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本發明涉及對免疫系統的調節，特別是對樹突細胞抗原呈遞作用的調節。
免疫系統識別機制的中心，是被稱為toll樣受體(TLRs)的多種種系編碼的受體(1)。個體的TLRs通過激活NF-κB轉錄因子激活特化的抗真菌或抗細菌基因(2)。因此，業已證實TLR4能賦予對細菌脂多糖的反應性(3)，而TLR2能賦予對細菌肽聚糖和脂磷壁酸質以及酵母碳水化合物的反應性(4)。目前已知有9種TLRs(8)，并且預計存在更多種TLRs。
盡管包括TLRs在內的Toll-相關受體(TRRs)的細胞外部分是相對多樣性的，其細胞質部分是更保守的。它們包括一種被稱為Toll結構域的確定的區域，該區域還存在于包括IL-1受體、IL-18受體和被廣義地稱為IL-1受體家族的其他受體的蛋白的細胞質部分中。另外，諸如MyD88、TollIP、Mal和TIRAP的可溶性細胞質蛋白可以具有Toll結構域。TLRs和IL-1受體使用類似的信號傳遞體系；在配體結合時，它們通過與在MyD88的C-末端所包含的Toll結構域的同型相互作用募集接頭分子MyD88。接著，MyD88又募集IRAK和TRAF-6，以便激活NF-κB和促分裂原激活的蛋白激酶。還可能與TollIP相關(2，Burns等(2000)Nature cell Biol.2，346-351)。
MyD88(骨髓分化蛋白)被認為具有一種模塊組織，該模塊組織包括N-末端死亡結構域(DD)，該結構域通過一個短的接頭與C-末端Toll結構域隔離(綜述于(5))。N-末端DD與大約90個氨基酸的基序相關，它被認為能介導與其他DD序列的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚體或異二聚體(Boldin等(1995)J Biol Chem 270，387-391)。
MyD88 Toll結構域具有大約130個氨基酸(Mitcham等(1996)JBiol Chem 199，144-146)。Toll結構域還被認為能介導與其他Toll結構域的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚體或異二聚體(參見(5))。
DD和Toll-Toll相互作用被認為與指導信號傳遞途徑相關。MyD88被認為通過其Toll結構域結合在TLRs和IL-1受體上(在結合于配體上時)。接著，MyD88被認為通過其DD結合在其他含有DD的蛋白上；特別是認為它結合在IRAK和TRAF-6上，從而激活NF-κB和促分裂原激活的蛋白激酶(2)。
抗原呈遞細胞在本領域中是眾所周知的，并且包括樹突細胞(參見Janeway，CA Jr & Tavers，P，Immunobiology(3rd Edition)，Editions Current Biology/Churchill Livingstone and GarlandPublishing)。它們是高度特化的細胞，能夠加工抗原，并且將其肽片段展示在細胞表面上，同時展示淋巴細胞激活所需要的分子。最有效的抗原呈遞細胞是樹突細胞、巨噬細胞和B細胞。
樹突細胞(DC)是專用抗原加工和呈遞細胞，它對于初次MHC-限制的T-細胞免疫的形成來說是至關重要的。這種細胞源于骨髓中的CD34+前體，不過，也可以源于外周血液中的后集落形成單位CD14+中間體。DC能遷移到皮膚、黏膜、脾臟和胸腺的外周部位。它們參與了多種臨床上重要的過程，包括同種異體移植排斥，特應性失調、自身免疫和抗腫瘤免疫性。
DC是用細胞因子，主要是GM-CSF，IL-4和TNFα由CD34+干細胞或CD14+外周血單細胞離體培養的。來自上述兩種來源的DC是免疫感受態的，并且能吸收外源呈遞的抗原，對所述抗原進行加工，并且將其呈遞給細胞毒性T-細胞(Grabbe等(1995)ImmunologyToday 16，117-121；Girolomoni & Ricciardi-Castagnoli(1997)Immunology Today 18，102-104)。DC可以傳遞在體內產生的抗原-特異性腫瘤免疫性(Kwak等(1995)Lancet 345，1016-1020)，而且用來自體內的腫瘤抗原脈沖刺激的自體DC，能夠誘導可檢測的抗腫瘤作用(Hsu等(1996)Nature Medicine 2，52-58)。可以用粗制腫瘤膜裂解物、純化的肽或肽片段有效刺激DC。例如，在WO/00/26249中披露了來自患者的自體樹突細胞的離體擴增，給所述患者加載了肽抗原，并且作為過繼免疫治療進行再輸注。
我們驚訝地發現，存在通過MyD88起作用的抑制信號，這種信號對諸如樹突細胞和巨噬細胞的抗原呈遞細胞(APCs)特異。所述抑制信號可能涉及一種或多種TRRs。
TRRs包括諸如TLRs的分子，包括IL-1受體和IL-18受體在內的IL-1受體家族成員，和諸如MyD88、TollIP、Mal和TIRAP的細胞質蛋白。
能調節，優選阻斷諸如樹突細胞的APCs中的TRR信號傳遞的分子，例如MyD88的無功能(抑制，例如顯性失活)形式可以被用作免疫刺激劑，例如用于DNA疫苗和癌癥免疫治療。例如，將抑制性MyD88整合到DNA載體上，能比單獨使用所述載體更有效地刺激T細胞和抗體反應。
本發明的第一方面提供了一種增強抗原呈遞作用的方法，包括給諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC)，或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選抑制劑的步驟。所述調節劑能激活APCs，例如DCs，例如增強APCs，例如DCs的抗原呈遞作用。
本發明的第二方面提供了一種抑制抗原呈遞作用的方法，包括給諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC)，或前體細胞提供Toll-相關受體(TLR)信號傳遞的調節劑，優選增強劑的步驟。
Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的抑制劑，優選能抑制存在于諸如樹突細胞的APCs，或其前體中的TRR信號傳遞途徑。在其他優選方面，所述抑制劑能抑制TRR信號傳遞途徑，它的抑制作用誘導了不成熟樹突細胞的激活和/或抗原呈遞功能的增強，并可以誘導NF-κB核轉位或激活MAP激酶。因此，TRR信號傳遞途徑被認為能夠維持諸如不成熟形式的樹突細胞的不成熟APCs，并且維持NF-κB的無活性形式。TRR信號傳遞途徑的激活能減弱諸如樹突細胞的不成熟APCs對諸如GM-CSF和IL4的成熟因子的反應，即減少所形成的諸如樹突細胞的成熟APCs的數量，或者可以增加形成特定數量的諸如樹突細胞的成熟APCs所需要的時間或成熟因子的劑量。TRR信號傳遞途徑的激活，可以減弱諸如樹突細胞的成熟APCs誘導MLR(混合淋巴細胞反應)的能力，這是對諸如樹突細胞的APC的一種試驗，其作用為領域技術人員所熟知。將諸如樹突細胞的APCs與同種異體T細胞一起培養，并且測定所述細胞的增殖，例如，在6天之后測定氚標記胸苷的吸收。例如，可以將105T細胞與梯度劑量(例如50-10000/孔)的樹突細胞鋪板在96孔圓底微量滴定板上。
通常，APC是專用的抗原呈遞細胞，如黏膜細胞、巨噬細胞或B細胞。II類MHC分子存在于專用的APCs中。專用的APCs的特征是存在諸如CD80和CD86的共刺激分子，正如Mellman等所定義的((1998)Trends Cell Biol.8，231-237)。
一般，與未刺激過的細胞相比，其中的所述途徑受到刺激的分離的前體或樹突細胞能表達較高水平的HLA-DR、I類MHC和CD80/86。
在以下文獻中提供了在增強抗原呈遞功能時受到調控的DC表面標記Banchereau等(2000)Ann.Rev.Immunol.。樹突細胞表面標記包括高CCR1、CCR5、CCR6，和低CCR7趨化因子受體；高CD86；低水平的I類MHC(HLA-A，B，C)和II型MHC(HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP)；低共刺激分子，如CD40、CD54、CD80、CD83和CD86，并且沒有DC-LAMP。具有較高抗原呈遞能力的活化DC具有低CCR1，CCR5，CCR6；高CCR7；低CD68；高表面I類和II類MHC；高共刺激分子，如CD40，CD54，CD58，CD80，CD83，CD86；高DC-LAMP和高p55fascin。
術語“Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的抑制劑”可以包括以下APC(如DC)TRR信號傳遞途徑中的任意一個步驟的調節劑i)刺激劑或拮抗劑結合于TRR，即，TRR結合于細胞外分子，ii)TRR結合于細胞內分子(TRR相互作用分子)，例如多肽，例如接頭分子，例如含有Toll結構域的分子，例如MyD88，Mal(Fitzgerald等(2001)Nature 415，78-83)，TIRAP Horng等(2001)NatureImmunol7，835-841)或TollIP(Burns等(2000)Nature Cell Biol.2，346-351)；iii)TRR相互作用分子結合于諸如多肽的第二種細胞內分子。例如，如上文所述，MyD88可以結合于含有死亡結構域(DD)的多肽。可以結合于諸如DC的APC中的MyD88的分子可以是IRAK或TRAF-6或者可以是TollIP。IRAK披露于以下文獻中Medzhitov等(1998)Mol.Cell 2，253-258；IRAK2披露于以下文獻中Muzio等(1997)Science 278，1612-1615；TollIP披露于以下文獻中Burns等(2000)Nature Cell Biol.2，346-351；而TRAF6披露于以下文獻中Dushay & Eldon(1998)Am J Hum.Genet.62，10-14和Cao等(1996)Nature 383，443-446；iv)導致抑制不成熟DC的成熟的其他信號傳遞步驟(例如涉及多肽多肽結合，或改變多肽的磷酸化狀態，或具體改變磷酸肌醇含量；可行性為本領域技術人員所熟知)。其他信號傳遞步驟可以促進維持NF-κB的無活性形式。作為其他信號傳遞步驟的一種例子，所述第二種細胞內分子可以與第三種或其它細胞內分子相互作用，例如與諸如IκB激酶或MAP激酶的多肽相互作用。所述相互作用可能涉及到多肽共價修飾的改變，例如通過第二種細胞內分子，或通過蛋白水解裂解或遍在化，將所述第三種細胞內多肽磷酸化或脫磷酸化。
如上文所述，諸如樹突細胞的APCs被認為具有能抑制NF-κB核轉運(激活)的TRR信號傳遞途徑。因此，可以理解的是，能加強NF-κB激活/核轉運的化合物不被認為是諸如DC的APC中TRR信號傳遞的抑制劑。
類似地，能抑制NF-κB激活/核轉運的化合物不被認為是諸如DC的APC中的TRR信號傳遞抑制劑。
在諸如DC的APC中的TRR信號傳遞的抑制劑或增強劑，優選不會作用于APC抑制TRR信號傳遞途徑，和APC中的能導致NF-κB激活的任何信號傳遞途徑所共同擁有的信號傳遞途徑成分或步驟。
APC中的TRR信號傳遞的抑制劑或增強劑優選作用于上述步驟(i)，(ii)或(iii)之一，優選作用于步驟(ii)或(iii)。因此，APC中的TRR信號傳遞的抑制劑或增強劑優選發揮調節細胞外分子與TRR結合的作用(即結合于TRR的細胞外部分)；或調節細胞內分子與TRR的結合(即結合于TRR的細胞內部分)；或調節所述細胞內分子與其他細胞內分子的結合。特別優選的是，TRR信號傳遞的抑制劑或增強劑能調節(功能性)MyD88與TRR的結合，或(功能性)MyD88與諸如含有DD的多肽的其他細胞內分子的結合。因此，諸如DC的APC中的TRR信號傳遞的抑制劑或增強劑優選發揮調節直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的作用。
另外，諸如DC的APC中的TRR信號傳遞的諸如抑制劑或增強劑的調節劑，優選發揮調節直接與TRR相互作用分子或諸如Mal(Fitzgerald等(2001))或TIRAP(Horng等(2001))或TollIP(Burns等(2000))的接頭相關的信號傳遞步驟的作用。野生型TIRAP或野生型Mal被認為在諸如DC的APC中對缺乏功能性DD的MyD88的突變體具有類似的作用，例如，對MyD881pr的類似作用。TollIP可能包括DD。缺乏功能性DD的TollIP的突變體被認為在諸如DC的APC中對缺乏功能性DD的MyD88的突變體具有類似的作用，例如對MyD881pr的類似作用。
諸如DC的APC中TRR信號傳遞的調節劑可以是TIRAP或Mal或其片段、融合體或變體。另外，它可以是TollIP(Burns等(2000))或其片段、融合體或變體。
所述抑制劑還可以是能選擇性地破壞編碼TRR的mRNA的核酶，或能抑制TRR轉錄的反義分子。
可以在本文所披露的病毒或病毒樣顆粒的基因組中編碼的核酶披露于以下文獻中Cech和Herschlag“單鏈DNA的位點特異性裂解”US5,180,818；Altman等“RNAseP對靶RNA的裂解”US5,168,053，Cantin等“HIV-1 RNA的核酶裂解”US5,149,796；Cech等“RNA核酶限制性內切核酸酶和方法”，US5,116,742；Been等“RNA核酶聚合酶，脫磷酸化酶，限制性內切核酸酶和方法”，US5,093,246；和Been等“RNA核酶聚合酶，脫磷酸化酶，限制性內切核酸酶和方法；通過酯交換在特定位點裂解單鏈RNA”，US4,987,071，以上所有文獻都被收作本文參考。
反義寡核苷酸是單鏈核酸，它能特異性結合互補的核酸序列，通過與合適的靶序列結合，形成了RNA-RNA，DNA-DNA或RNA-DNA雙鏈體。所述核酸通常被稱為“反義的”，因為它們互補于有關基因的有義或編碼鏈。最近，業已證實了可以形成三螺旋，其中，所述寡核苷酸結合在DNA雙鏈體上。業已發現，寡核酸能夠識別DNA雙螺旋大溝中的序列。由此形成了三螺旋。這表明，可以合成一種序列特異性分子，這種分子能通過識別大溝氫結合位點，特異地結合雙鏈DNA。
通過結合靶核酸，上述寡核苷酸能夠抑制所述靶核酸的功能。例如，所述功能可能是抑制轉錄、加工、聚(A)添加、復制、翻譯，或促進細胞的抑制機制，如促進RNA降解的結果。
反義寡核苷酸是在實驗室中制備的，然后將其導入細胞，例如通過顯微注射或從細胞培養基中吸收進入所述細胞，或在用具有反義基因的質粒或逆轉錄病毒或其他載體轉染之后在細胞中表達。最初發現，反義寡核苷酸能抑制Rous肉瘤病毒、水皰性口炎病毒、1型單純皰疹病毒、猿猴病毒和流感病毒在細胞培養物中的病毒復制或表達。從那時開始，業已在包括兔網織紅細胞裂解物和麥胚提取物在內的無細胞系統中，對反義寡核苷酸對mRNA翻譯的抑制作用進行了深入研究。業已在體外用互補于AIDS HIV逆轉錄病毒RNA的寡核苷酸證實了反義寡核苷酸對病毒功能的抑制作用(Goodchild，J.1988“反義寡脫氧核苷酸對人類免疫缺陷病毒復制的抑制作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究表明，最有效的寡核苷酸是互補于聚(A)信號的；同樣有效的是導向于RNA的5’末端的，特別是帽和靠近引物結合位點和位于引物結合位點上的5’非翻譯區。帽、5’非翻譯區、和聚(A)信號位于逆轉錄病毒RNA的末端的重復序列上(R區)，而與之互補的寡核苷酸可以與所述RNA結合兩次。
通常，反義寡核苷酸的長度為15-35個堿基。例如，業已證實20聚體寡核苷酸能抑制表皮生長因子受體mRNA的表達(Witters等，Breast Cancer Res Treat 5341-50(1999))，并且業已證實25聚體的寡核苷酸能使促腎上腺皮質素的表達降低90％以上(Frankel等，J Neurosurg 91261-7(1999))。不過，應當理解的是，可能需要使用長度在該范圍之外的寡核苷酸，例如10，11，12，13或14個堿基，或36，37，38，39或40個堿基。
反義核酸可以由合適的載體編碼。
本發明的另一方面提供了一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選抑制劑的步驟。所述調節劑能激活諸如DCs的APCs。所述調節劑可以激活某些信號傳遞途徑，如激酶途徑，例如MAP激酶p42或p44/erk1/erk2，p54/Jnk，p38MAP激酶或NF-κB。所述調節劑或抑制劑可以是MyD88，Mal，TIRAP或TollIP或其中任意一種的片段、融合體或變體，優選保留了功能性TIR，但是不具有功能性DD的片段、融合體或變體(例如可能沒有DD，或可能具有不能像DD那樣起作用的突變的DD，例如，不能與其他(功能性)DD相互作用)。
因此，本發明的另一方面提供了一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或前體細胞提供MyID88，Mal，TIRAP或TollIP的步驟。所說的MyD88，Mal，TIRAP或TollIP包括其片段、融合體或變體，優選保留了功能性TIR，但是不具有功能性DD的片段、融合體或變體。
本發明的另一方面提供了一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選增強劑的步驟。所述調節劑或增強劑可以是MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的片段、融合體或變體(或者可以是MyD88，Mal或TIRAP或TollIP)，優選分別保留了MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的某些，而不是全部結合或催化特性的片段、融合體或變體。所述調節劑或增強劑能抑制諸如DCs的APCs，例如抑制諸如DCs的APCs的抗原呈遞。所述調節劑可以抑制某些信號傳遞途徑，如激酶途徑，例如MAP激酶p42或p44/erk1/erk2，p54/Jnk，p38MAP激酶或NF-κB。
