細菌菌株，加工過的植物提取物，含有它們的組合物，其制備方法及其治療和工業應用的制作方法

專利名稱：細菌菌株，加工過的植物提取物，含有它們的組合物，其制備方法及其治療和工業應用的制作方法
技術領域：
和背景本發明涉及(i)一種非致病性益生性微生物及其益生/治療用途；(ii)含有由至少一種植物來源材料提取物制備的揮發性級份(VF)的水溶液的制劑，及其治療用途；(iii)一種由所述植物來源材料生產所述制劑的方法；(iv)含有本發明的非致病性益生性微生物和/或其他益生性微生物和本發明的制劑的益生性組合物，及其益生/治療用途；(v)一種用于工業應用的組合物，含有本發明的制劑和具有工業應用性的微生物；和(vi)應用上述后一種組合物的工業方法和裝置。
在正常條件下，胃腸(GI)道微生物區系對個體的健康和狀況起著重要作用。眾所周知，微生物區系是微生物的復雜的和多樣性的群體，該群體可能對個體具有有益和有害作用。在正常妊娠條件下，子宮中的胎兒是無菌的，不過，在出生期間，在通過陰道時胎兒會獲得微生物，導致胃腸道微生物區系的形成。最終穩定在胃腸中的固有胃腸微生物區系是非常復雜的集合體，它具有超過1000種不同類型的微生物，包括大約400種不同類型的細菌[Fuller R.J.AppliedBacteriology 66365-378(1989)]。胃腸道微生物區系的組成是由宿主和微生物因素決定的，盡管有很多細菌能夠在胃腸道中存活并生長，但是有很多種細菌不能存活和生長。另外，存活的生物必須避免蠕動作用，這種作用通常會通過食物將所述細菌沖洗掉。這一目的可以通過能夠通過與胃腸壁結合而固定它自己的微生物而實現，和/或通過以超過主動清除速度的速度繁殖而實現。
一般，胃腸道微生物區系的存在是共生性的，因為所述微生物區系不僅有助于分解某些無法消化的食物，而且還能保護個體免受由病原體導致的感染。后一種現象業已用‘細菌拮抗性’，‘細菌干擾’，‘屏障效應’，‘建群抗性’，‘競爭排斥’等名詞進行過表述。
胃腸道保護性微生物區系是非常穩定的。不過，它在少年、老年和受到危害的患者體內不那么有效。另外，它可能受到某些飲食和環境因素的影響，三種最重要的因素是過度潔凈、抗生素治療和緊張。
在胃腸道微生物區系的平衡受到負面影響的條件下，益生菌在恢復胃腸道微生物區系以及使得個體宿主恢復正常方面具有潛在價值。
益生菌是一類微生物，定義為能對動物和人類宿主產生有利影響的活的微生物。所述有益作用包括改善腸道微生物區系的微生物平衡或改善固有微生物區系的特性。益生菌的所述有益作用可以通過對特定類型生物的直接拮抗作用介導，通過對其代謝的影響或通過刺激免疫力導致所述生物數量減少。益生菌可以通過產生抗菌化合物，通過競爭營養或競爭附著位點抑制不需要的生物的存活數量。另外，益生菌能通過提高或降低酶活性改變微生物代謝，或通過提高抗體含量或提高巨噬細胞活性刺激免疫系統。
WO95/16461披露了一種厭氧細菌的益生性組合物，它能有效控制或抑制沙門氏菌在家畜體內的建群。該益生性組合物包含29種在生物學上基本上為純的細菌，特別是大腸桿菌的群體或培養物。不過，在該PCT公開文獻中所披露的益生性組合物對病原體的抑制作用需要大量細菌菌株的聯合作用。
WO97/35596披露了施用通過混合含有路氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌的粉末和一種液體獲得的新制備的益生性混合物。據說該混合物能有效預防人類的感染性腹瀉或由抗生素治療所導致的腹瀉。不過，冷凍干燥的活的細菌是復蘇狀態的。在施用之前必須使所述微生物濕潤，以便恢復其存活力，這樣做是不利的，因為正常情況下很多細菌在再水合過程中不能存活。另外，存活下來的生物不是馬上就具有代謝活性，并且在胃的極端、酸性條件下不能存活。另外，在給腹瀉受體施用時，它們從胃腸中排出的速度超過了恢復存活力的速度，導致少有或沒有有效作用。
通過其制劑保存益生性生物的存活力和保留其活性是很多文獻的主題。WO98/26787披露了通過提供β-葡聚糖，并選擇性地與益生元和/或益生微生物聯合，增強動物胃腸道中乳酸生產微生物，優選乳桿菌屬的存留群體。
WO97/34591還披露了通過給個體提供選擇性改性的或未改性的淀粉或其混合物在個體胃腸道的選定部位增強微生物的存留群體或抑制不需要的存留群體，所述改性或未改性淀粉起著一種或多種益生性微生物的載體作用，并且作為所述微生物的生長或維持培養基。所述益生元件以一種方式結合在所述載體上，以便在通過大腸或胃腸道的其他部位時保護所述微生物。
微生物被用于多種工業方法中。所述方法可以劃分成連續方法和批量方法。在連續方法中，如連續有氧或厭氧發酵生產線，被用于生產多種發酵產品，例如，包括乙醇和甲醇，將可發酵的原材料連續輸送到所述生產線上，并且以受控制的方式從所述生產線上連續收集發酵產品，以便在整個生產過程中所述微生物群體在所述生產線上得以維持。在批量方法中，例如，但不限于批量有氧或厭氧發酵，在漏油中對油的降解等，將可發酵的原材料與微生物群體混合，以便進行發酵。在某些場合下，在連續發酵和批量發酵方法中都需要用相關微生物的大量的和活的群體開始或恢復所述過程。例如，在生物降解油時，優選用假單胞菌或產堿菌微生物的盡可能大的群體開始所述過程，例如，以便減少完成所述油生物降解的時間。在使用富集了微生物的過濾器降解有機煙霧或揮發性物質時，其結果是一種連續過程，其中，將污染性化合物降解成無害的化合物。不過，存在于所述過濾器上的微生物的存活取決于有機煙霧或揮發性物質的連續供應。不過，在某些場合下，有機煙霧或揮發性物質的供應是不連續的，其結果是失去了所述微生物。在這種情況下，必須在短時間內恢復所述過濾器中有效量的存活微生物，以便能馬上恢復功能性過濾器。
因此，普遍認為需要，并且高度優選一種制劑，在該制劑中，包括益生性微生物和可用于多種工業應用的微生物在內的微生物可以長時間保持存活力并且呈代謝活性形式。
在將本發明付諸實施時，業已意外地發現源于大腸桿菌的非致病性益生性微生物的單一菌種本身就能夠恢復人和多種哺乳動物和禽類的正常胃腸道菌群。業已驚奇地發現，這種微生物，以及其他微生物可以在包括各種植物提取物的揮發性級份的水溶液的制劑中以存活和代謝活性形式長時間保存。業已發現包含懸浮在所述制劑中的益生生物的益生性組合物可以有效治療和預防各種胃腸道疾病。另外還意外地發現所述制劑本身能夠有效作為哺乳動物和禽類的體重增加增強劑和作為免疫刺激劑。
本發明概述根據本發明的一個方面，提供了ATCC保藏號為202226(DSM12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98。
根據本發明的另一方面，提供了一種含有ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98的益生性組合物和用于維持所述大腸桿菌菌株的存活力的制劑。所述益生性組合物優選還包含至少一種香味劑，所述制劑優選包含植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，它是通過在減壓條件下，在優選不超過38℃的水浴溫度下對植物(例如，甜菜、蒔蘿、歐芹或葡萄)提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
