包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的佐劑組合物的制作方法

專利名稱：包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的佐劑組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及供疫苗用的新型佐劑組合物。具體地說，本發明的佐劑組合物包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚組合。本發明也提供包含本發明佐劑組合物和至少一種抗原的疫苗。還提供生產本發明佐劑組合物和疫苗的方法以及它們作為藥物的應用。另外，本發明提供通過胃腸外或粘膜給予本發明的疫苗治療易感或患有疾病的個體的方法。
已知含有未甲基化CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸當通過系統和粘膜兩種途徑給予時是佐劑(WO 96/02555，EP 468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)870-876McCluskie和Davis，J.Immunol，1998，161(9)4463-6)。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基序的縮寫。從歷史的角度來講，觀察到BCG的DNA部分能夠發揮抗腫瘤效應。在進一步的研究中，表明衍生于BCG基因序列的合成寡核苷酸能夠誘發免疫刺激效應(在體外以及在體內)。這些研究的作者推斷，包括一個中心CG基序的某些回文序列帶有這種活性。所述CG基序在免疫刺激中的中心作用后來在出版物Krieg，Nature 374，第546頁1995中得以闡明。詳細的分析已經表明，CG基序必須處于某種序列環境中，并且這樣的序列在細菌DNA中是常見的，但在脊椎動物DNA中是罕見的。所述免疫刺激性序列通常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化CpG序列有免疫刺激性，并且可以用于本發明。
在所述六核苷酸的某些組合中，存在回文序列。或者作為一種基序的重復或者作為不同基序的組合的這些基序中的幾種，可以存在于同一寡核苷酸中。含有這些免疫刺激性序列中一種或多種的寡核苷酸的存在，可以激活各種免疫亞群，包括自然殺傷細胞(所述細胞產生干擾素γ并且具有溶細胞活性)和巨噬細胞(Wooldrige等Vol 89(no.8)，1977)。雖然現在已經表明，不具有這種共有序列的其它含未甲基化CpG的序列是免疫調節性的。
CpG當配制到疫苗中時，一般在自由溶液中與游離抗原一起給予(WO 96/02555；McCluskie和Davis，參見上文)，或者與抗原共價綴合(PCT公布號WO 98/16247)，或者與諸如氫氧化鋁的載體一起配制((肝炎表面抗原)Davis等，參見上文；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。其它含CpG制劑包括在WO 99/61056和WO 00/09159中描述的那些制劑。
包含CpG的母育酚(維生素E)和乳化佐劑在EP 0 382 271 B1和US5667784中有描述。
多年來已經了解油乳化佐劑，包括對弗氏完全和不完全礦物油乳化佐劑的研究。從那時起已經進行了許多研究，以設計這些有效、但有反應原性的佐劑制劑的穩定且很好耐受的替代物。在WO 95/17210中描述了包含母育酚的油乳液。
本發明基于這樣一個驚人的發現免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的組合構成了極其有效的佐劑制劑。這些佐劑制劑的成分在誘發抗原特異性抗體方面更好地協同相互作用，有效地誘發通常與Th1型免疫系統相關的免疫應答。因此，所述佐劑組合不僅適合于疾病的免疫預防，而且出乎意料地適合于諸如持續性病毒、細菌或寄生蟲感染的疾病以及諸如癌癥的慢性疾病的免疫治療。
所述免疫刺激性序列通常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基序未被甲基化。供本發明佐劑或疫苗使用的優選寡核苷酸最好包含兩個或兩個以上被至少3個、更優選至少6個或6個以上核苷酸隔開的二核苷酸CpG基序。本發明的寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個優選實施方案中，所述寡核苷酸中的核苷酸間鍵合是二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵，或者更優選是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯鍵和其它核苷酸間鍵合在本發明的范圍內，包括具有混合核苷酸間鍵合的寡核苷酸。產生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US 5,666,153、US 5,278,302和WO 95/26204中有描述。優選寡核苷酸的實例具有以下序列。所述序列優選含有硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合。OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO5)；TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)可供選擇的CpG寡核苷酸可以包含其中具有不重要的缺失或添加的上述優選序列。本發明中使用的CpG寡核苷酸可以用本領域已知的任何方法合成(例如EP 468520)。利用自動合成儀，可以方便地合成這類寡核苷酸。
本發明中使用的寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個優選實施方案中，所述寡核苷酸中的核苷酸間鍵合是二硫代磷酸酯鍵，或者更優選是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯在本發明的范圍內。考慮了包含不同核苷酸間鍵合的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。可以使用穩定所述寡核苷酸的其它核苷酸間鍵合。
可以有利地用于本發明佐劑組合中的母育酚在EP 0 382 271 B1中有描述。其中公開的母育酚用以下通式描述 其中R可以是H或者一個或多個選自以下的相同或不同的取代基烷基、烷氧基、酰氧基、羥基、硫酸酯基和磷酸酯基；R1和R3相互獨立地為H或烷基；R2為H或烷基，并且在每個單位中可以不同；虛線表示在一個單位中額外的碳-碳鍵存在或者不存在；且n＝1-10的數值；R、R1、R2和R3中的烷基可以具體選自具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈碳鏈，例如甲基、乙基、丁基或異丁基。
在EP 0 382 271 B1中描述的進一步限定的優選亞組通過引用結合到本文中。一種特別優選的母育酚是D，L，α-生育酚(CAS No.10191-41-0；化學名稱(2RS，4’RS，8’RS)-2，5，7，8-四甲基-2-(4’，8’，12’-三甲基-十三烷基)-6-苯并二氫吡喃醇(chromanol))，它以ROCHETM市售。
母育酚優選為油乳液形式，更優選為水包油(油/水)型乳液。母育酚可以如EP 0 382 271 B1中所述方法配制，其中母育酚可以是母育酚小滴的分散體，任選包含乳化劑，小滴的直徑優選小于1微米。另一方面，母育酚可以與其它油聯合使用，以構成油乳液的油相。以下描述可以與母育酚聯用的油乳液的實例。
已經提出水包油型乳液佐劑本身可用作佐劑組合物(EP 0 399843B)，水包油型乳液和其它活性劑的組合也已經描述為供疫苗用的佐劑(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。其它的油乳化佐劑已有描述，例如油包水型乳液(US 5,422,109；EP 0 480 982B2)和水包油包水(W/O/W)型乳液(US 5,424,067；EP 0 480 981 B)。所有這些都形成優選油乳液體系以摻入母育酚，并且最終與CpG混合，構成本發明的佐劑。
可供與母育酚聯合的油的選擇，可以是天然或合成的，并且可以是無機的或是有機的。無機和有機油的實例對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。