本發明的另一方面提供了一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或前體細胞提供MyD88，Mal，TIRAP或TollIP的片段、融合體或變體的步驟。所述片段、融合體或變體能抑制諸如DCs的APCs，例如抑制APCs，優選DCs的抗原呈遞。所述片段、融合體或變體優選分別保留了MyD88，Mal或TIRAP或TollIP的某些，而不是全部結合或催化特性。
本發明的另一方面提供了一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC)或樹突前體細胞提供直接與MyD88相關的信號傳遞步驟(存在于諸如DC的APC中)的抑制劑的步驟。所述抑制劑可以是MyD88的顯性失活突變體。
本發明的另一方面提供了一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或前體細胞提供MyD88的顯性失活突變體的步驟。
顯性失活突變體包括MyD88的各個部分，它可以包括所述分子的片段，包括死亡結構域(DD)或Toll結構域或其部分。在參考文獻(5)中披露了某些例子。所述顯性失活突變體優選是這樣的突變體，它能抑制IL-1或TRR信號傳遞，如通過激活IRAK或在成纖維細胞或在HUVECs中生產細胞因子。
本發明的另一方面提供了一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC)或前體細胞提供直接與MyD88相關的信號傳遞步驟(存在于諸如DC的APC中)的增強劑。所述增強劑可以是MyD88，例如野生型MyD88。
所述信號傳遞抑制劑或增強劑(例如TRR傳導抑制劑或增強劑或直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑或增強劑)優選是特異性導向于諸如樹突細胞的APCs或前體細胞，不過這并非是必須的。
可以通過給所述患者或患者的細胞提供抑制劑或增強劑或通過在患者的細胞中表達，給所述患者或患者的細胞提供信號傳遞抑制劑或增強劑。因此，所述提供可以通過給所述患者(或所述患者的APC或前體細胞；例如從所述患者體內取出進行操作并隨后再送回所述患者體內的細胞)施用編碼(并且能夠表達)一種信號傳遞抑制劑或增強劑的重組多核苷酸而實現的。
所述增強劑可以提高MyD88的信號傳遞活性。例如，所述增強劑可以是具有野生型活性的MyD88分子，或具有組成型活性的MyD88分子。例如，所述增強劑可以是缺乏功能性Toll結構域的MyD88分子(即缺少能夠結合Toll結構域的結構域)；它可以是MyD88的突變體，其中，Toll結構域是缺失的和/或無功能的，例如在文獻(5)中所披露的MyD88-DD多肽。另外，MyD88突變體可以是這樣的，其中的死亡結構域是缺失的和/或是無功能的，例如MyD881pr。因此，作為一種例子，可以給所述患者施用能表達野生型MyD88的重組多核苷酸。
具有野生型活性的MyD88分子可以是野生型MyD88，優選小鼠或人野生型MyD88，更優選能在小鼠或人DC中表達的MyD88，或保留了野生型MyD88的活性的突變型MyD88，即具有功能性Toll結構域或功能性死亡結構域(DD；即具有能夠結合死亡結構域的結構域)。MyD88Toll結構域和DD優選是非突變的，即所有突變都位于所述結構域之外。
MyD88優選具有以下文獻中所披露的序列Hardiman等(1996)Oncogene 13，2467-2475；或Bonnert等(1997)FEBS Lett.402，81-84；或Hardiman等(1997)Genomics 45，332-339，所有這些序列都是人類序列。所述人類序列還以Gen Bank保藏號NM-002468中提供。
小鼠MyD88序列披露于以下文獻中Harroch等(1995)Nucl.Acids Res.23，3539-3546和Hardiman等(1997)Genomics 45，332-339和Gen Bank保藏號NM-010851。
人類MyD88的氨基酸序列與小鼠MyD88的氨基酸序列具有82％的同一性。
人類和小鼠TIRAP序列分別披露于以下文獻中Horng等(2001)Nature Immunol 7，835-841和Genbank保藏號AF378129和AF378130。
人類和小鼠Mal序列披露于以下文獻中Fitzgerald等(2001)Nature 413，78-83。
人類、小鼠和果蠅TollIP序列披露于以下文獻中Burns等(2000)Nature cell Biol 2，346-351。
正如本領域技術人員所熟知的，任何突變都優選是保守性取代。“保守性取代”表示諸如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr的組合。可以用本領域技術人員所熟知的蛋白質工程和定點誘變的方法實現。
在本文中使用IUPAC-IUB生物化學命名委員會的三字母和單字母氨基酸代碼。多肽的序列是以常規形式從N-末端到C-末端提供的。所述氨基酸優選是L-氨基酸，不過它們可以是D-氨基酸殘基。
MyD88信號傳遞的增強子可以通過結合MyD88或MyD88的結合配偶體起作用，例如通過結合能抑制MyD88的信號傳遞活性的結合配偶體起作用。例如，MyD881pr可以通過取代TRR信號傳遞的天然抑制劑起作用。所述天然抑制劑可能與能抑制TNFα信號傳遞的SODD多肽相關。SODD披露于以下文獻中Jiang等(1999)Science 283，1852-1855。
所述抑制劑可以是MyD88信號傳遞活性的抑制劑。它可以結合MyD88或MyD88的結合配偶體，并且抑制MyD88與結合配偶體的結合。這樣可以通過MyD88破壞信號傳遞。例如，所述抑制劑可以抑制MyD88與TRR的Toll結構域的結合和/或可以抑制MyD88與包括DD的多肽的結合，例如，IRAK或TRAF-6或TollIP。
所述抑制劑或增強劑可以是藥物樣化合物。術語“藥物樣化合物”為本領域技術人員所熟知，并且可以包括化合物的含義，其特征是能使它適用于藥物，例如用作藥物的活性成分。因此，舉例來說，藥物樣化合物可以是通過有機化學技術合成的分子，其次是通過分子生物學或生物化學技術合成的，優選是分子量低于5000道爾頓的小分子。另外，藥物樣化合物可以具有選擇性地與特定蛋白選擇性相互作用的特征，并且可以是生物可利用的和/或能夠穿透細胞膜。不過，應當理解的是，所述特征是不必須的。
所述抑制劑或增強劑可以是抗體，正如本領域技術人員所熟知的，該術語包括抗體片段或抗體樣分子。所述抗體優選能結合MyD88(或其他接頭分子，例如Mal、TIRAP或TollIP)或結合MyD88的結合配偶體(或其他接頭分子)。例如，所述抗體可以結合MyD88的DD(和/或結合MyD88的結合配偶體的DD)，并且可以破壞MyD88與MyD88的結合配偶體的DD的結合。另外，所述抗體可以結合MyD88的Toll結構域(和/或結合MyD88的結合配偶體的Toll結構域)，并且可以破壞MyD88與MyD88的結合配偶體的Toll結構域的結合。所述抗體可優選結合于MyD88的包括相當于野生型小鼠MyD88的Phe56的殘基的表位。
正如下面將要進一步討論的，所謂的抗體包括抗體或其他免疫球蛋白，或其片段或衍生物。
抗體的可變重(VH)鏈區和可變輕(VL)鏈區與抗原識別相關，這是一種通過早期蛋白酶消化實驗所認識到的一種事實。通過嚙齒類抗體“人源化”發現了進一步的證實。來源于嚙齒類動物的可變區可以融合在來源于人的恒定區上，以便所得到的抗體保留了嚙齒類親代抗體的抗原特異性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6851-6855)。
所述抗原特異性是由可變區產生的，并且獨立于所述恒定區，這一點是通過涉及到抗體片段的細菌表達的實驗了解到的，所述抗體片段都包括一個或多個可變區。所述分子包括Fab-樣分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science240，1038)；單鏈Fv(ScFv)分子，其中的VH和VL配偶體結構域是通過柔性寡肽連接的(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)，和包括分離的V區的單結構域抗體(dAbs)(Ward等(1989)Nature 341，544)。可以從以下文獻中找到有關合成保留了其特異性結合位點的抗體片段合成的技術的概括綜述Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299。
我們所說的“BScFv”分子表示這樣的分子，其中的VH和VL配偶體結構域是通過柔性寡肽連接的。
使用抗體片段，而不是完整的抗體的優點是多方面的。抗體片段較小的體積會導致改善了的藥理學特性。消除了完整抗體的效應子功能，如補體結合。Fab，Fv，ScFv和dAb抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并且分泌，因此可以方便地大量生產所述片段。抗體片段還可以在患者細胞內表達。
完整抗體和F(ab′)2片段是“二價的”，我們所說的“二價的”表示所述抗體和F(ab′)2片段具有兩個抗原結合位點。相反，Fab，Fv，ScFv和dAb片段是一價的，僅具有一個抗原結合位點。
所述抗體對表位的親和力為大約105.M-1大約1012.M-1，更優選至少108.M1。
對選定多肽有反應性的抗體可以通過本領域眾所周知的方法產生。具體地講，所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
針對選定抗原的合適的單克隆抗體可以通過已知技術制備，例如披露于以下文獻中的技術“Monoclornal AntibodiesA manual oftechniques”，H Zola(CRC Press，1988)和“Monoclonal HybridomaAntibodiesTechniques and Applications”，JGR Hurrell(CRCPress，1982)。Neuberger等披露了嵌合抗體(1988，8thInternational Biotechnology Symposium Part2，792-799)。適當制備的非人抗體可以是用已知方法“人源化”的，例如，通過將小鼠抗體的CDR區插入人類抗體的構架中。
制備抗體的技術為本領域技術人員所熟知，例如，披露于以下文獻中Harlow，ED & Lane，D“Antibodiesa laboratory manual”(1988)New York Cold Spring Harbor Laboratory。合適的抗體以及制備合適抗體的技術可能披露于(5)中。
所述抗體(特別是抗體片段)可以與能促進諸如DC的細胞攝取所述抗體的成分結合。例如，正如本領域技術人員所公知的，所述抗體可以與親脂性分子或能夠促進所述分子或相互作用的多肽的細胞攝取的多肽結構域連接。因此，所述成分可源于觸足螺旋3(Derossi等(1998)Trends Cell Biol 8，84-87)，或源于HIV的序列，通常為tat，它可以進入細胞。另外，諸如cDNA的編碼所述抗體的多核苷酸，可以通過載體遞送，以便在所述細胞內表達所述抗體，正如上文所述的。
所述抑制劑可以是抑制性MyD88分子，優選顯性抑制性MyD88(即能夠通過野生型MyD88抑制信號傳遞，例如在其中存在野生型和抑制性MyD88分子的細胞中)。所述抑制作用可能是由于阻斷內源野生型MyD88與諸如TRR的內源MyD88的結合配偶體的相互作用導致的。
抑制性MyD88可以是MyD88分子，該分子的能力不如MyD88，優選基本上不能結合DD，例如MyD88或IRAK或TRAF-6的DD。例如，抑制性MyD88的能力可能不如MyD88，優選基本上不能通過DD二聚體化。抑制性MyD88分子可以是突變的MyD88分子，例如在DD上發生突變的MyD88，例如具有非保守性突變。例如，它可以在相當于全長小鼠MyD88的Phe56的位點上發生突變，例如突變成Asn。它可以是被稱為MyD881pr的突變的MyD88分子(5)，其中，同樣缺乏MyD88的N-末端53個氨基酸。與野生型MyD88，例如小鼠野生型MyD88相比，MyD881pr具有一個點突變(F56N；小鼠序列編號)。該點突變存在于DD中，并且能抑制DD的二聚體化(5)。已知相當于1prcp突變的突變能夠消除Fas的細胞毒性信號傳遞，可能是通過破壞DD結構域的構像而實現的(Nagata(1994)Semin Immunol 6，3-8；Huang等(1996)Nature 384， 638-641)。
野生型MyD88和顯性失活MyD88(MyD88-1pr)的構建體業已公開(Burns K.等.J Biol Chem 1998)，不過，MyD88-1pr被錯誤地披露為在其死亡結構域具有單一的氨基酸突變，其中，Phe56突變成Asn。該突變相當于存在于Fas配體的死亡結構域中的1prcp突變，它通過破壞所述死亡結構域的構像消除了其下游信號傳遞。實際上，除了所述點突變之外，在其N-末端53個氨基酸的結構域中存在一個缺失(缺少了genebank序列的1-159個堿基對)。這種缺失導致了部分死亡結構域的缺失。
所述抑制性MyD88可以是MyD88的截短形式，例如，其中被稱為死亡結構域的結構域的全部或部分缺失了的MyD88分子。與野生型MyD88分子相比，抑制性MyD88分子可能不能或較少能夠結合死亡結構域。
抑制性MyD8 8優選包括一個功能性Toll結構域，即能夠與Toll結構域相互作用的Toll結構域，例如野生型MyD88的Toll結構域，例如野生型人類或小鼠MyD88或TRR。抑制性MyD88優選包括全長的MyD88Toll結構域。全長的Toll結構域可能是Toll-Toll結構域相互作用所必須的。盡管不希望受理論的約束，抑制性MyD88隨后可能結合Toll受體的Toll結構域，并因此抑制野生型MyD88與Toll受體的結合，從而抑制來自所述受體分子的信號傳遞。
測定蛋白-蛋白相互作用(及其增強或破壞)的方法為本領域技術人員所熟知。測定DD和Toll-Toll相互作用的合適方法同樣披露于文獻(5)中。例如，合適的方法可以包括酵母雙雜交相互作用，共純化，ELISA，共免疫沉淀，熒光共振能量轉移(FRET)技術和表面等離子共振方法。因此，如果可以通過ELISA、共免疫沉淀或表面等離子共振方法或通過酵母雙雜交相互作用或共純化方法檢測到所述MyD88多肽和含有DD或Toll結構域的多肽之間的相互作用的話，可以認為MyD88分子能夠結合DD或Toll結構域或者與DD或Toll結構域相互作用。優選方法是表面等離子共振。
所述抑制劑或增強劑可以是肽模擬化合物，例如相當于上文所述多肽抑制劑或增強劑的肽模擬化合物。
術語“肽模擬物”表示能模擬作為治療劑的特定肽的構像和理想特征的化合物，不過它缺乏潛在的不希望的特征。例如，嗎啡是一種可以口服的化合物，并且它是內啡肽的肽模擬物。
與肽相關的治療用途可能是有限的，因為缺乏口服生物可利用性和存在蛋白水解降解作用。舉例來說，肽通常是在體內由外肽酶和內肽酶迅速降解的，一般會產生非常短的生物半衰期。肽作為潛在治療劑的另一個缺陷是，它們缺乏通過口服的生物可利用性。通過蛋白水解酶在胃腸道降解所述肽可能是一個重要的作用因素。不過，這一問題是更復雜的，因為業已認識到，即使是不會受到快速代謝物失活的小的環狀肽也表現出差的生物可利用性。這有可能是因為通過腸膜的轉運能力較差，以及通過肝臟萃取從血液中快速清除，并且隨后外泌到腸道內。以上發現表明，有多個酰胺鍵可能影響口服生物可利用性。人們認為，在口服使用所述肽藥物時，肽鏈上連接氨基酸殘基的肽鍵可能會斷開。
有多種不同的方法可以設計并合成肽模擬物。在一種方法中，如由Sherman和Spatola，J. Am.Chem.Soc.，112433(1990)所披露的，可以用化學官能團以基本等質的形式取代一個或多個酰胺鍵。這種逐步方法業已取得了某些成功，即業已獲得了活性類似物。在某些場合下，業已證實所述類似物與其天然存在的對應物相比具有更長的生物學半衰期。不過，該方法具有局限性。成功地取代一個以上的酰胺鍵是罕見的。因此，所得到的類似物仍然容易在該分子的其他地方發生酶促失活。在取代所述肽鍵時，新的接頭部分優選具有與肽鍵基本相同的電荷分布，和基本相同的極性。
可以通過本領域已知的方法，例如披露于Meziere等(1997)J.Immunol.159 3230-3237中的方法合成逆反肽模擬物，其中的肽鍵是反向的。該方法涉及制備包括主鏈改變，而不是側鏈取向改變的假肽。包括NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵的逆反肽更能抗蛋白水解作用。
在另一種方法中，業已用多種非編碼的或修飾過的氨基酸，如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修飾哺乳動物肽。另外，通過諸如環化作用的共價修飾或通過摻入γ-內酰胺或其他類型的鍵，業已對推測的生物活性構像進行了穩定。例如，參見Veber等，P roc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111166(1983)。
很多合成方法的共同主題是將某些環部分導入基于肽的構架。所述環部分限制了肽結構的構像空間，并且這通常會導致所述肽對特定生物學受體親和力的提高。該方法的額外優點是，將環部分導入肽，還有可能使得所述肽具有減弱了的對細胞肽酶的敏感性。
合成環穩定化的肽模擬物的一種方法是閉環置換作用(RCM)。該方法包括以下步驟合成肽前體，并且讓它與RCM催化劑接觸，以便產生構像限制性肽。合適的肽前體可能包括兩個或兩個以上不飽和C-C鍵。該方法可以用固相肽合成技術完成。在本實施方案中，讓固定在固體支持物上的前體與RCM催化劑接觸，然后將產物從所述固體支持物上裂解下來，以便得到構像限制性肽。
本發明的方法可用于治療任何哺乳動物，如人、犬、貓、馬和牛等。優選將所述方法用于治療人類患者。