本發明的益生性組合物可用于預防或治療胃腸感染或失調，保持或恢復正常的胃腸道微生物區系，預防或治療腹瀉，預防或治療由腸道病原體，如革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌導致的胃腸感染，預防或治療胃腸沙門氏菌感染，預防或治療由例如，艱難梭菌，沙門氏菌屬，特別是志賀氏沙門氏菌，彎曲桿菌屬，大腸桿菌，變形菌屬，假單胞菌屬或梭菌屬導致的感染性腹瀉，由抗生素治療、放療或化療所導致的慢性腹瀉或腹瀉，和/或用于使胃腸道的生理學活性正常化。
根據本發明的另一方面，提供了含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑，所述揮發性級份是通過在減壓條件下在不超過38℃的水浴溫度下通過對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。所述植物提取物優選可以從選自植物葉片、莖、根和果實的植物器官中獲得。所述植物可以是蔬菜，如大豆、苜蓿、大蒜、甜菜和甘藍或草本植物，如歐芹、薄荷和蒔蘿。所述制劑還包含蜂箱產品，例如，但不限于蜂膠。所述制劑可以用作獸醫飼料或食品添加劑，用于增強受體動物的體重增加。正如在本文中進一步披露的，還可將其用于保存存活細菌。
因此，根據本發明的另一方面，提供了一種制備植物的揮發性級份的方法，包括以下步驟(a)研磨植物來源的材料，得到一種植物生物物質；(b)將所述植物生物物質與水混合，并且在環境溫度下攪拌；(c)在減壓條件下，并且在不超過38℃的水浴溫度下對步驟(b)中所獲得的混合物進行蒸汽蒸餾；和(d)收集通過所述蒸汽蒸餾所獲得的揮發性級份。所述減壓優選為5-10毫巴。可以將該制劑用作食品添加劑，飼料添加劑，并且具有意想不到的治療作用，以及有利的細菌保存特性。還披露了含有植物的揮發性級份的治療制劑，該制劑可以通過將植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)與生理學或獸醫可接受的添加劑、載體或稀釋劑混合而制備。所述揮發性級份優選是在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下通過對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備。
因此，根據本發明的另一方面，提供了一種益生性組合物，該組合物包含(a)有效量的至少一種存活的益生性微生物，該微生物在胃腸道中具有有益的生物學或治療活性；和(b)植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，該揮發性級份優選是按本文所披露的方法制備的。所述益生性微生物可以是大腸桿菌，優選是ATCC保藏號為202226(DSM12799)的菌株BU-230-98，該微生物除了可用于治療或預防消化不良癥狀，用于增強患有免疫障礙的患者的免疫應答，例如，由免疫應答抑制治療導致的疾病之外或者作為替代方案，還可將其用于治療或預防上述任何失調/病理/疾病/綜合癥。
根據本發明的另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含(a)至少一種微生物，如埃希氏菌，產堿菌，節桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，乳球菌，亞硝化單胞菌和假單胞菌；和(b)植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保存至少2個月，優選至少3-6個月，更優選至少6-12個月或更長時間。
根據本發明的另一方面，提供了一種生長ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98的方法，該方法包括以下步驟將ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98的起始培養物接種到生長培養基中，并且將所述大腸桿菌菌株生長到在650nm下的光學密度為15-30。
根據本發明的另一方面，提供了一種生產益生性組合物的方法，該方法包括以下步驟將ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98懸浮在一種制劑中，以便保持所述大腸桿菌菌株的存活力。所述制劑優選包含植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，所述揮發性級份優選是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾制備的，例如，所述植物提取物是從選自諸如大豆、歐芹、薄荷、蒔蘿、苜蓿、大蒜、甜菜或甘藍的蔬菜或草本植物的葉片、莖、根和果實的植物器官獲得的。
根據另一方面，本發明提供了一種制備益生性組合物的方法，該方法包括以下步驟將有效量的、在胃腸道中具有有益的生物學或治療活性的至少一種存活的益生性微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中。
根據本發明的另一方面，提供了一種制備含有存活微生物的組合物的方法，該方法包括以下步驟將至少一種微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便能在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。例如，所述微生物可以是埃希氏菌，產堿菌，節桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，乳球菌，亞硝化單胞菌或假單胞菌。
根據本發明的另一方面，提供了一種微生物分配器，該分配器包含一個儲存器和一個與該儲存器連接的計量器，該儲存器裝有存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中的至少一種微生物，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種對生物進行生物控制的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能夠對所述生物進行生物控制的存活微生物噴灑在流行區域，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種清除油污染的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能降解油的微生物噴灑在受污染的區域，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種恢復生物過濾器中的有機煙霧降解微生物群體的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能降解有機煙霧的存活微生物分配在所述過濾器上，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種制備用于發酵過程的發酵劑的方法，該方法包括以下步驟生長足夠數量的發酵劑微生物，并且將所述發酵劑微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