所述乳液體系的油相優選包含可代謝油。術語可代謝油的含義是本領域眾所周知的。可代謝可以定義為“能夠通過代謝作用被轉化”(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，25thedition(1974))。所述油可以是任何植物油、魚油、動物油或合成油，對于受體而言是無毒的，并且能夠通過代謝作用被轉化。堅果(例如花生油)、種子和谷粒是常見的植物油來源。合成油也是本發明的部分，可以包括市售的油例如NEOBEETM以及其它油。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四烷六烯)是一種在鯊魚魚肝油中大量存在的不飽和油，而在橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中以較低量存在，并且是供本發明使用的特別優選的油。鑒于角鯊烯是膽固醇生物合成的中間體(Merck index，10th Edition，entry no.8619)的這一事實，角鯊烯是一種可代謝油。
可供與CpG聯合構成本發明佐劑的特別優選的油乳液是包含母育酚和乳化劑的水包油型乳液，特別是角鯊烯/水型乳液。
優選乳液體系的實例在WO 95/17210和WO 99/11241中有描述，所述文獻公開了基于角鯊烯、α-生育酚和TWEEN 80、任選與免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL一起配制的乳化佐劑。
在穩定的水包油型乳液中存在的油珠大小優選低于1微米，可以大致在在30-600nm范圍內，優選直徑大致在30-500nm左右，最優選直徑大致為150-500nm，特別是通過光子相關光譜學測定直徑約為150nm。在這一方面，按數目計80％的油珠應該在所述優選范圍內，更優選按數目計超過90％、最優選超過95％的油珠在所限定的大小范圍內。在本發明油乳液中存在的所述成分的量通常為2-10％范圍內的油，例如角鯊烯；并且當存在時，為2-10％α生育酚；和0.3-3％表面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯。油(優選角鯊烯)母育酚(優選α-生育酚)之比優選等于或小于1，因為這一比率提供了更為穩定的乳液。也可以存在大約1％水平的乳化劑，例如Tween80或Span85。在某些情況下，可能有利的是本發明的疫苗還含有穩定劑。
產生水包油型乳液的方法是本領域技術人員眾所周知的。通常，所述方法包括將含母育酚的油相與表面活性劑例如PBS/TWEEN80TM溶液混合，然后用均化器均化，包括使所述混合物兩次通過注射器針頭的方法適合于將小體積液體均化，這對于本領域技術人員而言是顯而易見的。同樣，本領域技術人員改進在微流化床中的乳化法(M110S微流控機(microfluidics machine)，最多50道(pass)，在6巴最大輸入壓(輸出壓約850巴)下2分鐘)，來產生更小或更大體積的乳液。這種改進可以通過常規實驗來完成，包括測量所得的乳液，直至獲得具有所需直徑油珠的制劑。
在本發明的一個替代實施方案中，所述母育酚和CpG組合可以另外包括其它免疫刺激劑，例如LPS或其衍生物或者皂苷。其它免疫刺激劑的實例在以下文獻中有描述“Vaccine Design-The Subunit andAdjuvant Approach”1995，Pharmaceutical Biotechnology，Volume 6，Powell，M.F.和Newman，M.J.編著，Plenum Press，New York和London，ISBN 0-306-44867-X。
因此，本發明的CpG/母育酚佐劑組合可以有利地包括至少一種腸細菌脂多糖衍生佐劑。長期以來已知腸細菌脂多糖(LPS)是免疫系統的一種有效的刺激物，雖然其在佐劑中的應用由于其毒性效應而一直被縮減。Ribi等(1986，Immunology and Immunopharmacology of bacterialendotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，第407-419頁)已經描述了通過從還原末端葡糖胺除去核心糖基團和除去磷酸酯而產生的LPS的一種無毒衍生物-單磷酰脂質A(MPL)，MPL具有以下結構 一種進一步解毒形式的MPL通過從二糖主鏈的3位除去酰基鏈而產生，稱為3-O-去酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)。它可以用GB2122204B中所述的方法來純化和制備，該文獻也公開了二磷脂脂質A及其3-O-去酰化變體的制備。一種優選形式的3D-MPL為直徑小于0.2μm的小粒徑的乳液形式，其生產方法公開于WO 94/21292中。在WO 9843670A2中描述了包含單磷酰脂質A和表面活性劑的水性制劑。
待配制到本發明的佐劑組合中的細菌脂多糖衍生佐劑可以從細菌來源純化和加工，或者它們可以是合成的。例如，在Ribi等1986(參見上文)中描述了純化單磷酰脂質A，而在GB 2220211和US 4912094中描述了來源于沙門氏菌(Salmonella sp.)的3-O-去酰化單磷酰或二磷脂脂質A。其它純化的和合成的脂多糖已有描述(WO 98/01139；US6,005,099和EP 0 729 473 B1；Hilgers等，1986.Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP 0 549 074 B1)。特別優選的細菌脂多糖佐劑是US 6,005,099和EP 0729 473 B1中描述的3D-MPL和β(1-6)葡糖胺二糖。
因此，可以用于本發明的LPS衍生物是在結構上與LPS或MPL或3D-MPL相似的那些免疫刺激劑。在本發明的另一方面，所述LPS衍生物可以是酰化單糖，它是MPL上述結構的亞部分。
一種優選的二糖佐劑是具有以下結構式的純化或合成脂質A 其中R2可以是H或PO3H2；R3可以是具有下式的酰基鏈或β-羥基肉豆蔻酰基或3-酰氧基酰基殘基 其中 并且其中X和Y具有從0至約20的數值。
所述佐劑組合物也可以進一步包括皂苷。在EP 0 761 231B中描述了3D-MPL和來源于皂樹Quillaja Saponaria molina樹皮的皂苷佐劑的組合。WO 95/17210公開了一種基于與免疫刺激劑QS21一起配制、任選與3D-MPL一起配制的角鯊烯、α-生育酚和聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80)的佐劑乳液體系。CpG和WO 95/17210中所上述佐劑系統的組合，構成了本發明的一個優選方面。WO 96/33739和WO98/15287描述了包含皂苷和顆粒性載體結構、任選包含3D-MPL和/或水包油型乳液的佐劑制劑；所述制劑當與母育酚和CpG聯合時，構成了本發明的優選佐劑。
已知皂苷為供系統給藥用的疫苗中的佐劑。在本領域中已經廣泛地研究了各種皂苷的佐劑和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，參見上文)。例如，在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55；和EP 0 362279 B1中描述了Quil A(來源于南美皂樹Quillaja Saponaria Molina的樹皮)及其級分。
包含Quil A級分的稱為免疫刺激復合物(Immune StimulatingComplexes)(ISCOMS)的顆粒性結構具有溶血性，已經用于疫苗的生產(Morein，B.，EP 0 109 942 B1)。據報道這些結構具有佐劑活性(EP 0 109942 B1；WO 96/11711)。
溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC純化級分)已被描述為有效的系統性佐劑，其生產方法公開于美國專利第5,057,540號和EP 0362 279 B1中。在這些參考文獻中也描述了作為系統疫苗用有效佐劑的QS7(Quil-A的一種非溶血性級分)的應用。QS21的應用在Kensil等(1991.J.Immunology vol 146，431-437)中有進一步的描述。QS21和聚山梨醇酯或環糊精的組合也是已知的(WO 99/10008)。包含Quil A級分諸如QS21和QS7的顆粒性佐劑系統描述于WO 96/33739和WO96/11711中。已經用于系統疫苗接種研究的其它皂苷包括來源于其它植物種例如絲石竹屬(Gypsophila)和肥皂草屬(Saponaria)的那些皂苷(Bomford等，Vaccine，10(9)572-577，1992)。