本發明的另一方面提供了一種鑒定作為抗原呈遞抑制劑的化合物的方法，包括鑒定能在諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或APC的前體細胞中調節，優選激活TRR信號傳遞，例如MyD88信號傳遞的化合物的步驟。TRR信號傳遞的調節，例如激活，優選可以通過觀察MyD88與一種相互作用分子，例如多肽的相互作用的改變檢測，例如，通過MyD88結合TRR能力的提高檢測。
本發明的另一方面提供了一種鑒定作為抗原呈遞增強劑的化合物的方法，包括鑒定能在諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或APC的前體中調節，優選抑制TRR信號傳遞，例如MyD88信號傳遞(或增強Mal、TIRAP或TollIP信號傳遞)的化合物的步驟。要抑制的TRR信號傳遞是能抑制DC成熟或功能的信號傳遞，如上文所述。TRR信號傳遞的抑制作用優選可以觀察MyD88與一種相互作用分子，例如多肽的相互作用的改變檢測，例如通過MyD88結合TLR能力的減弱檢測。
可以觀察IRAK或MAP激酶活性的改變。MyID881pr能提高IRAK活性。
本發明的另一方面提供了一種鑒定作為諸如DC的APC的抗原呈遞作用的抑制劑或增強劑的化合物的方法，包括以下步驟讓一種測試化合物暴露于MyD88或MyD88的APC結合配偶體(即存在于諸如DC的APC或其前體中的MyD88的結合配偶體)，并且確定該化合物是否能夠結合MyD88或MyD88的APC結合配偶體。選擇能夠進行這種結合的化合物。所述方法優選還包括以下步驟確定所述化合物是否能抑制或促進MyD88與MyD88的APC結合配偶體的結合，并且選擇能夠抑制或促進所述結合的化合物。可以進一步測試所述化合物，例如通過觀察其對DC成熟或抗原呈遞的作用。該方法還可以包括確定所述化合物是否能結合MyD88的突變體，例如缺乏功能性Toll結構域或缺乏功能性DD的MyD88的步驟。
如上文所述，所述結合配偶體可以是含有DD的TRR或多肽。在諸如DC的APC中鑒定MyD88結合配偶體的方法為本領域技術人員所熟知，并且包括共沉淀和酵母雙雜交方法和表面等離子共振和FRET。
本發明的另一方面提供了一種鑒定作為抗原呈遞，例如諸如DC的APC的抗原呈遞的抑制劑或增強劑的化合物的方法，包括以下步驟讓一種測試化合物暴露于TRR相互作用分子(接頭分子)，例如Mal或TIRAP或TollIP，或暴露于所述接頭分子的APC結合配偶體(即存在于諸如DC的APC或其前體中的接頭分子的結合配偶體)，并且確定所述化合物是否能結合所述接頭分子(例如Mal或TIRAP或TOllIP)或所述接頭分子的APC結合配偶體。選擇能夠進行這種結合的化合物。所述方法優選還包括以下步驟確定所述化合物是否能抑制或促進所述接頭分子與所述接頭分子的APC結合配偶體的結合，并且選擇能抑制或促進所述結合的化合物。可以進一步測試所述化合物，例如通過觀察其對DC成熟或抗原呈遞的作用。該方法還包括確定所述化合物是否能結合所述接頭分子的突變體，例如TIRAP或Mal或TollIP的缺乏功能性Toll結構域或缺乏功能性DD的突變體的步驟。
本發明的另一方面提供了將MyD88(或其他接頭分子，例如TIRAP或Mal或TollIP)或MyD88的結合配偶體或其他接頭分子用于鑒定諸如DC的抗原呈遞作用的抑制劑或增強劑的方法中的用途。
對于上述每一種鑒定化合物的方法來說，所述化合物可以是藥物樣化合物或開發藥物樣化合物的前導化合物。正如本領域技術人員所熟知的，可以將所述方法可以用作開發藥用化合物或藥物的篩選測定方法。
術語“前導化合物”同樣是本領域技術人員所熟知的，并且可以包括以下含義，即所述化合物本身盡管不合適用作藥物(例如，因為它只能低效率地作用于其預期的目標，其作用方面的非選擇性，不穩定性，難于合成或具有較差的生物利用度)，但是它可以提供計設可能具有更理想的特征的其他當合物的起點。
本發明的另一方面提供了一種通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物，即通過本發明的以上三個方面提供的方法。本發明的另一方面提供了一種通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的用于醫學目的的化合物。本發明的另一方面提供了用于醫學目的的MyD88的APC結合配偶體(或Mal或TIRAP或TollIP)或其突變體。本發明的另一方面提供了將通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物或MyD88的APC結合配偶體(或Mal或TIRAP或TollIP)或其突變體用于治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者或用于生產用來治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者的藥物的用途。
MyD88的APC結合配偶體(或Mal或TIRAP或TollIP)優選是MyD88的DC-結合配偶體。
本發明的另一方面提供了用于醫學目的的Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的抑制劑。本發明的另一方面提供了用于醫學目的的Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的增強劑，例如，用于治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者。
本發明的另一方面提供了用于醫學目的的直接與MyD88相關的信號傳遞步驟(出現在諸如DC的APC中)的增強劑或抑制劑，例如，用于治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者。
優選的所述信號傳遞抑制劑和增強劑如上文所述。信號傳遞抑制劑優選是MyD88的顯性失活突變體，例如MyD881pr或缺乏死亡結構域的MyD88，或能結合MyD88的化合物，優選如上文所述的小分子或藥物樣分子。如上文所述，所述信號傳遞抑制劑或增強劑還可以是TIRAP或Mal或TollIP或其片段、融合體或其變體。
如上文所述，可以理解的是，可以通過在細胞中表達(即合成)信號傳遞抑制劑或增強劑(或化合物)的方式，例如由存在于所述細胞中的重組多核苷酸(即能夠表達TRR信號傳遞抑制劑或增強劑的重組多核苷酸)表達TRR信號傳遞抑制劑或增強劑，將信號傳遞(例如TRR或MyD88信號傳遞)抑制劑或增強劑(或通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物)提供給所述細胞。可以理解的是，所述通過表達的方式在靶細胞中提供信號傳遞抑制劑或增強劑或化合物的方法可能是有利的；例如，所述提供方法可能促進將所述信號傳遞抑制劑或增強劑導向所需的細胞。它還可以促進從時間上延長所述信號傳遞抑制劑或增強劑的存在或向所述細胞提供信號傳遞抑制劑或增強劑的能力。
可以理解的是，可能需要給所需細胞同時提供兩種調節劑，例如上文所定義的信號傳遞抑制劑(或通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物，它是抗原呈遞的增強劑)和抗原。優選通過在所需細胞中表達的方式，給所需細胞提供信號傳遞抑制劑/化合物或抗原，優選提供這兩者。
類似地，可能需要給所需細胞同時提供信號傳遞增強劑(或通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物，它是抗原呈遞的抑制劑)和抗原。優選通過在所需細胞中表達的方式給所需細胞提供信號傳遞增強劑/化合物或抗原，優選提供這兩者。
本發明的另一方面提供了一種編碼信號傳遞抑制劑或增強劑(或通過本發明的方法鑒定的或可以鑒定的MyD88的APC結合配偶體或化合物)的重組多核苷酸，例如用于醫學目的的MyD88多肽(例如組成型活性MyD88多肽或顯性失活突變型MyD88多肽)或Mal或TIRAP或TollIP多肽。所述傳導抑制劑或增強劑優選是上文所定義的顯性失活MyD88多肽。所述重組多核苷酸優選能夠在諸如樹突細胞的APC或APC前體中表達信號傳遞抑制劑或增強劑。
所述重組多核苷酸優選編碼信號傳遞途徑的調節劑，如抑制劑和希望由APC呈遞的抗原。因此，所述重組多核苷酸可能包括一個編碼諸如抑制劑的信號傳遞調節劑的部分，和一個編碼抗原性分子的部分。另外，所述抗原性分子可以由一個獨立的多核苷酸分子編碼；這種情況是不太理想的。所述信號傳遞分子和抗原可以由單一的啟動子轉錄，它具有第二個編碼序列的內部核糖體進入位點(IRES)。另外，所述信號傳遞分子和抗原能夠由獨立的啟動子轉錄。
所述抗原性分子可以包括一個以上拷貝的一個或多個表位，例如，它可以包括單一拷貝的單一表位形成氨基酸序列，例如長度為大約8-30個氨基酸的序列，優選大約10-18個氨基酸，更優選大約15個氨基酸。它可以包括多個拷貝的所述表位形成序列，或單一或多個拷貝的至少兩種不同的表位形成序列。所述抗原性序列可以串聯在一起，形成結構域樣結構，或者可以分散于載體多肽的不同位點上。所述多核苷酸可以編碼一種或若干種不同的抗原性分子或其中的多種，其中每一種具有一個或多個抗原性部分或表位。
將重組多表位疫苗用于遞送多個CD8 CTL表位的用途披露于以下文獻中Thomson等(1996)J.Immunol.157，822-826和WO96/03144，這兩份文獻都被收作本文參考。就本發明而言，可能需要將一種肽(或編碼肽的核酸)包括單一的疫苗，其中，所述肽按任何順序包括一種或多種抗原性氨基酸序列(例如各自的長度為大約8-18個氨基酸)，例如源于腫瘤相關抗原，和CD4T細胞-刺激表位(如源于破傷風類毒素)。所述“串珠”疫苗一般是DNA疫苗。
例如，所述抗原性分子可以包括存在于轉化過的細胞或癌細胞上的表位(即腫瘤相關的抗原或表位，例如由高比例的人黑素瘤產生的MAGE-1抗原(van der Bruggen等(1991)Science 254，1643))。另外，它可以包括存在于諸如病毒的致病性生物的表位，或存在于由致病性生物感染過的細胞(特別是人類細胞)，例如病毒感染的細胞。
正如本領域技術人員所熟知的，所述表位可以是T-細胞表位，即能夠誘導T-細胞反應(TH-1反應)的表位，例如，T-輔助細胞反應，優選CD8+細胞毒性T-細胞反應，不過，還可以是CD4+輔助T-細胞反應(TH-2反應)。在某些場合下，細胞毒性T-細胞反應可能是不希望的，例如，當所述抗原是分支桿菌抗原(例如，結核分支桿菌或麻風分支桿菌)抗原時就是如此。
本文所披露的信號傳遞增強劑可能能夠調節針對一種抗原的免疫反應，以便改變免疫反應的TH1/TH2平衡，優選變得有更多的TH1和更少的TH2反應。TH2反應可能與過敏相關。
如果癌抗原是或者具有至少一種存在于下列任意一種蛋白的表位，則是優選的i)在腫瘤中以異常高的水平表達的正常細胞蛋白；例如，多種腫瘤中的細胞周期蛋白D1；乳腺癌中的細胞周期蛋白E；多種腫瘤中的mdm 2；EGF-R，erb-B2，erb-B3，FGF-R，胰島素樣生長因子受體，Met，myc，p53和BCL-2都是在各種腫瘤中表達的。
ii)在腫瘤中突變的正常細胞蛋白；例如各種腫瘤中的Ras突變；各種腫瘤中的p53突變；CML和ALL中的BCR/ABL易位；AML和MDS中的CSF-1受體突變；結腸癌中的APC突變；MEN2A，2B和FMTC中的RET突變；神經膠質瘤中的EGFR突變；PML中的PML/RARA易位；前B白血病和幼兒急性白血病中的E2A-PBX1易位。
iii)在與病毒感染相關的腫瘤中病毒編碼的蛋白；例如，宮頸癌中的人類乳頭瘤病毒蛋白；B細胞淋巴瘤和何杰金氏人淋巴瘤中的EB病毒蛋白；成年人T細胞白血病中的HTLV-1蛋白；肝細胞癌中的乙型和丙型肝炎蛋白病毒；卡波西肉瘤中的皰疹樣病毒蛋白。
iv)HIV感染的患者體內HIV編碼的蛋白。
因此，上述癌相關抗原可以劃分成三種主要類型(i)在腫瘤細胞中高水平表達的正常的自身抗原；(ii)在腫瘤細胞中表達的突變的自身抗原；(iii)在與病毒感染相關的腫瘤中表達的病毒抗原。優選類型(i)。
在類型(i)中包括三種亞型
a)超量表達的正常細胞蛋白；b)在正常細胞中以組織特異形式表達的蛋白，不過，也可以在腫瘤中表達；c)作為胚胎抗原的蛋白，它在大多數成人組織中是沉默的，但是，在腫瘤中異常表達。
b)和c)的例子有b)作為腫瘤反應性CTL的靶的組織特異性分化抗原，如GATA-1，IKAROS，SCL(在造血系和白血病中表達)；和免疫球蛋白恒定區(用于治療多發性骨髓瘤)；和c)用于治療白血病和Wilms腫瘤的Wilms-腫瘤抗原1(WT1)和用于肝臟和腸道腫瘤的癌胚抗原(CEA，胎蛋白)。
在一種實施方案中，癌相關抗原可以由腫瘤樣品的粗制提取物提供。
在以下文獻中披露了癌基因編碼的蛋白在人類腫瘤中的超量表達和突變的癌基因在人類腫瘤中的表達Stauss & Dahl(1995)TumourImmunology，Dalgleish/Browning，第7章，該文獻被收作本文參考。
因此，如果要治療的患者患有癌癥的話是優選的；更優選下列癌癥中的任意一種乳腺癌；膀胱癌；肺癌；前列腺癌；甲狀腺癌；白血病和淋巴瘤，如CML，ALL，AML，PML；結腸癌；神經膠質瘤；精原細胞瘤；肝癌；胰腺癌；膀胱癌；腎癌；宮頸癌；睪丸癌；頭頸癌；卵巢癌；成神經細胞瘤和黑素瘤。
CML是慢性髓細胞白血病；ALL是急性淋巴細胞白血病；AML是急性髓細胞白血病；而PML是前髓細胞白血病。
另外，所述患者可能患有由病原體，特別是細菌、酵母、病毒和錐蟲等導致的疾病或具有患這些疾病的危險。優選的是由一種病原體的慢性感染導致的疾病。同樣優選的是，所述病原體是不容易被宿主免疫系統清除的病原體。
優選的是所述疾病是病毒感染；更優選的疾病是由下面任意一種病毒導致的疾病HIV，乳頭瘤病毒，EB病毒，HTLV-1，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，皰疹病毒或任何能導致慢性感染的病毒。如果所述病毒是HIV的話是特別優選的。
在諸如某些類型的甲狀腺疾病的某些疾病的細胞中產生了異常高含量的激素。因此，本發明的方法可用于促進產生較高含量激素的細胞的剝離。所述抗原可以是所述激素，與所述激素合成相關的生物合成酶，它是由所述細胞超量產生的。
患有細菌感染，特別是能導致慢性感染的感染的患者也可進行有效治療。所述細菌感染可以是細胞內感染。因此，所述方法可用于治療結核病。
所述方法還可用于治療瘧疾。
可以從增強或刺激抗原呈遞作用中受益的其他患者包括患有朊病毒相關疾病的患者，如海綿狀腦病患者。所述增強或刺激抗原呈遞作用的方法可用于治療(包括預防性治療)以異常類型和/或異常高含量的(有害的)分子為特征的疾病或狀況，例如身體中的多肽，例如，與慢性炎癥相關的炎性介質(例如細胞因子)；細胞或結締組織基質的降解產物，例如纖連蛋白片段；β-淀粉樣多肽(與阿爾茨海默病相關)的含量。刺激針對所述分子的免疫反應，可能有助于從體內清除所述分子，因此有助于治療或預防所述癥狀。
需要抑制抗原呈遞作用的患者，可能是患有或者是有可能患自身免疫病或過敏的患者，或者是接受或將要接受移植組織的患者，即需要抑制對移植組織的排斥作用的患者。合適的抗原為本領域技術人員所熟知。
可以用本發明方法治療的自身免疫病包括類風濕關節炎，I型糖尿病，多發性硬化，克隆氏病，橋本氏甲狀腺炎，腹腔疾病，重癥肌無力，尋常天皰瘡，系統性紅斑狼瘡，和格雷夫斯病。
可以用本文所披露的方法治療的過敏反應包括對以下過敏原的過敏Fel d1(家貓的貓皮膚和唾液腺過敏原——其氨基酸序列披露于WO 91/06571中)，DerpI，Der p II，Der FI或Der fII(來自家庭塵螨嗜皮螨屬的主要蛋白過敏原——氨基酸序列披露于WO94/24281中)。
本發明基本上可應用于任何過敏，包括由存在下列任意一種物體上的過敏原引起的過敏牧草、樹木和雜草(包括豚草)花粉；真菌和霉菌；食品，例如魚，貝類，龍蝦，花生，堅果，麥谷蛋白，蛋和乳；叮咬類昆蟲，例如蜂，黃蜂和大黃蜂；以及搖蚊科(非叮咬搖蚊)；蜘蛛和螨蟲，包括家庭塵螨；存在于頭皮屑、尿液、唾液中的或諸如貓、狗、牛、豬、綿羊、馬、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙土鼠的哺乳動物的血液或其他體液中的過敏原；一般為空氣傳播的顆粒；乳膠；和蛋白型添加劑。
還可以治療對來自以下昆蟲的蛋白的過敏家蠅、果蠅、綿羊麗蠅、螺旋蠅、谷類象甲、蠶、蜜蜂、非叮咬搖蚊幼蟲、蠟螟幼蟲、粉虱、蟑螂和Tenibrio molitor甲蟲的幼蟲。
本發明的另一方面包括由各部分組成的試劑盒，組合物或諸如嵌合多肽的嵌合分子，所述嵌合分子包括上文所述的信號傳遞抑制或增強部分(它可以是編碼抗原性分子的多核苷酸)和抗原性部分(它可以是編碼抗原性分子的多核苷酸)。所述任意部分或兩部分還可以包括轉運部分和/或細胞結合部分。所述細胞結合部分優選能夠結合樹突細胞或其前體。所述轉運部分可能有助于所述分子或所述分子的至少抗原性部分，優選信號傳遞抑制或增強部分的內化。因此，外源添加肽的可以連接在HIV tat肽上。這樣可以引導它進入由CTL呈遞的I型MHC途徑(例如，參見Kim等(1997)J.Immunol.159，1666-1668)。可以在本發明中采用的嵌合分子披露于WO95/31483中。
樹突細胞的特征可以是能表達CD80，CD86，CD40，CD1a，HLA-DR和/或CD83細胞表面分子。不成熟的樹突細胞可以是CD34+或CD14+。因此，所述細胞結合部分可以能夠結合于一種或多種所述細胞表面分子上(例如，能夠結合所述分子的抗體)。對于DCs的定向來說，CD1a和CD83是優選的。
在多肽合成之前或之后對其中的一個或多個氨基酸殘基進行過化學修飾的多肽可以用作抗原，只要所述多肽的功能，即在體內特異性免疫反應的產生基本上保持不變就行。所述修飾包括與酸或堿，特別是生理學上可以接受的有機或無機酸和堿形成鹽，形成末端羧基的酯或酰胺，以及連接諸如N-叔丁氧基羰基的氨基酸保護基團。所述修飾可以抑制所述多肽的體內代謝。