附圖的簡述在本文中，僅以舉例方式結合附圖對本發明進行說明。下面具體詳細參見附圖，應當指出的是，圖中所示出的細節是舉例性質的，并且僅僅是用于對本發明的優選實施方案進行說明性討論的，提供這樣的附圖，是為了提供對本發明的原理和概念性特征進行最有用的和最便于理解的說明。就此而言，對本發明結構細節的顯示不超出功能性理解本發明的需要，對所述附圖的說明，使本領域技術人員可以了解能夠以若干種形式實施本發明。
在附圖中

圖1是本發明分配器的示意圖。
發明詳述本發明是(i)一種非致病性益生性微生物及其益生/治療用途；(ii)含有由至少一種植物來源材料提取物制備的揮發性級份(VF)的水溶液的制劑，及其治療用途；(iii)一種由所述植物來源材料生產所述制劑的方法；(iv)含有本發明的非致病性益生性微生物和/或其他益生性微生物和本發明的制劑的益生性組合物，及其益生/治療用途；(v)一種用于工業用途的組合物，含有本發明的制劑和具有工業應用性的微生物；和(vi)應用上述后一種組合物的工業方法和裝置。
參考附圖和附圖的說明可以更好地理解本發明的原理和操作。
在詳細解釋本發明的至少一種實施方案之前，必須理解的是，本發明的應用不并局限于在下面的說明書或實施例的說明中所提供的細節。本發明可以具有其他實施方案，或者以各種方式實施或執行。另外，應當理解的是，本文所使用的措辭和術語是用于說明目的的，而不應當被認為是限定性的。
在一方面，本發明涉及一種益生性微生物，它是源于大腸桿菌的非致病性細菌，例如，在胃腸道中具有有益的生理學和/或治療活性，并且在ATCC的保藏號為№202226，在DSMZ的保藏號為No.12799。
“益生性”在本文中被用作形容詞，用于表示具有抑制至少一種病原體生長的特性的分離的細菌。在本文中所使用的抑制試驗是在固體培養基上進行的體外試驗，其中，將候選分離細菌的培養上清液涂在所述固體培養基的表面上，觀察其抑制病原體生長的特性。通常，將用候選益生性菌株的培養上清液浸泡過的紙片放置在接種了所述病原體的瓊脂平板表面上。益生性細菌上清液導致了一圈透明的瓊脂或減弱了的生長密度，表明抑制了所述紙片附近的病原體。有其他抑制試驗可以使用或可以設計，包括體外或體內直接生長競爭試驗，它能產生一組類似于本文所披露的益生性細菌。通常上述任何一種試驗所鑒定的細菌菌株都屬于益生性細菌的類型，正如在本文中所使用的該術語。
本發明的益生性細菌可以用作食品或飼料添加劑，以便提供添加了ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98的食品或飼料。本發明的食品還可以包括至少一種乳來源物質，并且可以選自干酪和酸奶。
本發明還涉及含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑，所述揮發性級份是通過在減壓條件下在通常不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸餾而制備的。
用于獲得所述揮發性級份的植物材料可以從任何合適的植物部分獲得，如果實、葉片、莖或根。很多植物都適合用作所述揮發性級分的來源，例如蘋果、柑橘、大豆、甜菜、甘藍、大蒜和苜蓿，以及草本植物，如歐芹、薄荷和蒔蘿。本發明的制劑還可以選擇性地含有合適數量的農產品，如蜂蜜、蜂膠或其他蜂箱產品的揮發性級份，所述級份可以用與本文所披露的用于從植物提取物中獲得揮發性級份相同的方法制備。
正如在下面的實施例中將要更詳細地說明的，可以將所述制劑本身用作食品/飼料添加劑。本發明人業已發現，該制劑具有增強體重增加的活性，并且它構成了本發明的一個方面。根據本發明該方面的一種具體實施方案，所述動物體重增加增強制劑或飼料添加劑包含蒸餾水和苜蓿、大豆、甜菜和蒔蘿的揮發性級份，所述揮發性級份的體積比優選為2∶8∶1∶4。另外，本發明的制劑或飼料添加劑包含蒸餾水和每100份水中所含有的各1份的胡蘿卜、甜菜、蒔蘿和葡萄的揮發性級份。作為另一種替代性方案，本發明的制劑或食品添加劑包含蒸餾水和每100份水中所含有的各1份甜菜、蒔蘿和歐芹的揮發性級份。
在另一方面，本發明涉及一種組合物，該組合物含有本發明的上述制劑和至少一種存活微生物，所述微生物可以是在諸如人和/或動物的胃腸道中具有治療或有益生物學活性的益生性生物，以便提供一種益生性組合物，或者是具有工業應用價值的生物，以便提供具有工業應用性的組合物。
本發明的益生性和工業組合物的特殊優點源于以下事實，即它們是液體制劑。在生物學活性條件下，所述制劑還可用作活細菌的支持性培養基，冷凍干燥的制劑則不同，其中，所述細菌是處在厭氧條件下。結果，舉例來說，本發明的益生性組合物在口服之后馬上就起作用，這種作用始于胃腸道的上部，大部分腸道病原體的主要作用都是在這里發生的，導致不良的胃腸綜合癥的出現。本發明的益生性組合物還可用作體重增加制劑或食品/飼料添加劑。類似地，可以將本發明的工業組合物用于有效恢復具有工業應用性的微生物群體。
因此，應當指出的是，對于益生性用途來說，除了屬于菌株BC-230-98(ATCC保藏號202226，同樣以12799的編號在DSM保藏)的其他益性細菌可以與本發明的植物材料來源的制劑一起使用。所述益生性細菌具有非常廣譜的拮抗活性。它們也與大部分腸道病原體屬于相同的系統發育類型，并且擁有相同的存活系統。因此，腸道病原體的抑制和排出可以包括多種不同的機制，例如拮抗物質的分泌，對養分的競爭利用和對粘附受體的競爭。因此，符合上述標準的任何非致病性細菌都可用于本發明的益生性組合物中。
根據本發明的另一方面，可將本發明的益生性組合物可用于預防或治療胃腸感染。術語‘胃腸感染’被用于表示由腸道病原體導致的任何感染，包括但不限于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌。為了改善胃腸道的總體平衡和健康，本發明的制劑和益生性組合物還可用于預防由酵母、病毒和原生動物引起的胃腸感染。
對本文來說，術語‘治療有效量’或‘有效量’是由本領域公知的因素確定的用量。所述用量必須足以有效恢復胃腸道微生物區系，從而導致胃腸道功能的正常化。
在一種具體實施方案中，用于預防胃腸感染發生的益生性組合物包含本發明的制劑，該制劑是用蒸餾水和體積比為例如5∶1∶5∶15∶1的本文所定義的苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿和薄荷的揮發性級份，以及治療有效量的益生性細菌，如ATCC保藏號為202226的大腸桿菌(與DSM 12799相同)或任何其他益生性細菌制備的。
胃腸感染的一個具體例子是由沙門氏菌屬導致的感染，并且本發明特別有利于預防或治療由沙門氏菌屬導致的胃腸感染。
另外，本發明的食品添加劑或制劑可以單獨或與有效量的諸如ATCC保藏號為202226的大腸桿菌(與DSM 12799相同)聯合用于治療或預防感染性腹瀉、慢性腹瀉或由抗生素或化療導致的腹瀉。
根據本發明的另一種具體實施方案，所述用于治療腹瀉的益生性組合物可以含有蒸餾水和體積比為例如5∶1∶5∶15∶1的苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿和薄荷的揮發性級份，以及治療有效量的ATCC保藏號202226(DSMZ 12799)。
