治療局部缺血的基因轉移配方及方法

專利名稱：治療局部缺血的基因轉移配方及方法
技術領域：
本發明涉及通過轉移并表達能夠編碼血管生成因子的核酸而刺激血管的生成，具體地講，本發明涉及可以用來改善外周血管及冠狀動脈疾病中局部缺血癥狀的配方及方法。本發明的優先權是基于2000年10月20日的第60/242,277號美國臨時申請和2001年5月29日的第60/294,454號美國臨時申請。
背景技術：
“局部缺血”(ischemia)是描述機體某一器官或組織供血不足的醫學術語。局部缺血通常是由向組織供應富氧血液的動脈血管狹窄或阻塞所引起；嚴重的、拖延的局部缺血可導致相關組織死亡(梗死)。
冠狀動脈疾病(CAD)是指為心臟的肌肉組織(心肌)供應氧合血的血管疾病所導致的心臟局部缺血。一條或多條冠狀動脈血管發生狹窄或閉塞，將導致心臟局部缺血。暫時性的局部缺血是指由于運動負荷加大、緊張等原因使得血供不能滿足心臟對氧的需求而導致的狀況，這會引發心絞痛或胸部疼痛。嚴重的或完全的血流梗阻將使心肌死亡，也即通常所說的“心肌梗死”(心肌梗塞發作，heart attack)。在美國，心臟病已是死亡的主要原因。目前，治療心臟局部缺血的方法主要有通過藥物療法和體育調節以降低心臟對氧供的需要，或者利用藥物、血管成形術、旁路搭橋術等，以改善心臟的血液流動。
外周血管性疾病(PAD)是指除心臟及大腦之外的血管性疾病。腿部及上肢肌肉的血管狹窄是外周血管性疾病的典型病因，髂肌-腘動脈軸的一處或多處狹窄，將導致下肢肌肉及皮膚血流灌注減少并發展為進行性組織局部缺血。外周動脈性疾病則是一種與冠狀動脈疾病及頸總動脈性疾病相似的癥狀。
在外周動脈性疾病中，脂肪沉積在動脈管壁并影響血液循環，尤其是對腿部及腳部的動脈影響更為明顯。動脈粥樣硬化是導致下肢慢性動脈阻塞疾病的最常見原因，其臨床癥狀表現有間歇性跛行(局部缺血疼痛)、潰瘍、壞疽等。動脈粥樣硬化導致的動脈狹窄或阻塞，在運動或休息時會減少下肢血流量，其嚴重程度有賴于側支循環建立及利用的程度。最易受動脈粥樣硬化影響的是股淺動脈及腘動脈，其次是遠端主動脈及主動脈分為兩支髂動脈處的主動脈叉。
每年用于醫療保健的開銷中，外周動脈性疾病占了相當大的比例。而且，除了經濟因素外，外周動脈性疾病也是導致殘疾、失業/降薪及生活不便的主要原因(參閱Rosenfield，K.和Isner，JM.(1998)Comprehensive Cardiology Medicine，J.Topol編輯，Lippincott Raven出版商，費城，3109-3134)。據估計，在美國，每20個年齡在50歲以上的人中就有1個罹患外周動脈硬化，或者說其總數已達8,000,000人，且男性比女性更多(參閱Creage，MA.(2001)CardiolRev.9，238-245)。
對于外周動脈硬化的治療方法除了手術療法外，還有非手術法，比如體育鍛煉、危險因子調節(risk factor modification)及藥理學治療等，包括放射干涉法如血管成形術、支架置入以及手術療法如動脈內膜切除術、搭橋術及切除術。血管成形術是將一根頂端帶有一氣囊的導管伸入動脈狹窄部分，該氣囊事先排除氣體，然后將該氣囊充氣而達到擴張狹窄部分的目的。但是，目前尚無有效的治療下肢血管形成缺陷的藥理學方法。
許多患有持續性局部缺血性潰瘍的患者并不適宜進行手術或采用血管內的治療方法。
為了適應血流灌注不足，患有冠狀動脈疾病的心臟的血管就會生成額外的血管，可將其稱之為側支組織(collateral)；這些血管能夠在狹窄的冠狀動脈區域重建立血流通路，并以此灌注心肌。在治療心肌及外周組織的局部缺血時，導入促血管生成因子或促血管生長因子，可能能夠增加局部缺血組織的灌注。
最近，在動物的心肌局部缺血和后肢局部缺血模型研究中，其結果證實了采用重組促血管生成因子來促進形成側支動脈的可行性，如采用成纖維細胞生長因子(FGF)家族(Yanagisawa-Miwa等人，Science，2571401-1403(1992)和Baffour等人，J Vasc Surg，16181-91(1992))、內皮細胞生長因子(ECGF)(Pu等人，JSurg Res，54575-83(1993))、血管內皮生長因子(VEGF)(Takeshita等人，Circulation，90228-234(1994)和Takeshita等人，J Clin Invest，93662-70(1994))以及血管生成因子β-1(angiopoietin)與內皮細胞生長因子的組合(Chae，J.K.等人，Artherioscler Thromb Vasc Biol.December 2000)。
為了使局部濃度到達最高，而要反復地在肌肉內應用生長因子，這種反復的應用正是重組蛋白療法的主要限制。在治療過程中，重復應用重組蛋白，只會產生間歇性的蛋白濃度高峰。將重組的內皮細胞生長因子65(VEGF65)與成纖維細胞生長因子b蛋白(bFGF protein)應用于心肌局部缺血的患者，其最近的第二階段的試驗結果為患者在三個月時呈現陰性或者在一年時呈不確定狀態，這說明重組蛋白在組織內存留期較短，不能獲得期望的治療效果(Chiron Crop.PressRelease 3/12/2000；http//www.prnewswire.com/CHIR；Henry，TD等人(1998)，J.Am.Coll.Cardiol.31，65A.)。
最近，基因治療已使得在藥理學領域能夠轉移表達構建所攜帶的功能性重組基因，該此構建可以調節這些基因在宿主體內細胞的表達。將與表達調控元件相關的基因而非純化的或重組的蛋白輸送入病人體內，可在病人體內局部生成蛋白。這一病人體內生成蛋白，模仿了其自然表達，在單次給藥的治療濃度下會導致所需蛋白局部生成的延長。
動脈基因轉移，為肢體局部缺血的患者提供了血管生成的另一種治療方法(Kanno，S.等人(1999)，Circulation 99，2682-2678；Liau，G.等人(2001)，Drug Disc Today 1，689-597；Rissanen，TT.等人(2001)，Eur.J.Clin.Invest.31，651-666)。與重組基因治療方法相比，基因轉移治療的優勢在于可在數天至數周內維持局部適當高的濃度(Isner JM.和Asahara T.(1999)，J.Clin.Invest.103，1231-1236)。這一類的各種血管生成方法正在臨床試驗中進行驗證(Carmeliet，P.和Jain，RK.(2000)，Nature 407，249-257)。
