專利名稱：免疫調節性多核苷酸及其使用方法
技術領域：
本發明涉及包含免疫刺激性寡核苷酸序列(ISS)的免疫調節性多核苷酸。本發明也涉及施用該多核苷酸來調節免疫應答。
背景技術：
針對感染或其它抗原性攻擊所產生的免疫應答的類型通常可通過參與該應答的T輔助(Th)細胞亞群而區分。Th1亞群負責經典的細胞介導功能，如遲發型超敏反應和細胞毒T淋巴細胞(CTL)的活化，而Th2亞群作為B細胞活化的輔助細胞更為有效。針對抗原的免疫反應類型通常受細胞因子影響，其中所述細胞因子由細胞響應抗原而產生。Th1和Th2細胞所分泌的細胞因子的不同被認為可以反映這兩種亞群的不同生物功能。參見如Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Immunol.859-18。
Th1亞群尤其適于響應病毒感染、胞內病原體和腫瘤細胞，因為該亞群分泌可活化CTL的IL-2和IFN-γ。Th2亞群更適于響應自由生活的細菌和腸道寄生蟲并可介導變態反應，因為IL-4和IL-5已知可分別誘導IgE產生和嗜酸性粒細胞活化。總之，Th1和Th2細胞有不同的細胞因子分泌模式，故一類反應可調節另一類反應的活性。例如，Th1/Th2平衡的遷移可導致變態反應，或導致增強的CTL反應。
對于許多感染性疾病如結核病和瘧疾，Th2-類反應幾乎無針對感染的保護作用。提議使用衍生自靶抗原和其它目前所使用的抗原劑的小肽作為疫苗可避免使用具潛在感染性的完整病毒粒子，但這不總能引起達到治療效果所需的免疫反應。缺乏有效治療人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗是這種失敗的一個不幸例子。基于蛋白質的疫苗一般誘導Th2-類免疫反應，其特征在于高滴度的中和抗體但無顯著的細胞介導的免疫。
而且，一些類型的抗體反應在某些適應征中是不合適的，最明顯的是在變態反應中IgE抗體反應可導致過敏性休克。通常變態反應也涉及到Th2-類免疫反應。變態反應(包括變應性哮喘)的特征在于早期反應和晚期反應，其中早期反應發生在暴露變應原后的數秒至數分鐘內且特征在于細胞脫粒，晚期反應發生在4至24小時后且特征在于嗜酸性粒細胞浸潤變應原暴露位點。具體而言，在變態反應的早期，變應原與嗜堿性粒細胞和肥大細胞上的IgE抗體交聯，結果引發肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫粒和接下來的組胺和其它炎癥介質釋放。在晚期反應期間，嗜酸性粒細胞浸潤變應原暴露位點(在此處導致組織損傷和功能障礙)。
變應性疾病的抗原免疫治療包括皮下注射小量，但漸增量的抗原。此類免疫治療存在誘發IgE-介導的過敏反應的危險性并且不能有效解決晚期變應反應中細胞因子-介導的事件。因此至今，該方法只取得了有限的成功。
某些DNA序列(通常稱作免疫刺激性序列或＂ISS＂)的施用可誘導偏向于Th1-類的免疫反應，這一點可通過Th1-相關細胞因子的分泌而說明。免疫刺激性多核苷酸與抗原一起施用能導致針對所施用抗原的Th1-類免疫反應。Roman等人(1997)自然醫藥(Nature Med.)3849-854。例如，皮內注射于鹽水或佐劑明礬中的大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(β-Gal)的小鼠產生特異性IgG1和IgE抗體以及分泌IL-4和IL-5而非IFN-γ的CD4+細胞進行反應，表明這些T細胞主要為Th2亞群的。但是，皮內注射(或使用齒狀皮膚抓涂器施與)編碼β-Gal并含有ISS的質粒DNA(在鹽水中)的小鼠產生IgG2a抗體和分泌IFN-γ而非IL-4和IL-5的CD4+細胞，表明這些T細胞主要為Th1亞群的。而且，注射質粒DNA的小鼠的特異性IgE產生降低66-75％。Raz等人(1996)美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)935141-5145。總之，針對裸DNA的免疫反應的特征在于抗原刺激的CD4+T細胞產生IL-2、TNF-α和IFN-γ，這表明為Th1-類反應。在治療變態反應和哮喘時這尤其重要，這一點通過減少的IgE產生即可證實。免疫刺激性多核苷酸刺激Th1-類免疫反應的能力已通過細菌抗原、病毒抗原和變應原得以證明(參見如WO 98/55495)。
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ISS通常包括CG序列。ISS中CG側翼的核苷酸也似乎在該多核苷酸的免疫調節活性中起作用。仍需要繼續鑒定ISS以用于免疫調節性多核苷酸中。
此處引用的所有專利、專利申請和出版物全部并入本文作為參考。
本發明的公開本發明涉及免疫刺激性序列(ISS)、包含ISS的免疫調節性多核苷酸以及使用這些多核苷酸調節個體尤其是人的免疫反應的方法。
在一個方面，本發明提供了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調節性多核苷酸。在某些實施方案中，本發明包括含有本發明的免疫調節性多核苷酸和可藥用賦形劑的組合物。
在一個方面，本發明的免疫調節性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)的序列的ISS，式中X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且該式不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在另一方面，本發明的免疫調節性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)的序列的ISS，式中Z為5-溴胞嘧啶，X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且該式不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5溴胞嘧啶)。
在另一方面，本發明的免疫調節性多核苷酸包含至少一個如下序列TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)，GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)，CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
在另一方面，相對于此處公開的任何ISS，本發明的免疫調節性多核苷酸還可包含一個或多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，優選地位于ISS的5′(或上游)。
在另一方面，相對于此處公開的任何ISS，本發明的免疫調節性多核苷酸還可包含一個或多個TCGA和/或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
在另一方面，本發明的免疫調節性多核苷酸是經穩定化處理的。
在另一方面，本發明提供了免疫調節性多核苷酸/微載體復合體，其包含本發明的免疫調節性多核苷酸和與之連接的微載體，特別是尺寸小于10μm的微載體。
在另一方面，本發明提供了包含此處描述的任何免疫調節性多核苷酸(包括與微載體復合的免疫調節性多核苷酸)的組合物。組合物也可包含如可藥用賦形劑或許多其它組分中的任一種，如抗原。
在另一方面，本發明提供了調節個體免疫反應的方法，包括將本發明的免疫調節性多核苷酸以足以調節所述個體的免疫反應的量施與該個體。根據本發明方法的免疫調節可在個體身上應用，其中所述個體包括那些患有Th2-類免疫反應相關疾病(如變態反應或變態反應-誘導的哮喘)的個體，接受疫苗如治療性疫苗(如包含變態反應表位、分枝桿菌(mycobacterial)表位或腫瘤相關表位的疫苗)或預防性疫苗的個體，患有癌癥的個體，以及患有感染性疾病的個體。
在再一方面，本發明提供了增加個體的γ-干擾素(IFN-γ)(或刺激個體的IFN-γ水平(或量))的方法，包括將有效量的本發明免疫調節性多核苷酸施與個體。本發明免疫調節性多核苷酸的施用可提高個體的IFN-γ。這些方法的合適受試者包括那些可從IFN-γ升高而受益的個體，或患有特發性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射引發的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲病引發的肝纖維化)、腎纖維化以及其它可通過施用IFN-γ而改善的疾病的個體。
在再一方面，本發明提供了提高個體的α-干擾素(IFN-α)(或刺激個體的IFN-α水平(或量))的方法，包括將有效量的本發明免疫調節性多核苷酸施與個體。本發明免疫調節性多核苷酸的施用可提高個體的IFN-α。這些方法的合適受試者包括那些患有病毒感染以及其它可通過施用IFN-α或提高IFN-α的量而改善的疾病的個體。
在另一方面，本發明提供了改善感染性疾病的一種或多種癥狀的方法，其包括將有效量的本發明免疫調節性多核苷酸施與患有感染性疾病的個體。本發明免疫調節性多核苷酸的施用可改善感染性疾病的一種或多種癥狀。可根據本發明治療的感染性疾病包括由于細胞病原體引起的感染性疾病(如分枝桿菌病、瘧疾、利什曼病、弓形體病、血吸蟲病或支睪吸蟲病)，并且可包括或不包括病毒性疾病。
本發明還涉及試劑盒，優選地用于實施本發明方法的試劑盒。本發明的試劑盒通常包含本發明的免疫調節性多核苷酸(通常在合適的容器中)，并且還可包含例如當個體患有Th2-類免疫反應相關疾病(如變態反應或變態反應-誘導的哮喘)，當個體接受疫苗如治療性疫苗(如包含變態反應表位、分枝桿菌表位或腫瘤相關表位的疫苗)或預防性疫苗，當個體患有癌癥或患有感染性疾病時使用免疫調節性多核苷酸對個體進行免疫調節的說明書。還可提供其它合適的說明。
實施本發明的方式我們發現了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調節性多核苷酸以及使用這些免疫調節性多核苷酸調節個體尤其是人的免疫反應的方法。本發明的組合物包含含有此處所述的ISS的免疫調節性多核苷酸。本發明的某些免疫調節性多核苷酸還包括至少一個TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列。在一些免疫調節性多核苷酸中，該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產生。我們發現包含特異性ISS的免疫調節性多核苷酸可以有效地調節免疫細胞，包括人細胞。我們的發現尤其令人感興趣，因為人細胞對免疫調節性多核苷酸的免疫調節作用較來自常用實驗動物如小鼠的細胞更具抵抗性。我們也觀察到本發明的一些多核苷酸能有效地刺激IFN-α，甚至在人細胞中也是如此。
本發明也提供了通過向個體施用本發明的免疫調節性多核苷酸來調節個體免疫反應的方法。
本發明還提供了包含本發明的含有ISS的多核苷酸的試劑盒。這些試劑盒還可包含施用本發明免疫調節性多核苷酸對個體進行免疫調節的說明書和免疫調節性多核苷酸。
一般技術本發明的實踐除非另有說明，均采用本領域內常規的分子生物學技術(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學技術。此類技術在文獻中有充分的說明，如分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯1984)；動物細胞培養(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney編輯，1987)；實驗免疫學手冊(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir&C.C.Blackwell編輯)；用于哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene TransferVectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller&M.P.Calos編輯，1987)；分子生物學最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR聚合酶鏈反應(PCRThe PolymeraseChain Reaction)，(Mullis等人編輯，1994)；免疫學最新技術(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人編輯，1991)；免疫試驗手冊(The Immunoassay Handbook)(D.Wild編輯，Stockton Press NY，1994)；生物結合技術(Bioconjugate Techniques)(Greg T.Hermanson編輯，Academic Press，1996)；以及免疫學分析方法(Methods of ImmunologicalAnalysis)(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines編輯，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定義本文中，除非另外指出，單數形式的＂a＂，＂an＂和＂the＂包括復數形式。如＂an＂ISS包括一個或多個ISS。
本文中可互換使用的術語＂多核苷酸＂和＂寡核苷酸＂包括單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)、修飾的寡核苷酸和寡核苷或其組合。寡核苷酸可為線形或環狀構型，或寡核苷酸可同時包含線形和環狀區段。寡核苷酸為核苷的聚合物，其中核苷通常通過磷酸二酯鍵連接，但在寡核苷酸中也可使用其它的鍵接如硫代磷酸酯。核苷由與糖鍵接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)或它們的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或它們的衍生物)堿基組成。在DNA中這四種核苷單元(或堿基)稱為脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。核苷酸為核苷的磷酸酯。
術語＂ISS＂如此處所用是指實現體外、體內和/或離體測定中可測量的免疫反應和/或對其有貢獻的多核苷酸序列。可測量的免疫反應的實例包括但不限于抗原特異性抗體的產生、細胞因子分泌、淋巴細胞群如NK細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞等的活化或擴增。優選地，ISS序列優先活化Th1-類反應。本發明中使用的多核苷酸包含至少一個ISS。如此處所用，＂ISS＂也是含有ISS的多核苷酸，包括本發明的含有ISS的免疫調節性多核苷酸的縮寫術語。
術語＂3通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一個區域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區域或位置的3′(下游)。
術語＂5通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一個區域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區域或位置的5′(上游)。
＂鄰近＂另一序列的區域、部分或序列直接與那個區域、部分或序列毗連。例如，免疫調節性多核苷酸中鄰近ISS部分的其它多核苷酸序列直接與那個區域毗連。
術語＂免疫調節性多核苷酸＂或＂IMP＂或＂含有ISS的多核苷酸＂如此處所用，是指包含至少一個ISS的多核苷酸。在某些實施方案中，IMP為ISS。
術語＂免疫調節的＂或＂調節免疫反應的＂如此處所用包括免疫刺激和免疫抑制作用。免疫調節主要是在總體免疫反應中質的改變，雖然量的改變也可與免疫調節相連而發生。根據本發明受到免疫調節的免疫反應將朝向＂Th1-類＂免疫反應轉移而背離＂Th2-類＂免疫反應。Th1-類反應一般被認為是細胞免疫體系的(如細胞毒淋巴細胞)反應，而Th2-類反應通常為＂體液的＂，或基于抗體的反應。Th1-類免疫反應通常的特征在于對抗原的＂遲發型超敏＂反應，并可在生物化學水平通過Th1-相關細胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-β及IL-6水平的上升而檢測到，雖然IL-6也可與Th2-類反應相關。Th1-類免疫反應通常與細胞毒淋巴細胞(CTL)的產生和低水平或短暫的抗體產生相關。Th2-類免疫反應通常與較高水平的抗體產生(包括IgE產生)、無或極少的CTL產生和Th2相關細胞因子如IL-4的表達有關。因此，本發明的免疫調節作用可通過例如本發明方法治療的個體與未治療的個體相比IFN-γ的升高和/或IgE產生的降低而認知。
術語＂偶聯物＂是指含有ISS的多核苷酸與抗原連接的復合體。此類偶聯物的連接包括共價和/或非共價連接。
術語＂抗原＂是指被抗體或被T細胞抗原受體特異性識別并結合的物質。抗原可包括肽、蛋白質、糖蛋白、多糖、復合糖、糖類、神經節苷脂、脂類和磷脂；其部分和其組合。抗原可為自然中存在的抗原或可為合成的。適于與ISS一起施用的抗原包括任何可引發B細胞或T細胞抗原特異性反應的分子。優選地，抗原引發特異針對該抗原的抗體反應。半抗原包括在＂抗原＂的范圍內。半抗原為本身無免疫原性的低分子量化合物，但當它與含抗原決定簇的免疫原性分子偶聯時產生免疫原性。小分子可能需要被半抗原化以產生抗原性。優選地，本發明的抗原包括肽、脂類(如固醇類、脂肪酸和磷脂)、多糖(如在流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)疫苗中使用的多糖)、神經節苷脂和糖蛋白。
＂佐劑＂是指這樣的物質，當其加入免疫原性劑如抗原中時可非特異增強或加強受者宿主暴露于該混合物后對該免疫原性劑的免疫反應。
術語＂肽＂為具有足以實現生物反應如抗體產生或細胞因子活性的長度和組成的多肽，而不管該肽是否為半抗原。一般，肽長至少為6個氨基酸殘基。術語＂肽＂還包括修飾的氨基酸(天然或非天然存在的)，此類修飾包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化(pegylation)、脂化和甲基化。
＂抗原肽＂可包括純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質、粗蛋白提取物、減毒或滅活病毒、細胞、微生物、或此類肽的片段。＂抗原肽＂或＂抗原多肽＂因此指顯示出一種或多種抗原特性的全部或部分多肽。這樣，如＂Amba1抗原多肽＂或＂Amba1多肽抗原＂為來自Amba1的顯示抗原特性(即特異性結合抗體或T細胞受體)的氨基酸序列，不管其是否為全長序列、序列的一部分和/或序列的修飾物。
＂遞送分子＂或＂遞送載體＂為利于、允許和/或增加免疫調節性多核苷酸遞送至特定位點和/或在特定時間遞送的化學部份。遞送載體可以或不可以額外刺激免疫反應。
＂針對抗原的變態反應＂是指這樣的免疫反應，其通常的特征在于產生嗜酸性粒細胞和/或抗原特異性IgE以及它們所導致的作用。如本領域熟知的那樣，IgE結合肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE受體。當隨后暴露于IgE所識別的抗原時，該抗原將與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE交聯，引起這些細胞脫粒，包括但不限于釋放組胺。應了解并認識到在本發明一些方法的應用中，術語＂針對抗原的變態反應＂、＂變態反應＂和＂變應性疾病＂同等地適用。而且，應了解并認識到本發明的方法包括那些同樣適用于防止變態反應及治療已存在的變應性疾病的方法。