所述感染性腹瀉可以由多種因素引起，例如，由選自艱難梭菌，沙門氏菌屬，特別是志賀氏沙門氏菌，彎曲桿菌屬，大腸桿菌，變形菌屬，假單胞菌屬，梭菌屬，腸葡萄球菌屬。以上只是多種感染劑中的少數幾種。
另外，可以將本發明的益生性組合物用于有效恢復需要這種治療的對象體內的胃腸道微生物區系，這種治療會導致胃腸道功能的正常化。例如，所述組合物可以包含蒸餾水和苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿、薄荷、歐芹和甘藍的揮發性級份，揮發性級份的比例優選為例如1∶5∶5∶2∶2∶1，以及治療有效量的ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的益生性細菌。
含有至少一種在諸如胃腸道的部位具有治療作用的益生性細菌的本發明益生性組合物的其他用途包括緩解患有不耐受乳糖的患者的乳糖不耐受性，治療小腸結腸炎，治療便秘，用于降低血液中的膽甾醇含量，用于治療消化不良癥狀，和/或用于刺激患有免疫系統障礙的對象的免疫系統，所述障礙可能是由免疫抑制治療所導致的免疫障礙。
在另一方面，本發明涉及一種用于制備植物提取物的揮發性級份的方法，該方法包括以下步驟(a)研磨植物來源材料，以便獲得植物生物物質；(b)優選以3份水和1份植物生物物質的重量比混合在步驟(a)中獲得的植物生物物質和水，并且在環境溫度下攪拌該混合物至少2小時；(c)在減壓條件下，并且在優選在不超過38℃的水浴溫度下蒸餾在步驟(b)中獲得的混合物；和(d)收集通過蒸汽蒸餾所獲得的揮發性級份，可以用合適的緩沖液進一步稀釋所述級份。
本發明的揮發性級份可以與水混合，以便得到本發明的食品/飼料添加劑或制劑。還可以通過混合用本發明方法獲得的一種以上的植物揮發性級份，制備本發明的食品/飼料添加劑或制劑。該混合物可以進一步與水混合。
所述揮發性級份可以用任何合適的水果、蔬菜，植物的葉、莖或根制備。例如，所述植物可以是蘋果、柑橘果實、大豆、甜菜、大蒜、甘藍或苜蓿，或草本植物，如歐芹、薄荷或蒔蘿。應當指出的是，如果合適的話，所述制劑還可以含有來自農產品，如蜂蜜或蜂膠或其他蜂箱產品的揮發性級份。所述揮發性級份可以用制備植物提取物揮發性級份的相同的方法制備。
根據本發明的所述方法，所述蒸餾步驟優選是在5-10毫巴的減壓條件下進行的。
正如上文所指出的，本發明的食品/飼料添加劑或制劑還可以與至少一種益生性或工業制劑組合，以便提供本發明的益生性或工業組合物。因此，本發明的制備方法還可以包括將至少一種存活的益生性或工業微生物懸浮在在上述步驟(d)中獲得的揮發性級份或懸浮在按上述方法獲得的揮發性級份的混合物中的步驟。
根據本發明的一種具體方法，所述懸浮的益生性微生物可以是本發明的新型細菌，該細菌源于由ATCC保藏的保藏號為202226的大腸桿菌(在DSM的保藏號為12799)。
最后，本發明涉及將植物提取物的揮發性級份(VF)用于制備食品/飼料添加劑的用途，其中，所述VF是通過在不超過38℃的水浴溫度下蒸餾所述植物提取物或諸如蜂蜜或蜂膠的農產品而制備的。
本發明的另一方面包括一種制備含有存活微生物的組合物的方法。該方法是通過將至少一種微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中實現的。所述制劑是經過選擇的，以便能在室溫下將所述微生物的存活力保持至少2個月。所選擇的微生物可以是益生性的或者具有工業用途。可以在本發明的制劑中維持的生物包括埃希氏菌，產堿菌，節桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，乳球菌，亞硝化單胞菌和假單胞菌。
如圖1所示，本發明的另一方面提供了一種微生物分配器10。分配器10包含一個儲存器12和一個與它連接的計量器14。儲存器12容納有在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中的至少一種微生物。所述制劑是經過選擇的，以便在室溫下將所述微生物的存活力保持至少2個月。容器12可以是制冷的，例如制冷到大約2-20℃，優選制冷到大約4℃。分配器10可以是機載分配器，以便可以分配害蟲控制生物制劑。所述分配器可以是手持式的。在任何情況下，都可以將所述分配器設計成自動分配預定體積的溶液，例如定期分配。為此，分配器10可以包含一個可編程的或預設的控制機構16，閥18等。
因此，根據另一方面，本發明提供了一種生物的生物控制方法，該方法是通過將至少一種能夠對所述生物進行生物控制的存活微生物噴灑在流行區域而實現的。所述存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種清除油污染的方法，該方法是通過將諸如假單胞菌的至少一種能降解油的存活微生物噴灑在受污染的區域。所述存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種恢復生物過濾器中的有機煙霧降解微生物群體的方法，包括將諸如假單胞菌、亞硝化單胞菌或節桿菌的能降解有機油的至少一種存活微生物分配到所述過濾器上。所述存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
根據本發明的另一方面，提供了一種制備發酵過程的發酵劑的方法，包括生長足夠數量的發酵劑微生物，如乳球菌、埃希氏菌、雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌或假單胞菌，并且將所述發酵劑微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
通過審閱以下實施例，本領域普通技術人員可以了解本發明的其他目的、優點和新的特征，所述實施例不是用于限定目的的。另外，上述本發明的各種實施方案和方面的每一個，以及下面的權利要求部分都可以從以下實施例中找到實驗依據。
實施例參見以下的實施例，這些實施例與上述說明書一起以非限定方式對本發明進行了說明。
實施例1制備植物提取物或來自農產品的提取物的“揮發性級份”用自來水將從市場上購買的新鮮蔬菜充分洗凈，切碎，并且在商用攪拌器中磨成細粉。以3份水和1份蔬菜生物物質的重量比將蒸餾水添加到所述蔬菜生物物質中，并且在環境溫度下攪拌至少2小時。
將所述混合物轉移到旋轉蒸發器的蒸發燒瓶中，并且在以下條件下在減壓(5-10毫巴)下蒸發水浴溫度不超過38℃，冷凝器入口溫度為2-5℃。每2.5千克植物生物物質收集大約1升冷凝物(揮發性級份)。正如在下文將要進一步說明的，該材料可以在冷藏條件下保存至少12個月而不損失其特性。
可以用諸如蜂蜜或蜂膠的農產品代替所述植物材料，用相同的方法進行處理。
通常，每一種“揮發性級份”是用一種類型的蔬菜制備的，并且以不同的稀釋比例用于制備用于各種目的的不同的混合物。