本發明的佐劑組合可以任選地還包含另外一種載體，使得CpG可以與顆粒性載體實體結合，以增強所述組合的佐劑性(adjuvanticity)。因此，本發明佐劑組合中使用的CpG可以處于自由溶液中，或者可以與顆粒性載體例如無機鹽(例如但不限于鋁鹽或鈣鹽)、脂質體、ISCOM、聚合物(例如但不限于聚乳酸、聚羥基乙酸、聚磷腈(polyphosphazine)、聚氨基酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖)或微粒絡合。所述載體優選為陽離子型的。所述CpG也可以以這樣一種方式配制，使得它與母育酚或含母育酚的油乳液結合。這可以通過以使乳液成為陽離子型的方式配制所述乳液而達到。或者，可以將CpG與同乳液油相相關的脂質綴合(WO 00/15256)。
本發明的疫苗還包含一種抗原，所述抗原可以與CpG-載體復合物例如CpG/母育酚/油珠或者CpG/金屬鹽復合物結合或不結合。所述抗原可以是游離懸浮液，或者與一種單獨的載體結合。在本發明的一個優選方面，所述抗原與CpG/載體復合物結合。
按照本發明的一種優選佐劑組合由一種或多種在兩個相鄰CG基序之間含有至少3個、優選至少6個核苷酸的CpG寡核苷酸、以及母育酚例如D，Lα-生育酚組成。這種組合優選還包含一種LPS的佐劑活性衍生物和一種選自金屬鹽或水包油型乳液的顆粒性載體。最優選所述佐劑組合包含CpG 2006(SEQ ID NO4)或CpG 1758(SEQ ID NO2)或CpG 1826(SEQ ID NO1)和角鯊烯/D，Lα-生育酚乳液；這種優選佐劑還任選包含3-O-去酰化單磷酰或二磷酰脂質A和/或QS21或這兩者。一種優選的佐劑系統包含QS21、3D-MPL和母育酚的組合以及CpG。
本發明的佐劑組合可以用作系統佐劑，或者用作粘膜佐劑。給患者接種疫苗已經通過多種給藥途徑進行，其中最常用的給藥途徑是將疫苗給予個體的深部肌肉中(肌內注射)。其它熟知的疫苗接種途徑包括皮下、鼻內、經口、直腸和腹膜內和皮內給藥。雖然本發明的疫苗可以通過任一種途徑給予，但將所述疫苗給予皮膚中構成了本發明的一個優選實施方案。
人類皮膚構成覆蓋表皮的外部“角性”外皮，稱為角質層。在這一表皮之下，是稱為真皮的皮層，真皮又覆蓋皮下組織。研究人員已經指出，將疫苗注射到皮膚中、特別是注射到真皮中，刺激免疫應答，這也可能與許多其它優點相關。用本文所述疫苗的皮內疫苗接種構成了本發明的一個優選特征。
皮內注射的常規技術-“芒圖法(mantoux procedure)”包括下述步驟清潔皮膚，然后用一只手繃緊皮膚，將小號針頭(26-31號)的斜面朝上，以10-15°的角度插入針頭。一旦針頭的斜面插入，則壓低針頭的針筒并且進一步插入針頭，同時提供輕壓，在皮膚下將針頭挑起。然后非常緩慢地注射液體，從而在皮膚表面形成水泡或腫塊，然后緩慢抽出針頭。
最近，描述了具體設計用以將液體藥劑給予皮膚內或穿過皮膚給予的裝置，例如在WO 99/34850和EP 1092444中描述的裝置，以及例如在以下文獻中描述的噴射注射裝置WO 01/13977；US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。皮內給予疫苗制劑的替代方法可以包括常規注射器和針頭、或者設計用于射擊給予(ballistic delivery)固體疫苗(WO 99/27961)或透皮貼劑(WO 97/48440；WO 98/28037)的裝置；或者施用于皮膚表面(透皮遞藥WO 98/20734；WO 98/28037)。
當將本發明的疫苗給予皮膚、或更具體地講給予真皮內時，所述疫苗為小體積液體，特別是約0.05-0.2ml體積的液體。
當用于本文時，術語“真皮內給藥”是指將疫苗給予皮膚內的真皮區。然而，疫苗不一定僅僅給予真皮內。真皮在人類皮膚中是皮膚內位于距表面約1.0mm-2.0mm的層，但在個體之間以及在機體的不同部位有一定量的變化。一般而言，可以預料在皮膚表面下行進1.5mm則達到真皮。真皮位于表面的角質層和表皮與下面的皮下層之間。根據給藥模式，疫苗可能最終僅位于或者主要位于真皮內，或者它可能最終分布于表皮和真皮內。
在各種各樣治療方案(包括例如口服、胃腸外、靜脈內、真皮內、經皮、鼻內和肌內給藥和制劑)中用于使用本文所述的特定組合物的合適給藥和治療方案的開發是本領域眾所周知的，為了一般的說明目的，其中某些方案在下文中作簡單的論述。
在某些應用中，本文公開的藥用組合物可以通過口服給藥給予動物。因此，這些組合物可以用惰性稀釋劑或可吸收的食用載體來配制，或者它們可以包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者它們可以壓制為片劑，或者它們可以直接摻入食物中。
所述活性化合物可以甚至摻有賦形劑，并且以可攝取的片劑、口含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米紙囊劑等的形式使用(參見例如Mathiowitz等Nature 1997 Mar 27；386(6623)410-4；Hwang等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)243-84；美國專利5,641,515；美國專利5,580,579和美國專利5,792,451)。片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等也可以含有多種額外成分中的任一種，例如粘合劑，諸如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；和甜味劑(諸如可以加入蔗糖、乳糖或糖精)或者矯味劑諸如薄荷油、冬綠樹油或者櫻桃調味料。當劑量單位形式為膠囊時，除含有上述類型的材料外，它還可以含有液體載體。各種其它材料可以作為包衣存在，或者存在各種其它材料以便在其它情況下改進所述劑量單位的物理形式。例如，可以給片劑、丸劑或膠囊劑包上蟲膠、糖或者這兩者。當然，在制備任何劑量單位形式中使用的任何材料都應該是藥物級純的，并且在所用的量下基本上是無毒的。另外，所述活性化合物可以摻入到緩釋制劑和配方中。通常，這些制劑將含有至少約0.1％或0.1％以上的所述有效成分，雖然所述有效成分的百分率自然可以變化，可以適宜地在總制劑的重量或體積的約1％或2％和約60％或70％或70％以上之間。自然，每種治療上有用的組合物中的活性化合物的量可以以這樣一種方式制備，使得在任何給定單位劑量的所述化合物中獲得合適的劑量。制備這種藥用制劑的領域的技術人員將考慮多種因素，諸如溶解性、生物利用度、生物半壽期、給藥途徑、制品的貯藏期以及其它藥理學考慮因素，因此，可能需要各種各樣的劑量和治療方案。
另一方面，對于口服給藥而言，本發明的組合物可以摻有一種或多種漱口劑、牙粉、口含片、口腔噴霧劑或舌下口服給藥制劑形式的賦形劑。或者，可以將所述有效成分摻入到口服溶液劑中，例如含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的口服溶液劑，或者分散于牙粉中，或者以治療有效量加入到組合物中，所述組合物可以包括水、粘合劑、摩擦劑、矯味劑、發泡劑和濕潤劑。或者，所述組合物可以被制作為可以置于舌下或者溶于口腔的片劑或溶液劑形式。
在某些情況下，胃腸外、靜脈內、肌內或甚至腹膜內給予本文公開的藥用組合物將是理想的。這類途徑對于技術人員而言是眾所周知的，其中某些途徑例如在美國專利5,543,158；美國專利5,641,515和美國專利5,399,363中有進一步的描述。在某些實施方案中，作為游離堿或者藥理學上可接受的鹽的活性化合物的溶液，可以在水中適當地與表面活性劑例如羥丙基纖維素混合來制備。可以在甘油、液態聚乙二醇和其混合物中以及在油中制備分散體。在常規貯藏和使用條件下，這些制劑一般將含有防腐劑，以防止微生物生長。