與重組蛋白治療相比，將血管生成因子轉移作為一種基因治療手段有望提高療效、降低用藥頻率、減少全身毒性反應。但是，有效的基因治療必須能夠識別可達到治療目的蛋白，形成能夠控制基因生成的表達載體，所說基因對目的蛋白進行編碼，而且還要能夠對轉移至細胞的表達載體進行有效地定位轉移，該表達載體能夠表達目的蛋白而又不引起局部組織損傷及全身毒性反應。
人類臨床實驗證實以轉移編碼血管內皮細胞生成因子的DNA作為外周性血管疾病的基因治療手段，可促進血管生成。
然而，在接受治療的90例患者中有31例(34％)發生了下肢水腫，說明血管內皮生長因子表達可能會有增加血管通透性的副作用(Baumgartner等人，Ann Intern Med(2000)，132(11)880-4)。
據最近文獻報道，以表面覆蓋日本血細胞凝聚素病毒(HVJ)的脂質體轉移肝細胞生長因子(HGF)基因，將此脂質體直接注射入心臟組織使其在心包內孵育的同時與冠狀動脈直接融合并過度表達，發現梗死的心肌部位血流增加(Aoki等人，Gene Therapy 7(5)，417-427，2000)。
在有效的基因治療中，最關鍵的是轉移基因的方法或載體必須不能伴發組織損害。據報道，可以應用病毒載體在體內將基因轉移至血管組織的方法，包括采用泊洛沙姆(poloxamer，聚羥亞烴)凝膠來限制病毒在給藥部位的擴散(Feldman等人，Gene Therapy(1997)4，189-198；Van Belle等人，Human Gene Therapy(1998)9，1013-1024；Hammond等人，US Patent No.6,100,242)。
Wolf等人在美國專利5,693,622中描述了用直接注射法將非病毒的裸露DNA轉移入心臟；Leiden等人在美國專利5,661,133中也描述了用直接注射法將基因轉移入心臟。也有報道，采用選擇壓力將病毒轉移入心臟來調節冠狀動脈的逆輸注(Boekstaegers等人，GeneTherapy(2000)7，232-240)。但是，病毒載體有幾個嚴重的缺點它必須在哺乳類動物培養物中才能生存，并且能被來自宿主細胞其他的病毒污染，或者被某些必須媒介物成分如小牛血清等污染；病毒載體還肯定會將外源的病毒蛋白導入宿主體內。在體內應用這些載體很可能會使宿主產生強烈的免疫反應。
在過去的5年中，以血管生成因子治療進展性缺血性心臟病的領域已取得長足進展(Simons等人，Circulation(2000)102e73-e86)。盡管近來在治療局部缺血的療法方面取得了進展，但仍需進一步對用作基因治療的蛋白作出鑒定，選出能夠促進局部缺血性組織中側支血管生成而又沒有副反應的蛋白，并且所使用的轉移方法和配方應該能將基因高效轉移到局部缺血組織但又不引起局部的或全身毒性反應或病理性免疫反應。
發明概述本發明者發明了一種新型的將血管生成因子高效轉移至心臟及外周血管的方法，并且該方法能夠避免發生現有轉移技術所固有的毒性反應問題。
在具體實施方案中，基因聚合物轉移系統(polymeric genedelivery system)能夠保護表達血管生成因子的質粒不被細胞外核酸酶降解，并幫助其在注射點周圍被骨骼肌纖維及心肌纖維吸收。
在具體實施方案中，還提供了一種有效轉移基因的復配表達系統(formulated expression system)，該基因可以編碼新型血管生成因子即內皮細胞發育位點-1(Del-1，Developmental Endothelial Locus-1)蛋白。
在具體實施方案中，還提供了一種能夠編碼內皮細胞發育位點-1(DEL-1)的質粒DNA，它可以使內皮細胞發育位點-1在局部持續表達，表達方式與內流性內皮細胞發育位點-1的自分泌/旁分泌方式非常相似。局部轉移的方式減少了全身性應用以及與全身性應用有關的毒性反應。
在具體實施方案中，還發現了一種非病毒質粒介導(Dlasmid-based)的內皮細胞發育位點-1基因配方(formulation)，該配方可以用作遠端肢體、心肌、患有腎血管性疾病的腎臟的局部性缺血，以及因腦血管疾病、創傷愈合、非連續性骨折、缺少血供的股骨頭壞死等造成的局部缺血的治療。內皮細胞發育位點-1基因的應用途徑有肌注、血管內注射、關節腔內注射或通過逆行靜脈進行灌注；在具體實施中，這種逆行靜脈灌注可以是肢體靜脈、腎靜脈、肝靜脈、腦靜脈或心臟靜脈等。
在具體實施方案中，內皮細胞發育位點-1表達系統配方包括質粒表達系統并配有泊洛沙姆基因聚合物轉移系統，該質粒表達系統含有能夠編碼人類全長內皮細胞發育位點-1蛋白的真核表達盒(expression cassette)。
在具體實施方案中，復配的內皮細胞發育位點-1表達系統可保存于單個小瓶中、并在2-8℃時性質穩定；如有必要，可以重復應用復配的內皮細胞發育位點-1表達系統治療組織局部缺血。
內皮細胞發育位點-1(Del-1)是α-V-β-3(avb3)整合素(integrin)受體的配體。因而，在另一具體實施方案中，將內皮細胞發育位點-1與另一種生長因子結合，該生長因子是另一種不同的受體的配體，而該配體對于新血管的生成是很重要的。
在具體實施方案中，將編碼內皮細胞發育位點-1的核酸與編碼血管內皮生長因子(VEGF)的核酸一起轉移，以調節毛細血管的生成和血管的生成，VEGF是血管內皮生長因子-2(VEGF-2)受體的配體。聯合應用內皮細胞發育位點-1及血管內皮生長因子基因，可以解決幾點醫療中未遇到過的需要，如冠狀動脈疾病、創傷愈合、外周動脈疾病及類風濕性關節炎等。


為了更好地理解本發明，現結合附圖，采用優選的實施方案加以詳細闡述。
圖1顯示了質粒與泊洛沙姆188的濃度對轉移至鼠骨骼肌的質粒表達的影響。
圖2顯示了與聚合物轉移系統(polymer delivery system)相比，體內注射熒光素酶表達質粒等滲鹽水的大鼠脛前肌肉中熒光素酶的表達。
圖3a和圖3b顯示了人內皮細胞發育位點-1質粒表達圖。