實施例2ATCC保藏號為202226的益生性生物大腸桿菌的分離和生長益生性生物大腸桿菌(于1999年5月3日，以202226的保藏號保藏于ATCC，于1999年5月4日，以12799的保藏號保藏于DSM)是從大腸桿菌M-17中分離的，包括從在37℃下長期(2個月)保存在含有實施例1所述植物來源材料的揮發性級份的制劑中的存活物開始分離物的系列轉移，并且篩選能夠與病原體競爭的分離物，正如在下面更詳細說明的。將益生性生物大腸桿菌(于1999年5月3日，以202226的保藏號保藏于ATCC，于1999年5月4日，以12799的保藏號保藏于DSM)在以下培養基中生長(NH4)2SO4-5g/L，KH2PO4-13g/L，Na2HPO4-13g/L，MgCl2-3g/L，CaCl2-0.3g/L，酵母提取物-10g/L，大豆蛋白胨-10g/L和葡萄糖-5g/L。隨著所述培養物的生長連續添加額外的養分(酵母提取物-1g/L，大豆蛋白胨-2.5g/L和葡萄糖-90g/L)，使發酵培養液中的葡萄糖濃度保持在2g/L的水平上。通過連續添加4N NH4OH將發酵培養液的pH保持為中性。培養是在30℃下，在標準發酵罐中以0.5vvm的通氣速度進行16小時，此時生長達到匯合。該方法能得到1010-1011細胞/毫升。通過離心收獲大腸桿菌細胞，懸浮在鹽水中，并再次沉淀。所述微生物生物物質可以放在鹽水中在冰箱里保持48小時而不喪失存活力。
實施例3制備能夠快速增加哺乳動物和禽類體重的食品/飼料添加劑制劑該混合物含有按上述實施例1所述方法制備的以下揮發性級份苜蓿50ml/L，大豆-200ml/L，甜菜-25ml/L和蒔蘿-100ml/L。用蒸餾水進行平衡。
實施例4制備用于使人類胃腸道功能正常化的食品添加劑該混合物含有按上述實施例1所述方法制備的以下揮發性級份苜蓿-50ml/L，大豆-10ml/L，甜菜-50ml/L，蒔蘿-50ml/L，薄荷-20ml/L，歐芹-20ml/L和甘藍-10m1/L。用蒸餾水進行平衡。以107細胞/毫升的細胞濃度將大腸桿菌(ATCC 202226)細胞(實施例2)懸浮在該混合物。為了改善口感可以選擇性地添加NaCl(例如4-10g/L)。
實施例5制備用于預防哺乳動物和禽類胃腸道感染的飼料添加制劑該混合物含有按上述實施例1所述方法制備的以下揮發性級份苜蓿-50ml/L，大豆-10ml/L，甜菜-50ml/L，蒔蘿-150ml/L和薄荷-10ml/L。用蒸餾水進行平衡。以107細胞/毫升的細胞濃度將大腸桿菌(ATCC 202226)細胞(實施例2)懸浮在該混合物。為了改善口感可以選擇性地添加NaCl(例如4-10g/L)。
實施例6大腸桿菌(ATCC 202226)對鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)的拮抗活性用鼠傷寒沙門氏菌接種裝有改性的Brilliant Green瓊脂(沙門氏菌屬的選擇性生長培養基)的培養皿。在瓊脂上形成9毫米直徑的孔。將一定體積的所述食品添加劑(實施例4)沉積在每一個孔中，并且在35℃下孵育所述平板24小時。重復相同的過程，不過不用所述食品添加劑，而是將通過微生物濾膜(孔徑0.45微米)過濾獲得的液體沉積在所述孔中。
在含有所述食品添加劑的每一個孔周圍觀察到了缺乏鼠傷寒沙門氏菌菌落的抑制區(10-17毫米)。在含有不含所述益生性生物的濾液的孔周圍沒有出現抑制區。
實施例7大腸桿菌ATCC202226及其親代大腸桿菌M-17對志賀氏菌的拮抗活性將弗氏志賀氏菌、索氏志賀氏菌、大腸桿菌(ATCC 202226)和M-17分別在營養瓊脂上在37℃下生長18-20小時。所有培養物都收獲到鹽水中，并且稀釋到10Klett單位的光密度。將志賀氏菌稀釋培養物的等份試樣本身1毫升或與大腸桿菌(ATCC 202226)的稀釋培養物組合(1毫升)接種到裝有營養液(5毫升)的通風杯狀試管中。在37℃下孵育所述試管24小時。通過將所述培養物鋪板到營養瓊脂上，確定所述病原體和大腸桿菌(ATCC 202226)的集落形成單位(CFU)數量。在下面的表1中示出了兩種志賀氏菌物種在純的培養物和在具有益生性大腸桿菌的混合培養物中的CFU數量。
表1
實施例8將食品添加劑(實施例4)和大腸桿菌素(大腸桿菌M-17的干燥制劑)用于住院的腸胃炎患者將住院之后發生腸胃炎的一組60位患者隨機分成三個小組，使每一組在性別、年齡和腸胃炎癥狀嚴重程度方面具有類似的分布。所有患者都接受正常的支持性治療，包括再水合、維生素等。癥狀的嚴重程度不需要用抗生素治療。第一組的20位患者每日3次在飯前30分鐘接受10毫升的食品添加劑(實施例5)共治療7天時間。第二組同樣數量的患者按照生產商推薦的方案(每天2次飯前30分鐘施用)大腸桿菌素(Colibacteriilum siccum)，而第三組根本不接受添加劑。
記錄所有組的腸胃炎癥狀正常化的開始(以天數計)，并且在下面的表2中示出。
表2
大腸桿菌素(Colibacterinum siccum)是由BIOMED公司(莫斯科，俄羅斯)生產的活的大腸桿菌M-17的冷凍干燥制劑，并且被推薦用于治療腹瀉[Vidal HandbookPharmaceutical preparations inRussia(N.B.Nikolaeva，B.P.Alperovich and V.N.Sovinov，Eds.)AstrapharmService，1997，Moscow，p.275]。
實施例9將食品添加劑(實施例4)用于患有急性胃腸道感染的患者本研究包括患有各種病因的重度胃腸道感染的患者沙門氏菌病、埃希氏菌病、志賀氏菌病、葡萄球菌感染和未知病因的食物中毒。在所有患者中，住院以疾病的急性發作和急性腸胃炎的出現為指征。用所述食品添加劑對總共186位患者進行治療，而一組類似的102位患者接受標準治療。
記錄所有組的腸胃炎癥狀正常化的開始(以天數計)，并且在下面的表3中示出。
表3
在一項獨立的研究中，用所述食品添加劑對一組30位患有腸傷寒的患者進行治療，80％患者的疾病癥狀在3天內消失。僅有3例所述添加劑治療由于更嚴重的慢性腸炎的發展而終止。
實施例10將食品添加劑(實施例4)用于由抗生素導致的胃腸道失調患者將患有重度GI失調的患者分成2組。第一組包括48位患有胃潰瘍疾病的患者，這些患者在針對幽門螺桿菌進行抗生素治療之后出現了胃腸道失調。第二組包括22位患者，這些患者在針對肺炎進行抗生素治療之后出現了胃腸道失調。
每天3次在飯前施用所述食品添加劑(5毫升)，共使用7天。在這2組內，所有患者的腹瀉癥狀都在2-3天內消失。在施用所述添加劑之后，在84.5％的患者中觀察到了胃腸微生物區系的完全正常化。這是通過乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的顯著增加，大腸桿菌總數的減少，以及溶血大腸桿菌和諸如葡萄球菌屬、普通變形菌甚至是念珠菌的其他病原體的完全消失而證明的。在其余的15.5％的患者中，觀察到了顯著改善。
實施例11將食品添加劑(實施例5)用于患有放射治療后期腸胃炎的患者給患有子宮、結腸和胃癌的24位患者施用所述食品添加劑(10毫升，每天3次，飯前30分鐘施用，共施用14天)，所述患者在接受放射治療或放療和化療的聯合治療之后出現了腸胃炎。
在使用所述食品添加劑之前，所有患者都有經常性的和痛苦的排便欲望、液體樣糞(每天4-12次)、在糞便中出現黏膜(9例)和血液(3例)的主訴。
在攝入所述添加劑2或3天之后，所有患者都注意到了痛苦的減輕和排便次數的減少，大便具有正常的外觀。在腹瀉癥狀消失之后4-5天，血液和黏膜的出現停止。血液分析表明，血液指標有顯著改善。
在類似規模的對照組中，持續存在所述癥狀。
實施例12將食品添加劑(實施例4)用于AIDS患者患有AIDS的患者經常會出現慢性腹瀉。讓一組這樣的患者施用10毫升食品添加劑(實施例5)，每天3次，飯前30分鐘施用，共施用20天，對照組不接受添加劑。治療結果示于下面的表4中。