所述表位(例如表位形成氨基酸序列)能夠以單一拷貝或多拷貝形式存在，例如串聯重復。所述串聯的或多拷貝重復本身可能具有足夠的抗原性，避免了載體的使用。對于要以環狀形式形成的多肽來說，將N-末端和C-末端連接在一起，或在一個末端添加一個或多個Cys殘基，以便增強抗原性和/或形成二硫鍵可能是有利的。如果所述表位，例如表位形成氨基酸序列，共價連接在一種載體，優選多肽上的話，所述結構是優選的，以便由表位形成氨基酸序列形成一個環。
根據現有的免疫學理論，為了刺激或增強刺激免疫系統，在任何免疫原性制劑中都應當存在載體功能。本發明的前述部分所述的表位，可以與諸如血清白蛋白、肌紅蛋白、細菌類毒素和匙孔戚血藍蛋白的獨立的載體結合，例如通過交聯結合。最新開發的能在免疫反應中誘導T-細胞輔助的載體，包括乙型肝炎核心抗原(又被稱為核殼蛋白)，推測的T-細胞表位，如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys，β-半乳糖苷酶和白介素-1的163-171肽。可以將后一種化合物視為載體或佐劑或這兩者。
另外，可以將相同或不同表位的若干個拷貝彼此交聯；在這種情況下，不存在獨立的載體，但是可以通過這種交聯提供載體功能。合適的交聯劑包括在Sigma和Pierce產品目錄中所列舉的交聯劑，例如戊二醛、碳二亞胺和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯，后一種交聯劑利用了C-末端半胱氨酸殘基(如果存在的話)上的-SH基團。交聯多肽的任何常規形式都可以使用，如一般參見O′Sullivan等Ahal.Biochem.(1979)100，100-108。例如，其第一部分可以用巰基富集，而第二部分與能夠與所述巰基起反應的雙功能試劑起反應，例如，碘乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，即可以在綴合的化合物之間插入二硫鍵的異雙功能交聯劑。酰胺和硫醚鍵，例如，通過m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯獲得的，在體內通常比二硫鍵更穩定。
其他有用的交聯劑包括S-乙酰硫代乙醇酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA)，它是伯胺的硫醇化試劑，它能在溫和條件下對巰基脫保護(Julian等(1983)Anal.Biochem.132，68)，二甲基辛二亞胺二氯化物和N，N′-o-苯基二馬來酰亞胺。
如果所述多肽是通過在合適的宿主中表達合適的核苷酸序列制備的話，優選作為與能起到載體作用的肽序列的融合產物的形式表達所述多肽。Kabigen的“Ecosec”系統是所述結構的一個例子。
可以將來自不同生物學來源(例如不同的致病生物)的不同表位連接在其他抗原上，以便提供雙重作用。
正如本領域技術人員所熟知的，表位包括模擬表位。
可用于制備合適的重組多肽的合適的載體或結構或多核苷酸為本領域技術人員所熟知。
能夠表達需要的多肽的多核苷酸可以用本領域技術人員所熟知的技術制備。
所述多核苷酸優選能夠在患者體內表達多肽。如果合適的話，所述多肽，例如TRR信號傳遞抑制劑或增強劑或抗原可以由下文所披露的任何合適的多核苷酸(遺傳構建體)表達，并且遞送到患者體內。通常，能表達所述多肽的遺傳構建體包括可操作地與一種啟動子連接的所述多肽的編碼序列，它能在患者細胞內表達轉錄的多核苷酸(例如mRNA)分子，該分子能夠翻譯，以便合成所述多肽。合適的啟動子為本領域技術人員所熟知。并且可以包括用于普遍表達的啟動子，例如管家基因或組織選擇性基因的啟動子，這取決于表達所述多肽的需要(例如，在樹突細胞或其前體細胞中)。優選使用樹突細胞或樹突前體細胞選擇性啟動子，但是，這并非是必須的，特別是如果所述多核苷酸的遞送或攝取是針對特定細胞的話，例如針對樹突細胞或前體。樹突細胞選擇性啟動子可以包括CD83或CD36啟動子。
能夠表達所述多肽的核酸序列優選可操作地連接在表達所述序列所必須的調控元件上。
“可操作地連接”表示可以實現有關成分的正常功能的并列關系。因此，與調控因子“可操作地連接”的編碼序列表示這樣一種構型其中，編碼NF-κ B的抑制劑(或誘導劑，正如在下文更詳細的披露的，誘導劑是可以使用的)的核酸序列可以在所述調控序列的控制下表達。
“調控序列”表示在特定宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所必須的氨基酸序列。例如，適用于真核細胞的調控序列是啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
“載體”表示包括單鏈、雙鏈、環狀或超螺旋DNA在內的DNA分子。合適的載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘病毒和細菌質粒。逆轉錄病毒載體是通過將其基因組隨機整合到宿主的基因組上進行復制的逆轉錄病毒。合適的逆轉錄病毒載體披露于WO 92/07573中。
腺病毒是線性雙鏈DNA病毒。合適的腺病毒載體披露于以下文獻中Rosenfeld等，Science，1991，Vol.252，432頁。
腺伴隨病毒(AAV)屬于細小病毒科，并且由大約4-6KB的單鏈DNA組成。
痘病毒載體是大型病毒，它具有若干個可以插入基因的位點。這種病毒是熱穩定性的，并可以在室溫下保存。安全性研究表明，痘病毒載體是復制缺陷型的，并且不會在宿主之間傳播，或者向環境中傳播。
將所述疫苗導向諸如抗原呈遞細胞的特定細胞群體可以通過以下方式實現例如，通過注射部位，使用導向載體和遞送系統，或從患者體內選擇性地純化所述細胞群體并且離內施用所述肽或核酸(例如，可以按照披露于以下文獻中的方法保存樹突細胞Zhou等(1995)Blood 86，3295-3301；Roth等(1996)Scand.J.Immunology 43，646-651)。另外，導向載體可以包括組織或腫瘤選擇性啟動子，該啟動子能指導所述抗原在合適的部位表達。
盡管所述遺傳構建體可以是DNA或RNA，但優選是DNA。
所述遺傳構建體優選適用于遞送到人細胞內。
將遺傳構建體導入動物體內的細胞或從動物體內取出的細胞中的裝置和方法為本領域技術所公知。例如，可以通過任何常規方法將本發明的構建體導入細胞，例如，涉及到逆轉錄病毒的方法，以便將所述構建體插入(分裂)細胞的基因組中。定向逆轉錄病毒可用于本發明中；例如，可以通過工程方法將能產生特異性結合親和力的序列整合到現有病毒env基因上(有關用于基因治療的這種載體和其他導向載體的綜述可以參見Miller & Vile(1995)Faseb J.9，190-199)。
優選的逆轉錄病毒載體是慢病毒載體，如在以下文獻中所披露的載體Verma & Somia(1997)Nature 389，239-242。
可以理解的是，逆轉錄病毒方法，如在下文所披露的方法可能僅適合于分裂中的細胞。例如，在Kuriyama等(1991)Cell Struc.andFunc.16，503-510中，使用了純化逆轉錄病毒。可以用本領域所熟知的方法制備編碼所需多肽的逆轉錄病毒DNA構建體。為了由所述構建體生產活性逆轉錄病毒，通常使用在含有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基(DMEM)中生長的親嗜性psi2包裝細胞系。所述細胞系的轉染是通過磷酸鈣共沉淀以常規方式進行的，并且通過以1毫克/毫升的最終濃度添加G418選擇穩定的轉化體(假設逆轉錄病毒構建體含有neoR基因)。分離并且擴增獨立的菌落，取出培養上清液，通過0.45微米孔度的濾膜過濾，并且在-70℃下保存。為了將逆轉錄病毒導入靶細胞，通常直接注射業已在其中添加了10微克/毫升Polybrene的逆轉錄病毒上清液。所述注射可以在存在靶細胞的部位進行，例如皮下注射。
其他方法包括將所述構建體簡單地遞送到所述細胞中，以便進行有限時間的表達，或者在整合到基因組中之后進行較長時間表達。后一種方法的例子包括脂質體(Nǎssander等(1992)Cancer Res.52，646-653)。其他遞送方法包括通過抗體-聚賴氨酸鍵攜帶外源DNA的腺病毒(參見Curiel Prog.Med.Virol.40，1-18)和作為載體的轉鐵蛋白-聚陽離子綴合物(Wagner等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414)。在上述第一種方法中，用本發明的DNA構建體或其他遺傳構建體形成了聚陽離子-抗體復合體，其中，所述抗體對野生型腺病毒或變體腺病毒具有特異性，在變體腺病毒中業已導入了能結合所述抗體的新的表位。所述聚陽離子部分通過與磷酸主鏈的靜電相互作用結合DNA。所述腺病毒因為包括未改變的纖維和五鄰體蛋白而被內化到所述細胞中，并且將本發明的DNA構建體攜帶到所述細胞中。優選的聚陽離子是聚賴氨酸。
細菌遞送披露于以下文獻中Dietrich(2000)AntisenseNucleic Acid Drug Delivery 10，391-399。
所述DNA還可以通過腺病毒遞送，其中，它存在于所述腺病毒顆粒中，例如下文所披露的。
在所述第二種方法中，采用了高效核酸遞送系統，該系統使用受體介導的胞吞作用將DNA大分子運載到使用的細胞中。這一目的是通過將鐵轉運蛋白——轉鐵蛋白綴合在結合核酸的聚陽離子上而實現的。通過二硫鍵將人類轉鐵蛋白或其雞的蛋白同源物伴白蛋白或其組合共價連接到小的DNA結合蛋白魚精蛋白或各種大小的聚賴氨酸上。所述修飾過的轉鐵蛋白分子保留了它的結合其關聯受體的能力，并且能將鐵有效轉運到所述細胞內。無論核酸大小如何，所述轉鐵蛋白-聚陽離子分子都能與本發明的DNA構建體或其他遺傳構建體形成電泳穩定的復合體(從短的寡核苷酸到21千堿基對的DNA)。當將轉鐵蛋白-聚陽離子和本發明的DNA或其他遺傳構建體的復合體提供給所述靶細胞時，預期會出現所述構建體在靶細胞中的高水平表達。
還可以使用高效受體介導的本發明DNA構建體或其他遺傳構建體的遞送，該方法使用了通過以下文獻所披露的方法生產的缺陷型或化學失活的腺病毒顆粒的核內體破壞活性Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6094-6098。該方法似乎取決于以下事實腺病毒適合從核內體中釋放出它的DNA，而不通過溶酶體，并且在存在諸如與本發明的DNA結構或其他遺傳構建體連接的轉鐵蛋白的情況下，所述構建體通過與逆轉錄病毒顆粒相同的途徑被所述細胞吸收。
該方法的優點是，沒有必要使用復雜的逆轉錄病毒構建體；不存在與逆轉錄病毒感染相同的永久性基因組修飾；并且所述定向表達系統與定向遞送系統偶聯，因此降低了對其他細胞類型的毒性。
“裸露的”DNA和與陽離子和中性脂類復合的DNA也可用于將本發明的DNA導入要治療的患者的細胞中。基因治療的非病毒方法披露于以下文獻中Ledley(1995)Human Gene Therapy 6，1129-1144。其他定向遞送系統也是已知的，如披露于WO 94/10323中的修飾過的腺病毒系統，其中，所述DNA通常攜帶在腺病毒或腺病毒樣顆粒中。Michael等(1995)Gene Therapy 2，660-668披露了對腺病毒的修飾，以便在纖維蛋白上添加一個細胞選擇性部分。能選擇性地在p53-缺陷型人類腫瘤細胞中復制的變體腺病毒，如披露于Bischoff等(1996)Science 274，373-376中的腺病毒，也可用于將本發明的遺傳構建體遞送到細胞中。因此，可以理解的是，本發明的另一方面提供了包括本發明的遺傳構建體的病毒或病毒樣顆粒。其他合適的病毒或病毒樣顆粒包括HSV，AAV，痘苗病毒，慢病毒和細小病毒。
免疫脂質體(抗體定向脂質體)特別適用于導向能超量表達存在它的抗體的細胞表面蛋白的細胞類型，例如，使用樹突細胞或前體是可行的，例如，使用抗CD1，CD14或CD83的抗體(或其他樹突細胞或前體細胞表面分子，如上文所述)。為了制備免疫脂質體，按照Martin& Papahad jopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288的方法，合成了MPB-PE(N-[4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酰]磷脂酰乙醇胺)。將MPB-PE摻入到脂質體雙層中，以便可以將抗體或其片段共價偶聯到脂質體表面上。所述脂質體通常加載有用于遞送給所述靶細胞的本發明的DNA或其他遺傳構建體。例如，在所述DNA或其他遺傳構建體的溶液中，形成所述脂質體，然后在最高達0.8MPa的氮氣壓力下，通過0.6-0.2微米孔度的聚碳酸酯膜過濾器連續擠壓。在擠出之后，通過以80000×g的速度超速離心45分鐘使捕獲的DNA構建體與游離的DNA構建體分離。將新制備的MPB-PE-脂質體在脫氧緩沖液中與新制備的抗體(或其片段)混合，并且偶聯反應是在4℃下在氮氣中進行的，并且不間斷地勻速旋轉過夜。通過在80000×g的速度下超速離心45分鐘，使免疫脂質體與未偶聯的抗體分離。免疫脂質體可用于注射，例如腹膜內注射或直接注射到存在靶細胞的部位，例如皮下注射。
優選的載體包括慢病毒載體和腺病毒載體，例如類似于披露于以下文獻中的載體Foxwell等(2000)Ann Rheum Dis 59 Suppl 1，I54-59或Bondeson等(2000)J Rheumatol 27(9)，2078-2089。
可以理解的是可能需要調控所述多肽(例如TRR信號傳遞抑制劑，例如MyD881pr)在細胞中的瞬時表達。因此，所述多肽的表達可能需要直接或間接(參見下文)在一種啟動子的控制之下進行，所述啟動子是可以調控的，例如，通過在需要激活或阻遏所述多肽的表達時，給患者施用的小分子的濃度調控(取決于所述小分子是否能影響所述啟動子的激活或阻遏)。可以理解的是，如果所述表達構建體是穩定的話，將是特別有利的，即能夠在所述細胞中表達所述多肽(在存在任何必需調控分子的情況下)至少1周，1、2、3、4、5、6、8個月或1年或1年以上。本發明的優選構建體可以包括一個可調控的啟動子。可調控啟動子的例子包括在以下文獻中提到過的啟動子Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(15)，8657-62(由一種口服生物可利用的藥物納巴霉素控制，使用兩種獨立的腺病毒或腺伴隨病毒(AAV)載體，一種編碼誘導型人類生長激素(hGH)靶基因，另一種編碼二分納巴霉素調控的轉錄因子)；Magari等(1997)J ClinInvest 100(11)，2865-72(由納巴霉素控制)；Bueler(1999)BiolChem 380(6)，613-22(腺伴隨病毒載體綜述)；Bohl等(1998)Blood92(5)，1512-7(由腺伴隨載體中的多西環素控制)；Abruzzese等(1996)J Mol Med 74(7)，379-92(參見誘導因子，例如，激素，生長因子，細胞因子，細胞靜止因子，輻射，熱激和相關的效應因子)。還可以使用四環素-誘導型載體。所述載體是通過相對無毒的抗生素激活的，業已證實它們可用于調控在哺乳動物細胞培養物中的表達。另外，還可以使用基于甾體的誘導劑，特別是因為所述甾體受體復合物能進入細胞核，其中，所述DNA載體在轉錄之前必須分離。
可以通過在兩種水平上調控表達進一步改善該系統，例如，通過使用組織選擇性啟動子和由外源誘導劑/阻遏劑，例如上文所述的小分子誘導劑控制的啟動子，這種誘導劑為本領域技術人員所熟知。因此，一種水平的調控可能涉及將合適的多肽編碼基因連接在一種誘導型啟動子上，而另一種水平的調控涉及到使用組織選擇性啟動子驅動編碼必需的誘導型轉錄因子(它控制來自所述誘導型啟動子的所述多肽(例如MyD88多肽)-編碼基因的表達)。還可以通過所述遺傳構建體的細胞類型特異性定向改善控制。
可以理解的是，所表達的蛋白優選以相對參與MyD88或TRR傳導的其他蛋白的適當水平生產，以便獲得最佳功能。
正如本領域技術人員所公知的，在用完整動物進行評估之前，可以在體外產生的諸如樹突細胞的細胞中，評估本發明的方法或構建體。還可將在申請日為1999年12月24日的GB9930616.9中所披露的方法用于評估本發明的方法或構建體。
本發明的遺傳構建體可以用本領域中眾所周知的方法制備。
可以通過包括口服和腸胃外(例如皮下或肌內)注射在內的任何常規方法施用上述治療分子，例如信號傳遞抑制劑或增強劑(例如MyD88多肽，包括顯性失活MyD88變體多肽，如MyD881pr)或化合物，嵌合分子或本發明的構建體或其制劑。所述治療可以包括在一定時間內的單一劑量或多個劑量。所述治療分子(例如，多肽，嵌合分子，構建體或制劑)優選是通過注射施用的，優選皮下注射。可以理解的是，諸如上文所述的小分子誘導劑的誘導劑優選通過口服使用。
可能需要用包括所述遺傳構建體的合適的遞送載體對包括靶細胞的部位進行局部灌注一段時間。例如，需要移植的器官可以進行離體灌注。另外，或者作為一種替代方案，可以將所述遞送載體或遺傳構建體直接注射，例如皮下注射到包括靶細胞的可達到的部位。將諸如腺病毒載體構建體的遺傳構建體注射到患者細胞中的方法為本領域技術人員所熟知。
具體地講，可以使用過繼治療方法或使用基因槍將構建體遞送到樹突細胞中，例如遞送到皮膚中。
過繼治療方法披露于以下文獻中Nestle等(1998)Nature Med.4，328-332和De Bruijn等(1998)Cancer Res.58，724-731。
過繼治療方法可以包括以下步驟(1)從患者獲得抗原呈遞細胞或其前體，優選樹突細胞或其前體；(2)讓所述抗原呈遞細胞與來自體內的信號傳遞抑制劑或增強劑(或通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物)，以及需要針對它的免疫反應的任選的抗原，或上文所述的嵌合分子或多肽接觸；和(3)將如此處理過的抗原呈遞細胞重新導入患者體內。
合適的是，所述樹突細胞是用多肽，例如信號傳遞抑制劑和抗原刺激過的自體樹突細胞。在以下文獻中披露了用由來自腫瘤相關抗原的肽刺激過的自體樹突細胞進行的T-細胞治療Murphy等(1996)The Prostate 29，371-380和Tjua等(1997)The Prostate 32，272-278。