圖4顯示了鼠內皮細胞發育位點-1在小鼠脛前肌肉的表達。
圖5顯示了在常氧狀態下，內皮細胞發育位點-1的表達小鼠骨骼肌毛細血管密度的影響。
圖6顯示了在常氧狀態下，注射不同劑量鼠內皮細胞發育位點-1質粒的CD1小鼠的脛前肌肉中，CD31的表達與鼠內皮細胞發育位點-1的表達的關聯。
圖7顯示了結扎股動脈造成后肢局部缺血后，人內皮細胞發育位點-1對運動耐受情況的影響、圖8顯示了內皮細胞發育位點-1與血管內皮生長因子基因藥物對兔模型的后肢局部缺血的作用。
圖9顯示了心肌內注射復配的pLC1088質粒(10微升)后，熒光素酶在鼠類心肌的表達。
圖10顯示了直接進行心肌內注射(10微升)后，熒光素酶在鼠類心肌中表達的代表性數據資料。
圖11a顯示了在心臟膈膜處通過冠狀竇將轉移導管插入。
圖11b顯示了在心臟胸骨面將轉移導管置入心臟大靜脈。
圖12是用于pDL1680表達質粒的人內皮細胞發育位點-1的序列(SEQ ID NO1)。
圖13是用于pDL1680人內皮細胞發育位點-1表達質粒(SEQ IDNO2)的序列。
圖14顯示了用含聚合物的配方進行表達時其重復性得以改進。
圖15顯示了人內皮細胞發育位點-1mRNA在豬心臟中的表達，該受體豬已用pDL1680鹽溶液或pDL1680與5％泊洛沙姆188復配物進行了rIV轉移處理。
圖16是密碼子優化的血管內皮生長因子165(SEQ ID NO3)的核酸序列。
圖17顯示了第七天進行CD31染色的結果(A)對照組；(B)內皮細胞發育位點-1；(C)血管內皮生長因子；(D)內皮細胞發育位點-1神經細胞生長因子。
圖18是表示泊洛沙姆及逆轉泊洛沙姆特征的表格。
圖19是用于肌肉轉移的泊洛沙姆特征。
優選實施方案的詳細描述本發明中，術語“血管生成蛋白”(angiogenic protein)是指任何能夠直接或間接導致新血管生成的蛋白、多肽、突變蛋白或片段；這樣的蛋白包括如內皮細胞發育位點-1(Del-1)、酸性和堿性的成纖維細胞生長因子(aFGF和bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、α-和β-轉化生長因子(TGF-α和TGF-β)、血小板衍生內皮生長因子(PDECGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素生長因子(IGF)、促紅細胞生長素、集落刺激因子(CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)以及氧化氮合成酶(NOS)。優選地，血管生成蛋白包含一段分泌信號序列，以便分泌蛋白。Del-1及血管內皮生長因子均為優選的血管生成蛋白。
內皮細胞發育調節位點-1(Del-1)是最近鑒定的、具有內皮細胞特異性的細胞外基質蛋白，它在胚胎期血管發育過程中即開始表達(Penta，K.等人(1999)，J.Biol.Chem.274，11101-11109)。Del-1基因是在轉基因鼠通過增強子誘捕(enhancer trap)而獲得，它主要在發育中的脈管系統的內皮以及直接比鄰細胞中表達(Hidai，C，等人(1998)，Genes Dev.1，21-33)。Del-1蛋白及人和鼠Del-1的核苷酸序列均為美國專利US5,877,281及US5,874,562的研究對象，在此引用這兩件專利作為對比文件。
對實體腫瘤中及急性局部缺血性嚙齒類骨骼肌中的Del-1表達進行進一步分析，發現Del-1基因的表達在活性血管生成區域中局部上調。出生后，在正常狀況下Del-1不表達，但在局部缺血及受到其他血管生成性刺激時其表達上調；通過封閉α-v、β-3整連蛋白受體顯示Del-1與內皮細胞的粘附、遷移有關；絨毛膜尿囊膜分析顯示重組的Del-1能促進血管形成。
由Del-1編碼的全長Del-1蛋白，可以對質粒進行編碼，其分子量大約為52kDa，包括三個表皮生長因子(EGF)樣重復片斷以及隨后的兩個網柄菌素I樣的結構域；在Del-1中第二個表皮生長因子樣重復片段的B環中包含有一個RGD序列，該序列可以調節與α-v、β-3(avB3或avb3)整連蛋白受體的結合。已經證實，RGD序列是一種與纖連蛋白、網柄菌素I、巢蛋白/觸覺蛋白及肌腱蛋白結合的細胞結合位點(Anderson，1990，Experientia 462)。Del-1的整體結構見圖3a。
已有的資料表明，Del-1的作用機制與已知的整連蛋白受體的配體及血管生成因子不同。與av 3整連蛋白結合的配體為局部缺血內皮提供抗凋亡信號，并且對于血管生成也是必須的。鑒于Del-1蛋白的復雜結構以及全長Del-1序列C末端粘附于內皮，但并不誘導血管生成，因而推測Del-1可能是與地第二種尚未知道的受體發生作用(Penta等人J.Biological Chemistry(1999)27411101-11109)。
本發明者將非病毒性的復配Del-1表達體系通過肌注方式導入后肢局部缺血的小鼠及兔模型，研究其治療潛能。通過結扎18只新西蘭白兔髂外動脈遠端及切除股動脈，制作成左后肢局部缺血模型；手術當天，對白兔缺血側肢體進行血管造影。術后第三天，將編碼VEGF、Del-1或者作為陰性對照的空白載體的質粒5mg注射入白兔左側股四頭肌中。治療后30天，再次對白兔缺血肢體進行血管造影術，并且通過RT-PCR、CD-31免疫測定方法，采集股四頭肌，對療效進行評估，分析側支血管在中間大腿處的形成情況。通過結扎髂內動脈遠端及股動脈和股深動脈分杈點的方法，制作32只CD-1小鼠的局部缺血模型。術后當天，將70mg編碼VEGF、Del-1或者空白載體的質粒通過肌注給藥途徑導入小鼠。也采用了假對照組，即其后肢如前述進行手術但術后不給予質粒注射。使這些實驗動物在活動平板上跑動，記錄下他們運動衰竭的時間。在新西蘭白兔模型中，給予復配非病毒質粒的VEGF、Del-1治療組，其新生側支血管的生成有顯著的差別(P＜0.01)。在小鼠模型中，Del治療組的毛細血管與肌細胞的比率較對照組增加1.5倍，具有顯著差異(P＜0.05)，并且Del-1治療組在活動平板實驗中衰竭時間也顯著提高(P＜0.05)。