適用于注射應用的說明性藥物形式包括無菌水溶液或者分散體、以及供臨時制備無菌注射液或分散體用的無菌散劑(例如參見美國專利5,466,468)。在所有情況下，所述形式必須是無菌的，并且必須是流體，從而存在易注射性。它必須在生產和貯藏條件下穩定，并且必須防止微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油。可以借助包衣例如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持所需的粒徑和/或借助表面活性劑，可以維持適當的流動性。用各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以有助于防止微生物的作用。在許多情況下，最好包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的藥劑，例如一硬脂酸鋁和明膠，可以達到注射用組合物的延長吸收。
在一個實施方案中，對于水溶液的胃腸外給藥而言，所述溶液在必要時應該適當地緩沖，并且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液尤其適用于靜脈內、肌內、皮下和腹膜內給藥。在這一方面，根據本說明書，可以使用的無菌水性介質對于本領域技術人員而言是已知的。例如，可以將一個劑量溶于1ml等滲氯化鈉溶液中，或者加入至1000ml皮下輸液中，或者在建議的輸注部位注射(參見例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Edition，第1035-1038和1570-1580頁)。根據待治療受治療者的病癥，必定發生某些劑量的變化。此外，對于人類給藥而言，制劑當然最好符合FDAOffice of Biologics標準所要求的無菌性、熱原性和一般安全性和純度的標準。所述載體還可以包括任一種和所有的溶劑、分散介質、溶媒、包衣、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、混懸劑、膠體等。這類介質和藥劑在藥用活性物質方面的應用是本領域眾所周知的。除了由于任何常規的介質或藥劑與所述有效成分不配伍，則考慮了其在治療組合物中的應用。補充的有效成分也可以摻入到所述組合物中。短語“藥學上可接受的”是指當給予人類時不產生過敏反應或類似的不想要的反應的分子實體和組合物。
在某些實施方案中，所述藥用組合物可以通過鼻內噴霧劑、吸入和/或其它氣霧劑遞藥載體來給予。例如在美國專利5,756,353和美國專利5,804,212中，已經描述了用于通過鼻腔氣霧噴霧劑將基因、核酸和肽組合物直接傳遞至肺部的方法。同樣，用鼻內微粒樹脂(Takenaga等，J Controlled Release 1998 Mar 2；52(1-2)81-7)和溶血磷脂酰基-甘油化合物(美國專利5,725,871)遞藥也是制藥領域眾所周知的。同樣，說明性的在聚四氟乙烯形式的支持基質中經粘膜給藥在美國專利5,780,045中有描述。
所述疫苗制劑的系統給藥方法可以包括常規的注射器和針頭、或者設計用于射擊給予固體疫苗的裝置(WO 99/27961)、或者無針加壓液體噴射裝置(US 4,596,556；US 5,993,412)、或者透皮貼劑(WO 97/48440；WO 98/28037)。本發明也可以用來增強用于皮膚的抗原的免疫原性(透皮遞藥WO 98/20734；WO 98/28037)。因此，本發明提供一種預先填充本發明的疫苗或佐劑組合物的供系統給藥用的遞藥裝置。
因此，本發明提供一種預先填充本發明的疫苗或佐劑組合物的供系統給藥用的遞藥裝置。因此，提供一種在個體內誘發免疫應答的方法，所述方法包括將本發明的疫苗給予所述個體，其中所述疫苗通過胃腸外途徑或系統途徑給予。
本發明的疫苗制劑最好含有能夠誘發針對人類病原體的免疫應答的抗原或抗原組合物，所述抗原或抗原組合物來源于HIV-1(例如tat、nef、gp120或gp160)；人皰疹病毒，諸如gD或其衍生物或者立即早期蛋白諸如得自HSV1或HSV2的ICP27；巨細胞病毒((尤其是人巨細胞病毒)(諸如gB或其衍生物)；輪狀病毒(包括減毒活病毒)；EB病毒(諸如gp350或其衍生物)；水痘-帶狀皰疹病毒(諸如gpI、II和IE63)；或者來源于肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；或者來源于其它病毒病原體，例如副粘病毒呼吸道合胞病毒(諸如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，..)、黃病毒(例如黃熱病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或者流感病毒(完整的活病毒或者滅活病毒、在雞蛋或MDCK細胞中生長的裂解流感病毒(split influenzavirus)、或者完整的流感病毒體(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或者其純化或重組蛋白，諸如HA、NP、NA或M蛋白、或其組合)；或者來源于細菌病原體，諸如奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如夾膜多糖及其綴合物、運鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PilC、粘附素)；化膿鏈球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸質)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxella spp.)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis)，也稱為粘膜炎布蘭漢氏球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量粘附素和侵襲素)；博德特氏菌(Bordetella spp.)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝桿菌(Mycobacterium spp.)包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝桿菌(M.bovis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、鳥分枝桿菌(M.avium)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)；軍團菌)Legionellaspp.)，包括嗜肺軍團菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌(E.coli)(例如定居因子、熱不穩定性毒素或其衍生物、熱穩定性毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀菌毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp.)，包括霍亂弧菌(V.cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌(Shigellaspp.)，包括索氏志賀氏菌(S.sonnei)、痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S.flexnerii)；耶爾森氏菌(Yersinia spp.)，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；彎曲桿菌(Campylobacter spp.)，包括空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C.coli)；沙門氏菌(Salmonella spp.)，包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)；李斯特氏菌(Listeriaspp.)，包括單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺桿菌(Helicobacter spp.)，包括幽門螺桿菌(H.pylori)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假單胞菌(Pseudomonas spp.)，包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌(Staphylococcus spp.)