在另一種實施方案中，所述抗原呈遞細胞，如樹突細胞與編碼信號傳遞抑制劑或增強劑的多核苷酸接觸。所述多核苷酸可以是任何合適的多核苷酸，并且它優選能轉導所述樹突細胞，因此相應導致所述抗原呈遞細胞的抗原呈遞作用的激活或抑制。
通常，所述多核苷酸可以包括在上文所述的病毒多核苷酸或病毒中。例如，業已證實腺病毒轉導過的樹突細胞能誘導與MUC1相關的抗原特異性抗腫瘤免疫性(參見Gong等(1997)Gene Ther.4，1023-1028)。類似地，可以使用基于腺病毒的系統(例如，參見Wan等(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可以使用逆轉錄病毒系統(Specht等(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcs等(1997)Blood 90，2160-2167)；還可以使用顆粒介導的向樹突細胞的轉移(Tuting等(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；并且還可以使用RNA(Ashley等(1997)J.Exp.Med.186，1177-1182)。
所述樹突細胞可來自患者(即自體樹突細胞)或來自健康個體(MHC匹配的或錯配的)，按上述方法體外處理，進行過繼治療，即體內導入如此操作過的樹突細胞，這種細胞隨后能激活CTL反應。“健康個體”表示總體健康狀況良好的個體，優選具有感受態免疫系統，更優選不患有任何可以方便地測試和檢測的疾病。
因此，本發明的方法包括過繼免疫治療。
優選給患者施用大約103至1011APCs，更優選106至107APCs。APCs優選是DCs。
APCs可以通過任何常規途徑施用。優選通過靜脈內途徑施用APCs。同樣優選的是，將APCs局部施用到病變部位(如腫瘤或局部病毒或細菌感染)。通常，APCs是施用到動脈內的，該動脈供應病變或病變所在的組織。
APCs可以是皮下施用的，以便能夠遷移到淋巴節。
APCs優選是DCs。
可以將所述細胞(或疫苗)提供給用某些其他方法治療過其疾病的患者。因此，盡管可以單獨使用所述治療方法，但優選作為輔助治療使用。
可以在其他治療之前、期間或之后施用諸如DCs的APCs或疫苗。
當要治療的疾病是癌癥時，所述癌癥優選業已、正在或將要用常規療法或手術治療，并且用本發明的治療治療。通常，根據治療方法，通過放療或化療對所述癌癥進行治療。
在上面詳細披露了可能需要免疫反應的癌抗原。
當要治療的疾病是一種病原體感染時，所述感染優選業已、正在或將要用常規療法或手術進行治療。
如果要治療的患者患有HIV感染的話，優選將本發明的方法用作其他治療方法的輔助手段，所述其他治療方法如用諸如AZT或3TC的逆轉錄酶抑制劑治療或聯合治療，例如HART(高活性逆轉錄病毒治療)。
當本發明的方法被用于治療實質性腫瘤時，優選施用DCs或疫苗作為首次手術后治療。
當本發明的方法被用于治療白血病時，優選在放療或化療之后施用DCs或疫苗。如果同樣用DCs同時結合骨髓移植對白血病患者進行治療的話也是優選的。
癌癥治療，例如過繼免疫治療在控制或消除最小殘余病變，而不是減少大病變方面是最有效的。可以想象的是，免疫治療能暫時增加大病變的尺寸，這是因為細胞毒性T-淋巴細胞的流入和組織引流的結果。可以在治療之后監測疾病的程度和體積，但是不能用作正式終點。按常規方法長期隨訪患者，以便確保不會表現出長期的不良影響。
還可以包括以下遞送或導向方法。可以使用對培養物或體內細胞進行由沖擊壓縮空氣驅動的DNA/蛋白包衣的納米顆粒滲透(例如使用BioRad裝置)。用于遞送的結構可能優選具有細胞類型選擇性啟動子。
盡管可以單獨施用本文所披露的治療分子，例如信號傳遞增強劑或抑制劑或構建體或分子，不過優選以與一種或多種可接受的載體一起的藥物制劑形式提供。所述載體必須是“可以接受的”，其含義是與治療分子(可能是核酸或多肽)相容，并且不會損害其受體。通常，所述載體可以是無菌的，并且是無致熱原的水或鹽水。
鼻腔噴霧劑可能是有用的制劑。
所述制劑通常可以以單位劑量形式提供，并且可以通過制藥領域所熟知的任何方法制備。所述方法包括將活性成分(例如，本發明的信號傳遞增強劑或抑制劑，構建體或分子)與構成一種或多種輔助成分的載體結合在一起。一般，所述制劑是通過以下方法制備的將所述活性成分與液體載體或精細分割的固體載體或這兩者均勻而又緊密地結合在一起，然后，如果必要的話，使該產品成型。
適合口服的本發明的制劑可以以獨立的單位形式提供，如膠囊、錠劑或片劑，每一個單位含有預定數量的活性成分；作為粉末或顆粒形式；作為存在于含水液體或無水液體中的溶液或懸浮液形式；或作為水包油液體乳液或油包水液體乳液形式。所述活性成分還可以藥團、糖劑或糊劑形式提供。
片劑可以通過壓縮或模塑制備，可任選與一種或多種輔助成分一起制備。壓縮片劑可以通過在合適的機器中壓縮諸如粉末或顆粒的自由流動形式的活性制劑成分制備，所述活性成分可任選與粘接劑(例如聚乙烯吡咯烷酮，明膠，羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如淀粉乙醇酸鈉，交聯的聚乙烯吡咯烷酮，交聯的羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或分散劑混合。模塑的片劑可以通過在合適的機器中模塑用一種惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀化合物的混合物制備。所述片劑可任選進行包衣或分級，并且配制成能緩慢釋放或受控制地釋放其中的活性成分的形式，例如使用各種比例的羥丙基甲基纖維素，以便提供理想的釋放曲線。
適合于口腔局部施用的制劑包括喉糖錠，包括存在于香味基料，通常是蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠中的活性成分；錠劑，含有存在于諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠的惰性基料中的活性成分；和漱口水，含有存在于合適液體中的載體中的活性成分。
適合腸胃外施用的制劑包括含水和無水無菌注射液，該注射液可以包括抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質，這些成分使得該制劑與預期的受體血液等滲；和含水和無水無菌懸浮液，它可以包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以用單位劑量或多劑量容器形式提供，例如密封的安瓿瓶和管瓶，并且可以在冷凍干燥條件下保存，在即將使用之前，只需要添加注射的無菌液體載體，例如水。可以用上文所述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備臨時注射溶液和懸浮液。
優選的單位劑量制劑是含有每日劑量或單位、每日亞劑量或其適當部分的活性成分的制劑。
應當理解的是，除了上文具體提到的成分之外，所述本發明的制劑還可以包括本領域常見的其他制劑，這些制劑與相關制劑的類型相關，例如，適合口服的制劑可以包括香味劑。
可以理解的是，可以通過任何適合局部施用藥物的方法將治療分子，例如本發明的抑制劑或增強劑或分子或構建體遞送到有關部位。例如，可以將所述構建體的溶液直接注射到所述部位，或者可以通過用輸液泵通過輸液遞送。例如，所述結構還可以結合在可移植的裝置中，該裝置在放置到需要的部位之后，可以將所述構建體釋放到其周圍部位。
例如，所述構建體可以通過水凝膠材料施用。水凝膠是非炎性的和生物可降解的。有多種這樣的材料是已知的，包括由天然和合成聚合物制備的水凝膠。在一種優選實施方案中，所述方法采用這樣一種水凝膠，它在低于體溫的溫度下是液體，但是在體溫或接近體溫的溫度下膠凝形成能保持形狀的半固體水凝膠。優選的水凝膠是環氧乙烷-環氧丙烷重復單元的聚合物。所述聚合物的特性取決于所述聚合物的分子量和聚合物中聚環氧乙烷和聚環氧丙烷的相對百分比。優選的水凝膠包括重量為大約10％-大約80％的環氧乙烷，和重量為大約20％-大約90％的環氧丙烷。特別優選的水凝膠包括大約70％的聚環氧乙烷和30％的聚環氧丙烷。例如，可以使用的水凝膠可以從BASF公司(Parsippany，NJ)，以Pluronic_為商標獲得。
在本實施方案中，將水凝膠冷卻成液體狀態，并且將所述構建體混合到該液體中，使每克水凝膠中核酸的濃度為大約1毫克。然后將所得到的混合物涂敷在要治療的表面，例如在手術期間通過噴霧或涂抹使用，或者使用導管或內窺鏡方法。當所述聚合物變熱時，就固化形成凝膠，并且所述構建體用一定時間從所述凝膠中彌散到周圍的細胞中，所述時間是由所述凝膠的確切配方決定的。
例如，所述構建體可以通過其他植入物施用，所述植入物可以通過商業渠道獲得或披露于科技文獻中，包括脂質體、微膠囊和可植入的裝置。例如，由生物可降解的材料，如聚酐、聚原酸酯、聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物，膠原和蛋白聚合物，或生物不可降解的材料，乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)，聚乙酸乙烯酯，亞乙基乙烯醇，及其衍生物制備的移植物用于遞送所述構建體。可以使用熔融或溶劑蒸發技術將所述構建體以聚合化或固化形式摻入所述材料中，或者與所述材料機械結合。在一種實施方案中，將所述構建體(例如，包括反義寡核苷酸)混合到或涂敷到可植入裝置的包衣上，如葡聚糖包衣的硅珠，支架或導管。
舉例來說，所述構建體的劑量取決于所述構建體的大小及其預期的用途。一般，劑量范圍是根據要治療的組織的表面積計算的。所述構建體的有效劑量可能取決于該構建體的大小和所使用的遞送載體/導向方法，和寡核苷酸的化學組成，不過，合適的劑量可以由熟練的技術人員決定，例如，利用來自上文所述的動物和體外測試系統的數據確定。
例如，所述構建體可以以治療和預防目的給患者系統施用。例如，所述構建體可以通過上述任意一種有效方法施用，例如，腸胃外施用(例如靜脈內、皮下、肌內)或口服，鼻腔或其他方式施用，例如，所述施用方式能夠使所述結構進入患者血液，并且在患者血液中循環。全身施用的構建體優選是作為局部施用的構建體的補充提供的，不過，也可以在不進行局部施用的情況下起作用。
據信，樹突細胞對所述核酸的吸收，以及所編碼的多肽的表達可能是啟動免疫反應的機制。不過，樹突細胞可能是未經轉染的，但是仍然是重要的，因為它們能夠從組織中受轉染的細胞中挑選表達的肽。
優選將諸如DNA疫苗的疫苗用于肌肉中。同樣優選的是，將所述疫苗用在皮膚上或皮膚內。
本發明的另一方面提供了一種能有效抗癌，癌細胞或腫瘤細胞，或抗致病生物或受致病生物感染的細胞的疫苗，包括有效量的上文所述的抗原呈遞作用的信號傳遞增強劑或激活劑，或編碼所述抗原呈遞作用的信號傳遞增強劑或激活劑的核酸。所述疫苗優選還包括具有存在于癌或腫瘤細胞，或致病生物或受致病生物感染的細胞上的表位的抗原(或編碼抗原的多核苷酸)。
例如，本發明提供了能有效抗癌，或癌細胞或腫瘤細胞，或抗致病生物或受致病生物感染的細胞的疫苗，包括有效量的Mal或TIRAP或TollIP，或其片段、變體或融合體，或編碼它們的多核苷酸。所述疫苗優選還包括具有存在于癌細胞或腫瘤細胞，或致病生物或受致病生物感染的細胞上的表位的抗原(或編碼抗原的多核苷酸)。
如果所述疫苗是核酸疫苗的話是特別優選的。在以下文獻中披露了由多核苷酸介導的對癌癥的免疫治療Conry等(1996)Seminarsin Oncology 23，135-147；Condon等(1996)Nature Medicine 2，1122-1127；Gong等(1997)Nature Medicine 3，558-561；Zhai等(1996)J.Immunol.156，700-710；Graham等(1996)Int J.Cancer65，664-670；和Burchell等(1996)pp 309-313 InBreastCancer，Advances in biology and therapeutics，Calvo等(eds)，John Libbey Eurotext，以上文獻均被收作本文參考。
通常，所述核酸疫苗可以包括如上文所述的任何合適的核酸遞送裝置。所述核酸，優選DNA可以是裸露的(即基本上沒有要施用的其他成分)，或者它可以在脂質體中遞送，或作為病毒載體遞送系統的一部分。
所述核酸疫苗可以在不使用佐劑的情況下施用。所述核酸疫苗還可以在使用諸如BCG或明礬的佐劑的情況下施用。其他的合適佐劑包括Aquila’s QS21刺激子(Aquila Biotech，Worcester，MA，USA)，它來自皂苷，分支桿菌提取物和合成的細菌細胞壁模擬物，以及專有佐劑，如Ribi’s Detox。還可以使用另一種皂苷衍生的佐劑QuilA(Superfos，Denmark)。諸如弗氏佐劑的其他佐劑也可以使用。如果所述核酸疫苗是在不使用佐劑的情況下施用的話將是優選的。
本發明的另一方面提供了一種藥物組合物，包括信號傳遞抑制劑或增強劑或MyD88或MyD88多肽，或Mai，TIRAP或TollIP，或通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物的結合配偶體，或編碼所述化合物的多核苷酸，或本發明的組合物或嵌合分子，疫苗或多核苷酸，以及可以藥用的載體。
本發明的另一方面提供了一種殺傷患者體內的能異常表達第一種表位的靶細胞的方法，該方法包括以下步驟(1)從所述患者獲得抗原呈遞細胞(APCs)；(2)離體讓APCs與樹突細胞內的TRR信號傳遞的調節劑，優選抑制劑與編碼APCs的TRR信號傳遞的抑制劑的多核苷酸或表達載體接觸；(3)任選讓所述細胞與所述表位或編碼所述表位的多核苷酸或表達載體接觸，和(4)將如此處理過的APCs重新導入所述患者體內。
在重新導入患者體內之后，所述APCs能刺激細胞毒性T細胞對所述靶細胞的反應。
通常，APCs是樹突細胞。
所述靶細胞可以是癌細胞。
本發明的另一方面提供了一種治療患有癌癥或致病生物感染的患者或具有患這種病的危險的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的抗原呈遞細胞或前體細胞提供(1)如上文所述的TRR信號傳遞的調節劑，優選抑制劑(可以是上文所述的Mai，或TIRAP或TollIP(或其中一種的片段、變體或融合體)；并且它能激活諸如DCs的APCs，例如增強諸如DCs的APCs的抗原呈遞作用)或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑，或(3)MyD88的顯性失活突變體的步驟。
本發明的另一方面提供了一種治療患有自身免疫疾病或移植排斥或具有患這種病的危險的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的抗原呈遞細胞或前體細胞提供(1)如上文所述的TRR信號傳遞的調節劑，優選激活劑(它可以是Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、變體或融合體；并且它能抑制諸如DCs的APCs，例如抑制諸如DCs的APCs的抗原呈遞作用)或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的激活劑，或(3)MyD88的步驟。
本發明的另一方面提供了將(1)將TRR信號傳遞的調節劑，優選抑制劑(它可以是上文所述的Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、變體或融合體)或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑，或(3)MyD88的顯性失活突變體(或編碼它的多核苷酸)用于生產用來治療需要增強抗原呈遞作用和/或患有癌癥或致病生物感染或有患這種病的危險的患者的藥物的用途。
所述藥物優選還包括一種抗原或編碼抗原的多核苷酸。更優選的是，所述藥物包括編碼抗原的多核苷酸和本發明的抑制劑分子或嵌合分子。
另外，所述藥物可以包括通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的合適的化合物。
本發明的另一方面提供了將(1)將TRR信號傳遞的調節劑，優選激活劑(它可以是上文所述的Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、融合體或變體)或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的激活劑，或(3)MyD88(或編碼它的多核苷酸)用于生產用來治療患有自身免疫病或移植排斥或有患這種病的危險的患者的藥物的用途。
所述藥物優選還包括一種抗原或編碼抗原的多核苷酸，更優選的是所述藥物包括編碼抗原的多核苷酸和本發明的抑制劑分子或嵌合分子。
另外，所述藥物可以包括通過本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的合適的化合物。
本發明的另一方面提供了各個部分的試劑盒或組合物或嵌合分子，包括(1)Mal，或TIRAP或TollIP或其片段、衍生物或融合體(其優選形式如上文所述)(或編碼所述部分的多核苷酸)和(2)包括或編碼抗原性分子的抗原性部分。本發明的另一方面提供了將所述各部分的試劑盒或組合物或嵌合分子用于醫學目的的用途。本發明的另一方面提供了包括各部分的試劑盒或組合物或嵌合分子用于生產用來治療需要調節抗原呈遞作用的患者的藥物的用途。
在本發明所述方面的任一部分或兩部分還可以包括如上文所述的轉運部分和/或細胞結合部分。
下面將結合以下的非限定性附圖和實施例對本發明進行說明。