在另一具體實施方案中，采用Del-1聯合另外一種內皮細胞生長因子共同調節毛細血管的形成與血管的形成，后者的受體與Del-1的受體不同。Del-1是avb3整連蛋白受體的配體(Hidai，C等，Genes andDevelopment 1998，1221-33.)。
相反，血管內皮生長因子(VEGF)是血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1，a.K.a.flt-1)和血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2，人類a.k.a KDR)的配體。目前的資料表明，flt-1介導的信號主要參與內皮細胞的遷移，但對促進內皮細胞擴增的作用不象KDR是必須的。VEGFR-1可能有拮抗VEGFR-2活性的作用(Yancopoulos，GD等人，Nature(2002)407242)。avb3整連蛋白受體和VEGF受體-2與兩條重要的信號轉導通路有關。刺激avb3整連蛋白受體，可以調控內皮細胞的遷移，對血管發生具有重要作用。VEGF受體-2是一受體酪氨酸激酶，受到刺激時可以發生自身磷酸化，促發一系列激酶的級聯反應從而引起內皮細胞的擴增和運動增強。刺激VEGFR-2可以引起avb3上調。盡管通過結扎VEGFR2能使avb3上調，但在基質中可能已存在足夠的配體使體系最大化，而進一步添加Del-1將不再會產生添加效應。本發明者發現，添加Del-1(一種獨特的血管生成整連蛋白受體)，不僅能夠協同VEGF促進血管生成，而且能夠顯著促進內皮細胞遷移與擴增。
本發明者意外地發現，上述兩種基因在亞劑量(sub-maximallevel)時進行轉移，其促使內皮細胞遷移的效果要明顯優于單一基因最大劑量(maximal dose)時的情況。以前的研究證明，在受刺激時這兩種受體之間會發生相互作用，盡管它們中的任一個均不需要通過直接與其配體結合而與另一個結合。然而，一個受體的刺激和未結合受體的隨后結合，只能產生部分結合。本發明的基礎是，同時給予兩種配體Del-1及VEGF，可以達到avb3整連蛋白受體與VEGFR-2的完全結合。
此處所用的術語“Del-1基因”是指編碼Del-1基因家族功能蛋白的所有DNA序列。根據本發明，任何能夠編碼Del-1基因產物氨基酸序列的核酸序列，可以用來產生分子重組體，這種重組體可以控制Del-1基因產物的表達。由于先天性基因編碼缺陷，其它的、能夠編碼基本上同樣的氨基酸序列或功能上等效的氨基酸序列的DNA序列，也可以用于本發明。這樣的DNA序列包括那些在“嚴格條件”下能夠雜交到鼠和/或hDel-1序列的DNA序列；此處，術語“嚴格條件”是指如下的雜交條件(1)使用低離子濃度和高溫清洗，例如0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS 50℃；(2)在雜交過程中使用甲酰胺等變性劑，例如42℃的50％(vol/vol)的甲酰胺溶液并添加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH為6.5的磷酸鈉緩沖液(含750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉)；或者(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M焦磷酸鈉、5×Denhard’s溶液、超聲降解的鮭魚精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS、10％硫酸右旋糖苷，并于42℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中清洗。本發明所使用的改性后的DNA序列可能包括不同核苷酸殘基的缺失、插入或者替換等，從而生成能夠編碼相同的或者功能等效的基因產物的序列。基因產物本身在Del-1序列內可能會出現氨基酸殘基的缺失、添加或者替換，這會導致沉默改變，從而可以產生功能等效的Del-1蛋白。此類氨基酸替代物可以根據其在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或殘基的雙親性等方面的相似性來制備。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸、組氨酸和精氨酸；具有不帶電荷極性首基的氨基酸具有相似的親水性，包括甘氨酸、天冬酰氨、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸；具有非極性首基的氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、色氨酸。可以根據不同的目的，來設計本發明的DNA序列，以改變Del-1的編碼序列，包括可以改進基因表達及加工的改變，但不僅限于此。例如，利用本領域所熟知的技術可以誘導突變發生，如位點導向的誘變、插入新的限制位點、改變糖基化方式、磷酸化等。在本發明的另一具體實施方案中，Del-1或者修飾的Del-1序列與異種序列結合后編碼融合蛋白。為了表達具有生物學活性的Del-1，將編碼Del-1或者編碼Del-1功能等效物的核苷酸序列插入到一個合適的表達載體，例如具備可以轉錄和翻譯所插入編碼序列所需要素的載體。
此處所用的術語“Del-1蛋白”是指所有由Del-1基因序列衍生的核酸所編碼的、具有Del-1活性的多肽序列。
此處所用的術語“血管內皮生長因子”(“VEGF“)是一種46-48kDa(亞基為24kDa)的、同源二聚的、糖基化程度很高的蛋白，盡管糖基化并非其生物活性所必需的。同源二聚體的亞基(subunit)與二硫鍵相聯。人類的VEGF基因大約長12kb，含有8個外顯子。已證明至少有4種編碼VEGF-A的mRNA，并且具有組織表達特異性。在大多數組織中，此類因子的165個氨基酸形式(VEGF-165)是最常見的形式。VEGF-121和VEGg-165以可溶性分泌的形式存在，而VEGF-189和VEGF-206大多結合在細胞表面或者基底膜中含肝素的蛋白聚糖上。這些因子通過不同的剪切方式形成，其中，含165個氨基酸殘基的VEGF缺乏外顯子6所編碼的序列，而含121個氨基酸殘基的VEGF則缺乏外顯子6和7所編碼的序列。
