此實施例中，用GnRH激動劑和拮抗劑處理完整的、和切除性腺的非肥胖小鼠模型的糖尿病(NOD)小鼠，以確定其對血清IgG水平、糖尿病發病率和發作的作用。
方法小鼠。在整個研究中使用良好鑒定的NOD小鼠。雄性和雌性小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)。這些小鼠是此領域認可的用于糖尿病研究的動物模型。(Makino等，(1980)Breeding of a Non-Obese Diabetic Strain of Mice.Exp anim，29，1-13；Miyazaki，A.T.等，(1985)Predominance of T Lymphocytes in PancreaticIslets and Spleen in Prediabetic Non-obese Diabetic(Nod)MiceaLongitudinal Study.Clin Exp Immunol，60，622-630)。
實驗設計。使用完整的切除性腺的小鼠(GDX)。進行性腺切除術以證實糖尿病發病率的升高，同時也為了排除性激素產生的變化。為比較GnRH激動劑和拮抗劑的作用，性腺切除的動物隨機取自14-18天齡的動物，并將它們立即分成以下主要的治療組GnRH激動劑；安肽(安肽)；載體。用Nal-Glu處理其中一組性腺切除的雄性小鼠，作為附加對照。
將不同幾批中獲自出生后數周的小鼠的數據和隨機處理或對照組小鼠的數據組合。交錯收集血清以便所有小鼠以相同的4周間隔采血。將用于抗體測定的血清儲存在-20℃，對收集自各個時間點的所有樣品進行同樣的試驗以避免測量間的可變性。
性腺切除要。在戊巴比妥麻醉下通過一個陰囊切口將雄性動物的性腺切除。
在戊巴比妥麻醉下通過陰囊切口對雄性動物進行假手術。
注射。GnRH(天然十肽)購自Bachem(Bubendorf，Switzerland)。GnRH拮抗劑安肽(乙酰-β-[2-萘基]-D-Ala-D-p-氯代-Phe-β[3-吡啶基]-D-Ala-Ser-Nε-[煙酰]-Lys-Nε-[煙酰]-D-Lys-Leu-Nε-[異丙基]-Lys-Pro-D-Ala-NH2)由國立衛生研究的避孕開發分部(NICHHD)和Ares-Serono(Randolph，MA)提供。第二種GnRH拮抗劑，Nal-Glu(乙酰-D2Nal1、D4ClPhe2、D3Pal3、Arg5、Dglu6(AA)、DAla10)由NICHHD提供，并用于小鼠的子集。所有提到的GnRH激動劑都是指天然十肽。用100μg溶于100μl載體的GnRH或GnRH拮抗劑在頸背上皮下注射動物，一周六次，在上午進行，所述載體含有50％丙二醇和50％雙蒸水。
血清。血清收集自血液，所述血液在每六周輕微異熒烷麻醉后通過眼眶后穿刺獲得。
激素測量。用市售的試劑盒(Coat-A-Count，Diagnostic ProductsCorporation，Los Angeles，CA)通過RIA測量血清睪酮濃度。用前述方法通過放射免疫測定(RIA)測量血清LH和促乳素。(Neill，J.D.等，(1971)Development of aradioimmunoassay for rat prolactin and evaluation of the NIAMD rat prolactinradioimmunoassay.Endocrinology，88，548-55；Niswender等(1968)Radioimmunoassay for Rat Luteinizing Hormone with Antiovine Lh Serum andOvine Lh-131-i.Proc Soc Exp Biol Med，128，807-11。
臨床試驗用含有IgG單特異性抗血清的免疫擴散平板(ICN Biomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA)，通過單放射性免疫擴散試驗測量總免疫球蛋白G的濃度。用One Touch Fast Take計(Lifescan，Milpitas，CA)每周檢測血清葡萄糖。用尿液分析試劑條帶(Miles.Inc.，Elkhart IN)檢測尿中的葡萄糖。與參考標準進行比較按以下0-4個范圍對糖尿進行評分陰性＝0；30mg/dL＝1；100mg/dL＝2；300mg/dL＝3；＞1000mg/dL＝4。
尸體剖檢。對典型的小鼠進行尸體剖檢。沒有觀察到殘余的卵巢或睪丸組織。
統計。通過雙尾斯圖頓特氏成對t-檢驗比較血清免疫球蛋白的測量。用Mantel-Haenszel法估算仍舊未患糖尿病的小鼠的百分比。(Mantel，N.(1966)Evaluation of Survival Data and Two New Rank Order Statistics Arising inits Consideration.Cancer Chemother Rep，50，163-70)。
結果血清免疫球蛋白G的濃度。與假裝切除性腺相比，在處理8周后，切除性腺明顯增加了IgG的水平。與載體相比，用GnRH激動劑處理切除性腺的小鼠進一步增加了IgG的水平。在性腺切除的雄性中，安肽處理將血清IgG濃度降低至第8周時在假手術的小鼠中看到的水平。數據顯示在圖1中。
糖尿病的發病率。在性腺切除的雄性中，施用GnRH拮抗劑安肽的糖尿病發病率顯著降低。與載體相比，第60周時用安肽處理的小鼠無一患有糖尿病(p＝0.0025；圖2)。