如此處所用，術語＂變應原＂是指暴露于受試者后可引起變態反應的抗原或分子的抗原性部分，通常為蛋白質。一般地受試者如通過水皰和潮紅試驗或任一本領域已知的方法所指出的那樣對變應原具變應性。即使受試者中只有少數亞群在暴露于分子后顯示出變應性(例如IgE)免疫反應，該分子也被稱為變應原。許多分離的變應原為本領域公知。它們包括但不限于此處表1中所提供的變應原。
術語＂脫敏＂是指給顯示出敏感性的受試者施用漸增劑量的變應原的方法。用于脫敏的變應原劑量的實例為本領域公知，參見如Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31111-127。
＂抗原特異的免疫治療＂是指涉及到抗原并可對免疫反應產生抗原特異性調節的任何免疫治療形式。在變態反應中，抗原特異性免疫治療包括但不限于脫敏治療。
術語＂微載體＂是指不溶于水的微粒組合物，其尺寸小于約150、120或100μm，優選地小于約50-60μm，優選地小于約10μm，優選地小于約5、2.5、2或1.5μm。微載體包括＂毫微載體＂，其為尺寸小于約1μm，優選地小于約500nm的微載體。微載體包括固相粒子如由生物相容的天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的粒子，但此處定義的微載體及其它本領域公知的可生物降解材料可包括或不包括由瓊脂糖或交聯瓊脂糖形成的微載體。用于本發明的微載體可以為可生物降解的或不可生物降解的。不可生物降解的固相微載體由在哺乳動物生理條件下不易蝕的和/或不可降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯、聚丙烯、硅石、陶瓷、聚丙烯酰胺、金、膠乳、羥基磷灰石、葡聚糖以及鐵磁性和順磁性材料。可生物降解的固相微載體可由在哺乳動物生理條件下可降解的聚合物(如聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)及其共聚物)或易蝕的聚合物(例如，聚(原酸酯如3，9-二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]十一烷(DETOSU))，或聚(酐類)如癸二酸的聚(酐類))形成。微載體也可為液相(例如，基于油或酯的液相)，如脂質體、無抗原的iscom(免疫刺激復合體，其為膽固醇、磷脂和具有佐劑活性的皂甙的穩定復合體)或在水包油或油包水乳液中的微滴或微膠粒。可生物降解的液相微載體通常摻入可生物降解的油，它們中的一些為本領域公知，包括鯊烯和植物油。微載體一般為球狀，但偏離球狀的微載體也是可接受的(如橢圓形、棒狀等)。鑒于微載體的不可溶性(相對于水)，它們可從水和基于水的(含水的)溶液中過濾出來。
術語＂不可生物降解的＂如此處所用是指在正常的哺乳動物生理條件下不被降解或腐蝕的微載體。通常，如果微載體在正常的人血清中37℃孵育72小時后不被降解(即其質量或平均聚合物長度的損失小于5％)，則認為它不可生物降解。
如果微載體在正常的哺乳動物生理條件下可降解或易蝕，則認為它是＂生物可降解的＂。通常，如果微載體在正常的人血清中37℃孵育72小時后被降解(即其質量或平均聚合物長度至少損失5％)，則認為它可生物降解。
微載體的＂尺寸＂通常為廠商所陳述的粒子的＂設計尺寸＂或預期尺寸。尺寸可直接測定如測定平均或最大直徑，或通過間接試驗如過濾篩選試驗測定。微載體尺寸的直接測定一般通過顯微鏡及與已知大小的粒子比較或參照測微計而實施，其中所述顯微鏡通常為光學顯微鏡或掃描電鏡(SEM)。由于微載體在生產過程中在尺寸上可產生小的差異，因此當實測值顯示為聲明的測量值的約±5-10％時，認為微載體具有所述大小。尺寸特征也可通過動態光散射或暗化技術測定。另外，微載體的尺寸也可通過過濾篩選試驗測定。如果至少97％的粒子能通過具有所述大小的＂篩式＂濾器(即滯留粒子位于濾器表面的濾器，如聚碳酸酯或聚醚砜濾器，它們不同于將滯留粒子容納于濾器內的＂深度濾器＂)，則微載體小于所述大小。如果至少約97％的微載體粒子被具有所述大小的篩式濾器滯留，則微載體大于所述大小。這樣，至少約97％的尺寸為約10μm至約10nm的微載體能通過10μm孔的篩式濾器而被10nm篩式濾器滯留。
如上述討論中所指出的，談到微載體尺寸或尺寸范圍時隱含包括所述尺寸和/或尺寸范圍的近似變異值和近似值。當談及尺寸和/或尺寸范圍時，術語“約”的使用反應了這一點，并且當談及尺寸或尺寸范圍時沒提及“約”并不指該尺寸和/或尺寸范圍是精確的。
術語＂免疫調節性多核苷酸/微載體復合體＂或＂IMP/MC復合體＂是指含有ISS的多核苷酸和微載體的復合體。復合體的組分可共價或非共價連接。非共價連接可通過任何非共價結合力介導，包括疏水作用、離子(靜電)鍵、氫鍵和/或范德華引力。當為疏水連接時，該連接通常通過與IMP共價連接的疏水部分(如膽固醇)來實現。
＂個體＂為脊椎動物，如鳥，并優選為哺乳動物，更優選為人。哺乳動物包括但不限于人、靈長類、農畜、體育用動物、嚙齒動物和寵物。
物質的＂有效量＂或＂足夠量＂是足以實現有益或所需結果(包括臨床結果)的量，因而＂有效量＂取決于應用它的上下文。在施用可調節針對共施用抗原的免疫反應的組合物的上下文中，免疫調節性多核苷酸和抗原的有效量為足以實現調節的量，其中所述調節是與單獨施用抗原時所達到的免疫反應相比而言的。有效量可在一次施用或多次施用中施與。
術語＂共施用＂如此處所用是指在足夠接近的時間內施用至少兩種不同的物質以調節免疫反應。優選地，共施用是指同時施用至少兩種不同的物質。
＂刺激＂反應或參數包括引起和/或增強該反應或參數。例如＂刺激＂免疫反應如Th1反應是指增強該反應，這可通過引發該反應和/或增強該反應產生。同樣地，＂刺激＂細胞因子或細胞類型(如CTL)是指細胞因子或細胞類型的量或水平的升高。
＂與IgE相關的疾病＂為生理學疾病，其特征部分在于升高的IgE水平，這可為持續性的或可為非持續性的。IgE相關疾病包括但不限于變態反應和變應性反應、變態反應相關疾病(如下所述)、哮喘、鼻炎、結膜炎、風疹、休克、膜翅目昆蟲叮咬引起的變態反應和藥物變態反應、以及寄生蟲感染。該術語也包括這些疾病的相關表現。通常，在此類疾病中IgE為抗原特異的。
＂變態反應相關疾病＂是指由抗原特異性IgE免疫反應的結果導致的疾病。此類結果可包括但不限于低血壓和休克。過敏反應是變態反應相關疾病的一個例子，在過敏反應期間，組胺釋放入循環，引起血管舒張及毛細血管通透性增加，結果導致循環中血漿的顯著丟失。過敏反應可為全身性發生，整個身體都經歷相關的影響，也可為局部發生，反應局限于特異的靶組織或器官。
術語＂病毒性疾病＂如此處所用是指病毒作為致病因子的疾病。病毒性疾病的實例包括乙型肝炎、丙型肝炎、流感、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和帶狀皰疹。
如此處所用及本領域所熟知的，＂治療＂為用于獲得有益或所需結果(包括臨床結果)的方法。為了本發明的目的，有益或所需臨床結果包括但不限于減輕或改善一種或多種癥狀、減輕疾病的程度、穩定(即不加重)疾病的狀態、防止疾病的擴散、延遲或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、以及緩解(部分或全部)疾病，無論其是可檢測的或是不可檢測的。＂治療＂也可指與不接受該治療時的預期存活期相比延長存活。
疾病的＂減輕＂是指與不治療該疾病相比，疾病或病狀的程度和/或不想要的臨床表現得以減輕和/或疾病進展的時程減慢或延長。尤其在變態反應中，正如本領域技術人員熟知的，減輕可在調節針對變應原的免疫反應后發生。而且，減輕不一定會在施用一劑后發生，它往往在施用一連串的劑量后產生。因此，足以減輕反應或疾病的量可一次或多次施用。
通過施用免疫調節性多核苷酸和抗原“引發”的＂抗體效價＂或＂抗體量＂是指施用免疫調節性多核苷酸和抗原后在某一時間點測定到的特定抗體的量。
＂Th1相關抗體＂為其產生和/或增高與Th1免疫反應相關的抗體。如IgG2a為小鼠Th1相關抗體。為了本發明目的，Th1相關抗體的測定可為對一種或多種此類抗體的測定。如對人而言，Th1相關抗體的測定可能需要對IgG1和/或IgG3進行測定。
＂Th2相關抗體＂為其產生和/或增高與Th2免疫反應相關的抗體。如IgG1為小鼠Th2相關抗體。為了本發明目的，Th2相關抗體的測定可為對一種或多種此類抗體的測定。如對人而言，Th2相關抗體的測定可能需要對IgG2和/或IgG4進行測定。
＂抑制＂或＂阻止＂功能或活性如細胞因子產生、抗體產生或組胺釋放是指與除了目標條件或參數外的其它相同條件比較或備選地與另一條件比較時功能或活性的降低。例如，與如僅用抗原時誘導的組胺釋放相比，抑制組胺釋放的包含免疫調節性多核苷酸和抗原的組合物可減少組胺釋放。作為另一實例，與如僅用抗原時產生的抗體的程度和/或水平相比，抑制抗體產生的包含免疫調節性多核苷酸和抗原的組合物可降低抗體的程度和/或水平。
如此處所用，術語＂包含＂及其同族術語取它們包括在內的意思，即等同于術語＂包括＂及其相應的同族詞。
本發明的組合物本發明提供了用于調節個體免疫反應的免疫刺激性序列(ISS)和免疫調節性多核苷酸(IMP)。每一免疫調節性多核苷酸包含至少一個免疫刺激性序列(ISS)。
本發明的組合物可以僅包含免疫調節性多核苷酸(或兩種或多種免疫調節性多核苷酸的組合)，或可以包含免疫調節性多核苷酸與另一免疫調節劑如肽、抗原(見下述)和/或其它佐劑的聯合。本發明的組合物可包含免疫調節性多核苷酸和可藥用賦形劑。可藥用賦形劑，包括緩沖劑，為本領域熟知。RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，MackPublishing(2000)。
包含抗原、本發明的免疫調節性多核苷酸和任選地佐劑的組合物在施用后，可導致針對抗原的免疫反應增強，并由此較僅包含ISS和抗原的組合物導致增強的免疫反應。佐劑為本領域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明礬(鋁鹽)、脂質體和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合適的佐劑還包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細胞壁制品、單磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及衍生物、及免疫刺激復合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激復合物、以及基于脂的佐劑和此處描述的其它佐劑。對于獸用及在動物體內產生抗體，可使用弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)的促有絲分裂成分。
本發明含有ISS的多核苷酸可與其它的治療結合來治療特定的適應征。例如，除了包含含有ISS的多核苷酸外，本發明的組合物也可包含抗瘧疾藥如氯喹用于瘧疾患者、包含殺利什曼原蟲藥如戊烷脒和/或別嘌呤醇用于利什曼病患者、包含抗分枝桿菌藥如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇用于結核病患者、包含變應原脫敏劑用于特應性(變態反應)患者。
如此處所述，本發明的組合物可包括含有ISS的多核苷酸并還可包括一種或多種其它的免疫治療劑(即通過免疫系統起作用的試劑和/或來自免疫系統的試劑)，其中所述免疫治療劑包括但不限于細胞因子、佐劑和抗體。治療性抗體的實例包括在癌癥中使用的抗體(如抗腫瘤抗體)，如下所述。
免疫調節性多核苷酸根據本發明，免疫調節性多核苷酸包含至少一個ISS，并可包含多個ISS。在多核苷酸中多個ISS可相互鄰近，或被其它核苷酸堿基分開，或相重疊。在某些實施方案中，免疫調節性多核苷酸由ISS組成。
ISS在本領域已有描述，且ISS易于用指示免疫反應各方面(如細胞因子分泌、抗體產生、NK細胞活化和T細胞增殖)的標準試驗來鑒定。參見如WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等人(1995)自然(Nature)374546-549；Yamamoto等人(1992a)；Ballas等人(1996)；Klinman等人(1997)；Sato等人(1996)；Pisetsky(1996a)；Shimada等人(1986)日本癌研究雜志(Jpn.J.Cancer Res.)77808-816；Cowdery等人(1996)免疫學雜志(J.Immunol.)1564570-4575；Roman等人(1997)；Lipford等人(1997a)；WO 98/55495和WO 00/61151。因此，這些及其它方法可用于鑒定、試驗和/或證實含有ISS的免疫調節性多核苷酸。
ISS可為大于10個堿基或堿基對的任何長度，優選地長度大于15個堿基或堿基對，更優選地長度大于20個堿基或堿基對，且通常包含5′-胞嘧啶、鳥嘌呤-3′序列。
如此處所清楚表達的，應理解對于此處描述的式子，任何和所有參數都是獨立地選擇的。例如，如果x＝0-2，則可獨立地選擇y，而不用管x(或式中任何其它可選擇的參數)的值。
在一些實施方案中，ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中ISS不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在一些實施方案中，ISS包括如下任一序列TGAACGUTCG(SEQ IDNO67)；TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)；TGATCGGTCG(SEQ IDNO69)；TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)；TGAACGGTCG(SEQ IDNO71)；GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)；GTATCGGTCG(SEQ IDNO73)；GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)；GAACCGTTCG(SEQ IDNO75)；ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)；CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)；ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；TTAACGUTCG(SEQ ID NO80)；TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO82)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含序列5′-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO1)。
在其它實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含如下任一序列5′-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO2)；5′-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO3)；5′-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3′(SEQ ID NO4)；5′-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO5)；5′-TCGTCGAXCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO6)，其中X＝2-氨基-腺嘌呤；5′-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO7)；5′-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO8)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO9)；5′-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO10)；5′-TCGTCGAACGTTCGTT-3′(SEQ ID NO11)；
5′-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO12)；5′-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO13)；5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14)；5′-CTGTGATCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO15)；5′-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO16)；5′-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO17)；5′-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO18)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19)；5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO20)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO21)；5′-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO22)；5′-TZGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO23)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO24)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO25)；5′-TZGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO26)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO27)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO28)；5′-CTTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO29)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；.