170-235kDa的、高親和力的糖蛋白VEGF受體在血管內皮細胞上被表達。現已知道這種VEGF的高親和力受體是VEGF-R1，并已證明其是flt-1的基因表達產物。VEGF的另一種受體KDR，也稱作flk-1，現已知道為VEGF-R2。刺激信號可以通過受體KDR/VEGF-2上調整連蛋白受體的表達。
另一種與VEGF相關的因子是VEGF-B，其與VEGF或者VEGF-C(a.k.a.VEGF-2)形成異源二聚體。VEGF-C是一種23kDa的蛋白，可由一較大的前體進行蛋白水解剪切而得。VEGF-C的另一種受體是Flt-4。VEGF-D也已經被報道，其是KDR/Flk-1和Flt-4的配體。因此，KDR/VEGFR-2的配體包括VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D家族成員(Yancopoulos，GD等人，Nature(2000))。在一具體實施方案中，VEGF-A、C、D與Del-1聯合應用，以促進血管的形成。
術語“適合于內部給藥”是指藥物混合物可以通過器官組織內給藥，如肌肉內或關節腔內給藥，或可以皮內給藥、皮下給藥或靜脈內給藥。
術語“核酸”既指RNA，也指DNA，包括cDNA、基因組DNA、質粒DNA、縮合核酸或者復配有能延長核酸定域生物利用度(localized bioavailability)的化合物的核酸。在優選的實施方案中，用于給藥的核酸是包含“載體”的質粒DNA。
術語“逆行融合”或“逆行灌注”是指與正常血流方向相對而在靜脈內給藥。對于心臟的逆行融合或灌注，將一氣囊阻塞導管(balloon occlusion catheter)在靜脈內通至冠狀竇；從冠狀竇該導管可以進一步推進到冠狀竇的支流，包括心大靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)、左室后靜脈(PVLV)、室間前靜脈(AIV)或者這些靜脈的分支。這種轉移形式最初是用來描述在心肌手術中藥物轉移、心臟保護劑或者心臟停搏抑制劑轉移分布情況的(Kar等人，HeartLung(1992)21148-59；Herity等人，Catheter Cardiovasc Interv(2002)51358-63)。Wolff在WO00/15285中描述了編碼標記蛋白LacZ和熒光素酶的裸質粒的逆行轉移情況，但該申請中沒有關于采用復配有轉染促進劑的DNA的提示或建議。
術語“載體”是指含有能夠編碼治療性產物的核酸序列的分子，而且具有各種調控元件可以對轉錄、翻譯、復制等過程和轉錄子的活性以及其他功能進行調控。載體可以是核酸如質粒或者是其他DNA載體。另外，載體也可以是修飾過的病毒，而這種病毒的原始形式包含有病毒顆粒的基因組物質。
術語“轉錄子穩定劑”是載體中的一段序列，其有助于延長轉錄子的半衰期(減慢消失)。“翻譯后加工”是指對基因表達產物的修飾，這種修飾包括側鏈的添加，如糖類、脂類、無機或者有機復合物，對靶信號和前肽的剪切，也包括基因產物在細胞特定部位的定位，如線粒體、細胞核或者各種膜結構。載體可能在線性的或者是環狀的結構中包含一個或者更多的基因。載體也可能包含有質粒的主鏈或者其他涉及基因產物的產生、加工以及分析的元件。“表達載體”是指能夠利用載體中的核酸序列產生其編碼產物的載體。例如，表達一種被特殊基因編碼的特殊生長因子蛋白。“基因產物”是指被載體中核酸序列編碼的產物。
術語“延長核酸定域生物利用度”是指，當核酸以包含某一復合物的組合物形式給藥到生物體中時，其被細胞攝取利用的時間，相對于以不含這種復合物的核酸組合物形式給藥時，將會持續更長的時間。對細胞來說，這種對核酸利用度的增加可以歸因于包含核酸的組合物與細胞之間接觸時間的增加，或者是因為核酸免受核酸酶的破壞。那些可以延長核酸定域生物利用度的復合物適合于內部給藥。
可以延長核酸定域生物利用度的復合物，由于其物理的、化學的、流變學的特點，也可能達到以下一個或者多個的效應(1)保護核酸如質粒DNA免受核酸酶的破壞；(2)增加核酸如質粒DNA通過細胞外基質和細胞膜被攝取的接觸面；(3)將核酸如質粒DNA因水分的去除而濃縮在細胞表面；(4)通過干擾細胞膜的滲透性、疏水性或者溶胞作用而間接地促進核酸如質粒DNA的攝取。下列的復合物適用于延長核酸定域生物活性利用度泊洛沙姆(Pluronics)；泊洛沙胺(或叫保麗視明，英文原名poloxamine；Tetronics)；聚谷氨酸酯/鹽；乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)；聚乙二醇；葡聚糖(右旋糖酐)；聚乙烯吡咯烷酮；丙二醇；聚乙酸乙烯酯。這些物質可以制備成溶液、懸浮液、凝膠、乳劑和微乳劑(microemulsion)。所謂“溶液”是指水溶性的聚合物和/或表面活性劑與核酸的溶液。
這些可以延長核酸定域生物利用度的復合物，是通過分子間的相互作用力和/或價鍵力，如范德華力、離子偶極相互作用、離子誘導的偶極相互作用、氫鍵或離子鍵等，而與核酸發生相互作用或者聯系的。這些相互作用可以達到以下功能(1)為核酸提供立體選擇性的保護以免于核酸酶的破壞；(2)通過“背負式胞飲作用(piggybackendocytosis)”促進細胞攝取核酸。背負式胞飲作用是指藥物或者其它分子結合到載體上，通過胞飲作用被細胞攝取。請參閱CV Ugleaand C Dumitriu-Medvichi，Medical Applications of Synthetic Oligomers.InPolymeric Biomaterials，Severian Dumitriu編輯，Marcel Dekker，Inc.于1993年出版。為了達到預期的效果，理想的是延長核酸生物利用度的復合物具有雙親性特征，也就是說，既含有親水區域又還有疏水區域，但這并非是必須的。復合物的親水區與核酸的較大的離子區域以及親水區域相關聯，而復合物的疏水區有阻止核酸擴散的作用，并且可以保護核酸免遭核酸酶的破壞。另外，疏水區可以特異性地(或叫針對性地)與細胞膜發生相互作用，這可能促進復合物的胞飲作用，因而使核酸和復合物相關聯。這個過程有利于外周細胞對核酸的富集。具有雙親性并且一般可以用作藥物治療用的藥劑如下所示泊洛沙姆(Pluronics)、泊洛沙胺(Tetronics)、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇以及聚乙酸乙烯酯，還包括共聚物體系，如聚乙二醇-聚乳糖酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚羥基丁酸(PEG-PHB)、聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(PVP-PVA)以及一些衍生的共聚物，如N-乙烯基嘌呤(或者嘧啶)的衍生物和N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物。