圖1包括Toll和死亡結構域的MyD88的結構MyD88具有包括通過短的接頭與C-末端toll結構域分離的N-末端死亡結構域(DD)的模塊組織。N-末端DD與大約90個氨基酸的基序相關，該基序為FAS/AP01/CD95的細胞質尾和TNF受體所共同擁有，并且已知能介導與其他DD序列的蛋白相互作用，形成同或異二聚體(Boldin M.P.等.J Biol Chem 1995)。這種相互作用構成了建立信號傳遞復合體的基礎，該復合體能激活MAP激酶和轉錄因子NF-κB(Nagata S.Cell 1997)。MyD88 C-末端toll結構域包括大約130個氨基酸，它存在于Toll-相關受體的逐漸增大的家族中，該家族中包括toll-樣，IL-1和IL-18受體。Toll結構域還與蛋白-蛋白相互作用相關。MyD88在酵母中自我締合。示意性地示出了全長的MyD88和MyD88突變體。黑色和灰色三角分別表示死亡結構域和Toll結構域。在死亡結構域(用白色圓圈表示)中包括一個點突變F56N的MyD88用MyD88-1pr表示(援引自Burns等1998 JBC 273 12203)。
圖2toll-樣受體1-5在免疫系統細胞中的表達模式最近，Muzio等.(J Immunol 2000)業已檢查了TLR1-5的表達模式，并且發現TLR1是在免疫系統的細胞中普遍表達的，而TLR2，4和5的表達局限于多型核細胞，單核細胞和樹突細胞。TLR3似乎局限于樹突細胞。
圖3顯性失活(抑制性)MyD88在57A HELA細胞中阻斷反應于IL-1的NF-κB報導基因的激活用NF-κB報導基因穩定轉染過的57A HELA細胞不進行感染，或用編碼一種不相關的蛋白(AdGFP)GFP，IκBα(Ad IκBα)，野生型MyD88的對照腺病毒感染，所述MyD88突變體僅僅已知為MyD88-1pr或MyD88-toll突變體。在一天之后，用20ng/ml TNF或IL-1刺激細胞，并且測定來自NF-κB報導基因的熒光素酶活性。顯性失活(抑制性)MyD88-1pr蛋白的表達可以特異性抑制IL-1，但不能抑制TNF-誘導的NF-κB激活作用，而野生型MyD88像預期的那樣沒有作用。
圖4顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷中反應于IL-1的p38 MAPK，p42/44 MAPK和NF-κB激活作用，以及IκBα降解作用在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal，野生型MyD88或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮膚成纖維細胞(HSF)。在2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1或TNFα刺激所述細胞30分鐘，并且裂解細胞以便提取細胞質和細胞核。通過蛋白印跡分析細胞質提取物中的MyD88，磷酸化的p38和p42/44 MAPK，和IκBα。通過電泳遷移率變動分析(EMSA)分析核NF-κB-DNA結合活性。
圖5顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷IL-1誘導的IL-6在HSF中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal、野生型MyD88或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮膚成纖維細胞(HSF)。2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-6的生產。顯性失活MyD88-1pr的表達可以抑制IL-1誘導的IL-6在人皮膚成纖維細胞中的生產。
圖6顯性失活(抑制劑)或野生型MyD88的表達不會阻斷TNFα-誘導的IL-6在HSF中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal、野生型MyD88或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮膚成纖維細胞(HSF)。2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-8的生產。顯性失活MyD88-1pr的表達可以抑制IL-1誘導的IL-8在人皮膚成纖維細胞中的生產。
圖7顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷IL-1的IL-8在HSF中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal、野生型MyD88或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮膚成纖維細胞。2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml TNFα刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-6的生產。顯性失活MyD88-1pr的表達可以抑制TNFα-誘導的IL-8在人皮膚成纖維細胞中的生產，這表明MyD88是IL-1特異性需要的，而不是TNF信號傳遞途徑所需要的。
圖8顯性失活(抑制劑)或野生型MyD88的表達不會阻斷TNFα-誘導的IL-8在HSF中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal、野生型MyD88或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代人皮膚成纖維細胞(HSF)。2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml TNFα刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-8的生產。顯性失活MyD88-1pr的表達不會抑制TNFα誘導的IL-8在人皮膚成纖維細胞中的生產。這表明MyD88是IL-1特異性需要的，而不是TNF信號傳遞途徑所需要的。
圖9顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中反應于IL-1和LPS的p42/44 MAPK和NF-κB激活，以及IκBα的降解在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal或顯性失活形式的MyD88-1pr的腺病毒感染原代臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。2小時之后清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1小時，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1或1μg/ml LPS刺激所述細胞30分鐘，并且獲得細胞質和細胞核提取物。通過蛋白印跡分析細胞質提取物中的MyD88表達，p42/44 MAPK的磷酸化IκBα的表達。通過電泳遷移率變動分析(EMSA)分析核NF-κB-DNA結合活性。
圖10顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷IL-1-和LPS-誘導的，而不是TNF-誘導的IL-6在HUVEC中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal，野生型MyD88，顯性失活形式MyD88-1pr，IκBα或顯性失活形式的IKK-2的腺病毒感染原代HUVEC。2小時之后，清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1，20ng/ml TNFα或1μg/ml LPS刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-6生產。顯性失活MyD88-1pr的表達能抑制IL-1-和LPS-誘導的IL-6生產，這表明它是toll-相關受體的特異性抑制劑。IκBα和顯性失活IKK-2也能抑制IL-6生產，因為它們作用于toll-相關受體信號傳遞途徑中的MyD88的下游。TNF-誘導的IL-6生產沒有受到阻斷，因為沒有涉及到MyD88。不過，IKK-2和IκBα也能被TNF-R信號傳遞途徑所利用。
圖11顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能阻斷IL-1-和LPS-誘導的，而不是TNF-誘導的IL-8在HUVEC中的生產在無血清RPMI中用編碼對照蛋白β-gal，野生型MyD88，顯性失活形式MyD88-1pr，IκBα或顯性失活形式的IKK-2的腺病毒感染原代HUVEC。2小時之后，清除病毒，并且將所述細胞在5％FCS RPMI中培養1天，以便使表達發生。然后，用20ng/ml IL-1，20ng/ml TNFα或1μg/ml LPS刺激所述細胞24小時，收集上清液，并且通過ELISA分析IL-8生產。顯性失活MyD88-1pr的表達能抑制IL-1-和LPS-誘導的IL-8生產，這表明它是toll-相關受體的特異性抑制劑。IκBα和顯性失活IKK-2也能抑制IL-8生產，因為它們作用于toll-相關受體信號傳遞途徑中的MyD88的下游。TNF-誘導的IL-8生產沒有受到抑制，因為沒有涉及到MyD88。不過，IKK-2和IκBα也能被TNF-R信號傳遞途徑所利用。
圖12顯性失活(抑制劑)MyD88在樹突細胞中的表達具有相反的作用它能誘導NF-κB激活在50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用沒有插入片段的對照腺病毒(Ad0)和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88-1pr)感染所述細胞。使用100的感染復數。在表達6小時和24小時之后，裂解細胞，并且通過EMSA檢查其核提取物的NF-κB DNA結合活性。令人吃驚的是，顯性失活MyD88的表達能誘導它自身的NF-κB激活，這與以前的發現完全相反。
圖13顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達能誘導它自身的TNFα，并且不會抑制LPS-誘導的TNFα在樹突細胞中的生產在50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4中培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用編碼β-gal的對照腺病毒(Adβ-gal)，編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)或編碼野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)感染所述細胞。業已證實Adtoll是無功能的，并且應當被忽視。使用100的感染復數。24小時之后用100ng/ml LPS刺激細胞。令人吃驚的是，在沒有其他刺激的情況下，顯性失活MyD88的表達能誘導樹突細胞自身產生TNFα。另外，它不能抑制LPS-誘導的TNFα，這一發現與以前的發現完全相反。
圖14野生型MyD88的表達破壞了MyD88-1pr(顯性失活)-誘導的TNFα在樹突細胞中的生產用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用編碼β-gal的對照腺病毒(Adβ-gal)，編碼野生型MyD88(AdMyD88wt)的腺病毒和編碼顯性失活MyD88(Adlpr)的腺病毒感染所述細胞。在某些場合下，使用比例為1∶1和1∶5的Adlpr和Adβ-gal或AdMyD88wt的雙重感染。對于單一感染來說使用100的感染復數。24小時之后，用100ng/ml LPS刺激細胞。令人吃驚的是，在沒有其他刺激的情況下，顯性失活MyD88的表達能誘導樹突細胞自身產生TNFα。另外，它不能抑制LPS-誘導的TNFα生產，這一發現與以前的發現完全相反。
圖15顯性失活MyD88在樹突細胞中的表達能增強抗原特異性T細胞增殖用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用沒有插入片段的對照腺病毒(Ad0)，編碼作為原型抗原的綠色熒光蛋白的腺病毒(AdGFP)，和編碼與顯性失活MyD88連接在一起的GFP的腺病毒(AdGFP-1pr)感染所述細胞。48小時之后，用2×104抗原特異性T細胞培養分級劑量的樹突細胞，并且在第3天測定增殖。通過表達顯性失活MyD88增強了向樹突細胞中遞送抗原GFP誘導的抗原特異性T細胞增殖。這一結果與我們的意外結果吻合，即在樹突細胞而不是人皮膚成纖維細胞或HUVEC中抑制MyD88的活性，能誘導樹突細胞激活。
圖16顯性失活MyD88在樹突細胞中的表達增強了同種異體混合的淋巴細胞(MLR)用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用沒有插入片段的對照腺病毒(Ad0)和編碼顯性失活形式的MyD88的腺病毒(Adlpr)感染所述細胞。48小時之后，用1×105同種異體T細胞培養分級劑量的樹突細胞，并且在第6天測定增殖。顯性失活MyD88的表達增強了同種異體T細胞增殖，這一發現表明增強了DC抗原呈遞作用。
圖17顯性失活MyD88在樹突細胞中的表達增強了共刺激分子(CD80，CD86)的表達用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養5天之后，由外周血單核細胞制備出不成熟的DC。然后，不對所述細胞進行感染，或者在無血清培養基中用編碼GFP的對照腺病毒和編碼顯性失活形式的MyD88的腺病毒(Adlpr)感染所述細胞。48小時之后，收集樹突細胞，并且對CD80和CD86進行染色，它們是有效的抗原呈遞功能所必需的兩種非常重要的共刺激分子。顯性失活形式的MyD88的表達增強了CD80和CD86的細胞表面表達，這表明增強了樹突細胞抗原呈遞功能。
圖18顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達能誘導p38 MAPK磷酸化在5％FCS RPMI中，通過添加100ng/ml M-CSF用2-3天時間由外周血單核細胞分化人巨噬細胞。然后，不對所述細胞進行感染，在無血清培養基中用編碼β-gal的對照腺病毒感染，或用編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。如圖所示，使用100的感染復數(或在一種情況下使用50的感染復數)。在6，24和48小時之后，裂解細胞，并且通過蛋白印跡和磷酸-p38 MAPK-特異性抗體分析提取物中的p38 MAPK活性。出人意料的是，顯性失活MyD88的表達在人巨噬細胞中誘導了p38 MAPK活性。
圖19顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達能誘導IRAK磷酸化在5％FCS RPMI中，通過添加100ng/ml M-CSF用2-3天時間由外周血單核細胞分化人巨噬細胞。還使用了在5％FCS RPMI中培養的HELA細胞。不對這兩種類型的細胞進行感染，在無血清培養基中用編碼β-gal的腺病毒編碼野生型MyD88，或編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用100的感染復數。在5分鐘或12小時之后，裂解細胞，并且通過蛋白印跡分析提取物中的IRAK和磷酸-IRAK。在HELA細胞中，發現顯性失活MyD88(MyD88-1pr)的表達能抑制IL-1-誘導的IRAK的激活。不過，出人意料的是，顯性失活MyD88的表達能在人巨噬細胞中誘導了IRAK活性，通過添加LPS不能提高這種活性。這一發現表明，MyD88活性同樣是在巨噬細胞中(而不是在HELA細胞中)抑制IRAK磷酸化的抑制信號所必需的，并且其抑制作用導致了IRAK的激活。
圖20顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達能誘導IκBα磷酸化在5％FCS RPMI中，通過添加100ng/ml M-CSF用2-3天時間由外周血單核細胞分化人巨噬細胞。在無血清培養基中用編碼β-gal的對照腺病毒和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染細胞。使用100的感染復數。在24小時之后，裂解細胞，并且通過蛋白印跡分析提取物中磷酸-IRAK。出人意料的是，顯性失活MyD88的表達能在人巨噬細胞中誘導了IκBα活性磷酸化。
圖21顯性失活MyD88而不是野生型MyD88在巨噬細胞中能在沒有任何刺激的情況誘導TNFα，IL-6和IL-8生產在5％FCS RPMI中，通過添加100ng/ml M-CSF用2-3天時間由外周血單核細胞分化人巨噬細胞。然后，不對所述細胞進行感染，在無血清培養基中用編碼β-gal的對照腺病毒感染，用編碼野生型MyD88的腺病毒感染或用編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用100的感染復數。(a)在48小時之后，收集上清液，并且在不進行任何進一步刺激的情況下，分析TNFα，IL-6和IL-8細胞因子的生產。可以在表達顯性失活MyD88的細胞中檢測到細胞因子生產，但不能在表達野生型MyD88的細胞或對照細胞中檢測。這表明，與在樹突細胞中類似而與HSF或HUVEC不同，阻斷巨噬細胞中MyD88的活性，能導致細胞的激活，并釋放炎性細胞因子。(b)在表達0小時，4小時，24小時和48小時之后，收集上清液，并且通過ELISA分析TNF，IL-6和IL-8。只表示了來自超量表達顯性失活MyD88(MyD88-1pr)的細胞的結果，對照細胞或表達野生型MyD88的細胞具有本底水平的細胞因子生產。
實施例1人類細胞中Toll-樣受體信號傳遞材料和方法1.試劑人類重組GM-CSF和TNFα分別是由Glenn Larsen博士(GI)和DTracey博士(BASF)饋贈的。人類重組IL-4是從R&D系統(Minneapolis，USA)購買的，而IL-1是由Hoffman La Roche饋贈的。LPS是從Sigma化學公司(St Louis，USA)獲得的。