5′-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO30)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′(SEQ ID NO132)。
在一些實施方案中，本發明免疫調節性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z為5-溴胞嘧啶，X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中ISS不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5-溴胞嘧啶)。
在一些實施方案中，ISS包括如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)，TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)，TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)，GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)，GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)，GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)，GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)，CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)，ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)，TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)，TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO31)；5′-TCGTCGAAZGTTCGTTAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO32)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO33)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO34)；5′-TCGTCGGAAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO35)；5′-TCGTZGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO36)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO133)其中X1為T、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中該式不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)。
在其它實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO37)；5′-TGACTGTGAAZGTTZGAGATGA-3′(SEQ ID NO38)；5′-TGACTGTGAAZGTTCCAGATGA-3′(SEQ ID NO39)；
5′-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3′(SEQ ID NO40)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO41)，其中X＝5-溴尿嘧啶；5′-TGACTGTGAAZGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO42)；5′-TGACTGTGAAZGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO43)；5′-CTGTGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO44)；5′-TZGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO45)；5′-TCGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO46)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO47)，其中X＝4-硫代胸腺嘧啶；5′-TGACTGTGAACXTTCXAGATGA-3′(SEQ ID NO48)；其中X＝6-硫代鳥嘌呤；5 ′-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO49)；5′-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3′(SEQ ID NO50)；5′-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO51)；5′-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO52)；5′-CTGTCAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO53)；5′-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO55)；5′-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO56)；5′-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO57)；5′-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO58)。
在一些實施方案中，相對于此處公開的任何ISS，免疫調節性多核苷酸還可包含一個或多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，優選地位于ISS的5′，例如，一個或多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；兩個或多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；或三個或更多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′。TCG(一個或多個)和/或T，5-溴胞嘧啶，G(一個或多個)可直接或不直接鄰近ISS。這些序列的實例已在本文中提供。如在一些實施方案中，本發明的免疫調節性多核苷酸可包括如下任一序列5′-TCGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO97)；5′-TCGTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO98)；5′-TZGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO99；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TZGTZGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO100；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO101)。
在一些實施方案中，額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個或多個)位于ISS的5′并緊鄰ISS。即TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列與ISS之間有0個堿基的間隔，例如5′-T，C，G，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，ISS-3′。對于這些實施方案，ISS可為此處描述的任何10-mer式子。包含此類序列的免疫調節性多核苷酸包括如SEQ ID NO.12、18和46。
在其它實施方案中，額外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列與ISS之間有1個堿基的間隔，例如5′-T，C，G，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，ISS-3′(其中N＝任何堿基)。包含此類序列的免疫調節性多核苷酸包括如SEQ ID NO 19、26和27。在其它實施方案中，額外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個或多個)與ISS之間有2個堿基的間隔，例為5′-T，C，G，N，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，N，ISS-3′(其中N＝任何堿基)。對于這些實施方案，ISS可為此處描述的任何10-mer式子。
在免疫調節性多核苷酸的一些實施方案中，額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個或多個)通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產生。例如在SEQ ID NO14中，額外的TCG中的CG為10mer ISS的前兩個堿基(5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14))在另一例子中，TCG中的G為SEQ ID NO20中10mer ISS的第一個堿基(5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3 ′ (SEQ ID NO20))。對于諸如此類的實施方案，ISS可為此處描述的任一10-mer式子(如SEQ ID NO62，SEQID NO65或SEQ ID NO133)。包含此類序列的免疫調節性多核苷酸包括如SEQ ID NO.14，19，20，36和55。
因此，例如在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含一個鄰近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的T，其中X1為C且X2為G。參見如SEQ ID NO19。例如在其它實施方案中，免疫調節性多核苷酸包含鄰近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的TC，其中X1為G。參見如SEQ ID NO55。
在額外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5’端而產生的某些實施方案中，此額外的序列可與ISS一起產生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。例如在SEQ ID NO19中，額外的TCGA中的CGA為10-mer ISS的前三個堿基(5′-5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19))。在另一例子中，T，5-溴胞嘧啶，G，A序列中的5-溴胞嘧啶，G，A為SEQ ID NO36中10-mer ISS的前三個堿基(5′TCGTZGAAZGUTCGGAATG A-3′(SEQ IDNO36))。因此，本發明包括含有ISS和位于ISS 5’端的TCGA序列或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列的免疫調節性多核苷酸。
在一些實施方案中，本發明的免疫調節性多核苷酸的ISS可包括下式5′-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO126)其中w為1-2，y為0-2，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調節性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.1.11，12，13，17，18，14，19，55，20，22，25，28和30。
在一些實施方案中，ISS包含任一如下序列TCGAACGTTCG(SEQ ID NO102)，TCGTCGAACGTTCG(SEQ IDNO98)，TCGTGAACGTTCG(SEQ ID NO103)，TCGGTATCGGTCG(SEQ ID NO104)，TCGGTACCGTTCG(SEQ ID NO105)，TCGGAACCGTTCG(SEQ ID NO106)，TCGGAACGTTCG(SEQ IDNO107)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ ID NO108)，TCGTAACGTTCG(SEQ ID NO109)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ IDNO108)，TCGACCGTTCG(SEQ ID NO110)，TCGTCGACCGTTCG(SEQ ID NO111)，TCGTTAACGTTCG(SEQ ID NO101)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO127)其中z為1-2，y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調節性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.45，23，26和29。
在一些實施方案中，ISS包含如下任一序列(其中X為5-溴胞嘧啶)TXCTGAACGTTCG(SEQ ID NO112)，TXCTXCTGAACGTTCG(SEQID NO113)，TXCAACGTTCG(SEQ ID NO114)，TXCTXCAACGTTCG(SEQ ID NO115)，TXGACCGTTCG(SEQ IDNO116)，TXCTXCACCGTTCG(SEQ ID NO54)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO128)其中y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調節性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO.46，24和27。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS包含任一如下序列(其中X為5-溴胞嘧啶)TCGTXGTGAACGTTCG(SEQ ID NO117)，TCGTXGAACGTTCG(SEQ ID NO118)，TCGTXGACCGTTCG(SEQID NO119)。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TCG)wNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO129)其中w為1-2，y為0-2，N為任何堿基，X3為T、A或C，X為5-溴胞嘧啶，X4為T、G或U。包含此類ISS的免疫調節性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO35。在一些實施方案中，ISS包含序列TCGGAAAXGTTCG(SEQ ID NO120)或TCGAAXGTTCG(SEQ ID NO121)，其中X為5-溴胞嘧啶。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO130)其中z為1-2，y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。在一些實施方案中，ISS包括序列TXGAAXGUTCG(SEQ ID NO122)或TXGAAXGTTCG(SEQ ID NO123)，其中X為5-溴胞嘧啶。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO131)其中y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調節性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO36。在一些實施方案中，ISS包含序列TCGTXGAAXGUTCG(SEQ IDNO124)或TCGTXGAAXGTTCG(SEQ ID NO125)，其中X為5-溴胞嘧啶。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸可含有修飾。ISS的修飾包括本領域公知的任何修飾，但不限于對3′OH或5′OH基團的修飾、核苷酸堿基的修飾、糖組分的修飾和磷酸酯基團的修飾。多種此類修飾如下所述。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸可為單鏈或雙鏈DNA，以及單鏈或雙鏈RNA或其它修飾的多核苷酸。ISS可包括或不包括一個或多個回文序列區域，其中所述回文序列區域可存在于上述的10聚體基序中或可延伸至該基序外。ISS可包含額外的側翼序列，它們中的一些于文中描述。ISS可包含天然存在的或修飾的、非天然存在的堿基，并可包含修飾的糖、磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯的修飾包括但不限于膦酸甲基酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以任意組合使用。也可使用其它非磷酸酯連接。優選地，本發明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯主鏈。也可制備本領域公知的糖修飾如2′-烷氧基-RNA類似物、2′-氨基-RNA類似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體及此處描述的其它修飾并與任意磷酸酯修飾組合。堿基修飾的實例(以下進一步討論)包括但不限于向ISS的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分(如5-溴胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-碘胞嘧啶)和向ISS的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分(如5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-碘尿嘧啶)。參見如國際專利申請號WO 99/62923。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸可用本領域熟知的技術和核酸合成設備合成，包括但不限于酶法、化學法和降解較大的寡核苷酸序列。參見如Ausubel等人(1987)；和Sambrook等人(1989)。當用酶促方式組裝時，可用如連接酶將各單元連接起來，其中所述連接酶如T4 DNA或RNA連接酶。美國專利號5,124,246。寡核苷酸的降解可通過將寡核苷酸暴露于核酸酶而實現，如在美國專利號4,650,675中所示例的。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸也可用常規的多核苷酸分離法分離。此類方法包括但不限于用探針與基因組或cDNA文庫雜交來檢測共有的核苷酸序列、用抗體篩選表達文庫來檢測共同的結構特征和通過聚合酶鏈反應合成特定的天然序列。
可分離、通過重組法合成或化學合成環狀免疫調節性多核苷酸。當環狀IMP通過分離或通過重組法獲得時，IMP優選為質粒。可用文獻中描述的任一方法化學合成較小的環狀寡核苷酸。參見如Gao等人(1995)核酸研究(Nucleic Acids Res.)232025-2029；和Wang等人(1994)核酸研究(Nucleic Acids Res.)222326-2333。