非病毒核酸的非縮合聚合物配方的一個特殊優點是，其應用可以顯著地減少變化的系數，如圖14所示，請比較鹽水中的質粒與復配有非縮合聚合物PVP的質粒。
此處術語“泊洛沙姆”是指由疏水的1，2-環氧丙烷(氧化丙稀)和親水的環氧乙烷組成的二段或者三段的嵌段共聚物，其中，聚環氧丙烷(POP)的分子式為(C3H6O)x，聚合單元的分子量為58；聚環氧乙烷(POE)的分子式為(C2H4O)x，聚合單元的分子量為44。泊洛沙姆屬于聚乙二醇化學家族，其通常的化學名稱是聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，化學文摘檢索序號(CAS)是9003-11-6。
BASF公司生產的泊洛沙姆的商標是Pluronic。在歐洲，BASF公司生產的藥用級別的泊洛沙姆的銷售標志是Lutrol。Pluronic類型的泊洛沙姆三段的嵌段共聚物，其中間是疏水的1，2-環氧丙烷，兩側是親水的環氧乙烷，呈三明治結構，其化學通式和結構為 BASF生產的倒轉型Pluronic泊洛沙姆具有以下的結構 此處術語“泊洛沙胺(poloxamine)”是指聚氧丙稀-聚氧乙烯(POE-POP)嵌段共聚物，其中一個POP-POE單元通過胺基連結到另一個POP-POE單元之上，其通式結構為(POEn-POPm)2-N-C2H4-N-(POPm-POEn)2。BASF公司生產的TETRONIC和TETRONICR非離子型表面活劑是典型的泊洛沙胺。由于其胺基的特性，泊洛沙胺帶有正電荷，但是并不認為在其所濃度下可以濃縮DNA。
泊洛沙胺屬于烷氧基化胺。BASF公司生產的Tetronic型泊洛沙胺的化學名稱為含1，2-乙二胺結構的聚合物，其分子式如下(POEn-POPm)2-N-C2H4-N-(POPm-POEn)2，其CAS序號是1111-34-5。倒轉型Tetronics泊洛沙胺的分子式表達為(POPn-POEm)2-N-C2H4-N-(POEm-POPn)2，其CAS序號是26316-40-5。
BASF公司生產的下列Tetronics系列產品可以增加質粒DNA到肌肉中的轉移；通過直接肌肉注射或者逆行轉移，Tetronics可以增加包括編碼Del-1在內的基因的轉移。
TETRONIC904是平均分子量為6,700Da的液態物質；TETRONIC908是平均分子量為25,000Da的固態物質；TETRONIC1107是平均分子量為15,000Da的固態物質；TETRONIC90R4是平均分子量為7,240Da的液態物質。
實施例1提高質粒向骨骼肌纖維中轉移的配方應用PINCTM(Protective，Interactive，Non-Condensing)聚合物轉移體系，可以提高質粒向肌肉的轉移能力。Del-1的PINCTM轉移體系由U.S.P.NF級的泊洛沙姆188(PuronicF68)構成。圖1顯示了質粒和泊洛沙姆188濃度對表達載體在小鼠骨骼肌中轉移的影響。將10微升質粒/泊洛沙姆肌注入小鼠脛前肌內，質粒和泊洛沙姆的濃度分別是0.1-0.3mg/ml和1-10％(w/v)。注射后7天采集肌肉標本并且測定熒光素酶的表達水平。數據表示的是mean(均數)+/-SEM(標準誤差)(n＝10肌肉/組)。優化的配方含質粒1mg/ml、泊洛沙姆188 5％(w/v)，其產生的表達水平要比另一種由同樣濃度質粒與等滲鹽水配方產生的表達水平大約高出10倍。這種優化的質粒/泊洛沙姆配方隨后在大白鼠骨骼肌中進行驗證。
圖2顯示了配有等滲鹽水、聚乙烯吡咯烷或者泊洛沙姆188PINCTM轉移體系的螢光素酶表達質粒注入大白鼠脛前肌后螢光素酶的表達情況。螢光素酶表達質粒pLC0888合并有巨細胞病毒(CMV)啟動子、合成的5’端內含子、編碼螢光素酶的基因、3’端聚腺苷酸信號及牛源性生長激素基因的一段非翻譯區。具有不同上標的條形圖之間具有差異性(p＜0.05)。在大白鼠實驗中同樣觀察到，復配的質粒配方中基因表達水平大約增加了10倍。機體對于肌肉注射配有泊洛沙姆188質粒的耐受情況很好，并沒有發生任何嚴重的病理改變。
除了非縮合的聚合物轉移系統配方以外，在一些研究中也利用電穿孔技術提高質粒向骨骼肌中的轉移。利用優化的參數，電穿孔可以使質粒轉移的水平提高10-100倍。這種轉移水平的提高引起質粒編碼的轉基因在小鼠肢體多數肌細胞中的表達。電穿孔技術已經被用來研究對于局部表達Del-1的全劑量反應。臨床前的研究表明，無論有沒有采用進一步提高轉移水平的機械技術如電穿孔術，都可以獲得治療水平的Del-1的表達成功。
實施例2Del-1表達質粒通過CMV啟動子、5’合成的內含子、hDel-1 cDNA、、3’聚腺苷酸及人源性生長激素基因的一段非翻譯區的合并組合(圖3b)，獲得Del-1表達體系。除了編碼hDel-1的表達質粒外，還構建了一種類似的鼠Del-1表達質粒。mDel-1質粒在一些臨床前的鼠科研究中已經被使用。圖3b顯示的Del-1表達盒包含于質粒主鏈中，該主鏈包含一個抗卡那霉素細菌基因(圖3c)，這樣就允許質粒在產生過程中進行選擇性生長。可以使用的另外一些表達主鏈包括選擇性啟動子、5’和3’非翻譯區和聚腺苷酸信號等，這在本領域是熟知的。圖12描述的是hDel-1的核苷酸序列，而圖13描述的是hDel-1表達質粒pDL1680的核酸序列(圖3c中有示意圖解)。