表4
接受所述食品添加劑的患者表現出腸微生物區系的正常化大腸桿菌總數減少，溶血大腸桿菌消失，乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的數量增加，念珠菌減少。
實施例13將食品/飼料添加劑(實施例3)用于加速健康豬崽的體重增加。
每天給每只小豬崽施用3毫升所述食品/飼料添加劑，直到斷奶。接受所述飼料添加劑的組，在斷奶時每只小豬的體重平均比對照組增加了1.0千克。
實施例14將所述飼料添加劑(實施例5)用于健康小豬崽數百頭健康的小豬崽在出生的第1和第3天以及斷奶時每只小豬崽施用3毫升所述飼料添加劑。與接受標準預防性抗生素治療的對照組相比死亡率減少了50％。接受飼料添加劑的組在斷奶時每只小豬的體重平均比對照組增加了0.39千克。當在同窩崽中比較所述飼料添加劑和抗生素治療時，發現獲得所述飼料添加劑的小豬崽的體重增加比對照組高2.4千克。
實施例15將飼料添加劑(實施例4)應用于表現出腹瀉的小豬崽給表現出腹瀉的數百頭小豬崽每天每頭小豬施用5毫升的飼料添加劑。相同規模的對照組用抗生素處理advocin，慶大霉素，阿莫西林。接受所述飼料添加劑的組的腹瀉癥狀在1-2天內消失。沒有出現死亡，并且小豬崽發育正常。抗生素能使大部分小豬崽停止腹瀉，但是這些小豬崽仍然發育緩慢。
給接受抗生素治療腹瀉1周的、一般被認為會死去的大約70頭發育遲緩小豬崽施用飼料添加劑3天。這些小豬崽中除2頭外全部存活。
實施例16將飼料添加劑(實施例4)用于健康牛犢通過乳液給剛出生的健康牛犢施用5毫升飼料添加劑，施用7天時間。超過95％的小牛犢直到14日齡都沒有出現腹瀉，同時診斷了少量病例的輪狀病毒陽性。通常，一般，在該農場中腹瀉的發病率為20-30％。
實施例17將飼料添加劑(實施例6)用于出現腹瀉的牛犢通過乳液每天給每頭出現腹瀉的牛犢施用10毫升飼料添加劑。90-95％的牛犢的腹瀉癥狀在1-2天內消失。其余5-10％的腹瀉是由病毒引起的。用抗生素治療這些牛犢得到了較差的結果。
實施例18將飼料添加劑(實施例6)用于健康的綿羊羔和山羊羔通過乳液給剛出生的綿羊羔和山羊羔施用3毫升的飼料添加劑，共施用7天時間。在某些情況下，會出現輕度至中度腹瀉癥狀。這些癥狀通常會自動消失，或能夠用較大劑量的飼料添加劑(5毫升)成功治療。對于綿羊羔和山羊羔來說，在所述農場中腹瀉的發病率通常為50％。
實施例19將飼料添加劑(實施例5)用于表現出腹瀉的綿羊羔和山羊羔在患有致病性大腸桿菌感染的獸群中試驗所述飼料添加劑。在試驗的前一年，120只綿羊羔和山羊羔中大約有90只死于腹瀉。用抗生素治療不起作用，因為這種病是突然發生的，并且很快死亡。在3-5天時間內，通過乳液給每頭表現出腹瀉的綿羊羔和山羊羔每天施用5毫升的飼料添加劑。對照組的動物按照正常的推薦用抗生素治療。接受飼料添加劑的綿羊羔和山羊羔的大約90％的腹瀉癥狀在1-2天內消失。這些羊羔的進一步發育表現正常。接受抗體(慶大霉素)的對照組表現出較差的結果。對照組的腹瀉持續存在，需要用抗生素反復治療。對照組動物的發育嚴重遲緩。
實施例20將飼料添加劑(實施例5)用于家禽在繁育期(42-49天)將飼料添加劑添加到飲用水中，使每只雞每天攝入0.01毫升的飼料添加劑。在用童子雞進行的受控制的試驗中，發現了體重增加為3.2％，同時還伴隨著飼料轉化提高4％。
用1天-6周齡的火雞同樣獲得了良好的結果。每只禽每天接受0.01毫升的添加劑。觀察到了超過10％的體重增加，同時降低了死亡率。仍然表現出腹瀉的家禽每天用0.1毫升的食品添加劑治療，而不用任何抗生素治療，并且與僅用抗生素治療的對照禽類相比，表現出更好的恢復情況。
實施例21將飼料添加劑(實施例5)用于犬和貓將飼料添加劑用于小狗，導致在24-48小時內使腹瀉癥狀終止。
實施例22將飼料添加劑(實施例5)用于小鼠；免疫刺激的證據將2周齡的C571B1小鼠分成4組，每組10只動物。從下午4點到次日上午8點不讓小鼠喝水，然后提供15毫升的水(第1和3組)或飼料添加劑(第2和4組)。重復該處理2周。在該處理結束時，來自第3和4組的小鼠在乙醚麻醉條件下進行剖腹手術。在腹壁上形成1.5厘米的切口。通過干燥紗布進行腸刺激。所有小鼠都在剖腹手術之后24小時宰殺；切除脾臟。分離脾細胞，并且在存在植物凝集素(PHA)的條件下，在RPMI培養基上培養48-72小時。在用飼料添加劑處理的組中，由剖腹手術導致的脾細胞增殖活性的減弱得到恢復。
由PHA誘導的脾細胞增殖1.對照組/水3060±2902.對照組/水/剖腹手術 2120±3003.測試組/BioCocktail 2740±3704.測試組/BioCocktail/剖腹手術 3040±520實施例23將食品添加劑(實施例4)用于人；免疫刺激的證據對多位患者實施子宮、宮頸、胃和腸惡性腫瘤手術。婦科患者(20位患者)接受隨后的放射治療。腹部患者(30位患者)接受化療。大約1/2的患者在治療期間每天2次施用食品添加劑。在接受食品添加劑的所有患者中，出現了顯著的免疫刺激，其表現為婦科腫瘤 腹部腫瘤對照 食品添加劑 對照 食品添加劑T-淋巴細胞0.03±0.01 0.10±0.03 1.0±0.1 1.6±0.2(CD3+，HLA-，DR+)淋巴母細胞轉化a.自發 530±110 880±80700±120 1070±100b.PHA-誘導 1600±360 5720±2100 4400±134013370±3720吞噬細胞數量(％) 60.7±2.9 76.5±2.2 57.7±1.5 74.2±1.9實施例24所述制劑的細菌保存作用將大腸桿菌細胞分散在按上述實施例1方法制備的制劑中，并且在室溫下保存6個月。在所述6個月開始和結束時，將來自所述分散液的樣品，以合適的連續稀釋比例接種在營養液瓊脂平板上。測定這兩種樣品的集落形成單位數量。在這兩種情況下所測定的濃度為1×107，證實了該制劑在保存微生物方面的作用。用惡臭假單胞菌同時進行的上述實驗，得到了相同的結果。
盡管業已結合本發明的具體實施方案對本發明進行了說明，很明顯，很多種改變、改進和變化對本領域技術人員來說是顯而易見的。因此，所有這樣的改變、改進和變化都被認為屬于所附權利要求書的構思和廣泛的范圍。在本說明書中所提到的所有文獻、專利和專利申請，都被以相同的程度以全文形式收作本說明書的參考文獻，就如同每一份文獻、專利、專利申請被專門和特別指明收作本文參考一樣。另外，在本申請中所引用或提到的任何參考文獻，都不應當被認為是承認所述文獻可以用作本發明的現有技術。
權利要求
1.ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98。
2.一種含有ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98的益生性組合物和用于維持所述大腸桿菌菌株的存活力的制劑。
3.如權利要求2所述的益生性組合物，還包含至少一種香味劑。
4.如權利要求2所述的益生性組合物，其中所述制劑包含植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)。
5.如權利要求4所述的益生性組合物，其中所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