制備寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的技術為本領域公知。包含磷酸二酯鍵的天然存在DNA或RNA一般通過將合適的核苷亞磷酰胺依次偶聯至3′-端固定在固相載體上的、正在生長的寡核苷酸的5′-羥基上，然后將中間體亞磷酸三酯氧化為磷酸三酯而合成。一旦已合成目標寡核苷酸序列，即可從載體上除下寡核苷酸，將磷酸三酯基團去保護成磷酸二酯，并用氨水或其它堿對核苷堿基去保護。參見如用于寡核苷酸和類似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis andProperties)(Agrawal編輯)Humana Press，Totowa，NJ一書中的Beaucage(1993)“寡脫氧核糖核苷酸的合成”(＂OligodeoxyribonucleotideSynthesis＂)；Warner等人(1984)DNA 3401和美國專利號4,458,066。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸也可包含修飾了磷酸酯的寡核苷酸，它們中的一些公知可穩定該多核苷酸。因此，一些實施方案包括穩定的免疫調節性多核苷酸。包含修飾的磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的多核苷酸的合成也為本領域公知。綜述參見作為治療劑的寡核苷酸(Oligonucleotides asTherapeutic Agents)(D.J.Chadwick和G.Cardew編輯)John Wiley andSons，New York，NY一書中的Matteucci(1997)“寡核苷酸類似物總覽”(＂Oligonucleotide Analogsan Overview＂)。可與本發明寡核苷酸中的糖或糖類似物部分連接的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備及將它們摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸中本身也是公知的并無需在此詳述。Peyrottes等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)241841-1848；Chaturvedi等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242318-2323；和Schultz等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成類似于上述天然存在寡核苷酸的合成，除了氧化步驟用硫化步驟替換外(用于寡核苷酸和類似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotidesand Analogs，Synthesis and Properties)(Agrawal編輯)Humana Press一書中的Zon(1993)“寡核苷硫代磷酸酯”(＂OligonucleosidePhosphorothioates＂)165-190頁)。同樣，其它磷酸酯類似物的合成如磷酸三酯的合成(Miller等人(1971)JACS 936657-6665)、非橋接氨基磷酸酯的合成(Jager等人(1988)生物化學(Biochem.)277247-7246)、N3′至P5′phosphoramidiates的合成(Nelson等人(1997)JOC 627278-7287)和二硫代磷酸酯的合成(美國專利號5,453,496)也已有描述。也可使用其它基于非磷的修飾的寡核苷酸(Stirchak等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)176129-6141)。具硫代磷酸酯鍵主鏈的寡核苷酸較具磷酸二酯鍵主鏈的寡核苷酸更具免疫原性并在注射入宿主后似乎更抗降解。Braun等人(1988)免疫學雜志(J.Immunol.)1412084-2089；和Latimer等人(1995)分子免疫學(Mol.Immunol.)321057-1064。
用于本發明的ISS和/或免疫調節性多核苷酸可包含一個或多個核糖核苷酸(包含核糖作為唯一或主要的糖組分)、脫氧核糖核苷酸(包含脫氧核糖作為主要的糖組分)，或如本領域公知的那樣，可以在ISS和/或免疫調節性多核苷酸中可摻入修飾的糖或糖類似物。因此，糖部分除了核糖和脫氧核糖外，還可為戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖和糖＂類似物＂環戊基基團。糖可為吡喃型或呋喃型。在ISS和/或IMP中，糖部分優選為呋喃型的核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖，且糖可以以α或β端基異構構型和各雜環堿基連接。糖的修飾包括但不限于2′-烷氧基-RNA類似物、2′-氨基-RNA類似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體。例如在ISS和/或免疫調節性多核苷酸中的糖修飾包括但不限于2-氨基脫氧腺苷。這些糖或糖類似物以及各＂核苷＂(其中此類糖或類似物與雜環堿基(核酸堿基)連接)的制備本身是公知的，并無需在此描述，除非此類制備可能涉及到任何具體的實施例。在ISS和/或免疫調節性多核苷酸制備物中也可進行糖修飾并與任何磷酸酯修飾結合。
摻入ISS和/或免疫調節性多核苷酸中的雜環堿基或核酸堿基可為天然存在的主要嘌呤和嘧啶堿基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤，如上所述)，以及所述主要堿基的天然和合成的修飾物。
本領域技術人員將認識到包含各種雜環堿基和各種糖部分(和糖類似物)的大量＂合成的＂非天然核苷在本領域中是現成的，并且只要滿足本發明的其它要求，ISS和/或免疫調節性多核苷酸可包括不屬于此主要五種天然核酸堿基成分的一種或幾種雜環堿基。但優選地，ISS和/或IMP中的雜環堿基包括但不限于尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通過9-位、嘧啶通過1-位、吡咯并嘧啶通過7-位而吡唑并嘧啶通過1-位與ISS和/或IMP的糖部分連接。
ISS和/或免疫調節性多核苷酸可包含至少一種修飾堿基。如此處所用，術語＂修飾的堿基＂與＂堿基類似物＂同義，如＂修飾的胞嘧啶＂與＂胞嘧啶類似物＂同義。類似地，＂修飾的＂核苷或核苷酸此處定義為與核苷或核苷酸＂類似物＂同義。堿基修飾的實例包括但不限于向ISS和/或IMP的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分。優選地，該吸電子部分為鹵素。此類修飾的胞嘧啶可包括但不限于氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5，6--二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、尿嘧啶和任何其它嘧啶類似物或修飾的嘧啶的。堿基修飾的其它實例包括但不限于向ISS和/或免疫調節性多核苷酸的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分。優選地，該吸電子部分為鹵素。此類修飾的尿嘧啶可包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶。
堿基修飾的其它實例包括添加一個或多個硫代基團至堿基上，包括，但不限于6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。
雖然可進行其它修飾和/或添加，但優選存在于ISS中的CG基序的胞嘧啶不發生甲基化。但在某些實施方案中，ISS可包含一個或多個甲基化的胞嘧啶。在此類實施方案中，優選10mer ISS序列中的胞嘧啶(即此處描述的式子如SEQ ID NO62，65，126，127，128，129，130，131和133的CG和/或TCG部分中的C)在位置C5處不被甲基化。但在位置N4處的甲基化可考慮存在于包含甲基化胞嘧啶的ISS中。
具有修飾堿基的核苷的制備和使用所述具有修飾堿基的核苷作為前體進行的修飾寡核苷酸的合成已在例如美國專利4,910,300、4,948,882和5,093,232中描述。這些具有修飾堿基的核苷經設計以致可通過化學合成摻入寡核苷酸的末端或內部。此類存在于寡核苷酸末端或內部的具有修飾堿基的核苷可作為連接肽或其它抗原的位點。糖部分被修飾的核苷也已有描述(包括但不限于例如，美國專利4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并可類似使用。
在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸小于約任何以下長度(以堿基或堿基對表示)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在一些實施方案中，免疫調節性多核苷酸大于約任何以下長度(以堿基或堿基對表示)10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。或者，免疫調節性多核苷酸的長度可在如下任何范圍內，其上限為10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10，而獨立選擇的下限為10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500，其中下限小于上限。
本發明也提供了制備此處描述的免疫調節性多核苷酸的方法。此方法可為此處描述的任一方法。例如，此方法可為合成含有ISS的多核苷酸(例如用固相合成)且可進一步包括任何純化步驟。純化方法為本領域公知。其它制備方法包括組合免疫調節性多核苷酸和抗原。
抗原任何抗原都可與免疫調節性多核苷酸共施用，和/或用于包含免疫調節性多核苷酸和抗原的組合物(以及這些組合物的制品)中。
在一些實施方案中，抗原為變應原。重組變應原的實例在表1中提供。許多變應原的制備在本領域是熟知的，包括但不限于豚草花粉變應原Antigen E(Amb a I)(Rafnar等人(1991)生物化學雜志(J Biol.Chem.)2661229-1236)、草變應原Lol p1(Tamborini等人(1997)歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)249886-894)、主要塵螨變應原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)167175-182；Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91124-129)、家貓變應原FeldI(Rogers等人(1993)分子免疫學(Mol.Immunol.)30559-568)、白樺花粉Betvl(Breiteneder等人(1989)EMBO J 81935-1938)、柳杉變應原Cryj1和Cryj2(Kingetsu等人(2000)免疫學(Immunology)99625-629)和來自其它樹木花粉的蛋白質抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.20417-31)的制備。如所述的那樣，來自樹的變應原是公知的，包括來自樺樹、杜松和柳杉的變應原。已報導了用于體內施用的來自草花粉的蛋白質抗原制品。
在一些實施方案中，變應原為食物變應原，包括但不限于花生變應原如ArahI(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409213-216)；胡桃變應原如JugrI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101807-814)；巴西堅果變應原如白蛋白(Pastorello等人(1998)J Allergy Clin.Immunol.1021021-1027)；蝦變應原如PenaI(Reese等人(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113240-242)；卵變應原如類卵粘蛋白(Crooke等人(1997)免疫學雜志(J.Immunol.)1592026-2032)；奶變應原如牛β-乳球蛋白(Selot等(1999)臨床與實驗變態反應(Clin.Exp.Allergy)291055-1063)；魚變應原如小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J Immunol.50619-625；Galland等人(1998)J Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.70663-71.)。在一些實施方案中，變應原為膠乳變應原，包括但不限于Hevb7(Sowka等人(1998)歐洲生物化學雜志(Eur.J Biochem.)255213-219)。表1列出了可使用的變應原的示例。
表1重組變應原
在一些實施方案中，抗原來自感染物，包括原生動物、細菌、真菌(包括單細胞和多細胞)和病毒感染物。合適的病毒抗原的實例于文中描述并為本領域公知。細菌包括流感嗜血桿菌、分枝結核桿菌和百日咳桿菌(Bordetella pertussis)。原生動物感染物包括瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲和血吸蟲。真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)。
在一些實施方案中，抗原為病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不限于膜錨定(MA)蛋白、核心殼(CA)蛋白和核衣殼(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基質(M)蛋白和流感病毒核衣殼(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、肝炎e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。討論流感接種的文獻包括Scherle和Gerhard(1988)，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)854446-4450；Scherle和Gerhard(1986)，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1641114-1128；Granoff等(1993)，疫苗(Vaceine)11S46-51；Kodihalli等人(1997)，病毒學雜志(J.Virol.)713391-3396；Ahmeida等人(1993)，疫苗(Vaccine)111302-1309；Chen等人(1999)，疫苗(Vaccine)17653-659；Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41251-257；Koide等人(1995)，疫苗(Vaccine)133-5；Mbawuike等人(1994)，疫苗(Vaccine)121340-1348；Tamura等人(1994)，疫苗(Vaccine)12310-316；Tamura等人(1992)歐洲免疫學雜志(Eur.J Immunol.)22477-481；Hirabayashi等人(1990)，疫苗(Vaccine)8595-599。抗原多肽的其它實例為組或亞組特異性抗原，它們公知存在于許多感染物中，其中所述感染物包括但不限于腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus)、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和痘病毒(poxviruse)。
如以下實施例3中所示，在靈長類中，含有ISS的多核苷酸與肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))的聯合施用導致抗HBsAg抗體效價較單獨施用HBsAg時升高。
許多抗原性肽和蛋白質是公知的，并在本領域中是現成的；其它的可用常規技術鑒定。對于通過免疫抵抗腫瘤形成或治療已存在的腫瘤，免疫調節性肽可包括腫瘤細胞(活的或輻射過的)、腫瘤細胞提取物或腫瘤抗原如Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)的蛋白質亞單位、神經節苷酯、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特異抗原(PSA)和酪氨酸酶。基于免疫的避孕疫苗可通過包括精子蛋白與ISS而形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307263。
減毒和滅活病毒適用于本文中用作抗原。這些病毒的制備為本領域熟知并且許多可通過商業途徑獲得(參見如Physicians′Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如，脊髓灰質炎病毒(poliovirus)可以以1POL(Pasteur Merieux Connaught)和ORIMUNE(LederleLaboratories)獲得，甲肝病毒可以以VAQTA(Merck)獲得，麻疹病毒(measles virus)可以以ATTENUVAX(Merck)獲得，腮腺炎病毒(mumps virus)可以以MUMPSVAX(Merck)獲得，及風疹病毒(rubellavirus)可以以MERUVAXII(Merck)獲得。此外，如HIV-1、HIV-2、單純皰疹病毒、乙肝病毒、輪狀病毒(rotavirus)、人和非人乳頭狀瘤病毒和腦慢病毒(slow brain virus)的減毒和滅活病毒可提供肽抗原。
在一些實施方案中，抗原包含病毒載體，如痘苗病毒、腺病毒和金絲雀痘病毒載體。
抗原可從它們的來源中用本領域公知的純化技術分離，或更方便地，可用重組方法產生。
抗原性肽可包括純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質、粗蛋白提取物、減毒或滅活病毒、細胞、微生物或此類肽的片段。，免疫調節性肽可為天然肽，或為化學或酶法合成的肽。本領域公知的任何化學合成法均適用。液相肽合成可用于構建中等大小的肽，或肽的化學構建可采用固相合成來進行。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362833-839。也可使用蛋白水解酶來偶聯氨基酸而產生肽。Kullmann(1987)EnzymaticPeptide Synthesis，CRC Press，Inc。另外，可通過使用細胞的生物化學機器或通過從生物源分離來獲得肽。可采用重組DNA技術產生肽。Hames等人(1987)，轉錄和翻譯實用方法(Transcription and TranslationAPractical Approach)，IRL Press。也可用標準技術如親和層析分離肽。
優選地，抗原為肽、脂類(如除膽固醇外的固醇類、脂肪酸和磷脂)、多糖(如那些用于流感嗜血桿菌疫苗中的多糖)、神經節苷脂和糖蛋白。它們可通過本領域公知的幾種方法獲得，包括使用化學和酶法分離和合成。在某些情況下，例如對于許多固醇類、脂肪酸和磷脂，分子的抗原性部分可通過商業途徑得到。
用于本發明組合物和使用該組合物的方法中的病毒抗原的實例包括但不限于HIV抗原。此類抗原包括但不限于那些來自HIV包膜糖蛋白的抗原，其中所述HIV包膜糖蛋白包括但不限于gpl60、gpl20和gp41。許多HIV基因和抗原的序列是公知的。例如Los Alamos National LaboratoryHIV Sequence Database收集、管理和注釋HIV核苷酸和氨基酸序列。該數據庫通過互聯網網址http//hiv-web.lanl.gov/可進入，并且在每年公布中，參見Human Retroviruses and AIDS Compendium(如2000版)。
來自感染物的抗原可用本領域公知的方法獲得，如從天然病毒或細菌提取物獲得、從感染物感染的細胞獲得、從純化的多肽獲得、從重組產生的多肽獲得和/或以合成肽的形式獲得。
ISS-抗原當與抗原一起使用時，ISS可以以多種方式與抗原一起施用。在一些實施方案中，含有ISS的多核苷酸和抗原可以以相互空間接近的方式施用，或以混合物(即在溶液中)施用。如下所述，可以以多種方式實行空間接近，包括偶聯(連接)、包囊、通過添加至平臺或吸附至表面上。通常且最優選地，與ISS和抗原作為混合物施用所產生的免疫反應相比，含有ISS的多核苷酸和抗原以有效增強該免疫反應的距離相鄰連接。
在一些實施方案中，含有ISS的多核苷酸與抗原偶聯。ISS部分可以以多種方式與偶聯物的抗原部分偶聯，包括共價和/或非共價相互作用。
這些部分間的連接可在ISS的3′或5′末端，或在ISS中間位置的適當修飾的堿基處進行。如果抗原為肽并包含合適的活性基團(如N-羥基琥珀酰亞胺酯)，則它可直接與胞嘧啶殘基的N4氨基反。根據ISS中胞嘧啶殘基的數量和位置，可在一個或多個殘基處實現特異性偶聯。
或者，可將本領域所公知的修飾寡核苷摻入ISS的末端或內部位置。它們可包含被封閉的官能團，當去封閉后，這些官能團可與多種存在于或連接在目的抗原上的官能團反應。
當抗原為肽或多肽時，偶聯物的該部分可通過固相載體化學連接至ISS的3′-端。例如，可將ISS部分添加至已在載體上預合成的多肽部分上。Haralambidis等人(1990a)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18493-499；和Haralambidis等人(1990b)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18501-505。另外，可這樣合成ISS以使其通過從3′-端延伸出的可切割接頭連接固相載體。當ISS從載體上化學切割下來后，在寡核苷酸的3’-端留下一個末端巰基(Zuckermann等人(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)155305-5321；和Corey等人(1987)科學(Science)2381401-1403)或在寡核苷酸的3’-端留下一個末端氨基基團(Nelson等人(1989)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)171781-1794)。氨基修飾的ISS與肽的氨基的偶聯可如Benoit等人(1987)Neuromethods 643-72中所述進行。巰基修飾的ISS與肽的羧基的偶聯可如Sinah等人(1991)，寡核苷酸類似物實用方法(OligonucleotideAnaloguesA Practical Approach)，IRL Press中所述進行。攜帶有附加的馬來酰亞胺的寡核苷酸與肽的半胱氨酸殘基的巰基側鏈的偶聯也已有描述。Tung等人(1991)Bioconjug Chem.2464-465。