GnRH激動劑處理明顯增加了發病率并促進了糖尿病發作的時間安排。
討論本研究是要證明GnRH活性的降低是否與易感糖尿病的性腺切除的雄性小鼠的糖尿病的改善有關。我們不試圖區分下丘腦和垂體激素的作用；同樣，我們不謀略確定性腺激素對下丘腦/垂體激素的相對重要性。然而，該實施例證明GnRH和/或其垂體產物似乎改變鼠糖尿病的表現，并且假設性腺甾體以外的激素可能有助于在自身免疫性表現中熟知的的性別差異。
在該實施例中，研究了性腺切除的小鼠以評估GnRH對性腺甾體產生的作用以及對GnRH釋放的性腺反饋作用。這樣可以更加直接評估GnRH在調節鼠糖尿病中的作用。發現用GnRH拮抗劑處理的性腺切除的NOD小鼠顯示出總IgG明顯降低，并延遲了糖尿病的發作。施用GnRH激動劑導致了可逆的效果。
GnRH拮抗劑可能通過對b或T淋巴細胞的直接效應直接作用于免疫系統，或者通過減少促性腺素或減少免疫細胞產生細胞因子而間接作用于免疫系統。現有技術提示，GnRH激動劑可能在體內和體外對B和T細胞的增殖起作用(Marchetti，B.等，(1989)Luteinizing Hormone-releasing Hormone(Lhrh)Agonist Restorationof Age-associated Decline of Thymus Weight，Thymic Lrhr Receptors，andThymocyte Proliferative Capacity.Endocrinology，125，1037-45；Morale等，(1991)Blockade of Central and Peripheral Luteinizing Hormone-releasingHormone(Lhrh)Receptors in Neonatal Rats with a Potent Lhrh-antagonistInhibits the Morphofunctional Development of the Thymus and Maturation ofthe Cell-mediated and Humoral Immune Responses.Endocrinology，128，1073-85；和Batticane等，(1991)Luteinizing Hormone-releasing Hormone Signalingat the Lymphocyte Involves Stimulation of Interleukin-2 ReceptorExpression.Endocrinology，129，277-86)。例如，以前證明用GnRH拮抗劑處理的性腺切除的有狼瘡傾向的小鼠中B淋巴細胞比例降低的工作提示，GnRH拮抗劑在一定程度上會影響B淋巴細胞的增殖。B淋巴細胞增殖的減少可以解釋觀察到血清IgG和自身抗體濃度的降低和減少免疫復合物介導的腎病。
已表明促乳素釋放的抑制可減輕疾病的嚴重程度并延長糖尿病鼠的存活期，而促乳素治療可加劇疾病。(Mc Murray，R等，(1991)Prolactin InfluencesAutoimmune Disease Activity in the Female B/w Mouse.J Immunol，147，3780-7)。然而，發現無論是激動劑還是拮抗劑處理都改變了血清促乳素的水平。因此，認為所觀察到的效果與促乳素無關。
以前報道證明了雌二醇加劇鼠糖尿病的能力。盡管雌二醇對GnRH的反饋作用是復雜的，已知在某些情況下雌二醇對GnRH的產生有正反饋作用。已表明雌二醇在體外可增加從下丘腦細胞釋放GnRH(Leadem，C.A.等，(1984)Stimulation withEstrogen and Progesterone of Luteinizing Hormone(Lh)-releasing HormoneRelease from Perifused Adult Female Rat HypothalamiCorrelation with theLh Surge.Endocrinology，114，51-6。增加的雌二醇被認為有助于中間循環GuRh驟增。(Roselli，C.E.等，(1990)Regulation of Hypothalamic LuteinizingHormone-releasing Hormone Levels by Testosterone and Estradiol in MaleRhesus Monkeys.Brain Res，509，343-6)。已在GnRH基因的5’側鑒定了具有正調節作用的雌激素響應元件。(Radovick，S.等(1991)Evidence for Direct EstrogenRegulation of the Human Gonadotropin releasing Hormone Gene.J ClinInvest.88，1649-55)。基于這些觀察結果，雌二醇的一些免疫刺激作用可導致其對GnRH的正反饋。