，包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；腸球菌(Enterococcus spp.)，包括糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破傷風梭菌(C.tetani)(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.bolutinum)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢桿菌(Bacillus spp.)，包括炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒桿菌(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒桿菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體(B.hermsii)；埃里希氏體(Ehrlichia spp.)，包括馬埃里希氏體(E.equi)以及人粒細胞性埃利希病的病原體；立克次氏體(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏體(R.rickettsii)；衣原體(Chlamydia spp.)，包括砂眼衣原體(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；鉤端螺旋體(Leptospiraspp.)，包括問號鉤端螺旋體(L.interrogans)；密螺旋體(Treponemaspp.)，包括蒼白密螺旋體(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(T.denticola)、豬痢疾密螺旋體(T.hyodysenteriae)；或者來源于寄生蟲，例如瘧原蟲(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧原蟲(P.falciparum)；弓形蟲(Toxoplasmaspp.)，包括鼠弓形蟲(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；內阿米巴(Entamoeba spp.)，包括溶組織內阿米巴(E.histolytica)；巴貝蟲(Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲(B.microti)；錐蟲(Trypanosoma spp.)，包括克氏錐蟲(T.cruzi)；賈第鞭毛蟲(Giardiaspp.)，包括蘭氏賈第鞭毛蟲(G.lamblia)；利什曼原蟲(Leshmania spp.)，包括大型利什曼原蟲(L.major)；肺囊蟲(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲(Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲(T.vaginalis)；血吸蟲(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸蟲(S.mansoni)；或者來源于酵母，例如念珠菌(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隱球菌(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球菌(C.neoformans)。
結核分枝桿菌的其它優選具體抗原例如為Tb Ra12、Tb H9、TbRa35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCCI(WO99/51748)。結核分枝桿菌的蛋白也包括其融合蛋白和其變異體，其中至少兩種、優選三種結核分枝桿菌多肽融合為一種較大的蛋白。優選融合體包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MITI-MSL、Erd14-DPV-MITI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。
衣原體的最優選抗原包括例如高分子量蛋白(HWMP)(WO99/17741)、ORF3(EP 366 412)和推定的膜蛋白(Pmps)。所述疫苗制劑的其它衣原體抗原可以選自WO 99/28475中所述的組。
優選的細菌疫苗包含來源于以下的抗原鏈球菌，包括肺炎鏈球菌(例如夾膜多糖及其綴合物、PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結合蛋白)和蛋白質抗原肺炎球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，Microbial Pathogenesis，25，337-342)及其突變型解毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它優選的細菌疫苗包括來源于以下的抗原嗜血菌(Haemophilus spp.)，包括乙型流感嗜血菌(H.influenzae type B)(例如PRP及其綴合物、不可分型的流感嗜血菌例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、以及絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽(US 5,843,464)或者其多拷貝變異體或融合蛋白。
乙型肝炎病毒表面抗原的衍生物是本領域眾所周知的，尤其包括在歐洲專利申請EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP 198-474中敘述的那些PreS1、PreS2 S抗原。在一個優選方面，本發明的疫苗制劑包含HIV-1抗原gpl20，尤其是當在CHO細胞中表達時。在再一實施方案中，本發明的疫苗制劑包含上文限定的gD2t。
在本發明的一個優選實施方案中，含有要求保護的佐劑的疫苗包含來源于被認為引起生殖器疣的人乳頭瘤病毒(HPV)(HPV 6或HPV11和其它HPV毒株)和引起宮頸癌的HPV病毒(HPV 16、HPV 18和其它HPV毒株)的抗原。
生殖器疣預防性或治療性疫苗的特別優選的形式包含L1顆粒或殼粒、以及包含一種或多種選自HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2的抗原的融合蛋白。
融合蛋白的最優選形式為WO 96/26277中公開的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公開的蛋白D(1/3)-E7。
一種優選的HPV宮頸感染或宮頸癌預防性或治療性疫苗組合物可以包含HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體、或者L1或L2抗原在一起作為病毒樣顆粒(VLP)存在，或者單獨的L1蛋白在VPL或殼粒結構中單獨存在。這樣的抗原、病毒樣顆粒和殼粒本身是已知的。參見例如WO 94/00152、WO 94/20137、WO 94/05792和WO 93/02184。
可以單獨包括或者作為融合蛋白包括其它早期蛋白，例如E7、E2或者尤其是E5；這種早期蛋白的特別優選的實施方案包括包含L1E7融合蛋白的VLP(WO 96/11272)。
特別優選的HPV16抗原包含與蛋白D載體融合的早期蛋白E6或E7，形成蛋白D-得自HPV 16的E6或E7融合體或者其組合；或者E6或E7與L2的組合(WO 96/26277)。
另一方面，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可以以單個分子存在，優選為蛋白D-E6/E7融合體。這種疫苗可以任選地含有得自HPV 18的E6和E7蛋白中的任一種或這兩種，優選為蛋白D-E6或者蛋白D-E7融合蛋白、或者蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本發明的疫苗還可以包含來自其它HPV毒株、最好來自毒株HPV31或33的抗原。