偶聯物的肽或多肽部分可通過在ISS合成過程中摻入該寡核苷酸的胺、巰基或羧基基團連接至ISS的5’-端。優選地，當寡核苷酸固定于固相載體時，一端包含被保護的胺、巰基或羧基且另一端包含亞磷酰胺的連接基團可與5′-羥基共價結合。Agrawal等人(1986)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)146227-6245；Connolly(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res.)134485-4502；Kremsky等人(1987)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)152891-2909；Connolly(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)153131-3139；Bischoff等人(1987)Anal.Biochem.164336-344；Blanks等人(1988)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)1610283-10299；以及美國專利號4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。去保護后，這些胺、巰基和羧基官能團可用于使寡核苷酸與肽共價連接。Benoit等人(1987)；和Sinah等人(1991)。
ISS-抗原偶聯物也可通過非共價相互作用如離子鍵、疏水相互作用、氫鍵和/或范德華引力而形成。
非共價連接的偶聯物可包括非共價相互作用，如生物素-鏈親和素復合體。生物素基團可例如連接至ISS的修飾堿基上。Roget等人(1989)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)177643-7651。將鏈親和素部分摻入肽部分使得鏈親和素偶聯的肽和生物素化寡核苷酸可以形成非共價結合復合體。
也可通過涉及到ISS和抗原內的殘基如帶電荷氨基酸的離子相互作用，或通過使用包含有可與寡核苷酸和抗原相互作用的帶電荷殘基的接頭部分來產生非共價連接。例如，非共價偶聯可以在通常帶負電的ISS和肽中帶正電的氨基酸殘基如多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚組氨酸殘基之間發生。
ISS和抗原間的非共價偶聯可通過與DNA相互作用的分子中的DNA結合基序而產生，其中DNA為該分子的天然配體。例如，此類DNA結合基序可在轉錄因子和抗DNA抗體中找到。
ISS與脂的連接可通過標準方法形成。這些方法包括但不限于合成寡核苷酸-磷脂偶聯物(Yanagawa等人(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19189-192)、寡核苷酸-脂肪酸偶聯物(Grabarek等人(1990)生物化學年鑒(Anal.Biochem.)185131-135；和Staros等人(1986)生物化學年鑒(Anal.Biochem.)156220-222)、和寡核苷酸-固醇偶聯物。Boujrad等人(1993)，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905728-5731。
寡核苷酸與寡糖的連接可通過標準的已知方法形成。這些方法包括但不限于合成寡核苷酸-寡糖偶聯物，其中寡糖為免疫球蛋白的一部分。O′Shannessy等人(1985)，應用生物化學雜志(J.Applied Biochem.)7347-355。
環狀ISS與肽或抗原的連接可以以幾種方式形成。當環狀ISS是通過重組或化學法合成時，修飾核苷是合適的。參見Ruth(1991)在寡核苷酸和類似物實用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach)，IRL Press一書中的描述。然后可用標準的連接技術將環狀ISS連接至抗原或其它肽上。Goodchild(1990)Bioconjug.Chem.1165。當環狀ISS為分離的，或使用重組或化學法合成的時，可通過化學活化或光活化已摻入抗原或其它肽中的活性基團(如卡賓、自由基)來形成連接。
用于將肽和其它分子連接至寡核苷酸上的其它方法可在美國專利號5,391,723；Kricka(編輯)，非同位素DNA探針技術(Nonisotopic DNA ProbeTechniques)，Academic Press一書中的Kessler(1992)，“核酸的非放射性標記法”(＂Nonradioactive labeling methods for nucleic acids＂)；和Geoghegan等人(1992)Bioconjug.Chem.3138-146中找到。
ISS可以以其它方式與抗原緊鄰連接。在一些實施方案中，ISS和抗原通過包囊而緊鄰連接。在其它實施方案中，ISS和抗原通過與平臺分子連接而緊鄰連接。＂平臺分子＂(也稱為＂平臺＂)為包含允許ISS和抗原連接的位點的分子。在其它實施方案中，ISS和抗原通過吸附在表面，優選載體粒子上而緊鄰連接。
在一些實施方案中，本發明的方法使用了包囊劑(或包含此包囊劑的組合物)，其中所述包囊劑可維持ISS和第一抗原的緊鄰連接，直至該復合體到達靶。優選地，包含ISS、抗原和包囊劑的組合物為佐劑水包油乳劑、微粒子和/或脂質體形式。更優選地，包裹有ISS-免疫調節分子的佐劑水包油乳劑、微粒子和/或脂質體為約0.04μm至約100μm大小的顆粒形式，優選地其大小為任一以下范圍約0.1μm至約20μm；約0.15μm至約10μm；約0.05μm至約1.00μm；約0.05μm至約0.5μm。
膠體分散體系如微球、珠、大分子復合體、毫微膠囊和基于脂的體系如水包油乳劑、微膠粒、混合微膠粒和脂質體可有效地包囊含有ISS的組合物。
包囊組合物還可包含如下多種組分中的任何組分。這些組分包括但不限于明礬、脂類、磷脂、脂膜結構(LMS)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物如多肽、糖肽和多糖。
適用作包囊組分的多肽包括本領域公知的任何多肽，并包括但不限于脂肪酸結合蛋白。修飾的多肽可包含如下多種修飾中的任何修飾，所述修飾包括但不限于糖基化、磷酸化、肉豆蔻基化、硫酸化和羥化。如此處所用，合適的多肽為能保護含有ISS的組合物以保留其免疫調節活性的多肽。結合蛋白的實例包括但不限于白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其它合適的聚合物可為制藥領域公知的任何聚合物，其包括但不限于天然存在的聚合物(如葡聚糖、羥乙基淀粉和多糖)和合成的聚合物。天然存在的聚合物的實例包括蛋白質、糖肽、多糖、葡聚糖和脂類。其它聚合物可為合成的聚合物。適用于本發明的合成聚合物的實例包括但不限于聚烷基二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化多元醇(POP)如聚氧乙基化甘油(POG)、聚三亞甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚異丁烯酸羥乙基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的聚合物也可為直鏈或支鏈的、取代或未取代的均聚物、兩種或多種不同的合成單體的共聚物或嵌段共聚物。
用于本發明包囊組合物中的PEG可購自化學供應商或用本領域公知的技術合成。
術語＂LMS＂如此處所用是指這樣的層狀脂粒子，其中極性脂的極性頭部基團面向界面的水相排列以形成膜結構。LMS的實例包括脂質體、微膠粒、螺旋體(即通常的圓柱狀脂質體)、微乳、單層脂質體、多層脂質體等。
本發明優選的膠體分散體系為脂質體。用脂質體包裹的抗原免疫小鼠，脂質體表現出可促進針對抗原的Th1-類免疫反應。Aramaki等人(1995)，疫苗(Vaccine)131809-1814。如此處所用，＂脂質體＂或＂脂質小泡＂為被至少一個且可能多于一個的雙層脂膜包裹的小泡。可以從磷脂、糖脂、脂類、類固醇如膽固醇、相關分子或其組合通過本領域公知的任何技術人工制備脂質體，所述技術包括但不限于超聲處理、擠壓或從脂-去污劑復合體中去除去污劑。脂質體也可任選地包含其它組分如組織靶向組分。應理解＂脂膜＂或＂脂雙層＂不一定僅由脂類組成，只要膜的總體結構為兩個親水表面夾著一個疏水核的片層，＂脂膜＂或＂脂雙層＂還可包含任何合適的其它組分，所述組分包括但不限于膽固醇和其它類固醇、溶于脂的化學物質、任何長度的蛋白質以及其它兩親性分子。對膜結構的綜合討論參見J.Kendrew(1994)的分子生物學百科全書(The Encyclopedia of MolecularBiology)。合適的脂類參見如Lasic(1993)＂Liposomesfrom Physics toApplications＂Elsevier，Amsterdam。
用于制備含有ISS組合物的脂質體的方法為本領域公知。脂質小泡可通過本領域公知的任何合適技術制備。方法包括但不限于微囊化、微流化、LLC法、醇注射、氟利昂注射、＂發泡＂法、去污劑透析、水合作用、超聲處理和反相蒸發。綜述見Watwe等人(1995)Curr.Sci.68715-724。可組合多種技術以提供具最理想特性的小泡。
本發明包括含有組織或細胞靶向組分的LMS的用途。此類靶向組分為這樣的LMS中的組分，當LMS施用于完整的動物、器官或細胞培養物時，該組分可促進LMS優先積聚在特定組織或細胞位點而非其它組織或細胞位點。靶向組分通常從脂質體外部來接近，因此其優選結合在外表面或插入外部的脂雙層中。靶向組分尤其可為肽、較大肽的區域、細胞表面分子或標記物的特異性抗體或其抗原結合片段、核酸、糖類、復合糖的區域、特異的脂、或可與任一上述分子結合的小分子如藥物、激素或半抗原。對細胞類型特異性細胞表面標記物具特異性的抗體為本領域公知，并易于通過本領域公知的方法制備。
可使LMS靶向治療欲指向的任何細胞類型，如可調節和/或參與免疫反應的細胞類型。此類靶細胞和器官包括但不限于APC如巨噬細胞、樹狀突細胞和淋巴細胞、淋巴結構如淋巴結和脾、以及非淋巴結構，尤其是那些存在樹狀突細胞的非淋巴結構。
本發明的LMS組合物還可包含表面活性劑。表面活性劑可為陽離子的、陰離子的、兩親的或非離子的表面活性劑。表面活性劑的優選類型為非離子表面活性劑；尤其優選那些水溶性的。
在ISS和抗原通過與平臺分子的連接而緊鄰連接的實施方案中，平臺可為蛋白質或非蛋白質平臺(即有機的)。蛋白質平臺的實例包括但不限于白蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel等人(1990)，免疫學方法(Immunol.Methods)126159-168；Dumas等人(1995)Arch.Dematol.Res.287123-128；Borel等人(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107264-267；Borel等人(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.77880-87。平臺為多價體(即包含多于一個的結合或連接位點)以滿足與ISS和抗原兩者的結合。聚合物平臺的其它實例為葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚糖體、羧甲基纖維素、聚乙烯醇和聚D-谷氨酸/D-賴氨酸。
使用平臺分子的原則在本領域是熟知的。通常，平臺包含或經衍生后包含合適的ISS和抗原結合位點。此外或備選地，通過衍生ISS和/或抗原以提供合適的連接基團。例如，簡單的平臺為雙功能接頭(即具有兩個結合位點)，如肽。在下文中討論了其它的實例。
平臺分子可為生物穩定的，即它們顯示的體內排泄半衰期通常為數小時至數天至數月從而可賦予治療功效，且平臺分子優選由規定組合物的合成單鏈組成。它們通常具有的分子量為約200至約1,000,000，優選在如下任一范圍內約200至約500,000；約200至約200,000；約200至約50,000(或更小，如30,000)。價平臺分子的實例為聚合物(或由聚合物組成)，如聚乙二醇(PEG，優選地具有約200至約8000的分子量)、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-賴氨酸(比率為3∶2)。可使用的其它分子為白蛋白和IgG。
適用于本發明的其它平臺分子為在美國專利5,552,391中公開的化學定義的非聚合價平臺分子。適用于本發明的其它均質的化學定義的價平臺分子為衍生的2，2′-亞乙二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。
其它合適的價平臺分子包括但不限于四氨基苯、七氨基β-環糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮雜環十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮雜環十二烷(Cyclen)。
通常，這些平臺分子通過標準的化學合成技術制備。PEG必須被衍生并制成多價的。這通過使用標準技術實現。適用于偶聯物合成的一些物質如PEG、白蛋白和IgG可通過商業途徑獲得。
ISS和抗原與平臺分子的偶聯可以以多種方式實現，一般涉及到一種或多種交聯劑、抗原和ISS及平臺分子上的官能基。平臺分子及ISS和抗原必須具有合適的連接基團。可以用標準的合成化學技術向平臺分子添加連接基團。而可用標準的固相合成技術或重組技術將連接基團添加至多肽抗原和ISS上。重組方法可能需要翻譯后修飾以連接接頭，此類方法在本領域是公知的。
例如，多肽可包含含有官能團如氨基、羧基或巰基的氨基酸側鏈部分，這些基團可作為將該多肽偶聯至平臺分子上的位點。如果多肽不包含這些基團，可將具有此類官能團的殘基添加至該多肽。此類殘基可通過固相合成技術或重組技術摻入，這兩種技術為肽合成領域所熟知。當多肽具有糖側鏈(或當抗原為糖)時，可通過常規化學向其中摻入官能團氨基、巰基和/或醛基。例如，通過氧化糖的反應在氰基硼氫化鈉存在下使用乙二胺可摻入伯氨基基團，通過半胱胺二鹽酸化物反應然后用標準的二硫化物還原劑還原可摻入巰基，而醛基可在高碘酸氧化后產生。如果平臺分子不具有合適的官能團，也可以以類似方式衍生平臺分子以包含官能團。
可變長度的親水接頭可用于將ISS和抗原連接至平臺分子。合適的接頭包括乙二醇的線性寡聚體或多聚體。此類接頭包括具有下式的接頭R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保護基如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基如4-硝基苯基酯。這些接頭可用于將含有硫基反應基如haloaceyl、maleiamide等的分子(通過硫醚)和含有氨基的第二分子(通過酰胺鍵)連接。就連接的次序而言，這些接頭具彈性，即硫醚可首先或最后形成。
在ISS和抗原通過吸附至表面而緊鄰連接的實施方案中，表面可為用無機或有機核心制備的載體粒子(如毫微粒子)形式。此類毫微粒子的實例包括但不限于毫微結晶粒子、通過聚合氰基丙烯酸烷基酯而制備的毫微粒子和通過丙二酸亞甲酯聚合而制備的毫微粒子。可吸附ISS和抗原的其它表面包括但不限于活性碳粒子和蛋白質-陶瓷毫微板。本文提供了載體粒子的其它實例。
通過將多核苷酸和多肽吸附至表面來實現所吸附的分子向細胞的遞送是本領域所熟知的。參見如Douglas等人(1 987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3233-261；Hagiwara等人(1987)In Vivo 1241-252；Bousquet等人(1999)Pharm.Res.16141-147；和Kossovsky等人，美國專利5,460,831。優選地，含有吸附表面的材料是可生物降解的。ISS和/或抗原可通過非共價相互作用(包括離子和/或疏水相互作用)吸附至表面。
總之，載體如毫微粒子的特征如表面電荷、粒子大小和分子量取決于聚合條件、單體濃度和在聚合過程中穩定劑的存在(Douglas等人，1987)。載體粒子的表面可通過如表面包被來修飾，以允許或促進ISS和/或抗原的吸附。吸附了ISS和/或抗原的載體粒子可進一步用其它物質包被。此類其它物質的添加如此處所述可例如在將粒子施用于受試者后延長粒子的半衰期，和/或可將粒子靶向特定的細胞類型或組織。
可吸附ISS和抗原的毫微結晶表面已有描述(參見如美國專利5,460,831)。毫微結晶核心粒子(直徑為1μm或更小)用促進多肽、多核苷酸和/或其它藥劑吸附的表面能量修飾層包被。如在美國專利5,460,831中所述，例如核心粒子可以用促進寡核苷酸吸附的表面包被，接下來用抗原制品包被，其中所述抗原制品為例如脂-抗原混合物形式。此類毫微粒子為毫微米大小粒子的自我組裝復合體，一般為0.1μm級，其具有ISS內層和抗原外層。
另一吸附表面為通過聚合氰基丙烯酸烷基酯而制備的毫微粒子。氰基丙烯酸烷基酯可在酸化的水性介質中通過陰離子聚合法而聚合。根據聚合條件，這些小粒子趨向于具有20至3000nm的尺寸，并且可制備具有特定表面特征和特定表面電荷的毫微粒子(Douglas等人，1987)。例如，在存在疏水陽離子如氯化四苯鏻或季銨鹽如溴化十六烷基三甲基銨時，寡核苷酸可被吸附至聚氰基丙烯酸異丁酯和聚氰基丙烯酸異己酯毫微粒子上。寡核苷酸吸附在這些毫微粒子上似乎是通過核酸鏈的帶負電荷磷酸基團和疏水陽離子之間形成的離子對介導的。參見如Lambert等人(1998)，生物化學(Biochimie)80969-976，Chavany等人(1994)Pharm.Res.111370-1378；Chavany等人(1992)Pharm.Res.9441-449。多肽也可吸附在聚氰基丙烯酸烷基酯毫微粒子上。參見如Douglas等人，1987；Schroeder等人(1998)肽(Peptide s)19777-780。
另一吸附表面為通過丙二酸亞甲酯聚合而制備的毫微粒子。例如，如Bousquet等人，1999所述，多肽吸附至聚(丙二酸亞甲酯2.1.2)毫微粒子上似乎最初是通過靜電力然后是通過疏水力穩定來實現的。
IMP/MC復合體含有ISS的多核苷酸可以以免疫調節性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復合體的形式施用。因此，本發明提供了包含IMP/MC復合體的組合物。
用于本發明的微載體尺寸小于約150、120或100μm，較常見地為小于約50-60μm，優選小于約10μm，并且不可溶于純水。用于本發明的微載體優選地為可生物降解的，但不可生物降解的微載體也是可接受的。微載體通常為固相，如＂珠＂或其它粒子，但液相微載體如包含可生物降解聚合物的水包油乳液或油也可考慮。可接受用作微載體的大量可生物降解和不可生物降解物質為本領域所公知。
用于本發明組合物或方法中的微載體通常小于約10μm(如具有的平均直徑小于約10μm，或至少約97％的粒子能通過10μm篩式濾器)，并且包括毫微載體(即尺寸小于約1μm的載體)。優選地，選擇上限尺寸約為9、7、5、2或1μm或900、800、700、600、500、400、300、250、200或100nm，而獨立選擇的下限尺寸約為4、2或11μm或約800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25或10 nm的微載體，其中下限小于上限。在一些實施方案中，微載體具有的尺寸約1.0-1.5μm，約1.0-2.0μm或約0.9-1.6μm。在某些優選的實施方案中，微載體具有的尺寸為約10nm至約5μm，或約25nm至約4.5μm，約1μm，約1.2μm，約1.4μm，約1.5μm，約1.6μm，，約1.8μm，約2.0μm，約2.5μm或約4.5μm。當微載體為毫微載體時，優選的實施方案包括約25至約300nm，、50至約200nm、約50nm或約200nm的毫微載體。
可生物降解的固相微載體可由可生物降解的聚合物制備，其中所述可生物降解的聚合物包括但不限于可生物降解的聚酯如聚(乳酸)、聚羥基乙酸及它們的共聚物(包括嵌段共聚物)，以及聚(乳酸)和聚(乙二醇)的嵌段共聚物；聚原酸酯如以3，9--二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]十一烷(DETOSU)為基礎的聚合物；聚酐類，如基于相對親水單體如癸二酸的聚(酐)聚合物；聚二酰亞胺，如基于摻入氨基酸如甘氨酸或丙氨酸的癸二酸衍生單體(即利用二酰亞胺鍵通過氨基末端的氮與癸二酸連接)的聚(酐)聚合物；聚酐酯；聚磷腈，尤其是含有易水解酯基的聚(磷腈)，其中所述易水解酯基可以通過產生羧酸基團催化聚合物主鏈的降解(Schacht等人，(1996)Biotechnol.Bioeng 1996102)；和聚酰胺如聚(乳酸-共-賴氨酸)。
適用于制備微載體的大量不可降解物質也是公知的，其包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、乳膠、金以及鐵磁性和順磁性物質。某些實施方案不包括金、乳膠和/或磁珠。在某些實施方案中，微載體可由用第二種物質(如聚苯乙烯)包封的第一種物質(如磁性物質)制成。
固相微球體可用本領域公知的技術制備。例如，它們可通過乳液-溶劑提取/蒸發技術制備。一般，在此技術中，將可生物降解的聚合物如聚酐、聚(α-氰基丙烯酸烷基酯)和聚(α-羥基酯)，如聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)、聚(D，L-乳酸-共-羥基乙酸)和聚(己內酯)溶于合適的有機溶劑如二氯甲烷中，以構建乳液的分散相(DP)。該DP在過量體積的含有溶解的表面活性劑如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的連續水相(CP)中高速勻漿而乳化。CP中的表面活性劑可以確保形成離散的且合適大小的乳液小滴。然后將有機溶劑提取入CP并接下來通過升高系統溫度來蒸發。固體微粒子然后通過離心或過濾分離，并干燥如通過冷凍干燥或應用真空干燥，然后置于4℃保存。