2.外周血單核細胞的制備通過對來自健康志愿者(North London Blood TransfusionService，Colindale，UK)的白細胞提取物殘余物進行密度離心，獲得外周血單核細胞(PBMC)。用HBSS將肝素化的殘余物稀釋2倍，并且將25ml稀釋液小心鋪放到裝在50ml無菌試管中的等體積的Ficoll-Hypaque lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)上，然后在室溫下以2000rpm的速度離心30分鐘。在離心之后，收集界面層，并且用HBSS洗滌2次(以2000rpm的速度離心10分鐘)。然后收集PBMC，并且重新懸浮在30ml的含有5％FCS的RPMI中。
3.外周血T細胞和單核細胞的分離外周血T細胞和單核細胞是通過在Beckman JE6淘析離心機中進行細胞-細胞分離之后從PBMC中分離的。淘析是在含有1％FCS的RPMI的(淘析介質)中進行的。通過流式細胞術評估淋巴細胞和單核細胞純度，使用抗CD45，CD3，CD14和CD19的熒光染料偶聯的抗人單克隆抗體(Becton Dickinson，Oxford，UK)。T淋巴細胞級份通常含有約80％CD3-表達細胞，約6％CD19-表達細胞和＜1％CD14-表達細胞。單核細胞級份通常包括＞85％CD14-表達細胞，＜0.5％CD19細胞和＜3％CD3-表達細胞。
4.為了進行腺病毒感染，用M-CSF分化單核細胞為了優化腺病毒感染，以1×106細胞/ml的密度在含有100ng/ml的M-CSF(Genetics Institute，Boston，USA)的10厘米培養皿(Falcon，UK)中培養新淘析的單核細胞。在2-3天之后，用PBS洗滌所述細胞，以便除去非貼壁細胞，而其余的貼壁單核細胞用10ml解離溶液(Sigma，UK)在37℃下孵1小時。用含有5％FCS的RPMI洗滌細胞懸浮液2次，并且通過臺盼蘭排阻評估細胞存活力(90％)。通過FCS染色發現處于這一時期的細胞99％是CD14陽性的，并且以1×106/ml的密度在24孔或48孔平底組織培養平板(Falcon，UK)上培養，以便作進一步的實驗。
5.單核細胞向樹突細胞的分化以1×106細胞/ml的密度將新淘析的單核細胞放在裝在10厘米培養皿(Falcon，UK)中的添加了50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的5％FCS RPMI中培養5-6天。在第3天，補充細胞因子。與直接由血液或骨髓前體分化樹突細胞相比，該方法具有若干優點。除了簡單和能提供大量細胞之外，它能產生具有穩定的“不成熟DC”表型的均勻的細胞群體。通過添加TNFα(10ng/ml)，LPS(100ng/ml)或單核細胞條件培養基(50％v/v)可以使該表型成熟，再用2-3天時間形成DC。
6. 57A和未轉染過的HELA，HUVEC和HSF
57A HELA細胞是由R.Hay(University of St Andrews，UK)慷慨饋贈的，并且在5％FCS，1％青霉素/鏈霉素DMEM中維持。按以前披露的方法(Jaffe EA等.(1973).J Clin Invest 522745-8)分離人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，并且在存在10％FCS 10％NCS，1％青霉素/鏈霉素，15μg/ml內皮生長添加劑(Sigma，Poole，UK)和50IU/ml肝素的條件下在RPMI中維持。原代人皮膚成纖維細胞(HSF)是從裝在T-75組織培養燒瓶中的5％FCS，1％青霉素/鏈霉素的DMEM中培養的，從包皮環切樣品獲得的。
8.腺病毒載體及其繁殖編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Adβ-gal)的重組復制缺陷型腺病毒載體或不具有插入片段(Ad0)的腺病毒載體是由A.Byrnes博士和M.Wood博士的(Oxford University，UK)。GFP-表達腺病毒(AdGFP)是通過AdTrack與由B.Vogelstein教授(The Howard Huges MedicalInstitute，Baltimore，USA)提供的AdEasy-1腺病毒質粒的雙重組制備的。AdMyD88wt和AdMyD881pr是用由Xu博士(University ofTexas，Southwestern)和K.Burns博士(Lausanne，Switzerland)提供的質粒產生的。具體地講，將pAdTrackCMV用于AdMEKK-1wt，而對于AdMyD88wt和AdMyD881pr來說，使用被稱為AdTrack.CMVKS17的pAdTrack.CMV載體衍生物。pAdTrack.CMVKS17是通過以下方法構建的去除AdTrack.CMV的EcoRI位點及其多克隆位點(MCS)，并且插入載體pBCSK(+)(Stratagene)的較大的多克隆位點。重組病毒是在BJ5183細菌細胞中產生的，所述細胞通過熱激方法用1μg線性化的pAdTrack.CMV-MEKK1wt，AdTrack.CMVKS17-MyD88wt或AdTrack.CMVKS17-My881pr構建體和100ng復制缺陷型腺病毒載體pAdEasy-1轉化過的。通過其對卡那霉素的抗性篩選陽性重組克隆。在選擇之后，將DNA提取物用于在293人胚胎腎細胞中進行病毒繁殖。通過用兩種氯化銫梯度進行超速離心純化病毒，正如He等.(He T.C.等.(1998).Science 2811509-12)所披露的。通過以下方法在HEK293細胞中通過噬斑分析確定滴度和病毒原種在無血清DMEM培養基(Gibco BRL)中處理1小時，然后覆蓋(1.5％)瓊脂(2×DMEM，含有4％FCS)混合物(v/v1∶1)，并且孵育10-14天(He T.C.等.(1998).Science2811509-12)。
9.細胞的腺病毒感染收集M-CSF-分化的巨噬細胞和不成熟的或成熟的樹突細胞，計數并且重新鋪平板。然后，在無血清RPMI中用能表達感興趣的基因的復制缺陷型腺病毒感染所述細胞。對于巨噬細胞和不成熟的DC來說使用50-100的感染復數，而對于成熟的DC來說使用150-300的感染復數。2小時后，清除病毒，并且在完全培養基中再培養細胞1-2天，以便能表達感興趣的蛋白。然后，將其用于進一步實驗。
類似地，在無血清培養基中感染57A HELA，HUVEC和HSF 2小時。使用40-100的感染復數。然后，清除病毒，重新添加完整的培養基，并且將細胞再培養1-2天。
10.抗原特異性T細胞系的建立綠色熒光蛋白是從Clontech購買的。為了建立抗原特異性多克隆T細胞系，用1μg/ml綠色熒光蛋白(抗原)培養1×106 PBMC/ml 7天時間，然后用20ng/ml的I L-2再培養10-14天。每隔4天補充IL-2。由此導致了抗原特異性T細胞的擴增，和存在于PBMC中的大多數其他細胞群體的細胞死亡。在培養17-21天之后，采用一個再刺激步驟，包括在沒有IL-2的條件下，以1∶1的比例用輻射過的自體PBMC和新鮮抗原培養T細胞。在4天之后，添加IL-2再培養10-14天。在將抗原特異性T細胞用于進一步實驗之前，將該再刺激循環重復至少4次。
11.抗原特異性T細胞的增殖實驗為了評估抗原特異性T細胞系的特異性，在96孔平底微量滴定板上用1×105輻射過的自體PBMC和各種濃度的抗原培養1×105抗原特異性T細胞。3天之后，用[3H]胸苷脈沖細胞過夜，并且在次日收獲。
為了測定樹突細胞誘導的抗原特異性T細胞增殖，用分級劑量的刺激過的或絲裂霉素處理過的樹突細胞培養1×105抗原特異性T細胞，所述細胞是未脈沖過的，用抗原脈沖過的，未感染過的或腺病毒感染過的。2天之后，測定[3H]-胸苷的摻入。所有抗原特異性增殖實驗都重復進行3次。
12.混合的淋巴細胞反應(MLR)為了分析未輻射過的或輻射過的(3000拉德，來自137Cs源)DC的免疫刺激能力，將未感染過的和腺病毒感染過的DC以分級的劑量與1×105淘析過的同種異體T細胞一起放在96孔平底微量滴定板(Falcon)中培養，有4個重復。在第5天，在用[3H]胸苷脈沖16小時(0.5μCi/孔；Amersham Life Science，UK)之后，通過胸苷摻入測定增殖。
13.細胞因子分析用腺病毒載體感染細胞2小時，然后再培養2天，以便使相關的蛋白能超量表達。在對所述細胞進行刺激24小時之后，收集培養上清液，并且保持冷凍。通過標準的2或3層夾心ELISA技術，使用TNFα，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12和IFNγ的特異性單克隆和多克隆抗體測定細胞培養上清液中細胞因子含量。用于所述分析的抗體對和標準物是從Pharmingen購買的，只有IL-2試劑例外。它是由GeneticsInstitute(Boston，USA)饋贈的。
14.免疫熒光染色和流式細胞術為了進行FACS染色，首先收獲細胞。對于需要表面受體完整的貼壁細胞來說，在37℃下使用溶解在PBS溶液中的熱的2％EIDTA 20分鐘。在將細胞溶解到溶液中之后，對它進行1次洗滌，然后重新懸浮在冰冷的FACS洗滌緩沖液中。隨后的所有培養都是在4℃下進行。對每一種分析來說，將5×105細胞與相關的抗原特異性抗體或同種型對照一起孵育30分鐘，然后用FACS洗滌緩沖液洗滌2次。然后通過流式細胞術檢查所述細胞。可以在FACScan流式細胞計(Becton和Dickinson)上通過使用CellQuest(Becton Dickinson)分析細胞。直接與HLA-DR，HLA-A，B，C，CD80，CD86，CD3，CD14和CD25偶聯的單克隆抗體是從Pharmingen購買的(San Diego，USA)。
15.細胞質蛋白提取物的制備制備細胞質提取物，以便通過蛋白印跡研究與信號傳遞相關的生物化學事件。將貼壁細胞從組織培養平板/燒瓶上刮至新鮮PBS中，并且通過離心收獲(在4℃下以13000g的速度離心10秒)。通過類似的離心方法使非貼壁細胞沉淀，并且用新鮮PBS洗滌1次。在棄掉上清液之后，根據要裂解的細胞的數量(每1×106個細胞50-100μl)添加合適量的冰冷低滲裂解緩沖液(Whiteside S.T.等(1992)。NucleicAcids Res 201531-8)。在冰上孵育10分鐘之后對裂解物進行離心(13000g，5分鐘，4℃)，以便除去細胞核和細胞碎片。然后將澄清的裂解液取出放入新的試管中，冷凍，并且在-20℃下保存，以便隨后估算蛋白濃度，并用于蛋白印跡分析。
16.核蛋白提取物的制備制備核蛋白提取物，是為了研究NF-κB激活，以及從細胞質向細胞核的轉運，及其DNA結合能力。在裂解緩沖液(見第部分)中裂解細胞之后，通過離心使細胞核沉淀(在4℃下以13000g的速度離心5分鐘)，用低滲裂解緩沖液洗滌1次，以便除去污染性細胞質蛋白，然后重新懸浮在高滲提取緩沖液中，在4℃下攪拌培養1-2小時。低滲裂解緩沖液抑制了在裂解期間蛋白從細胞核中滲出，而高滲提取緩沖液使得核膜穿孔，使核蛋白能夠進入溶液。在離心之后(在4℃下以13000g的速度離心10分鐘)，將含有核蛋白的上清液取出放入新的試管，并且在-70℃下保存。這種核提取物制備方法基于Whiteside S.T.等的方法((1992).Nucleic Acids Res 201531-8)。
17.免疫沉淀為了免疫沉淀IRAK，在4℃下在柔和振蕩的條件下將細胞質提取物與3μg抗-IRAK抗體一起孵育。然后添加50μl的50％漿液蛋白G瓊脂糖(Amersham)，并且再振蕩2小時。然后，收集與蛋白G瓊脂糖結合的IRAK，洗滌4次，重新懸浮在蛋白印跡加樣緩沖液中，煮沸5分鐘，然后馬上用于蛋白印跡分析。
18.蛋白濃度分析在將細胞質或細胞核提取物用于任何進一步的實驗方法(例如蛋白印跡分析，電泳遷移率變動分析)之前，必須測定其蛋白濃度，以便確保在每一份樣品中存在相同量的蛋白。通過Bradford分析評估蛋白濃度。簡單地講，將20μl適當稀釋過的提取物連同20μl被用作標準物的一系列濃度在10-1000μg/ml范圍內的BSA(Sigma，UK)一起添加到96孔組織培養平板上，共三份。然后向每一個孔中添加200μlBradford試劑，并且在分光光度計(Multiscan Bichromatic，Labsystems)上在595nm的波長下測定吸收值。根據由各種BSA濃度制備的線性標準曲線確定細胞質和細胞核提取物中的蛋白含量。
19.蛋白印跡和電泳遷移率變動分析通過在10％(w/v)聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE分離細胞質蛋白，然后電轉移到硝酸纖維素膜上。分別用從Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，USA)和Upstate Biotechnology(USA)購買的抗體檢測IκBα和IRAK，而通過從New England Biolabs購買的抗體檢測磷酸化形式的IκBα，p38和p42/44 MAPK。
20.熒光素酶分析在LPS刺激之后，用PBS洗滌細胞1次，并且用100μl的CAT裂解緩沖液(0.65％(v/v)NP40，10mM Tris-HCL pH 8，0.1mM EDTApH8，150mM NaCl)裂解。將細胞裂解液(50μl)轉移到發光計樣品槽條的孔中，并且添加熒光素酶分析緩沖液(220μl)。用Labsystem發光計通過在每個分析點上分配30μl熒光素(1.5mM，Sigma，Poole，UK)測定熒光素酶活性。通過Bradford分析測定細胞裂解物的蛋白濃度，并相應調整測定的熒光素酶活性。
結果Myd88是含有toll和死亡結構域細胞質蛋白(圖1)，它與TRR成員TLR(圖2)和IL-1受體的信號傳遞機制相關。在N-末端含有53個氨基酸缺失和Phe56Asn突變的Myd88的突變蛋白Myd881pr(圖1)能夠在Hela細胞(圖3)和人皮膚成纖維細胞(圖4)中起IL-1的抑制劑作用，但不能起NF-κB的TNF激活(圖3和4)和MAPK激活(圖4)的抑制劑作用。與該結果吻合的是，當Myd881pr在所述細胞中表達時，同樣能抑制IL-1誘導的IL-6在人皮膚成纖維細胞中的生產(圖5)。相反，Myd88本身能誘導IL-6生產，而無需任何IL-1激活(圖5和6)。相反，Myd881pr對TNF誘導的IL-6在HSF中的生產沒有任何影響(圖6)。這一結果是預料中的，因為Myd88不參與TNF信號傳遞。當Myd881pr在人皮膚成纖維細胞中表達時，也能抑制IL-1(圖7)但不能抑制TNF誘導的IL-8(圖8)生產。Myd881pr的抑制作用并不局限于人皮膚成纖維細胞，正如在用AdMyd881pr轉染的HUVECs進行研究所證實的。IL-1和LPS-誘導的NF-κB激活和p42/44 MAPK激活(圖9)以及IL-6和IL-8生產(圖10和11)也受到抑制。與以上結果不同，我們驚奇地發現，當在不成熟的DC中表達時，Myd881pr激活了NF-κB(圖12)，而不需要任何額外的刺激。另外，Myd881pr的表達能夠誘導不成熟的DC產生TNF(圖13)，而與HSF不同，Myd88沒有作用(圖13)。Myd881pr在DC中的激活作用受到了Myd88的拮抗，這表明這兩種類型競爭相同的信號傳遞途徑(圖14)。正如用GFP抗原特異性T細胞進行的研究(圖15)或在同種異體MLR(圖16)中所證實的，Myd881pr的激活作用翻譯成了DC的增強了的抗原呈遞功能。DC的抗原呈遞功能與諸如CD80和CD86的共刺激分子在DC表面的表達的上調相關。與該刺激作用吻合的是，發現當Myd881pr在不成熟的DC中表達時能增強CD80和CD86的表達(圖17)。Myd881pr的激活作用不局限于NF-κB，因為Myd881pr在另一種潛在的APC即MCSF-人巨噬細胞中的表達，導致了p38 MAPK(圖18)和IRAK(圖19)的激活。相反，但是與圖3所示的以前用Hela細胞進行的研究吻合，Myd881pr抑制了IL-1誘導的IRAK磷酸化(圖19)。因為對于DC來說，Myd881pr還誘導了人MCSF巨噬細胞中IκBα磷酸化(圖20)，并且誘導或增強了人巨噬細胞的TNF，IL-6和IL-8的生產(圖21)。
討論Toll相關受體包括Toll樣受體(TLR)，它是跨膜受體蛋白，它具有包括富含亮氨酸的重復的細胞蛋白，該重復能識別LPS-LBP-CD14復合體，并具有一個細胞質結構域(Toll結構域)，該結構域還存在于IL-1R和相關分子的細胞內部分中(Gay NJ and Keth FH，Rock F等1997)。TRR通常使用信號傳遞成分，如Myd88，IRAK和TRAF6。具體地講，Myd88與TRR一樣，也包括Toll結構域，它通過同型相互作用與所述受體的Toll結構域締合在一起。Myd88還具有一個死亡結構域，它通過該結構域與IRAK締合，并因此將TRR與細胞內信號傳遞途徑連接在一起。以前業已證實，顯性失活Myd88的表達抑制了293細胞中IL-1和LPS信號傳遞(Mujio等1998)，并且同時抑制了細胞因子釋放和MAPK/NF-κB激活。在人皮膚微血管內皮細胞中以及在原單核細胞系THP-1中獲得了類似結果(Zhang FX等1999)，其中，顯性失活Myd88的瞬時超量表達阻斷了IL-1和LPS-誘導的NF-κB激活。
Myd88剔除小鼠不能誘導LPS-依賴型TNFα生產(Kawai等1999)。不過，盡管剔除了IL-1和IL-18誘導的MAPK和NF-κB激活，在鼠類Myd88-1-巨噬細胞中所述途徑的LPS-誘導的激活似乎正常，只是略微推遲了一點。