本發明的疫苗還包含來源于引起瘧疾的寄生蟲的抗原。例如來自惡性瘧原蟲的優選抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一種雜種蛋白，包含通過乙型肝炎病毒表面抗原的preS2部分的4個氨基酸與乙型肝炎病毒表面(S)抗原連接的惡性瘧原蟲環子孢子(CS)蛋白的基本全部的C末端部分。其完整結構公開于以WO 93/10152公布的、要求英國專利申請第9124390.7號優先權的國際專利申請號PCT/EP92/02591中。當在酵母中表達時，RTS作為脂蛋白顆粒產生，而當其與HBV的S抗原共同表達時，它產生一種稱為RTS，S的混合顆粒。TRAP抗原描述于以WO 90/01496公布的國際專利申請PCT/GB89/00895中。本發明的一個優選實施方案是瘧疾疫苗，其中所述抗原制劑包含RTS，S和TRAP抗原的組合。可能作為候選者而成為多級瘧疾疫苗成分的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSAI、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230以及瘧原蟲中的其它類似物。
所述制劑也可以含有抗腫瘤抗原，可用于癌癥的免疫治療性治療。例如，所述佐劑制劑可應用于腫瘤排斥抗原，例如前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素瘤的抗原。示例性抗原包括MAGE1、3和MAGE4、或者其它MAGE抗原例如在WO 99/40188中公開的其它MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(也稱為NY Eos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，第628-636頁；Van den Eynde等，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997年提交)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，第293頁)。實際上這些抗原在各種各樣的腫瘤類型例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表達。
供本發明使用的MAGE抗原可以作為具有一種表達增強子或免疫學融合配偶體所融合蛋白表達。特別是，可以將Mage蛋白與得自乙型流感嗜血菌的蛋白D或其脂質化(lipidated)衍生物融合。特別是，所述融合配偶體可以包含蛋白D的前1/3。這類構建體公開于WO 99/40188中。
其它腫瘤特異性抗原適合于與本發明的佐劑一起使用，所述腫瘤特異性抗原包括但不限于腫瘤特異性神經節苷脂諸如GM2以及GM3或其與載體蛋白的綴合物；或者所述抗原可以是自身肽類激素，例如全長促性腺素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，這是一種10個氨基酸長的短肽，可用于治療許多癌癥，或者可用于免疫去勢(immunocastration)。
在一個優選實施方案中，使用例如諸如以下的前列腺抗原前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4)1735-1740 1998)、PSMA或者稱為Prostase的抗原。
Prostase是一種前列腺特異性絲氨酸蛋白酶(胰蛋白酶樣)，有254個氨基酸，具有一個保守的絲氨酸蛋白酶催化三聯體H-D-S和一個表明有潛在的分泌功能的氨基末端前原肽序列(P.Nelson，Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L.Hood和K.Wand，“Molecular cloningand characterisation ofprostase，an androgen-regulated serine protease withprostate restricted expression，載于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96，3114-3119)。已經描述了一個推定的糖基化位點。預測的結構非常類似其它已知的絲氨酸蛋白酶，表明成熟多肽折疊成一個單一的結構域。所述成熟蛋白長224個氨基酸，具有一個表明是經天然加工的A2表位。
Prostase的核苷酸序列和導出的多肽序列以及同源物公開于Ferguson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119)和國際專利申請WO 98/12302(也是相應的授權專利US 5,955,306)、WO98/20117(也是相應的授權專利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特異性激肽釋放酶)和WO 00/04149(P703P)。
本發明提供包含基于prostase蛋白及其片段和同源物(“衍生物”)的prostase蛋白融合體的制劑。這類衍生物適用于治療性疫苗制劑中，適用于治療前列腺腫瘤。通常，所述片段將含有至少20個、優選50個、更優選100個連續氨基酸，如在上述引用的專利和專利申請中公開的。
再一種優選的前列腺抗原被稱為P501S，Wo98/37814中的SEQ IDno 113。在上述引用的專利申請中公開了包含至少20個、優選50個、更優選100個連續氨基酸的其免疫原性片段和部分。參見例如PS108(WO 98/50567)。
其它前列腺特異性抗原可從Wo 98/37418和WO/004149中得知。另一種抗原是STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999。
可用于本發明內容的其它腫瘤相關抗原包括Plu-1(J Biol.Chem274(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等Bioessays 199，21 61-70，美國專利5654140)、Criptin(美國專利5 981215)。另外，特別適合于癌癥治療中的疫苗的抗原也包括酪氨酸酶和生存素(survivin)。
粘蛋白衍生肽諸如Muc1參見例如US 5744,144、US 5827,666、WO 8805054、US 4,963,484。尤其考慮了Muc1衍生肽，該肽包含Muc1肽的至少一個重復單位，優選包含至少兩個這類重復單位，并且該肽為SM3抗體所識別(US 6 054 438)。其它粘蛋白衍生肽包括得自Muc5的肽。
本發明也可與乳癌抗原例如her 2/Neu、mammaglobin(美國專利5668267)或者WO/00 52165、WO 99/33869、WO 99/19479、WO 98/45328中公開的那些抗原聯合使用。Her 2 neu抗原特別公開于美國專利5,801,005中。優選Her 2 neu包含完整的胞外結構域(包含大約氨基酸1-645)或其片段和胞內結構域的至少一個免疫原性部分或完整的胞內結構域(大約C末端的580個氨基酸)。特別是，所述胞內部分應該包含磷酸化結構域或其片段。這類構建體公開于WO 00/44899中。一種特別優選的構建體稱為ECD PD，第二種稱為ECD PD，參見Wo/00/44899。本文所用的her 2 neu可以來源于大鼠、小鼠或人類。
所述制劑可以包含與腫瘤支持機制(例如血管生成、腫瘤侵襲)相關的抗原，例如tie2、VEGF。
可以預見，本發明的組合物將可用來配制含有來源于疏螺旋體的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原體源抗原或抗原制劑、重組生產的蛋白或肽、以及嵌合融合蛋白。特別是，所述抗原為OspA。所述OspA可以是借助于宿主細胞(大腸桿菌)脂質化形式的完整成熟蛋白(稱為(Lipo-OspA))或其非脂質化衍生物。這類非脂質化衍生物包括非脂質化NS1-OspA融合蛋白，它具有流感病毒非結構蛋白(NS1)的前81個N末端氨基酸和完整的OspA蛋白，而另一種衍生物MDP-OspA是攜帶3個額外的N末端氨基酸的OspA的非脂質化形式。
本發明的疫苗可以用于預防或治療變態反應。這類疫苗應該包含變應原特異性抗原(例如Der p1)和變應原非特異性抗原(例如來源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP 0 477 231 B1))。
本發明的疫苗也可以用來預防或治療除變態反應、癌癥或傳染病以外的慢性疾病。這樣的慢性疾病是諸如動脈粥樣硬化和早老性癡呆的疾病。