可測定干燥微粒子的物理化學特性如平均尺寸、尺寸分布和表面電荷。尺寸特性可以例如通過動態光散射技術測定，表面電荷通過測定ζ電位而確定。
液相微載體包括脂質體、微膠粒、油滴和其它其中摻入了可生物降解的聚合物或油類的基于脂或油的粒子。在某些實施方案中，可生物降解的聚合物為表面活性劑。在其它實施方案中，液相微載體為可生物降解的，因為其包含可生物降解的油如鯊烯或植物油。一種優選的液相微載體是在水包油乳液中的油滴。優選地，用作微載體的水包油乳液包含可生物降解的代用品如鯊烯。
IMP/MC復合體包含連接在微載體表面的IMP(即IMP不是被包裹在MC中)，并優選每一微載體連接有多個IMP分子。在某些實施方案中，不同IMP的混合物可與一種微載體復合，這樣該微載體將連接有多種的IMP。IMP和MC之間的鍵可為共價或非共價的。本領域技術人員理解可以修飾或衍生IMP，并且可以選擇和/或修飾微載體的組成以適應用于形成IMP/MC復合體的期望結合類型。
共價結合的IMP/MC復合體可用本領域公知的任一共價交聯技術連接。一般，對IMP部分進行修飾，以摻入額外部分(如游離胺、羧基或巰基)或摻入修飾的(如硫代磷酸酯)核苷酸堿基，從而提供IMP部分可與微載體連接的位點。復合體中IMP和MC部分之間的連接可發生在IMP的3′或5′端，或在IMP內部經合適修飾的堿基處。通常也修飾微載體以摻入通過其可形成共價連接的部分，但也可利用正常存在于微載體上的官能團。通過將IMP與微載體在允許共價復合體形成的條件下(如在存在交聯劑時或通過使用包含可與IMP形成共價鍵的活化部分的活化微載體)孵育來形成IMP/MC。
大量的交聯技術為本領域所公知，并包括與氨基、羧基和巰基反應的交聯劑。對本領域技術人員顯而易見的是交聯劑和交聯法的選擇取決于IMP和微載體的構型及所期望的IMP/MC復合體的最終構型。交聯劑可為同雙功能的或異雙功能的。當使用同雙功能交聯劑時，交聯劑利用IMP和MC上的相同部分(如當IMP和MC包含一個或多個游離胺時，可使用醛交聯劑來共價連接IMP和MC)。異雙功能交聯劑利用IMP和MC上的不同部分(如馬來酰亞胺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯可用于共價連接IMP上的游離巰基和MC上的游離胺)，并且其在使微載體間鍵的形成最小化方面是優選的。在大多數情況下，優選通過在微載體上的第一交聯部分和在IMP上的第二交聯部分來交聯，其中第二交聯部分不存在于微載體上。產生IMP/MC復合體的一種優選方法是通過與異雙功能交聯劑孵育來活化微載體，然后將IMP與活化的MC在適于反應的條件下孵育而形成IMP/MC復合體。交聯劑可在兩個反應部分之間摻入＂間隔臂＂，或交聯劑中的兩個反應部分可直接連接。
在一個優選的實施方案中，IMP部分包含至少一個游離巰基(如由5′-巰基修飾的堿基或接頭提供)用于交聯微載體，同時微載體包含游離氨基。可以使用與這兩個基團反應的異雙功能交聯劑(如包含馬來酰亞胺基團和NHS-酯的交聯劑)，諸如琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯活化MC，然后共價交聯IMP以形成IMP/MC復合體。
非共價IMP/MC復合體可通過任何非共價結合或相互作用連接，其中非共價結合或相互作用包括離子(靜電)鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華引力、或兩種或多種不同相互作用的組合，當利用結合對連接IMP和MC時通常就是這樣。
優選的非共價IMP/MC復合體一般通過疏水或靜電(離子)相互作用或它們的組合而復合(例如，通過IMP和連接至MC上的多核苷酸之間的堿基配對，即使用結合對)。由于多核苷酸主鏈的親水特性，依賴疏水相互作用形成復合體的IMP/MC復合體通常需要修飾復合體的IMP部分以摻入高度疏水部分。優選地，疏水部分為生物相容的、非免疫原性的并天然存在于該組合物欲施用的個體體內(例如，該疏水部分可在哺乳動物，尤其是人體內找到)。優選的疏水部分的實例包括脂類、類固醇類、固醇類如膽固醇和萜類。當然，將疏水部分連接至IMP的方法取決于IMP的構型和疏水部分的特性。可在IMP中的任何適宜位點添加疏水部分，優選地在5′或3′端添加；在將膽固醇部分添加至IMP時，優選地使用常規化學反應將該膽固醇部分添加至IMP的5′端(參見如Godard等人(1995)，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)232404-410)。優選地，用于通過疏水鍵連接的IMP/MC復合體中的微載體由疏水材料如油滴或疏水聚合物制成，但也可使用經修飾摻入了疏水部分的親水材料。當該微載體為脂質體或其它包含腔的液相微載體時，在制備MC后通過混合IMP和MC而形成IMP/MC復合體，從而避免在MC制備過程中對IMP的包裹。
通過靜電結合的非共價IMP/MC復合體一般利用多核苷酸主鏈的高負電荷。因此，用于非共價結合的IMP/MC復合體中的微載體通常在生理pH(如約pH 6.8-7.4)下為帶正電荷的(陽離子)。微載體可本身就具有正電荷，但使用一般不具有正電荷的化合物制備的微載體可通過衍生或修飾而成為帶正電荷的(陽離子)。例如，可衍生用于制備微載體的聚合物，以添加帶正電荷的基團，如伯胺。另外，可在生產過程中將帶正電的化合物摻入微載體制劑中(例如，在聚(乳酸)/聚(羥基乙酸)共聚物的生產過程中可使用帶正電荷的表面活性劑，以在所得的微載體粒子上賦予正電荷)。
如此處所述，為制備陽離子微球，可將陽離子脂類或聚合物，如1，2-二油酰基-1，2，3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)或聚賴氨酸根據它們在DP或CP相中的溶解度加至DP或CP中。
如此處所述，可以通過多核苷酸和微球粒子一起孵育，優選地在含水混合物中孵育，使多核苷酸吸附至陽離子微球上預形成IMP/MC復合體。此孵育可在任何期望條件下實施，包括環境溫度(室溫)(如，約20℃)或在冷藏下(如4℃)。由于陽離子微球和多核苷酸能相對快地結合，孵育可持續任一適宜的時間段，如5、10、15分鐘或更多，包括過夜和更長的孵育。例如，通過將包含ISS的多核苷酸和微球于4℃過夜含水孵育可使其吸附至陽離子微球上。但是，由于陽離子微球和多核苷酸能自發結合，通過將多核苷酸和MC簡單地共施用也可形成IMP/MC復合體。在多核苷酸結合前后可通過微球的大小和表面電荷對其進行表征。然后在如本文描述的建立的人外周血單核細胞(PBMC)和小鼠脾細胞試驗中評估所選擇批次與合適的對照相比的活性。也可在合適的動物模型中評估該制劑。
通過核苷酸堿基配對連接的非共價IMP/MC復合體可用常規方法制備。通常，用包含連接有，優選地共價連接有至少部分互補于IMP的多核苷酸(＂捕捉多核苷酸＂)的微載體制備堿基配對的IMP/MC復合體。IMP和捕捉核苷酸之間的互補片段優選至少有6、8、10或15個相鄰堿基對，更優選至少20個連續堿基對。捕捉核苷酸可通過本領域公知的任一方法連接至MC，且優選在5′或3′端共價連接IMP。
在其它實施方案中，可使用結合對連接IMP/MC復合體中的IMP和MC。結合對可為受體和配體、抗體和抗原(或表位)、或任何其它以高親和性結合的結合對(例如，Kd小于約10-8)。一類優選的結合對為生物素和鏈親和素或為生物素和親和素，它們可形成緊密的復合體。當使用結合對介導IMP/MC復合體的結合時，用結合對中的一員衍生IMP，一般通過共價鍵合衍生，且用結合對中的另一員衍生MC。這兩種衍生化合物的混合將導致IMP/MC復合體的形成。
許多IMP/MC復合體的實施方案不包括抗原，且某些實施方案排除與疾病或紊亂相關的抗原，其中所述疾病或紊亂為IMP/MC復合體的治療對象。在另外的實施方案中，IMP還結合一個或多個抗原分子。抗原可以以多種方式(包括共價和/或非共價相互作用)與IMP/MC復合體中的IMP部分偶聯，這一點參見例如WO 98/16247中描述。另外，抗原可與微載體連接。IMP上連接有抗原的IMP/MC復合體中，抗原與IMP的連接可通過本文中描述的技術和本領域公知的技術來實現，這些技術包括但不限于直接的共價鍵合、通過交聯劑部分(其可包括間隔臂)的共價偶聯、通過特異結合對(如生物素和親和素)的非共價偶聯以及通過靜電或疏水作用的非共價偶聯。
本發明的方法本發明提供了調節個體免疫反應的方法，其中個體優選地為哺乳動物，更優選地為人，該方法包括施與個體此處所述的含有ISS的多核苷酸。免疫調節可包括刺激Th1-類免疫反應和/或抑制或降低Th2-類免疫反應。含有ISS的多核苷酸以足以調節免疫反應的量施用。如本文所述，免疫反應的調節可為對體液和/或細胞免疫反應的調節，并且該調節可用本領域的標準技術及按此處所述測定。
許多個體適于接受本文所述的免疫調節性多核苷酸。優選地(但非必需)，個體為人。
在某些實施方案中，個體患有與Th2-類免疫反應相關的疾病，如變態反應或變態反應-誘導的哮喘。含有ISS的多核苷酸的施用將導致免疫調節，提高一種或多種與Th1-類反應相關的細胞因子的水平，這可導致與個體的變應原反應相關的Th2-類反應特征的減少。對患有Th2-類反應相關疾病的個體的免疫調節可導致減輕或改善一個或多個疾病癥狀。如果疾病為變態反應或變態反應-誘導的哮喘，一個或多個癥狀的改善包括減輕一個或多個以下癥狀鼻炎、變應性結膜炎、循環IgE水平、循環組胺水平和/或對′搶救性′吸入器療法(例如，通過計量給藥吸入器或噴霧器而施用的吸入舒喘靈)的需要。
在進一步的實施方案中，接受本發明免疫調節治療的個體為接受疫苗的個體。疫苗可為預防性疫苗或治療性疫苗。預防性疫苗包含與個體可能有危險罹患的疾病相關的一個或多個表位(例如，分枝結核桿菌抗原作為疫苗用于預防結核病)。治療性疫苗包含與感染個體的特定疾病相關的一個或多個表位，如結核病患者體內的分枝結核桿菌或牛結核分枝桿菌(M.bovis)表面抗原、在產生變態反應的個體體內使個體產生變應性的抗原(即變態反應脫敏療法)、來自癌癥患者的腫瘤細胞(例如，在美國專利號5,484,596中所述)、或癌癥患者的腫瘤相關抗原。如以下實施例3中所示，將含有ISS的多核苷酸與肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))聯合施用導致靈長類體內的抗HBsAg抗體效價較僅施用HBsAg時產生的抗體效價升高。
含有ISS的多核苷酸可以與疫苗聯用(例如，與疫苗一同注射或同時但分別注射)或含有ISS的多核苷酸可分開施用(例如，在疫苗施用前后至少12小時)。在某些實施方案中，疫苗的抗原是ISS的一部分，該抗原共價或非共價連接至ISS。與接受疫苗但不接受含有ISS的多核苷酸的個體比較，對接受疫苗的個體施用免疫調節性多核苷酸治療導致對疫苗的免疫反應移向Th1-類反應。向Th1-類反應的偏移可通過如下來識別，即，出現對疫苗中抗原的遲發型超敏(DTH)反應、升高的IFN-γ和其它Th1-類反應相關細胞因子、特異針對疫苗中抗原的CTL的產生、特異針對疫苗中抗原的IgE水平的下降或減少、特異針對疫苗中抗原的Th2-相關抗體的減少、和/或對疫苗中抗原具有特異性的Th1-相關抗體的升高。在治療性疫苗的情況下，含有ISS的多核苷酸和疫苗的施用可導致疫苗所欲治療的疾病的一種或多種癥狀得以改善。正如本領域技術人員顯而易見的，改進的確切癥狀和改進的方式取決于所欲治療的疾病。例如，當治療性疫苗針對結核病時，用含有ISS的多核苷酸與疫苗治療導致咳嗽、胸膜或胸壁痛、發燒和/或本領域公知的其它癥狀減輕。當疫苗為用于變態反應脫敏療法中的變應原時，所述治療導致變態反應癥狀的減輕(例如，鼻炎、變應性結膜炎減輕、循環IgE水平和/或循環組胺水平降低)。
本發明的其它實施方案涉及對已患有疾病或紊亂如癌癥或感染性疾病的個體的免疫調節治療。癌癥是有吸引力的進行免疫調節的靶標，因為大多數癌表達腫瘤相關抗原和/或腫瘤特異性抗原，這些抗原在體內其它細胞上不存在。刺激針對腫瘤細胞的Th1-類反應導致免疫系統直接和/或旁觀者殺傷腫瘤細胞，導致腫瘤細胞減少和/或癥狀減輕。將含有ISS的多核苷酸施用給患有癌的個體可導致刺激針對腫瘤細胞的Th1-類免疫反應。此免疫反應通過細胞免疫系統的細胞(如CTL)或體液免疫系統的組分的直接作用，或通過對免疫系統靶向細胞的鄰近細胞的旁觀者效應殺傷腫瘤細胞。參見如Cho等人(2000)，自然生物技術(Nat.Biotechnol.)18509-514。在癌癥的情況下，含有ISS的多核苷酸的施用還可包括一種或多種其它治療劑如抗腫瘤抗體、化學治療方案和/或放射治療的施用。抗腫瘤抗體包括但不限于抗腫瘤抗體片段和/或其衍生物、以及單克隆抗腫瘤抗體、片段和/或其衍生物，它們是本領域公知的，且在腫瘤治療中施用此類抗體制劑(例如，RITUXAN(rituximab)；HERCEPTIN(trastuzumab))也為本領域公知。一種或多種其它治療劑的施用可在含有ISS的多核苷酸施用前、后和/或同時進行。
根據本發明的免疫調節治療也可用于患有感染性疾病的個體，其中感染性疾病尤其是抗體液免疫反應的感染性疾病(例如，由分枝桿菌感染和胞內病原體引起的疾病)。免疫調節治療可用于治療由細胞病原體(如細菌或原生動物)或亞細胞病原體(如病毒)引起的感染性疾病。可將ISS治療施與患有分枝桿菌疾病的個體，其中疾病如結核病(例如，分枝結核桿菌和/或牛結核分枝桿菌感染)、麻風病(即麻風分枝桿菌(M leprae)感染)或海分枝桿菌(M.marinum)或潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)感染。ISS治療也可用于治療病毒性感染，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒尤其是單純皰疹病毒和乳頭瘤病毒感染。由胞內寄生蟲引起的疾病也可受益于ISS治療，所述疾病如瘧疾(例如，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、惡性瘧原蟲(P.falciparum)和/或三日瘧原蟲(P.malariae)引起的感染)、利什曼病(例如，杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、熱帶利什曼原蟲(L.tropica)、墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)、巴西利什曼原蟲(L.braziliensis)、秘魯利什曼原蟲(L.peruviana)、嬰兒利什曼原蟲(L.infantum)、L.chagasi和/或埃塞俄比亞利什曼原蟲(Leishmania aethiopica)引起的感染)、以及弓形體病(即鼠弓形體(Toxoplasmosis gondii)引起的感染)。ISS治療也可用于治療寄生蟲病如血吸蟲病(即由血吸蟲屬血吸蟲如埃及血吸蟲(S.haematobium)、曼氏血吸蟲(S.mansoni)、日本血吸蟲(S.japonicum)和湄公血吸蟲(S.mekongi)引起的血吸蟲感染)和枝睪吸蟲病(即由華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)引起的感染)。將含有ISS的多核苷酸施與患有感染性疾病的個體可導致感染性疾病的癥狀改善。在一些實施方案中，感染性疾病非病毒性疾病。
本發明還提供了升高或刺激個體的至少一種Th1-相關細胞因子的方法，其中所述Th1-相關細胞因子包括IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ和IFN-α。在某些實施方案中，本發明提供了升高或刺激個體體內的IFN-γ的方法，所述個體尤其是需要增高的IFN-γ水平的個體，其方式是通過給個體施用有效量的含有ISS的多核苷酸，從而升高IFN-γ。需要增高的IFN-γ水平的個體為那些患有一般對施用IFN-γ有反應的疾病的個體。此類疾病包括許多炎性疾病，包括但不限于潰瘍性結腸炎。此類疾病也包括許多纖維化疾病，包括但不限于特發性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射引發的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲病引發的肝纖維化)、腎纖維化以及其它可通過施用IFN-γ而改善的疾病。施用本發明的含有ISS的多核苷酸將導致IFN-γ水平升高，并導致響應IFN-γ的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩定和/或疾病的發展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。
本發明的方法可與組成疾病護理標準的其它療法聯用，如對IPF與施用抗炎劑諸如全身皮質類固醇療法(如考的松)聯用。
在某些實施方案中，本發明提供了升高個體體內的IFN-α的方法，所述個體尤其是需要增高的IFN-α水平的個體，其方式是通過給個體施用有效量的含有ISS的多核苷酸，從而升高IFN-α水平。需要增高的IFN-α的個體為那些患有一般對施用IFN-α(包括重組IFN-α)有反應的疾病的個體，此類疾病包括但不限于病毒性感染和癌癥。在某些實施方案中，如本文所述，能有效誘導IFN-α產生的免疫調節性多核苷酸除了包含ISS外，還包含一個或多個TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，尤其是包含在ISS的5’端。該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列可緊挨著ISS的5′，或位于ISS的5′但兩者之間有1個或多個堿基的間隔。在一些實施方案中，該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產生。在一些實施方案中，如果額外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列是通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產生的，則該額外的序列可與ISS一起產生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
可特別有效地誘導IFN-α產生的免疫調節性多核苷酸的實例包括但不限于SEQ ID NO1、14、19、46、24、11、18、35、12、13、28和36。
施用本發明的含有ISS的多核苷酸可導致IFN-α水平升高，并導致響應IFN-α的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩定和/或疾病的發展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。本發明的方法可與組成疾病護理標準的其它療法聯用，如對于病毒性感染可與施用抗病毒劑聯用。
本發明還提供了對患有IgE-相關疾病的個體降低其IgE水平，尤其是血清IgE水平的方法，其方式是向個體施用有效量的含有ISS的多核苷酸。在此類方法中，免疫調節性多核苷酸可單獨施用(如，無抗原)或與抗原如變應原聯合施用。IgE的降低將導致IgE-相關疾病的一種或多種癥狀得以改善。此類癥狀包括變態反應癥狀(如鼻炎、結膜炎)，癥狀改善包括對變應原的敏感性降低、發生變態反應的個體的變態反應癥狀減輕或變態反應的嚴重程度降低。因此，本發明也提供了治療個體的變應性疾病的方法。在一些實施方案中，治療變應性疾病的方法包括將免疫調節性多核苷酸與一定量或劑量的抗原聯合施用。對于任何額外的抗原施用，所施用的抗原量或劑量在治療期間可保持相同、或可減少或增加(如在常規的脫敏療法中一樣)。
在一些實施方案中，本發明提供了刺激個體產生CTL的方法，所述個體尤其是需要增高的CTL數目和/或活性的個體，該方法包括施用有效量的含有ISS的多核苷酸給個體，從而提高CTL的產生。需要增高的CTL產生的個體為那些患有一般對CTL活性有反應的疾病的個體。此類疾病包括但不限于癌癥和胞內感染。施用本發明的含有ISS的多核苷酸將導致CTL水平升高，并導致響應CTL活性的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩定和/或疾病的發展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。
本發明的方法包括本文所述的任何實施方案，如以免疫調節性多核苷酸/微載體復合體形式(有或沒有抗原，或在施用過程中有或沒有抗原)，或與抗原緊鄰連接的形式施用含有ISS的多核苷酸。
對本領域技術人員顯而易見的是，對于施用含有ISS的多核苷酸的特定適應癥，本發明的方法可與其它療法聯用。例如，ISS療法可與抗瘧疾藥如氯喹聯用施與瘧疾患者、可與殺利什曼原蟲藥如戊烷脒和/或別嘌呤醇聯用施與利什曼病患者、可與抗分枝桿菌藥如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇聯用施與結核病患者、或可與變應原脫敏療法聯用施與特應性(變態反應)患者。
如此處所述，含有ISS的多核苷酸的施用還可包括一種或多種其它免疫治療劑(即通過免疫系統起作用的治療劑和/或來自于免疫系統的治療劑)的施用，其中所述免疫治療劑包括但不限于細胞因子、佐劑和抗體(包括但不限于抗體片段和/或衍生物，以及單克隆抗體、其片段和/或衍生物)。治療性抗體的實例包括那些用于癌癥的抗體(如抗腫瘤抗體)。此類額外免疫治療劑的施用適用于本文所述的所有方法。
含有ISS的多核苷酸也可與佐劑聯用。與僅包含ISS和抗原的組合物所產生的免疫反應相比，抗原與ISS和佐劑聯合施用可導致對抗原的免疫反應增強，并由此導致增強的免疫反應。佐劑為本領域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明礬(鋁鹽)、脂質體和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合適的佐劑還包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細胞壁制品、單磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激復合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激復合物、以及基于脂的佐劑和本文描述的其它佐劑。對于獸用及在動物體內產生抗體，可使用弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)的促有絲分裂組分。