我們業已利用有效的腺病毒基因轉移技術檢查了TRRs在人原代細胞中的作用，以便超量表達野生型(Myd88wt)或Myd88突變蛋白，或Myd881pr(圖1)。正如由Burns等(1998)以前的研究所預料的，Myd881pr能夠阻斷HSF，HUVECs和Hela細胞中的信號傳遞。另外，Myd881pr阻斷了HUVECs中的LPS信號傳遞。Myd881pr的抑制作用包括諸如NF-κB和MAPK的信號傳遞分子的激活和細胞因子生產。正如所預料的，TNF信號傳遞途徑未受影響。另外，在HSF中，Myd88wt能夠誘導細胞因子生產，而無需任何額外的刺激。不過，出乎意料的是，我們發現將Myd881pr導入不成熟的DC和MCSF巨噬細胞，導致了NF-κB，MAPK的激活和細胞因子生產。另外，在DC中，共刺激分子CD80和CD86的表達主要與所述APC的抗原呈遞功能相關，通過Myd881pr上調了所述功能。作為上述作用的結果，Myd881pr的表達大大增強了DC的抗原呈遞功能。
以上結果意味著，在DC和巨噬細胞中，TRR信號傳遞的抑制能導致所述細胞的激活。這表明，可能存在TRR，其作用是抑制APC，特別是抑制DC功能。這種推測得到了以下發現的部分支持，即Myd881pr的刺激作用受到了Myd88wt的同時表達的抑制。另外，與Hela細胞不同，在Hela細胞中Myd881pr能抑制IRAK激活，而在巨噬細胞中，Myd881pr能誘導這種激酶的激活。
除了對給我們對TRR信號傳遞的理解增加了一層新的復雜性，以及所述受體對調控細胞功能具有何種作用之外，以上結果業已揭示了一種與控制抗原呈遞活性相關的新的途徑。該途徑可用于對免疫系統進行治療性調節，用于自身免疫病和過敏的預防和治療，并且還可用于需要刺激免疫系統的場合，如用于免疫接種。所述途徑的發現可能對疫苗設計和免疫調節方法在總體上產生重大影響。
編號的參考文獻1.Rock等(1998)PNAS 95，588-5932.O’Neill & Dinarello(2000)Immunol Today 21，206-2093.Poltorak等(1998)Science 282，2085-20884.Underhill等(1999)Nature 401，811-8155.Burns等(1998)JBiol Chem 273，12203-122096.Kawai等(1999)Immunity11，115-1227.Takeuchi等(2000)Int Immunol 163，978-9848.Du等(2000)Eur Cytokine Netw 11，362-371實施例2樹突細胞培養物來自正常志愿者的示例性樹突細胞培養物將CD14+外周血單核細胞貼在組織培養燒瓶上，并且在存在1％AB血清，GM-CSF(400ng/ml)和IL-4(400IU/ml)的條件下培養7天。由此得到了具有DC形態的細胞，并且平均49％的細胞具有CD1a+標記，它是能攝取并呈遞抗原的不成熟的DC形式的標記。然后通過添加TNFα(15ng/ml)使所述細胞成熟成CD83+細胞，這使得DC向細胞毒性T-細胞呈遞抗原。7％的細胞在1天內成為CD83+，不過，要獲得最大效果至少需要3天時間。可以用單核細胞條件培養基取代1％AB血清，不過這樣做可能不太理想。
來自癌癥患者的示例性樹突細胞在挽救性化療之前和之后從患有復發的轉移性疾病的6位患者體內制備DC(一共12個外周血液樣品，每個樣品50ml)。
臨床研究按照標準方法由患者捐獻一個單位的自體血液。在獻血之前，由輸血服務醫生對患者進行評估。以與同種異體獻血相同的方式對自體獻血進行篩選，尋找常見病毒標記(HIV，HBV，HCV和梅毒)，并且在對詢問患者是否愿意參與之后得到了患者的同意。這種預防措施保護臨床和實驗室職員免受潛在感染，并且防止常規血液供應受到可能交叉污染的可能性。將血液采集到常見的方形包裝袋中，這能使得紅細胞，血塊黃色層和血漿自動分離。血塊黃色層產生了大約670×106單核白細胞，使用現有技術它能提供大約47×106DC。每位患者使用8-128×106DC的劑量。將外周血單核細胞分成兩份，并且用TRR信號傳遞抑制劑(例如MyD881pr，選擇性地與細胞攝取促進劑一起使用)和抗原性肽或腫瘤細胞提取物脈沖1-10天。另外，讓外周血單核細胞接觸DNA疫苗構建體，例如編碼TRR信號傳遞抑制劑(例如MyD881pr)和編碼抗原性肽的腺病毒構建體，并且培養10天，可以多次接觸所述疫苗。與同種異體AB血清相比，優選使用無血清培養條件或自體血漿。合并培養的DCs，洗滌，并且重新懸浮在100ml鹽水中，然后用1小時輸液。自體紅細胞濃縮物不再送回到患者體內，而是進行標準臨床指示。按照良好的生產操作方法，實施離體的DC培養方法。
此時，捐獻最初血液樣品的患者業已接受了挽救性化療，并且可能或不可能處在臨床緩解中。其他患有復發性轉移疾病的患者在接受化療之前接受治療。有兩套治療方案(1)轉移性復發，標準治療，然后進行過繼免疫治療；(2)轉移性復發，過繼免疫治療，然后進行標準治療。
產品輸液是在有經驗的醫生的直接監督下，在白天在病房里的病床上進行的，在這里，如果必要的話可以得到搶救和支持性護理設施。
權利要求
1.一種增強抗原呈遞作用的方法，包括給諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選抑制劑的步驟。
2.一種抑制抗原呈遞作用的方法，包括給諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選增強劑的步驟。
3.一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選抑制劑的步驟。
4.一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選增強劑的步驟。
5.如上述權利要求中任意一項的方法，其中TRR信號傳遞的調節劑，增強劑或抑制劑能調節細胞外分子與TRR的結合。
6.如上述權利要求中任意一項的方法，其中TRR信號傳遞的調節劑，增強劑或抑制劑能調節細胞內分子與TRR的結合。
7.如上述權利要求中任意一項的方法，其中TRR信號傳遞的調節劑，增強劑或抑制劑能調節MyD88與TRR的結合。
8.如上述權利要求中任意一項的方法，其中TRR信號傳遞的調節劑，增強劑或抑制劑能調節MyD88與包括死亡結構域(DD)的多肽的結合。
9.一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑的步驟。
10.如權利要求1-4，8或9中任意一項的方法，其中所述抑制劑是MyD88的顯性失活突變體。
11.一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供MyD88的顯性失活突變體的步驟。
12.如權利要求1-4，8-11中任意一項的方法，其中所述抑制劑或顯性失活突變體是MyD88lpr。
13.一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的增強劑的步驟。
14.如權利要求2，4，6，7，8或13中任意一項的方法，其中所述增強劑是MyD88。
15.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述調節劑，增強劑或抑制劑或顯性失活突變體是在細胞中或患者中表達的。
16.如權利要求15的方法，其中，給所述患者或細胞施用能夠在細胞中或患者中表達所述調節劑，增強劑或抑制劑或顯性失活突變體的多核苷酸。
17.如權利要求16的方法，其中，所述多核苷酸是以腺病毒載體形式施用的。
18.一種鑒定作為抗原呈遞作用的抑制劑的化合物的方法，包括鑒定能夠調節，優選激活諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或所述細胞的前體中TRR信號傳遞的化合物。
19.一種鑒定作為抗原呈遞作用的增強劑的化合物的方法，包括鑒定能夠調節，優選抑制諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞或所述細胞的前體中TRR信號傳遞的化合物。
20.如權利要求18或19的方法，其中，TRR信號傳遞的激活或抑制是通過觀察MyD88與相互作用分子的相互作用的改變檢測的。
21.一種鑒定作為抗原呈遞作用的抑制劑或增強劑的化合物的方法，包括以下步驟將測試化合物暴露于存在于抗原呈遞細胞或其前體中的MyD88或MyD88的結合配偶體，和確定所述化合物是否能結合MyD88或MyD88的結合配偶體。
22.如權利要求22的方法，其中，所述MyD88的結合配偶體是TRR或包括DD的多肽。
23.將存在于抗原呈遞細胞中的MyD88(或另一種接頭分子，例如TIRAP或Mal或TollIP)或MyD88或其他接頭分子的結合配偶體用于鑒定抗原呈遞作用的抑制劑或增強劑的方法中的用途。
24.通過權利要求18-22中任意一項的本發明的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物。
25.將通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物用于醫學的用途。
26.將存在于抗原呈遞細胞或其突變體中的MyD88的結合配偶體或編碼它的多核苷酸用于醫學的用途。
27.將通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物或存在于抗原呈遞細胞或其突變體中的MyD88的結合配偶體用于生產用來治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者的藥物的用途。
28.將Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的抑制劑或編碼它的多核苷酸用于醫學的用途。
29.將Toll-相關受體(TRR)信號傳遞的增強劑或編碼它的多核苷酸用于醫學的用途。
30.將直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的增強劑或抑制劑或編碼它的多核苷酸用于醫學的用途。
31.用于醫學的MyD88的組成型活性突變體或顯性失活突變體或編碼它的多核苷酸。
32.一種重組多核苷酸，包括(1)一個編碼如權利要求1-10，12-14中任意一項所限定的信號傳遞抑制劑或增強劑，或如權利要求11，12，26中任意一項所限定的MyD88的結合配偶體或MyD88多肽，或通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物的部分(調節部分)，和(2)一個編碼抗原性分子的部分。
33.如權利要求32的重組多核苷酸，其中所述抗原性分子包括一個存在于轉化過的或癌細胞上的或存在于致病性生物上的，或存在于受致病性生物感染的細胞上的表位。
34.一種各部分的試劑盒、組合物、或嵌合分子，包括(1)一個包括如權利要求1-10，12-14中任意一項所限定的調節劑、信號傳遞抑制劑或增強劑，或如權利要求11，12，26中任意一項所限定的MyD88的結合配偶體或MyD88多肽，或通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物的調節部分(或編碼所述調節部分的多核苷酸)，和(2)一個包括如權利要求32或33所限定的抗原性分子的抗原性部分(或編碼所述抗原性部分的多核苷酸)。
35.一種調節患者的抗原呈遞作用的方法，包括以下步驟(1)從所述患者獲得抗原呈遞細胞或其前體，優選樹突細胞或其前體；(2)離體讓所述抗原呈遞細胞與如權利要求1-10，12-14中任意一項所限定的調節劑，信號傳遞抑制劑或增強劑，或如權利要求11，12，26中任意一項所限定的MyD88的結合配偶體或MyD88多肽，或通過通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物(或編碼它們的多核苷酸)接觸，并且任選與需要針對它的免疫反應的抗原接觸；或與權利要求32-34中任意一項限定的嵌合分子或多核苷酸接觸；和(3)將如此處理過的抗原呈遞細胞重新導入所述患者體內。
36.一種能有效抗癌，或癌細胞或腫瘤細胞，或抗致病生物或受致病生物感染的細胞的疫苗，包括有效量的如權利要求1-10，12-14中任意一項所限定的信號傳遞抑制劑，或如權利要求11，12，26中任意一項所限定的MyD88的結合配偶體或MyD88多肽，或通過通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物，或編碼它們的多核苷酸。
37.如權利要求36的疫苗，還包括具有存在于癌細胞或腫瘤細胞，或致病生物或受致病生物感染的細胞上的表位的抗原(或編碼該抗原的多核苷酸)。
38.如權利要求36或37的疫苗，其中，所述疫苗是核酸疫苗。
39.一種藥物組合物，包括如權利要求1-10，12-14中任意一項所限定的調節劑，信號傳遞抑制劑或增強劑，或如權利要求11，12，26中任意一項所限定的MyD88的結合配偶體或MyD88多肽，或通過通過權利要求18-22中任意一項的篩選方法鑒定的或可以鑒定的化合物，或編碼它們的多核苷酸，或權利要求34的組合物或嵌合分子或權利要求36-38中任意一項的疫苗，或權利要求32的多核苷酸，以及可以藥用的載體。
40.一種殺傷患者體內的錯誤表達第一種表位的靶細胞的方法，該方法包括以下步驟(1)從所述患者獲得諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞；(2)離體讓所述抗原呈遞細胞與抗原呈遞細胞中的TRR信號傳遞的調節劑，優選抑制劑接觸，或者與編碼抗原呈遞細胞中TRR信號傳遞的抑制劑的多核苷酸或表達載體接觸；(3)任選讓所述細胞與所述表位或編碼所述表位的多核苷酸或表達載體接觸，和(4)將如此處理過的抗原呈遞細胞重新導入所述患者。
41.如權利要求40的殺傷患者體內的靶細胞的方法，其中，所述靶細胞是癌細胞。
42.一種治療患有癌癥或致病生物感染或具有患這些病的危險的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供(1)TRR信號傳遞的抑制劑或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑，或(3)MyD88的顯性失活突變體的步驟。
43.一種治療患有自身免疫病或移植排斥或過敏或具有患這些病的危險的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供(1)TRR信號傳遞的調節劑，優選激活劑，或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的調節劑，或(3)MyD88的步驟。
44.將(1)TRR信號傳遞的調節劑，優選抑制劑，或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的抑制劑，或(3)MyD88的顯性失活突變體(或編碼它們的多核苷酸)用于生產用來治療需要增強抗原呈遞作用和/或患有癌癥或致病生物感染和/或與致病形式的蛋白生產相關的疾病，如阿爾茨海默病或海綿狀腦病或具有患這些病的危險的患者的藥物的用途。
45.將(1)TRR信號傳遞的調節劑，優選激活劑，或(2)直接與MyD88相關的信號傳遞步驟的激活劑，或(3)MyD88(或編碼它們的多核苷酸)用于生產用來治療需要患有自身免疫病或移植排斥或具有患這些病的危險的患者的藥物的用途。
46.如權利要求44或45的用途，其中，所述藥物還包括一種抗原或編碼抗原的多核苷酸。
47.用于醫學目的如權利要求39所述的藥用組合物，多核苷酸，嵌合分子或疫苗。
48.將如權利要求39所述的藥用組合物，多核苷酸，嵌合分子或疫苗用于生產用來治療需要抑制或增強抗原呈遞作用的患者的藥物的用途。
49.一種治療需要增強抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Mal或TIRAP或TollIP的步驟。
50.一種治療需要抑制抗原呈遞作用的患者的方法，包括給所述患者或所述患者的諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞，或前體細胞提供Mal或TIRAP或TollIP，或其片段、融合體或變體的步驟。
51.一種鑒定作為諸DC的APC的抗原呈遞作用的抑制劑或增強劑的化合物的方法，包括以下步驟讓一種測試化合物暴露于TRR相互作用分子(接頭分子)或所述接頭分子的APC結合配偶體(即存在于諸DC的APC，或其前體中的接頭分子的結合配偶體)接觸，和確定所述化合物是否能夠結合所述接頭分子或所述接頭分子的APC結合配偶體。
52.如權利要求51的方法，其中，所述接頭分子是Mal或TIRAP或TollIP。
53.一種各部分的試劑盒或組合物或嵌合分子，包括(1)Mal或TIRAP或TollIP或其片段、衍生物或融合體(或編碼所述部分的多核苷酸)和(2)包括或編碼一種抗原性分子的抗原性部分。
54.用于醫學的權利要求53的各部分的試劑盒或組合物或嵌合分子。
55.將權利要求53的各部分的試劑盒或組合物或嵌合分子用于生產用來治療需要調節抗原呈遞作用的患者的藥物的用途。
56.一種能有效抗癌，或癌細胞或腫瘤細胞，或抗致病生物或受致病生物感染的細胞的疫苗，包括有效量的Mal或TIRAP或TollIP或其片段、變體或融合體，或編碼它們的多核苷酸。
57.如權利要求56的疫苗，還包括具有存在于癌細胞或腫瘤細胞，或致病生物或受致病生物感染的細胞上的表位的抗原(或編碼該抗原的多核苷酸)。
58.如權利要求56或57的疫苗，其中，所述疫苗是核酸疫苗。
全文摘要
一種增強抗原呈遞作用的方法，包括給諸如樹突細胞的抗原呈遞細胞、或前體細胞提供To11－相關受體(TRR)信號傳遞調節劑，優選抑制劑的步驟。一種抑制抗原呈遞作用的方法，包括以給諸如樹突細胞、或前體細胞的抗原呈遞細胞提供To11－相關受體(TRR)信號傳遞的調節劑，優選增強劑的步驟。TRR信號傳遞的抑制劑可以是MyD88的顯性失活突變體，例如MyD881pr。
文檔編號A61K39/39GK1649618SQ01822685
公開日2005年8月3日 申請日期2001年12月21日 優先權日2000年12月22日
發明者B·M·J·福克斯維爾, M·費爾德曼 申請人:辛諾維斯有限公司