本發明的疫苗尤其適合于諸如慢性病癥和癌癥的疾病的免疫治療性治療，也適合于持續性感染的治療。因此，本發明的疫苗特別適合于傳染病例如肺結核(TB)、AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染的免疫治療。
因此提供可供傳染病例如TB、AIDS和HepB的免疫治療用的本發明疫苗和佐劑；以及這類佐劑和疫苗在傳染病例如TB、AIDS和HepB的免疫治療藥物的生產中的應用。在TB方面，提供一種治療患有TB感染的個體的方法，所述方法包括將本發明的疫苗給予所述個體，從而減少該個體的細菌載荷。細菌載荷的減少包括肺部痰中存在的TB量的減少，導致TB疾病的緩解或治愈。
此外，在AIDS方面，提供一種治療易感或患有ADIS的個體的方法。所述方法包括將本發明的疫苗給予所述個體，從而減少由后續HIV感染所致的CD4+T細胞下降的量，或者使已經感染HIV的個體中CD4+T細胞的下降減慢或使其停止。
另外，在持續性乙型肝炎病毒感染方面，提供一種治療易感或患有HepB的個體的方法。因此提供一種包括下述步驟的方法將本發明的疫苗給予所述個體，從而減少血清中的HepB載荷水平(根據DNA清除來測定)以及減少肝損傷量(根據丙氨酸轉移酶(ALT)的血清水平的降低或穩定化來檢測)。
每劑疫苗中的蛋白量被選擇為在典型的接種者體內誘發免疫保護性應答而無顯著的毒副作用的量。這樣一種量將視使用哪種特定免疫原和將其如何呈遞而變化。一般而言，預期每劑將包含1-1000μg蛋白，優選1-500μg，優選1-100μg，最優選1-50μg。特定疫苗的最適量可以通過包括觀察接種疫苗的受治療者的合適免疫應答的標準研究來確定。
本發明的佐劑或疫苗中CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量一般為小量，但根據疫苗制劑，其范圍可以為1-1000μg/劑，優選1-500μg/劑，更優選1-100μg/劑。
如果有的話，用于本發明佐劑中的LPS衍生物的量可以在1-1000μg/劑范圍內，優選1-500μg/劑，更優選1-250μg/劑，最優選1-100μg/劑。因此，CpG∶LPS衍生物(w/w)之比將1∶1000-1000∶1范圍內，通常在1∶100-100∶1范圍內，優選在1∶10-1∶1或1∶1-10∶1范圍內，最優選為1∶1、4∶1或10∶1。
本發明的制劑可以既可以用于預防目的，也可用于治療目的。因此，提供皂苷和CpG分子的組合在用于病毒性、細菌性、寄生蟲性感染、變態反應、癌癥和其它非慢性疾病的預防和治療用的疫苗的生產中的應用。因此，本發明提供一種治療易感或患有傳染病或癌癥或者變態反應或自身免疫病的哺乳動物的方法。在本發明的再一方面，提供一種如本文所述的用作藥物的疫苗或佐劑組合，所述疫苗或佐劑組合包含皂苷和CpG。疫苗的制備在New Trends and Developments inVaccines，Voller等編著，University Park Press.Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中有全面的描述。
可以預見，本發明的組合物將可用來配制含有來源于各種各樣來源的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括人類、細菌或病毒的核酸、病原體源抗原或抗原制劑、腫瘤衍生抗原或抗原制劑、宿主源抗原包括來源于IgE的肽諸如IgE的組胺釋放十肽(也稱為Stanworth十肽)、重組生產的蛋白或肽、以及嵌合融合蛋白。
本發明也提供一種通過含有利于Th1型免疫應答的免疫刺激性寡核苷酸的疫苗產生的改變針對抗原的免疫應答質量的方法，所述方法包括用免疫刺激性寡核苷酸和含母育酚的水包油型乳液來配制所述疫苗。具體地說，所述改變免疫應答質量的方法導致通過在小鼠模型中測定產生Th1型免疫應答，其中由所述疫苗誘發的抗原特異性IgG同種型的特征在于，根據通過同種型特異性ELISA測定的中點效價(midpoint titre)來測定，IgG1構成總抗原特異性IgG的50％以下。優選根據通過同種型特異性ELISA測定的中點效價來測定，IgG1構成總抗原特異性IgG的40％以下。
也提供一種生產疫苗組合物的方法，所述方法包括配制包含母育酚的水包油型乳液，將所述母育酚乳液與免疫刺激性寡核苷酸混合形成佐劑，并且將所述佐劑和抗原或抗原組合物配制在一起。
也提供一種治療易感或患有疾病的個體的方法，所述方法包括給予所述個體一種包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的組合的疫苗組合物。也提供了本文所述的疫苗在醫藥中的應用。
還提供了一種生產疫苗或佐劑的方法，所述方法包括取LPS的衍生物、取CpG分子，然后將它們與抗原在藥學上可接受的賦形劑中、在無皂苷的情況下混合。供本發明組合用的合適的藥學上可接受的賦形劑的實例包括水、磷酸緩沖鹽溶液、等滲緩沖液。
優選本發明的佐劑由母育酚和可代謝油乳液以及免疫刺激性寡核苷酸組成，或者基本上由它們組成。更優選所述佐劑組合物基本上由母育酚和可代謝油乳液、免疫刺激性寡核苷酸和皂苷組成。在上述兩種實施方案中，所述母育酚優選為α-生育酚，所述可代謝油優選為角鯊烯，而免疫刺激性寡核苷酸優選為CpG 2006(SEQ ID NO.4)；本發明清楚地設想了在這些實施方案內的所有變化和組合。最優選所述佐劑組合物由α-生育酚和角鯊烯乳液、CpG 2006(SEQ ID NO.4)和QS21組成，或者基本上由它們組成。
本發明的最優選疫苗含有Her2Neu抗原，優選為與磷酸化結構域連接的Her2Neu的胞外結構域的融合體(ECD-PD)(如WO 00/44899中所述方法生產的))。因此，本發明提供一種治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括給予所述個體一種包含免疫刺激性寡核苷酸、母育酚和ECD-PD的組合的疫苗組合物。在這種治療方法中，也考慮了在上文中已經描述的免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的所有優選特征。
通過以下實施例例證本發明，但本發明不限于以下實施例。實施例1用ECD-PD抗原免疫小鼠這一實驗設計用所述抗原研究各種各樣的佐劑制劑，所述抗原是與磷酸化結構域連接的Her2Neu胞外結構域的融合體(ECD-PD)，該融合體在CHO細胞中依照WO 00/44899的方法生產。
在上述組別中使用的含母育酚水包油型乳液使用D，L，α-生育酚(CAS No.10191-41-0；化學名稱(2RS，4’RS，8’RS)-2，5，7，8-四甲基-2-(4’，8’，12’-三甲基-十三烷基)-6-二氫苯并呋喃醇))；它以ROCHETM市售。如果存在母育酚，則所述母育酚存在于水包油型乳液中，所述乳液包含與2.5％(體積)角鯊烯組合的2.5％(體積)母育酚。將這兩種油混合，加入聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(Tween 80TM)，然后進行微流化(M110S microfluidics machine，最多50道，在6巴最大輸入壓(輸出壓約為850巴)下達2分鐘，如WO 95/17210中所述)。因此，第3組、第6組和第9組基于添加含水QS21、3D-MPL或CpG的上述母育酚乳液。
如果在任一種以上疫苗組中存在QS21和3D-MPL，則它們以5μg/劑存在；以50μg劑量加入CpG(OLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCGTTT TGT CGT TTT GTC GTT)。
第2組、第5組、第10組使用的佐劑依照EP 0 822 831 B1(所述文獻的內容通過引用結合到本文中)中所述技術來制備。第11組在脂質體膜中包含3D-MPL。簡而言之，將3D-MPL、二油酰磷脂酰膽堿和膽固醇混合在一起，然后微流化為單室脂質體(如EP 0 822 831 B1中所述，但去除QS21)。