已表明雄激素對GnRH和促性腺素的產生和釋放有負調節作用。(Finkelstein，J.S.等(1991)，Sex Steroid Control of Gonadotropin Secretionin the Human Male.I.Effects of Testosterone Administration in Normal andGonadotropin releasing Hormone-deficient Men.Clin Endocrinol Metab，73，609-20；Veldhuis，J.D.等，(1992)Evidence That androgen Negative FeedbackRegulates Hypothalamic Gonadotropin-releasing Hormone Impulse Strength andthe Burst-like Secretion of Biologically Active Luteinizing Hormone in Men.J Clin Endocrinol Metab，74，1227-35；和Kalra，P.S.等(1982)DiscriminativeEffects of Testosterone on Hypothalamic Luteinizing Hormone-releasingHormone Levels and Luteinizing Hormone Secretion in Castrated MaleRatsAnalysis of Dose and Duration Characteristics.Endocrinology，111，24-9)。它們還顯現出對自身免疫性的抑制作用雄激素處理可改善鼠糖尿病，而切除性腺的雄性則糖尿病加劇。(Hawkins，T.等，(1993)The Effect of NeonatalSex Hormones on the Incidence of Diabetes in Nonobese DiabeticMice.Proc.Soc.Exper.Biol.Med，202，201-205；Makino等，(1981)The Effectof Castration on the Appearance of Diabetes in NOD Mouse.Exp Anim，30；和Fitzpatrick等，(1991)Influence of Castration，along or Combined withThyrmectomy，on the Development of Diabetes in the Non-obese Diabetic Mouse.Endocrinology，129，1382-1390)。各種雄激素制劑已被成功地用于人自身免疫性疾病如狼瘡和特發性凝血細胞減少性紫殿(ITP).(Bizzarro，A.等，(1987)Influence of Testosterone Therapy on Clinical and ImmunologicalFeatures of Autoimmune Diseases Associated with Klinefelter’s Syndrome.JClin Endocrinob Metal，64，32-6；和Weinblatt，M.E.等，(1988)Danazol forChildren with Immune Thrombocytopenic Purpura.Am J Dis Child，143，1317-9)。
該實施例證明，GnRH拮抗劑對糖尿病具有免疫調節作用。如圖2所示，GnRH拮抗劑可顯著增加整個試驗期間未患糖尿病的小鼠的數目。總之，這些研究證實GnRH拮抗劑對鼠糖尿病表現的調節不依賴于它們對性腺的作用。因此，證實GnRH激動劑和拮抗劑具有免疫作用，這種作用與雄激素和雌激素的作用不同。
在此說明書中并入本文引用的所有專利和文獻以供參考。
權利要求
1.一種降低糖尿病易感哺乳動物的糖尿病發病率或延遲糖尿病發作的方法，其特征在于，所述方法包括對哺乳動物施用有效量的促性腺素釋放激素拮抗劑的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，它包括通過皮下注射施用所述拮抗劑的步驟。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，它包括在一段時間內重復施用所述拮抗劑的步驟。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述拮抗劑選自乙酰-β-[2-萘基]-D-Ala-D-p-氯代-Phe-β[3-吡啶基]-D-Ala-Ser-Nε-[煙酰]-Lys-Nε-[煙酰]-D-Lys-Leu-Nε-[異丙基]-Lys-Pro-D-Ala-NH2，Glu-Nal和乙酰-D2Nal-D4CIPhe-D3Pal-Ser-Aph(Ac)-D-Aph(Ac)-Leu-Lys(Ipr)-Pro-D-Ala-NH2。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是小鼠。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖尿病是IA型自身免疫性糖尿病。
全文摘要
提供了一種降低糖尿病易感哺乳動物(如小鼠、大鼠、人)糖尿病發病率或延遲該病發作的方法，其中哺乳動物用促性腺素釋放激素(GnRH)拮抗劑處理。優選的拮抗劑是通過皮下注射重復施用的。有用的拮抗劑是乙酰－β－[2－萘基]－D－Ala－D－p－氯代－Phe－β[3－吡啶基]－D－Ala－Ser－N
文檔編號A61P3/10GK1492766SQ01822978
公開日2004年4月28日 申請日期2001年8月6日 優先權日2001年1月26日
發明者J·D·雅各布森, J D 雅各布森 申請人:兒童慈善醫院