實施例3Del-1藥物的藥理學研究Del-1 Western一對來自于Del-1編碼載體的蛋白產物進行SDS-PAGE凝膠分析。將冷凍的肌肉組織放入2ml管中，該管中含有2.5mm的硅珠的溶解緩沖液，濕重10微升/毫克，攪勻，然后通過離心的方法去除不溶性物質。用高分子量標記物(SIGMA#C3312)進行NOVEX三甘氨酸凝膠電泳，每一泳道含有50毫微克肽標準樣品(PROGENITOR)，或者50毫克未知樣品蛋白。凝膠被轉移到硝化纖維膜上，并且在PBS/0.1％Tween20/5％干奶粉/4％BSA條件下封閉1小時。將鼠的抗Del-1單克隆作為一抗(primary antibody)，并以1∶500稀釋后添加到封閉的緩沖液中過夜。在PBS/0.1％Tween-20中徹底清洗后，將二抗(secondary antibody)--抗鼠HRP以1∶10,000稀釋添加到PBS/0.1％Tween-20中。纖維膜孵育一小時后進行徹底洗滌，接著在AMERSHAM ECL化學發光試劑中孵育1-2分鐘，最后暴露于X-OMAT AR膠片。
IGEN一通過針對Del-1特異性的OGIGEN IGEN免疫檢測，按配方組成的Del-1表達體系的蛋白產物可以被定量檢測。簡要的說，就是將冰凍的肌肉組織放入盛有2.5mm硅珠的溶解緩沖液的2ml管中，該管中含有2.5mm的硅珠的溶解緩沖液，濕重10微升/毫克，攪勻，然后通過離心除去不溶性的物質。所使用的檢測手段包括抗生物素蛋白包裹的硅珠、生物素標記的捕捉抗體、釕標記的檢測抗體。所有的試劑進行孵育讓它們充分結合，然后利用IGEN儀器抽取樣品，IGEN具有一個磁性的捕捉系統可以結合硅珠復合物，未被結合的部分被洗掉。當電流通過結合復合物時，含釕的成分可以發出信號，這種信號可以被探測器測量到。這種檢測的動態范圍是10pg-100ng/mg裂解物中的總蛋白。
RT-PCR一應用RT-PCR技術分析Del-1和VEGF-165以證明Del-1和VEGF-165 RNA的存在。RT-PCR的應用程序首先是對實驗動物的后肢肌肉進行采集、冷凍、均質化。通過硅珠的攪拌或者利用Tel-Test RNA Stat 60對組織進行加工以提取RNA，使用標準的DNA酶I(Boehringer Mannheim)去除樣品中的雜質DNA。應用SUPERSCRIPTTMONE STEPTMRT-PCR系統(GIBCO/BRL)完成RT-PCR。利用基因特異性的引物(primer)，cDNA的合成和PCR可以在同一個管中完成。Del-1和VEGF的引物均設計成可以跨越質粒的合成內含子。DEL-1的引物產生了一個304bp的片斷(DNA雜質產生的片斷為421bp)。引物是有義的5’-TGA CCTCCA TAG AAGACA CCG GGA C-3’(SEQ ID NO4)和反義的5’-GTG ATG CAA CCTCCA CAA CAC TAG A-3’(SEQ ID NO5)。VEGF引物產生了一段長724bp的片斷(DNA雜質將會產生841bp長度的片斷)。有義引物與Del-1相同，反義鏈是5’-GGA GGGGTC ACA GGG ATG C-3’(SEQID NO6)。RT反應參數和PCR循環參數如下所示。RT反應50℃持續30分鐘；95℃持續2分鐘；PCR循環95℃持續30秒；65℃持續40秒，循環35次。延伸階段時65℃水平持續5分鐘，然后降至4℃。
Del-1和VEGF的免疫組織學通過免疫組織化學分析我們在被治療的肌肉組織樣品中發現了Del-1和VEGF-165基因藥物。將一5μm的冰凍切片用普通兔血清封閉，再與以1∶500稀釋的大鼠抗小鼠Del-1抗體免疫染色1小時。接著，用PBS液對肌肉切片進行漂洗，然后再與以1∶400稀釋的用生物素標記的兔抗鼠IgG(VectorLaboratories)孵育1小時。接下來對肌肉切片漂洗后再與抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，Vector Laboratories)孵育1小時。切片用PBS液漂洗完后，通過與DAB(Vector Laboratories)反應，免疫復合物就可以顯影。VEGF-165的免疫組織化學定位通過3mm2石蠟切片完成。首先將切片與普通羊血清封閉，然后再與以1∶200稀釋的兔抗人VEGF抗體(Intergen Company)孵育1小時，這樣切片就完成了免疫染色。將生物素標記的羊抗兔IgG(Vector Laboratories)以1∶400的比例稀釋，肌肉切片用PBS液漂洗后與其孵育1小時，接下來肌肉切片用PBS液漂洗后，再與抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，VectorLaboratories)孵育1小時。PBS液漂洗過的肌肉切片通過與DAB(Vector Laboratories)反應，免疫復合物就可以顯影了。
定量RT-PCR按配方組成的Del-1表達體系在被治理肌肉中可以表達，其產生的RNA數量可以通過RT-PCR技術進行分析。應用RNAzol可以從肌肉樣品中分離出所有的RNA。殘留的質粒DNA通過用DNA酶處理RNA樣品而被除去。在一個ABI-7700熱循環中使用單步Taqman RT-PCR測定就可以對Del-1樣品中的mRNA進行定量分析。在Del-1 mRNA中跨過5’端非翻譯區內含子的5’端和3’端引物被用來擴增mRNA特異性的擴增子。
毛細血管密度及其與肌纖維比率通過針對CD-31的westernblot(蛋白質印跡實驗)可以分析毛細血管密度。簡單地說，就是把冷凍的肌肉在含有2.5mm硅珠溶解緩沖液(濕重10微升/毫克)的2ml管中攪勻，離心后除去不溶性物質。用高分子量標記物(Sigma#C3312)進行Novex三甘氨酸凝膠電泳，每一泳道含有50ng肽標準樣品(RDI)或者50mg未知樣品的總肽。凝膠轉移到硝化纖維膜上，在PBS/0.1％Tween-20/5％干奶粉/4％BSA條件下封閉1小時。將以1∶500稀釋的羊抗CD-31(RDI)作為一抗，添加到封閉緩沖液中，搖晃后室溫下孵育過夜。在PBS/0.1％Tween-20液中徹底清洗后，再添加以1∶10,000稀釋的抗山羊-HRP作為二抗。硝酸纖維素膜孵育1小時后，經徹底清洗，再于Amersham ECL化學發光試劑中孵育1-2分鐘，接著將其暴露于X-OMAT AR膠片。膠片經過計算機掃描后，利用ImageQuant軟件對每一條帶的像素濃度進行評估。因為凝膠之間有差異，可以得出在同一電泳凝膠中肽樣品CD-31的百分比數值。