施用和評估免疫反應如此處所述，含有ISS的多核苷酸可與其它藥劑和/或免疫原性試劑和/或免疫刺激劑聯合施用，并可組合其生理可接受載體(就此本發明包括這些組合物)。含有ISS的多核苷酸可為本文描述的任何此類多核苷酸。
因此，含有ISS的多核苷酸可與其它免疫治療劑聯用，所述免疫治療劑包括但不限于細胞因子、佐劑和抗體。
如所有的免疫原性組合物一樣，特定的含有ISS的多核苷酸制劑的免疫有效量和施用方法根據個體、欲治療的疾病和為本領域技術人員顯然的其它因素的不同而不同。待考慮的因素包括所施用抗原的抗原性、含有ISS的多核苷酸是否與佐劑、遞送分子或和/或抗原聯合施用或與它們共價連接、施用途徑和欲施用的免疫給藥次數。此類因素為本領域公知，并且不用過多試驗而對它們作出確定也屬于本領域技術人員的技術范圍。合適的劑量范圍是能為免疫反應提供所需調節(如刺激IFN-γ和/或IFN-α)的劑量范圍。當針對抗原的免疫反應為所需要的時，合適的劑量范圍為能為抗原免疫反應提供所需調節的劑量范圍。通常，劑量由施用于患者的含有ISS的多核苷酸的量而不是由所施用的含有ISS的組合物的總量而確定。含有ISS的多核苷酸的有用劑量范圍(以遞送的含有ISS的多核苷酸的量給出)可以例如為下列任一個約1至500μg/kg，100至400μg/kg，200至300μg/kg，1至100μg/kg，100至200μg/kg，300至400μg/kg，400至500μg/kg。施與每一患者的絕對量取決于藥理學特性如生物利用度、清除率和施用途徑。
特定的含有ISS的多核苷酸制劑的有效量和施用方法根據患者個體、所需結果和/或疾病類型、疾病價段和本領域技術人員明了的其它因素可不同。具體應用時的施用途徑對本領域技術人員是顯而易見的。施用途徑包括但不限于局部的、皮膚的、經皮膚的、經粘膜的、表皮的、腸胃外的、腸胃的以及鼻咽的和肺的(包括經支氣管的和經肺泡的)施用途徑。合適的劑量范圍為這樣的劑量范圍，其提供了足夠的含有ISS的組合物，通過測定血液水平足以達到約1-10μM的組織濃度。施與每一患者的絕對量取決于藥理學特性如生物利用度、清除率和施用途徑。
如此處所述，APC和具有高濃度APC的組織為含有ISS的多核苷酸的優選靶。因此，將含有ISS的多核苷酸施用至APC以相對高的濃度存在的哺乳動物皮膚和/或粘膜處是優選的。
本發明提供了適用于局部應用的含有ISS的多核苷酸制劑，包括但不限于生理可接受的植入物、軟膏、霜劑、洗劑和凝膠。局部施用為例如通過其中分散有遞送系統的敷料或繃帶施用、將遞送系統直接施用入切口或開放性傷口、或通過定向于目標位點的經皮膚施用裝置來施用。其中分散有含有ISS的多核苷酸的霜劑、洗劑、凝膠或軟膏適用于用作局部軟膏或傷口充填劑。
優選的皮膚施用途徑為那些對皮膚侵害最小的途徑。這些方式中優選的為經皮膚遞送、表皮施用和皮下注射。在這些方式中，由于預計皮內組織中存在較高濃度的APC，優選表皮施用。
經皮膚施用通過應用可使得含有ISS的多核苷酸透過皮膚并進入血流的霜劑、洗劑、凝膠等來實現。適于經皮膚施用的組合物包括但不限于直接應用于皮膚或摻入保護性載體如經皮膚載置(所謂＂貼劑＂)中的可藥用混懸液、油、霜劑和軟膏。合適的霜劑、軟膏等的實例可例如在Physician′s Desk Reference中找到。
對于經皮膚遞送，離子電滲是一合適的方法。離子電滲遞送可通過市售的貼劑而完成，其中貼劑可以通過未破損皮膚持繼遞送它們的產物幾天或更長時間。該方法的使用使得藥物組合物能以相對大的濃度受控遞送、并允許輸注組合藥物及同時使用吸收促進劑。
用于該方法中的示例性貼劑產品是Los Angeles，CA的GeneralMedical Company的商標為LECTRO PATCH的產品。該產品通過電子方式維持貯庫電極在中性pH并能適應于提供不同濃度的劑量以及連續地和/或周期性地給藥。貼劑的準備和使用應按照與LECTRO PATCH產品在一起的、廠商印制的說明書進行；這些說明書在此引用作為參考。其它封閉式貼劑體系也是合適的。
對于經皮膚遞送，低頻超聲遞送也是一合適的方法。Mitragotri等人(1995)科學(Science)269850-853。低頻超聲頻率(約1MHz)的應用允許治療組合物(包括那些具有高分子量的治療組合物)的總體受控遞送。
表皮施用基本上涉及機械刺激或化學刺激最外層表皮，而且所述刺激將足以激發對該刺激的免疫反應。具體而言，該刺激應足以將APC吸引至刺激位點。
一個示例性的機械刺激方式使用多個直徑非常狹窄的短齒，其可用于刺激皮膚并將APC吸引至刺激位點，以攝取從齒的末端轉移出的ISS。例如，法國Lyon的Pasteur Merieux生產的MONOVACC舊結核菌素試驗包含適于導入含免疫調節性多核苷酸的組合物的裝置。
該裝置(由Swiftwater，PA的Connaught Laboratories，Inc.在美國供銷)由在一端具有注射器推進器和在另一端具有齒盤的塑料容器組成。齒盤上固定著具有一定長度的多個直徑狹窄的齒，以致其恰好能刮搔表皮的最外層細胞。MONO-VACC試劑盒中的每個齒都包被有舊結核菌素；在本發明中，每個針都包被有免疫調節性多核苷酸制劑的藥物組合物。該裝置的使用優選按照包括在該裝置產品中的、廠商所寫的說明書進行。在此實施方案中也可使用的類似裝置為目前用于實施變態反應試驗的那些。
表皮施用含有ISS的多核苷酸的另一合適方法是使用化學品，該化學品能刺激表皮的最外層細胞，因此激發可吸引APC至該區域的足夠的免疫反應。一個實例為角質裂解劑，如由Noxema Corporation以商標NAIR賣出的市售局部脫毛霜劑中使用的水楊酸。該方法也可用于實現粘膜的上皮施用。化學刺激劑也可與機械刺激物聯合應用(例如，如果MONO-VACC類齒也包被有化學刺激劑，則存在此聯合應用)。含有ISS的多核苷酸也可懸于包含化學刺激劑的載體中或與該化學刺激劑共施用。
腸胃外的施用途徑包括但不限于電注射(離子電滲)或直接注射如直接注射入中央靜脈、靜脈內注射、肌內注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射。適用于腸胃外施用的含有ISS的多核苷酸的制劑通常配制在USP水或注射用水中，并且還可包含pH緩沖劑、鹽填充劑、防腐劑和其它可藥用賦形劑。用于腸胃外注射的免疫調節性多核苷酸可配制在可藥用無菌等滲溶液如注射用鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水中。
胃腸施用途徑包括但不限于吞咽和直腸途徑。本發明包括的適于胃腸施用的含有ISS的多核苷酸的制劑，包括但不限于用于吞咽給藥的可藥用粉劑、片劑或液體及用于直腸施用的栓劑。對本領域技術人員顯而易見的是片劑或栓劑還將包含可藥用固體如淀粉，以填充組合物。
鼻咽的和肺的施用可通過吸入實施，并包括遞送途徑如鼻內途徑、經支氣管途徑和經肺泡途徑。本發明包括適于吸入施用的含有ISS的多核苷酸的制劑，包括但不限于用于形成氣霧的液態懸浮劑及用于干粉吸入遞送系統的粉劑。對于吸入施用ISS制劑，適用的裝置包括但不限于噴霧器、蒸發器、霧化器和干粉吸入遞送裝置。
本領域熟知，用于本文所述施用途徑的溶液或懸液可包括任一或多種下列組分無菌稀釋劑如用于注射的水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調節張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿如鹽酸或氫氧化鈉調節pH。腸胃外制品可封裝在用玻璃或塑料制備的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
本領域熟知，適于注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(如果溶于水的話)或分散體和用于當時制備可注射的無菌溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑制細菌的水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須無菌并應為流動性達到易于注射程度的流體。該組合物在制備和存儲條件下應是穩定的，并且必須在抗微生物如細菌或真菌的污染作用的條件下存儲。載體可為含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和它們的合適混合物的溶劑或分散介質。合適的流動性可以如通過使用包衣劑如卵磷脂、對于分散體通過保持所需的粒徑、以及通過使用表面活性劑來維持。微生物作用的防止可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑來實現，如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在組合物中包括等張劑，如糖、聚醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉可能是優選的。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠而產生。
本領域熟知，無菌可注射液可通過將活性化合物以所需量摻入合適的溶劑中，然后過濾除菌而制備，其中所述溶劑根據需要具有上面列舉的一種成分或多種成分的組合。一般，分散體通過將活性化合物摻入無菌賦形劑而制備，其中所述無菌賦形劑包含基本分散介質和所需的來自上述的其它成分。對于用于制備無菌可注射液的無菌粉末，優選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，這些方法產生含有來自前述無菌過濾溶液的活性成分及任何其它所需成分的粉末。
遞送途徑的選擇可用于調節所引發的免疫反應。例如，當流感病毒載體通過肌內或表皮(基因槍)途徑施用時，IgG效價和CTL活性是相同的；但是，肌肉接種主要產生IgG2a，而表皮途徑主要產生IgG1。Pertmer等人(1996)，病毒學雜志(J.Virol.)706119-6125。因此，本領域技術人員可利用本發明免疫調節性多核苷酸的不同施用途徑所引發的免疫原性的輕微差別。
上述組合物和施用方法旨在描述而不用于限制本發明含有ISS的多核苷酸制劑的施用方法。制備各種組合物和裝置的方法在本領域技術人員的能力范圍內，在此不再詳述。
針對ISS的免疫反應可以按任一本領域公知的方法進行分析(定性和定量分析)，包括但不限于測定抗原特異性的抗體產生(包括測定特異的抗體亞類)、特異淋巴細胞群如CD4+T細胞、NK細胞或CTL的活化、細胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10或IL-12的產生和/或組胺的釋放。測定特異性抗體反應的方法包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，并且為本領域熟知。特定類型淋巴細胞如CD4+T細胞數目的測定可例如用熒光激活的細胞分選法(FACS)完成。細胞毒性和CTL試驗可例如如Raz等人(1994)，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)919519-9523和Cho等人(2000)所述進行。細胞因子濃度可例如通過ELISA測定。這些和其它用于評估針對免疫原的免疫反應的試驗為本領域熟知。參見如細胞免疫學中的選擇方法(Selected Methods inCellular Immunology)(1980)Mishell和Shiigi編輯，W.H.Freeman andCo.。
優選地，刺激，即引發和/或增強Th1-類反應。關于本發明，對Th1-類免疫反應的刺激可通過體外或離體測定ISS處理的細胞的細胞因子產生并與未用ISS處理的細胞相比來確定。確定細胞的細胞因子產生的方法包括那些本文中描述的方法及本領域公知的任何方法。響應ISS處理產生的細胞因子的類型表明了細胞產生的是偏向Th1-類或Th2-類的免疫反應。如此處所用，術語＂偏向于Th1-類的＂細胞因子產生是指在存在刺激劑時Th1-類免疫反應相關細胞因子的產生與缺乏刺激時此類細胞因子的產生相比，前者可測量地升高。此類偏向于Th1-類的細胞因子的實例包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反，＂偏向于Th2-類的細胞因子＂是指那些與Th2-類免疫反應相關的細胞因子，其包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13。可用于測定ISS活性的細胞包括免疫系統的細胞、分離自宿主的原代細胞和/或細胞系，優選地為APC和淋巴細胞，甚至更優選地為巨噬細胞和T細胞。
對Th1-類免疫反應的刺激也可在使用含有ISS的多核苷酸處理的宿主中測定，并且可用本領域公知的任一方法測定，包括但不限于(1)任選地與接觸過抗原的或接觸過抗原并被攻擊過的、未用ISS處理過的對照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后測定到IL-4或IL-5的水平降低；或檢測到較低(或甚至沒有檢測到)IL-4或IL-5水平，(2)與接觸過抗原的、或接觸過抗原并被攻擊過的未用ISS處理過的對照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)的水平升高；或檢測到較高的IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)水平；(3)與未用ISS處理的對照比較，在ISS處理的宿主中產生＂偏向于Th1-類的＂抗體；和/或(4)與接觸過抗原的或接觸過抗原并被攻擊過的、未用ISS處理過的對照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后檢測到抗原特異性IgE的水平降低；或檢測到較低(或甚至沒有檢測到)抗原特異性IgE的水平。這些測定中的許多可通過使用此處描述的方法或任一本領域公知的方法體外或離體測量由APC和/或淋巴細胞，優選地由巨噬細胞和/或T細胞產生的細胞因子來實現。這些測定中的一些測定可通過使用此處描述的方法或任一本領域公知的方法測量抗原特異性抗體的類和/或亞類來實現。
應答含有ISS的多核苷酸處理所產生的抗原特異性抗體的類和/或亞類表明細胞產生的是偏向于Th1-類或偏向于Th2-類的免疫反應。如此處所用，術語＂偏向于Th1-類的＂抗體產生是指與Th1-類免疫反應相關的抗體(即Th1-相關抗體)的產生可測定地升高。可測定一種或多種Th1相關抗體。此類偏向于Th1-類的抗體的實例包括但不限于人IgG1和/或IgG3(參見如Widhe等人(1 998)Scand.J Immunol.47575-581和deMartino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83160-164)和鼠IgG2a。相反，＂偏向于Th2-類的抗體＂是指那些與Th2-類免疫反應相關的抗體，其包括但不限于人IgG2、IgG4和/或IgE(參見如Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及鼠IgG1和/或IgE。
由于施用含有ISS的多核苷酸而發生的對偏向于Th1-類的細胞因子的誘導可導致增強的細胞免疫反應，如那些由NK細胞、細胞毒殺傷細胞、Th1輔助細胞和記憶細胞實施的免疫反應。這些反應用在抗病毒、真菌、原生動物寄生蟲、細菌、變應性疾病、哮喘及腫瘤的預防性或治療性疫苗接種上尤其有益。
在一些實施方案中，Th2反應被抑制(減少)。Th2反應的抑制可通過如Th2相關細胞因子(諸如IL-4和IL-5)水平的降低、Th2相關抗體水平的降低、及應答變應原的IgE的降低和組胺釋放的減少來確定。
本發明的試劑盒本發明提供了試劑盒。在某些實施方案中，本發明的試劑盒一般包含一個或多個容器，容器中包含有本文所述的任何含有ISS的多核苷酸。試劑盒還可包含一套有關含有ISS的多核苷酸的用途的適當說明書，通常為書面說明書，所述用途為在任一本文所述的方法中的應用(例如，免疫調節、改善感染性疾病的一種或多種癥狀、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相關疾病)。
試劑盒可包含包裝在任一方便合適的包裝中的含有ISS的多核苷酸。例如，如果該含有ISS的多核苷酸為干燥制劑(例如，冷凍干燥的或干粉)，通常使用帶彈性塞的小瓶，這樣通過彈性塞注入液體可容易地將含有ISS的多核苷酸重懸。帶有無彈性可摘取封口(如封口玻璃)的安瓿或帶有彈性塞的安瓿最適用于含有ISS的多核苷酸的液體制劑。也可考慮使用與特定的裝置如吸入器、鼻施用裝置(如噴霧器)或輸注裝置如微型泵組合應用的包裝。
有關含有ISS的多核苷酸的用途的說明書通常包括劑量、給藥方案及針對預期使用方法的施用途徑的信息。用于含有ISS的多核苷酸的容器可為單位劑量、大包裝(如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明試劑盒中提供的說明書一般為標簽或包裝插入物上的書面說明書(如，包括在試劑盒中的紙片)，但可機讀的說明書(如在磁盤或光存儲盤上攜帶的說明書)也可接受。
在一些實施方案中，試劑盒還包含抗原(或包含一種或多種抗原)，該抗原可與或不與含有ISS的多核苷酸包裝在同一容器(制劑)中。文中已描述了抗原。
在某些實施方案中，本發明的試劑盒包含以免疫調節性多核苷酸/微載體復合體(IMP/MC)形式存在的含有ISS的多核苷酸，并還可包含一套涉及該IMP/MC復合體用途的說明書，通常為書面說明書，所述用途為在任一此處所述的方法中的應用(例如，免疫調節、改善感染性疾病的一種或多種癥狀、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相關疾病)。
在一些實施方案中，本發明的試劑盒包含用于產生IMP/MC復合體的材料，通常包括分開裝有IMP和MC的容器，但在某些實施方案中提供的是用于產生MC的材料而不是預形成的MC。IMP和MC優選以如下形式提供，所述形式允許所提供的IMP和MC在混合后可形成IMP/MC復合體。當IMP/MC復合體通過非共價鍵連接時，優選這種配置。當IMP和MC待通過異雙功能交聯劑交聯時；當IMP或MC以＂活化＂形式(例如，連接在異雙功能交聯劑上，這樣可獲得與IMP反應的部分)提供時，也優選這種配置。
對于包含液相MC的IMP/MC復合體，試劑盒優選地包含一個或多個容器，容器中含有用于產生液相MC的材料。例如，對于水包油的乳液MC，IMP/MC試劑盒可包含一個或多個含有油相和水相的容器。乳化容器中的內容物以產生MC，然后其可與IMP混合，優選地與已修飾而摻入了疏水部分的IMP混合。此類材料包括用于產生水包油乳液的油和水，或者包括含有冷凍干燥脂質體組分(如磷脂、膽固醇和表面活性劑的混合物)的容器加上含有水相(例如，可藥用的水性緩沖液)的一個或多個容器。
提供下列實施例來舉例闡述而非限制本發明。
實施例實施例1含有ISS的多核苷酸對鼠細胞的免疫調節試驗了免疫調節性多核苷酸(即含有ISS)或對照多核苷酸(即不合ISS)對小鼠脾細胞的免疫調節活性。受試多核苷酸為充分修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。在受試多核苷酸中設置了5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO59)(陽性對照)和5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)(陰性對照)。
BALB/c小鼠脾的碎片用溶解于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的膠原酶/分散酶(0.1U/mL/0.8U/mL)于37℃消化45分鐘，然后將消化的碎片通過金屬篩機械分散。離心沉淀分散的脾細胞，然后重懸于新鮮培養基(具10％胎牛血清的RPMI 1640，加上50單位/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素、2mM谷氨酰胺和0.05mM β-巰基乙醇)中。
將小鼠脾細胞分散在96孔板的孔中(7×107個細胞/ml)并于37℃孵育1小時。加入2倍濃度的試驗樣本或對照100μL，并再孵育細胞24小時。從每孔收獲培養基并通過ELISA試驗細胞因子濃度。在多個濃度包括5.0、1.0和0.1μg/ml下試驗多核苷酸。對照樣本包括單獨的培養基和PANSORBIN熱滅活的、福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(SAC)(CalBiochem)。
用夾心ELISA測定IFN-γ。來自小鼠脾細胞試驗的培養基在包被有抗IFN-γ單克隆抗體的微滴定板(Nunc)中孵育。用生物素化的抗IFN-γ抗體和鏈親和素-辣根過氧化物酶偶聯的二級抗體檢測結合的IFN-γ，用生色過氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)在過氧化物酶存在下顯色，并用Emax精確微板讀數儀(Molecular Devices)在450nm處測定光吸收值而定量。
與對照多核苷酸相比，含有ISS的免疫調節性多核苷酸實質性地提高了小鼠脾細胞IFN-γ的分泌。表2-5總結了應答5μg/ml多核苷酸所產生的IFN-γ的試驗結果。
表2.小鼠脾細胞試驗-IFNγ(pg/ml)
表3.小鼠脾細胞試驗-IFNγ(pg/ml)
表4.小鼠脾細胞試驗-IFNγ(pg/ml)
表5.小鼠脾細胞試驗-IFNγ(pg/ml)
實施例2含有ISS的多核苷酸對人細胞的免疫調節試驗了免疫調節性多核苷酸(即含有ISS)或對照樣本對人外周血單核細胞(PBMC)的免疫調節活性，其中所述對照樣本包括不含ISS的多核苷酸(5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)和5′-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO61))、SAC及僅培養基。受試多核苷酸為充分修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。