6.如權利要求4所述的益生性組合物，其中所述植物提取物是從選自植物葉片、莖、根和果實的植物器官中獲得的。
7.如權利要求4所述的益生性組合物，其中所述植物提取物是從選自蔬菜和草本植物的植物獲得的。
8.如權利要求7所述的益生性組合物，其中所述蔬菜選自大豆、苜蓿、大蒜、甜菜和甘藍。
9.如權利要求7所述的益生性組合物，其中所述草本植物選自歐芹、薄荷和蒔蘿。
10.如權利要求4所述的益生性組合物，還含有蜂箱產品。
11.如權利要求10所述的益生性組合物，其中所述蜂箱產品是蜂膠。
12.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療胃腸感染或失調。
13.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于保持或恢復正常的胃腸道微生物區系。
14.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療腹瀉。
15.如權利要求14所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療由腸道病原體導致的胃腸感染。
16.如權利要求15所述的益生性組合物，其中所述病原體是革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。
17.如權利要求2所述的益生性組合物，包含蒸餾水和甜菜、蒔蘿和歐芹的揮發性級份。
18.如權利要求2所述的益生性組合物，包含蒸餾水和甜菜、蒔蘿和葡萄的揮發性級份。
19.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療胃腸沙門氏菌感染。
20.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療感染性腹瀉、由抗生素治療、放療或化療所導致的慢性腹瀉或腹瀉。
21.如權利要求2所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療感染性腹瀉，包含蒸餾水和甜菜、蒔蘿和歐芹的揮發性級份。
22.如權利要求21所述的益生性組合物，其中所述感染性腹瀉是由艱難梭菌，沙門氏菌屬，特別是志賀氏沙門氏菌，彎曲桿菌屬，大腸桿菌，變形菌屬，假單胞菌屬或梭菌屬導致的。
23.如權利要求2所述的組合物，被鑒定用于使胃腸道的生理學活性正常化。
24.含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑，所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
25.如權利要求24所述的制劑，其中所述植物提取物是從選自植物葉片、莖、根和果實的植物器官中獲得的。
26.如權利要求24所述的制劑，其中所述植物提取物是從選自蔬菜和草本植物的植物獲得的。
27.如權利要求26所述的制劑，其中所述蔬菜選自大豆、苜蓿、大蒜、甜菜和甘藍。
28.如權利要求26所述的制劑，其中所述草本植物選自歐芹、薄荷和蒔蘿。
29.如權利要求24所述的制劑，還含有蜂箱產品。
30.如權利要求29所述的制劑，其中所述蜂箱產品是蜂膠。
31.一種用于增強動物的體重增加的獸醫食品添加劑，含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
32.如權利要求31的獸醫飼料添加劑，包含蒸餾水和甜菜、蒔蘿和歐芹的揮發性級份。
33.一種用于增強受體體重增加的食品添加劑，含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
34.如權利要求33的食品添加劑，包含蒸餾水和甜菜、蒔蘿和歐芹的揮發性級份。
35.一種益生性組合物，包含(a)有效量的至少一種存活的益生性微生物，該微生物在胃腸道中具有有益的生物學或治療活性；和(b)植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)。
36.如權利要求35的益生性組合物，還包含至少一種香味劑。
37.如權利要求35的益生性組合物，其中所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
38.如權利要求35的益生性組合物，其中所述益生性微生物是大腸桿菌。
39.如權利要求37的益生性組合物，其中所述益生性微生物是ATCC保藏號為202226的大腸桿菌菌株BU-230-98。
40.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療胃腸感染或失調。
41.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于保持或恢復正常的胃腸道微生物區系。
42.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療腹瀉。
43.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療由腸道病原體導致的胃腸感染。
44.如權利要求43所述的益生性組合物，其中所述病原體是革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。
45.如權利要求43所述的益生性組合物，用于治療消化不良癥狀。
46.如權利要求43所述的益生性組合物，用于增強患有免疫障礙患者的免疫應答。
47.如權利要求46所述的益生性組合物，其中所述免疫障礙是由免疫應答抑制治療導致的。
48.如權利要求35所述的益生性組合物，包含蒸餾水和甜菜和蒔蘿的揮發性級份。
49.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療胃腸沙門氏菌感染。
50.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療感染性腹瀉、由抗生素治療、放療或化療所導致的慢性腹瀉或腹瀉。
51.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于預防或治療感染性腹瀉，包含蒸餾水和甜菜和蒔蘿的揮發性級份。
52.如權利要求51所述的益生性組合物，其中所述感染性腹瀉是由艱難梭菌，沙門氏菌屬，特別是志賀氏沙門氏菌，彎曲桿菌屬，大腸桿菌，變形菌屬，假單胞菌屬或梭菌屬導致的。
53.如權利要求35所述的益生性組合物，被鑒定用于使胃腸道的生物學活性恢復正常。
54.如權利要求53所述的益生性組合物，包含蒸餾水，并且其中所述揮發性級份來自苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿、薄荷、歐芹和甘藍，所述益生性微生物是ATCC保藏號為202226的大腸桿菌菌株Bu-230-98。
55.一種組合物，包含(a)至少一種微生物；和(b)植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