第4組、第7組和第8組中使用的佐劑為水性懸浮液或水溶液。疫苗接種方法給各組B6F1小鼠以14天的間隔肌內接種疫苗4次(以50μl的體積)。給予第4劑疫苗后14天，用2×106表達Her2Neu的TC1腫瘤細胞皮下攻擊小鼠。腫瘤細胞系TC1得自C57BL.6小鼠的原代肺上皮細胞用HPV 16 E6和E7無限增殖化，然后用活化ras癌基因轉化，產生表達E6和E7的致瘤性細胞系(Lin KY Cancer Res 1996 Jan 1，56(1)21-61)。用小鼠抗HPV 16 E7Mab(Triton Corp.Alameda，CA)通過固定和透化的TC1細胞的FACS分析，證實E7的表達。通過用編碼Her2Neu的逆轉錄病毒載體轉導這些TC1細胞，產生Her2Neu-TC1腫瘤細胞系。在使用blastocydin的選擇期后，分離出抗性克隆，并通過FACS，根據Her 2 Neu的表達篩選所述克隆。選擇出具有最高Her 2 Neu表達的克隆，鑒定2×106細胞的攻擊劑量具有與野生型TC1細胞相似的生長動力學，并且導致在100％的對照動物中產生腫瘤。
1周兩次測量各個腫瘤的大小，并且以組平均值來表示。結果

圖1顯示了第1、2、4、5和6組的腫瘤生長結果。圖2顯示了第1、5、6、7和11組的腫瘤生長結果。圖3顯示了第1、5、6、8、9和10組的腫瘤生長結果。包含母育酚和CpG的制劑誘發了腫瘤的完全消退。
圖4和圖5顯示了在與5μg/ml免疫原(ECD-PD)或胞外結構域(ECD)或胞內結構域(ICD)或Her 2 Neu一起孵育后體外脾細胞的淋巴組織增生。
圖6和圖7顯示了依據通過ELISA測量的總Ig(圖6)或者依據這些應答中IgG同種型分布(圖7)的抗免疫原(ECD-PD)的體液免疫應答。實施例2用P703P抗原免疫小鼠該實驗設計用來用作為抗原Prostase(Ferguson，等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119))和流感病毒NS1的N末端1-81片段的融合體(P703P-NS1)的抗原，研究各種各樣的佐劑制劑。
在上述組別中使用的含母育酚水包油型乳液使用D，L，α-生育酚(CAS No.10191-41-0；化學名稱(2RS，4’RS，8’RS)-2，5，7，8-四甲基-2-(4’，8’，12’-三甲基-十三烷基)-6-二氫苯并呋喃醇))；它以ROCHETM市售。如果存在母育酚，則所述母育酚存在于水包油型乳液中，所述乳液包含與2.5％(體積)角鯊烯組合的2.5％(體積)母育酚。將這兩種油混合，加入聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(Tween 80TM)，然后進行微流化(M110S microfluidics machine，最多50道，在6巴最大輸入壓(輸出壓約為850巴)下達2分鐘，如WO 95/17210中所述)。因此，第5組和第6組基于添加含水QS21、3D-MPL和/或CpG的上述母育酚乳液。
如果在任一種以上疫苗組中存在QS21和3D-MPL，則它們以5μg/劑存在；以50μg劑量加入CpG(OHGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCGTTT TGT CGT TTT GTC GTT)。
第3組和第4組使用的佐劑依照EP 0 822 831 B1(所述文獻的內容通過引用結合到本文中)中所述技術來制備。疫苗接種方法給各組B6F1小鼠以14天的間隔肌內接種疫苗4次(以50μl的體積)。結果圖8和圖9顯示了第2次疫苗接種后和第4次疫苗接種后14天、在與3μg/ml免疫原(NS1-P703P)或者畢赤酵母表達的P703P或者非特異性NS1-OspA融合蛋白一起體外孵育后的脾細胞體外淋巴組織增生。
圖10和圖11顯示了依據通過中點效價ELISA測量的總Ig(圖10)或者依據這些應答中IgG同種型分布(圖11)的抗免疫原(NS1-P703P)的體液免疫應答。
權利要求
1.一種佐劑組合物，所述組合物包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的組合。
2.一種權利要求1的佐劑組合物，其中所述母育酚為水包油型乳液形式。
3.一種權利要求2的佐劑組合物，其中所述水包油型乳液還包含角鯊烯。
4.一種權利要求1-3中任一項的佐劑組合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含一個嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶序列，其中所述C和G未被甲基化。
5.一種權利要求1-3的佐劑組合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸選自TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO1)；TCT CCCAGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO2)；ACC GAT GAC GTC GCC GGTGAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO3)；TCG TCG TTT TGT CGT TTTGTC GTT(SEQ ID NO4)；TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ IDNO5)。
6.一種權利要求1-3的佐劑組合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸含有至少兩個由至少3個核苷酸分開的未甲基化CG重復。
7.一種權利要求6的佐劑組合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸含有至少兩個由6個核苷酸分開的未甲基化CG重復。
8.一種權利要求1的佐劑組合物，其中所述母育酚由以下通式描述 其中R可以是H或者一個或多個選自以下的相同或不同的取代基烷基、烷氧基、酰氧基、羥基、硫酸酯基和磷酸酯基；R1和R3相互獨立地為H或烷基；R2為H或烷基，并且在每個單位中可以不同；虛線表示在一個單位中額外的碳-碳鍵存在或者不存在；且n＝1-10的數值；R、R1、R2和R3中的烷基可以具體選自具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈碳鏈，例如甲基、乙基、丁基或異丁基。
9.一種權利要求8的佐劑組合物，其中所述母育酚為D，L，α-生育酚。
10.一種權利要求1-9中任一項的佐劑組合物，其中所述佐劑還包含一種額外的免疫刺激劑。
11.一種權利要求10的佐劑組合物，其中所述額外的免疫刺激劑選自LPS或其衍生物、3D-MPL、皂苷或QS21。
12.一種疫苗組合物，所述組合物包含權利要求1-11中任一項要求保護的佐劑組合物以及抗原或抗原組合物。
13.一種權利要求12的疫苗，其中所述抗原是ECD-PD。
14.一種通過含有利于Th1型免疫應答的免疫刺激性寡核苷酸的疫苗產生的改變針對抗原的免疫應答質量的方法，所述方法包括用免疫刺激性寡核苷酸和含母育酚的水包油型乳液來配制所述疫苗。
15.一種權利要求14的改變免疫應答質量的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸和含母育酚的水包油型乳液的組合產生Th1型免疫應答，使得當測量在給小鼠接種疫苗后由所述疫苗誘發的抗原特異性IgG同種型時，根據通過同種型特異性ELISA測定的中點效價來測定，IgG1構成總抗原特異性IgG的50％以下。
16.一種生產疫苗組合物的方法，所述方法包括配制包含母育酚的水包油型乳液，將所述母育酚乳液與免疫刺激性寡核苷酸混合形成佐劑，并且將所述佐劑和抗原或抗原組合物配制在一起。
17.一種治療易感或患有疾病的個體的方法，所述方法包括給予所述個體一種包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的組合的疫苗組合物。
18.一種用于藥物的權利要求12的疫苗。
全文摘要
本發明涉及供疫苗用的新型佐劑組合物。特別是，本發明的佐劑組合物包含免疫刺激性寡核苷酸和母育酚的組合。本發明也提供一種包含本發明佐劑組合物和至少一種抗原的疫苗。還提供多種生產本發明佐劑組合物和疫苗的方法及其作為藥物的應用。另外，本發明提供通過胃腸外或粘膜給予本發明的疫苗來治療易感或患有疾病的個體的方法。
文檔編號A61K39/39GK1481254SQ01820660
公開日2004年3月10日 申請日期2001年10月16日 優先權日2000年10月18日
發明者N·加孔, C·M·G·格拉德, J·斯蒂芬尼, G 格拉德, N 加孔, 俜夷 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司