用肝素抗凝的注射器通過靜脈穿刺從自愿者收集外周血。將血液置于FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech)墊層上并離心。收集位于FICOLL分界處的PBMC，然后用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗兩次。重懸細胞，在24孔板或48孔板中以2×106個細胞/mL在含10％熱滅活的人AB血清加上50單位/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和1×MEM非必需氨基酸(NEAA)的RPMI1640中培養細胞。
細胞在存在20μg/ml受試樣本(免疫調節性多核苷酸或對照)時培養24小時，然后從每孔收集無細胞培養基并檢測IFN-γ和IFN-α濃度。用來自BioSource International，Inc.的CYTOSCREENTMELISA試劑盒按照廠商的說明書檢測IFN-γ和IFN-α。
含有ISS的多核苷酸刺激人PBMC分泌IFN-γ和/或IFN-α。在人PBMC試驗中，IFN-γ的背景水平可隨著供體的不同而不同，甚至是明顯不同。但其它細胞因子如IFN-α顯示了大體穩定的活化模式并且在未受刺激的情況下常規顯示低的背景水平。來自獨立PBMC供體的此類試驗結果的例子總結在表6中。
如表6中所示，對人細胞而言，某些免疫調節性多核苷酸可有效升高IFN-γ水平。同樣如表6中所示，對人細胞而言，某些免疫調節性多核苷酸在提升IFN-α水平方面尤其有效。此類多核苷酸通常包括那些在ISS的5′含有至少一個TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸，或那些通過將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產生的含有至少一個TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸。此類免疫調節性多核苷酸的例子包括但不限于SEQ ID NO1，14，19，46，24，11，18，12，13，28和36。
表6.人PBMC試驗-IFN(pg/ml)
表6(續)
表6(續)
表6(續)
表6(續)
表6(續)
表6(續)
實施例3靈長類動物對抗原+ISS的免疫反應檢測了狒狒對存在本發明的含有ISS的多核苷酸時施用的乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫反應。
HBsAg為酵母中產生的重組HBsAg。在研究開始時，狒狒的組中(每組5只)包括雄性和雌性狒狒，體重范圍為8-31kg(組平均體重為13-16kg)。
通過肌內注射(IM)1ml體積的20μg HBsAg免疫狒狒三次，間隔期為兩個月(第0、2和4月)。如下所列出的，一些組還接受了ISS加HBsAg。
在免疫前和免疫后2周收集所有動物的血。如下測定抗HBsAg IgG效價。用包被有來自人血漿的HBsAg的珠，使用AUSAB EIA商業試劑盒(Abbott Labs Cat.#9006-24和1459-05)分析狒狒血清樣本。一系列范圍在0-150mIU/ml的來自人血漿的HBsAg陽性和陰性標準品與試驗樣本一起進行測試。生物素偶聯的HBsAg和兔抗-生物素-HRP偶聯的抗體用作檢測用的二級抗體復合體。該試驗用鄰苯二胺(OPD)顯色，并在492nm處測定吸光值，在600nm處扣除本底(Quantum II分光光度計，Abbott Labs)。根據廠商確定的參數繪制標準曲線，應用樣本的吸光值從此曲線確定相應的抗HBsAg濃度，以毫國際單位/ml(mIU/ml)表示。對于稀釋的樣本，以樣本產生的導致0-150mIU/ml值的吸光度為基礎來定量，然后乘以稀釋系數可得到終濃度。
用單因素分差設計的比較(α＝0.05)，通過方差分析(NCSS97統計軟件程序，Kaysville，UT)對對數變換數據進行統計學分析。認為p≤0.05時具有顯著性。
試驗動物組如下進行免疫組1-20μg HBsAg；組2-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO59(ISS)；組3-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO60(無ISS)；組4-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO38(ISS)；組5-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO2(ISS)；組6-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO18(ISS)；組7-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO35(ISS)；研究結果如下表7所示。與僅施用HBsAg或施用HBsAg和無ISS的寡核苷酸相比，聯合施用包含ISS序列的寡核苷酸與HBsAg導致增高的抗HBsAg抗體效價。在成對比較中，組2(ISS寡核苷酸)中檢測到的免疫反應與組3(無ISS寡核苷酸)中檢測到的免疫反應有顯著性差異(第一次免疫后p＜0.05，第三次免疫后p＝0.06)。在與組2的成對比較中，組2和其它接受ISS寡核苷酸的組(組4、組5、組6和組7)在產生的免疫反應方面無顯著性差異。表7.免疫后血液樣本中的抗HBsAg
與僅施用HBsAg(組1)的成對比較**p＜0.05；*p＝0.05
實施例4可生物降解的陽離子微球的制備如下制備陽離子聚(乳酸、羥基乙酸)(PLGA)微球。將本身粘度為0.41dl/g(0.1％，氯仿，25℃)的0.875g聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)5050聚合物以10％w/w的濃度溶解于7.875g二氯甲烷中，同時加入0.3g DOTAP。然后將澄清的有機相在500ml聚乙烯醇(PVA)水溶液(0.35％w/v)中用實驗室混合器(Silverson L4R，Silverson Instruments)室溫下以4000轉/分鐘均化30分鐘而乳化。然后用通過混合器套管的循環熱水升高系統溫度至40℃。同時，將攪拌速率降低至1500轉/分鐘，并維持這些條件2小時以提取和蒸發二氯甲烷。用循環冷水將微球懸液冷卻至室溫。
室溫下8000轉/分鐘離心(Beckman Instruments)10分鐘分離微粒子并通過溫和的浴內超聲處理將其重懸于去離子水中。該離心洗滌再重復兩次，以從粒子表面去除過量的PVA。將粒子的最終離心沉淀懸于約10ml水中，并過夜冷凍干燥。鑒定干燥陽離子微球粉末的大小和表面電荷平均大小(所稱重的數目，μ)＝1.4；ζ電位(mV)＝32.4。
實施例5IMP/MC復合體對人細胞的免疫調節用人PBMC試驗測試了多核苷酸單獨的免疫調節活性和與陽離子PLGA微球(cPLGA)復合的多核苷酸的免疫調節活性。人PBMC試驗如實施例2中所述進行。陽離子PLGA微球如實施例4中所述制備。測試了單獨的多核苷酸，或與cPLGA微球組合的多核苷酸。受試多核苷酸為SEQ IDNO59、60、1和132。所有多核苷酸含有100％的硫代磷酸酯鍵，并以20μg/ml的濃度試驗。以100μg/ml的濃度加入cPLGA。當多核苷酸與cPLGA復合進行測試時，將多核苷酸和cPLGA室溫下預混合15分鐘，然后加至培養物中。SAC(PANSORBINCalBiochem，1/5000稀釋)和IMP(含ISS)(SEQ ID NO59)用作陽性對照，對照多核苷酸SEQ ID NO60和單獨的細胞用作陰性對照。還單獨測試了陽離子PLGA。SAC含有金黃色葡萄球菌(Cowan I)細胞物質。每次試驗在四個健康供者中對樣本進行測試。
如下表8中所示，含有ISS的多核苷酸(IMP)，SEQ ID NO59、1和132單獨使用時可誘導IFN-γ和IFN-α。這些IMP與cPGLA陽離子微載體(cat MC)的復合顯著增強了對這兩種細胞因子的誘導。對照多核苷酸SEQ ID NO60當單獨使用或與cPLGA復合時，均既不誘導IFN-γ也不誘導IFN-α。
表8IFN-γ(pg/ml)IFN-α(pg/ml)樣本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO59 324 1036 529 653 636 9 432210843SEQ ID NO60 430 19483534 0 0 4 54 15SEQ ID NO1 287 278 2679 1057 1075 230 268 295 798398cat MC 9 5 597236 7 0 9811254SEQ ID 601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511NO59/cat MCSEQ ID 1313466534 5 0 0 43 12NO60/cat MCSEQ ID NO1/cat 1645 770 3322 3355 2273 1896 1078 2691 1728 1848MC僅細胞 114 0 1378 2 3 64 19表8(續)IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)樣本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO591508344144104525 50 172 234 72 132SEQ ID NO60124 24 16 40 512 32 474 2 128SEQ ID NO132 29289363801081088 4968 72 129011821878cat MC 32 8 72 1205810 2 60 92 41SEQ ID 16409689602300 1467 948260 12981470994NO59/cat MCSEQ ID 72 16 32 316109 14 14 22 2 13NO60/cat MCSEQ ID 10604584 5172 1188 3001 5292 1050377232143332NO132/cat MC僅細胞 44 24 20 28 2920 2002 2 56為了清楚和理解的目的，對前述發明以闡述和實施例方式較詳細地進行了描述，但對本領域技術人員來講，顯然可實施某些變化和改變。因此，詳述和實施例不構成對本發明范圍的限制，本發明范圍在所附權利要求書中描述。
權利要求
1.一種包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調節性多核苷酸，其中ISS包括下式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1為T、G、C或Z，其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X2為T、G、A或U；其中X3為T、A或C；其中X4為T、G或U；且其中ISS不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
2.根據權利要求1的免疫調節性多核苷酸，其中ISS選自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)、TGATCGGTCG(SEQ ID NO69)、TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)、TGAACGGTCG(SEQ ID NO71)、GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)、GTATCGGTCG(SEQ ID NO73)、GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)、ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z為5-溴胞嘧啶、CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)、CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)、ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z為5-溴胞嘧啶、TTAACGUTCG(SEQ ID NO82)、TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO80)。
3.根據權利要求2的免疫調節性多核苷酸，其中ISS選自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)和CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)。
4.根據權利要求3的免疫調節性多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO132的序列。
5.一種包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調節性多核苷酸，其中ISS包含下式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X1為T、G、C或Z，其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X2為T、G、A或U；其中X3為T、A或C；其中X4為T、G或U；且其中ISS不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
6.根據權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中ISS選自TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)、TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)、TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)、GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)、GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)、GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)、GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)、ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)、CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)、ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)、ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)、TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)、TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
7.根據權利要求6的免疫調節性多核苷酸，其中ISS選自ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
8.根據權利要求7的免疫調節性多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO35和SEQ ID NO36的序列。
9.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸還包含至少一個TCG序列。
10.根據權利要求9的免疫調節性多核苷酸，其中TCG序列鄰近于ISS的5’端。
11.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸還包含TCGA序列。
12.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸還包含至少一個T，5-溴胞嘧啶，G序列。
13.根據權利要求12的免疫調節性多核苷酸，其中T，5-溴胞嘧啶，G序列鄰近于ISS的5’端。
14.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸還包含T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
15.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸的長度小于約150個堿基或堿基對。
16.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸的長度小于約100個堿基或堿基對。
17.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸的長度小于約50個堿基或堿基對。
18.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸為單鏈。
19.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸為雙鏈。
20.根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸，其中該免疫調節性多核苷酸是經穩定化處理的。
21.根據權利要求20的免疫調節性多核苷酸，其中該多核苷酸包含硫代磷酸酯鍵。
22.包含根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸的免疫調節性組合物。
23.根據權利要求22的免疫調節性組合物，其還包含可藥用賦形劑。
24.根據權利要求22的免疫調節性組合物，其還包含抗原。
25.根據權利要求24的免疫調節性組合物，其還包含可藥用賦形劑。
26.一種免疫調節性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復合體，其包含連接至可生物降解的微載體(MC)上的根據權利要求1的多核苷酸，其中該MC的尺寸小于10μm。
27.一種免疫調節性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復合體，其包含連接至可生物降解的微載體(MC)上的根據權利要求5的多核苷酸，其中該MC的尺寸小于10μm。
28.一種調節個體免疫反應的方法，其包括將根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸以足以調節所述個體的免疫反應的量施與個體。
29.權利要求28的方法，其中所述個體患有與Th2-類免疫反應相關的疾病。
30.權利要求29的方法，其中所述與Th2-類免疫反應相關的疾病為變態反應或哮喘。
31.權利要求28的方法，其中所述個體患有感染性疾病。
32.升高個體的γ-干擾素(IFN-γ)的方法，其包括將根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸以足以升高所述個體的IFN-γ的量施與該個體。
33.權利要求32的方法，其中所述個體患有特發性肺纖維化。
34.升高個體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸以足以升高所述個體的IFN-α的量施與該個體。
35.權利要求34的方法，其中所述個體患有病毒性感染。
36.升高個體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據權利要求9的免疫調節性多核苷酸以足以升高所述個體的IFN-α的量施與該個體。
37.權利要求35的方法，其中所述個體患有病毒性感染。
38.升高個體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據權利要求11的免疫調節性多核苷酸以足以升高所述個體的IFN-α的量施與該個體。
39.權利要求38的方法，其中所述個體患有病毒性感染。
40.改善個體的感染性疾病的癥狀的方法，其包括將有效量的根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸施與個體，其中有效量為足以改善所述感染性疾病的癥狀的量。
41.權利要求40的方法，其中所述感染性疾病為由細胞病原體引起的感染性疾病。
42.權利要求41的方法，其中所述由細胞病原體引起的感染性疾病選自分枝桿菌病、瘧疾、利什曼病、弓形體病、血吸蟲病和枝睪吸蟲病。
43.改善個體的IgE-相關疾病的癥狀的方法，其包括將有效量的根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸施與患有IgE-相關疾病的個體，其中有效量為足以改善所述IgE-相關疾病的癥狀的量。
44.權利要求43的方法，其中所述IgE-相關疾病為變態反應。
45.權利要求43的方法，其中所述IgE-相關疾病為變態反應相關疾病。
46.權利要求43的方法，其中所述IgE-相關疾病為哮喘。
47.一種試劑盒，其包含根據權利要求1或權利要求5的免疫調節性多核苷酸。
48.權利要求47的試劑盒，其還包含使用免疫調節性多核苷酸對個體進行免疫調節的說明書。
全文摘要
本發明提供了免疫調節性多核苷酸和用該免疫調節性多核苷酸對個體進行免疫調節的方法。
文檔編號A61P33/12GK1483079SQ01821490
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月27日 優先權日2000年12月27日
發明者K·L·費倫, D·迪納, K L 費倫 申請人:戴納瓦克斯技術公司