56.如權利要求55所述的益生性組合物，其中所述至少一種微生物選自埃希氏菌，產堿菌，節桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，乳球菌，亞硝化單胞菌或假單胞菌。
57.一種制備植物的揮發性級份的方法，包括以下步驟(a)研磨植物來源的材料，得到一種植物生物物質；(b)將所述植物生物物質與水混合，并且在環境溫度下攪拌；(c)在減壓條件下，并且在不超過38℃的水浴溫度下對步驟(b)中所獲得的混合物進行蒸汽蒸餾；和(d)收集通過所述蒸汽蒸餾所獲得的揮發性級份。
58.如權利要求57的方法，其中所述植物提取物獲自植物葉片、莖、根或果實。
59.如權利要求58的方法，其中所述植物是蔬菜或草本植物。
60.如權利要求59的方法，其中所述蔬菜或草本植物選自大豆、苜蓿、大蒜、甜菜、蒔蘿、薄荷、歐芹和甘藍。
61.如權利要求57的方法，其中所述減壓為5-10毫巴。
62.一種制備治療制劑的方法，包括將植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)與生理學上或獸醫學上可以接受的添加劑、載體或稀釋劑混合的步驟。
63.如權利要求62的方法，其中所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備。
64.一種生長ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98的方法，該方法包括以下步驟將ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的大腸桿菌菌株BU-230-98的起始培養物接種到生長培養基中，并且使所述大腸桿菌菌株生長到在650nm下的光學密度為15-30。
65.一種生產益生性組合物的方法，該方法包括以下步驟將ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98懸浮在一種制劑中，以便保持所述大腸桿菌菌株的存活力。
66.如權利要求65的方法，其中所述制劑包含植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)。
67.如權利要求66的方法，其中所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
68.如權利要求66的方法，其中所述植物提取物獲自選自植物葉片、莖、根和果實的植物器官。
69.如權利要求66的方法，其中所述植物提取物是從選自蔬菜和草本植物的植物獲得的。
70.如權利要求69的方法，其中所述蔬菜或草本植物選自大豆、苜蓿、大蒜、甜菜、蒔蘿、薄荷、歐芹和甘藍。
71.如權利要求66的方法，還包括添加蜂箱產品。
72.如權利要求71的方法，其中所述蜂箱產品是蜂膠。
73.如權利要求65的方法，其中所述至少一種揮發性級份來自苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿和薄荷。
74.一種制備益生性組合物的方法，該方法包括以下步驟將有效量的、在胃腸道中具有有益的生物學或治療活性的至少一種存活益生性微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中。
75.如權利要求74的方法，其中所述揮發性級份是通過在減壓條件下，在不超過38℃的水浴溫度下通過對所述植物提取物進行蒸汽蒸餾而制備的。
76.如權利要求74的方法，其中所述益生性微生物是大腸桿菌。
77.如權利要求75的方法，其中所述益生性微生物是ATCC保藏號為202226的大腸桿菌菌株BU-230-98。
78.如權利要求74的方法，其中所述至少一種揮發性級份包含苜蓿、大豆、甜菜、蒔蘿、薄荷、歐芹和甘藍的揮發性級份。
79.一種制備含有存活微生物的組合物的方法，該方法包括以下步驟將至少一種微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便能在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
80.如權利要求79的方法，其中所述至少一種微生物選自埃希氏菌，產堿菌，節桿菌，雙歧桿菌，乳桿菌，乳球菌，亞硝化單胞菌或假單胞菌。
81.一種微生物分配器，該分配器包含一個儲存器和一個與該儲存器連接的計量器，該儲存器裝有存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中的至少一種微生物，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
82.如權利要求81的分配器，其中所述分配器是機載的。
83.如權利要求81的分配器，其中所述分配器是手持式的。
84.如權利要求81的分配器，其中所述分配器被設計成能自動分配預定的體積。
85.如權利要求81的分配器，其中所述分配器被設計成能定期自動分配預定的體積。
86.一種對生物進行生物控制的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能夠對所述生物進行生物控制的存活微生物噴灑在流行區域，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
87.一種清除油污染的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能降解油的微生物噴灑在受污染的區域，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
88.一種恢復生物過濾器中的有機煙霧降解微生物群體的方法，該方法包括以下步驟將至少一種能降解有機煙霧的存活微生物分配在所述過濾器上，所述至少一種存活微生物存在于含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
89.一種添加了ATCC保藏號為202226(DSM 12799)的存活大腸桿菌菌株BU-230-98的食品。
90.如權利要求89的食品，含有至少一種乳來源物質。
91.如權利要求90的食品，選自干酪和酸奶。
92.一種制備用于發酵過程的發酵劑的方法，該方法包括以下步驟生長足夠數量的發酵劑微生物，并且將所述發酵劑微生物懸浮在含有植物提取物的至少一種揮發性級份(VF)的制劑中，所述至少一種揮發性級份是經過選擇的，以便在室溫下將所述至少一種微生物的存活力保持至少2個月。
全文摘要
本發明披露了(i)一種非致病性益生性微生物及其益生/治療用途；(ii)含有由至少一種植物來源材料提取物制備的揮發性級份(VF)的水溶液的制劑，及其治療用途；(iii)一種由所述植物來源材料生產所述制劑的方法；(iv)含有本發明的非致病性益生性微生物和/或其他益生性微生物和本發明的制劑的益生性組合物，及其益生/治療用途；(v)一種用于工業應用的組合物，含有本發明的制劑和具有工業應用性的微生物；和(vi)應用上述后一種組合物的工業方法和裝置。
文檔編號A61P31/04GK1494374SQ01821485
公開日2004年5月5日 申請日期2001年11月27日 優先權日2000年11月30日
發明者M.奧爾謝尼特斯基, G.布克曼, 曼 申請人:生物平衡公司