毛細血管對肌纖維的比率由CD-31的免疫組織化學定位決定。5mm2冰凍切片用普通兔血清封閉后，采用以1∶1000稀釋的大鼠抗小鼠CD-31抗體(PharMingen)對其進行免疫染色。接著用PBS緩沖液對切片進行漂洗并且與以1∶400稀釋的生物素標記的兔抗鼠IgG(Vector Laboratories)孵育一小時。接下來用PBS液對切片進行漂洗，與抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite，Vector laboratories)共孵育1小時。再次對切片進行漂洗后讓其與DAB(Vector Laboratories)進行反應，這樣免疫復合物就可以顯影了。
使用Optimas圖象分析軟件可以完成毛細血管與及肌細胞比率的圖象分析，這種軟件可以對毛細血管和肌纖維數量進行特定的宏觀分析。對來自CD-31免疫染色冰凍切片的圖象進行分析，建立毛細血管與肌纖維比率的數據。
治療性血管形成的評價應用血管造影術對白兔后肢局部缺血模型實驗中形成的側枝血管進行評價。右股動脈經導管注射4ml對照劑(VISIOPAQUETM)。記錄下雙測后肢連續的影像。使用盲法可以對側枝血管的形成作出定量的血管造影分析，觀察者直接對以股骨解剖標幟形成的兩個互相垂直的平面內的血管計數，然后求平均。使用DIACOM VIEWTM軟件將分析用的圖片從照相機中取出。圖象分析的完成需要3個分離的時間段，記錄下觀察到的均數。
活動平板實驗對給藥Del-1、VEGF-165、非編碼質粒以及對照組的實驗動物進行活動平板強度測試，以分析它們生理方面改變的情況。把動物放置在傾斜7度的活動平板上，轉數每分鐘5米，持續5分鐘，使動物適應活動平板。起始5分鐘后，將活動平板的轉數提高到每分鐘10米并開始計時。每間隔兩分鐘將活動平板的轉數提高一次，直到動物出現疲勞信號。動物疲勞的信號是其步態的改變，不能夠運動到活動平板的前部，在震動的格子上要花費5秒鐘以上。一旦觀察到這些聯合信號的出現，立即終止實驗，將動物從平板上移去，并且停止計時。
統計分析所有的結果以means(均數)+/-SEM(標準誤差)的形式表示。利用單向的ANOVA對其統計學意義進行評價。P＜0.05表示結果具有統計學意義。
動物模型按配方組成的Del-1表達體系的臨床前藥理學作用已經在小鼠和大白兔動物模型中得到評估。在肢體局部缺血的動物模型中，肌肉注射按配方組成的Del-1質粒已經被證明可以增加含氧量正常的骨骼肌中毛細血管的密度，并且可以增加側枝血管的形成以及運動耐受量。Del-1質粒產生的生物學效應具有劑量依賴性。在動物模型中沒有觀察到與Del-1表達有關的藥物毒性或者嚴重的病理反應發生。
將復配的mDel-1表達質粒肌注入小鼠脛前肌，伴有或者不伴有電穿孔，mDel-1在脛前肌的表達水平和持續時間如圖4所示。將10mg復配的Del-1質粒注入CD-1小鼠的脛前肌，注射后7、14、30和60天分別采集被注射的肌肉，并通過qrtPCR測定mDel-1的mRNA。數據點代表的是n＝5/組的平均值+/-標準誤差。這項實驗顯示如果沒有進行電穿孔，mDel-1的表達大約以每月一個數量級的速率下降。mDel-1編碼核苷酸與電穿孔技術聯合應用可以使Del-1mRNA的表達水平大約增加100倍，而且可以增加mDel-1表達的持續時間。
注射(伴有或者不伴有電穿孔)后第7天，hDel-1在含氧量正常的小鼠脛前肌內的表達效果如圖5所示。將復配的Del-1表達質粒或者對照質粒肌注注入小鼠脛前肌，然后行電穿孔術以進一步增強質粒的上調(+EP)。平面A以條形圖的形式描述治療7天后毛細血管的密度，這種結果是由電腦對CD-31免疫染色的圖象分析決定的。數據顯示了n＝3/組的平均值+/-標準誤差。帶星號的組表示同與對照組有差別，具有統計學意義(p＜0.01)。平面B相片顯示的是典型的肌肉橫斷面的CD-31的免疫染色。單份10mg劑量的hDel-1質粒可以使毛細血管/肌纖維比率增加60％(p＜0.01)。應用電穿孔可以增加hDel-1的表達，但是并不能進一步增加毛細血管/肌纖維比率。雖然數據沒有說明，但人源性與鼠源性Del-1在動物模型中的表達是等效的。
免疫組織化學分析表明，復配的Del-1質粒可以引起非常微弱的炎癥反應，而復配的VEGF-165質粒可以引起大量的炎癥細胞浸潤。其它一些研究也顯示VEGF-165可以引起炎癥細胞的增加，甚至有報道在VEGF-165長期表達的情況下甚至發生血管瘤(Springer M等人，Molecular Cell(1998) 2549-558；Ozawa C等人，Annu.Rev.Phar-macol.Toxicol.(2000)40295-317)。
實施例4劑量反應關系為了研究表達的Del-1蛋白與增強表達的毛細血管內皮細胞表面抗原CD31之間的關系，進行了確定注射肌肉中表達的mDel-1蛋白與CD31濃度量的實驗。給小鼠肌肉注射10mg非編碼質粒，10mgDel-1質粒、20mg Del-1質粒或者30mg Del-1質粒，并聯合應用電穿孔術。術后7天，采集小鼠肌肉，并且通過免疫測定法測定mDel-1以及通過蛋白印跡分析測定CD31，接著進行密度檢測。這項實驗的研究結果如圖6所示。研究結果顯示mDel-1的表達量與毛細血管內皮細胞表面抗原CD31之間有著很強的相關性(R＝0.65，P＜0.01)。與Del-1濃度增加相關，CD31的EC50約為5ng/g濕肌肉。
實施例5；復配的Del-1質粒在小鼠局部缺血后肢的作用除了研究含氧量正常的小鼠后肢外，對復配的Del-1表達質粒在小鼠后肢局部缺血模型中的作用也進行了研究。CD-1小鼠(2631gm)來源于Charles River(Houston)。先給予氯胺酮7.4mg/gm、噻拉嗪0.4mg/gm、阿西喹林0.08mg/gm使小鼠保持鎮靜狀態，然后結扎小鼠雙側股動脈。在用藥側肢體腹股溝韌帶下方與髕骨近端之間做一個縱向的切口，找到股動脈起始于髂動脈處，在此位置結扎股動脈近端；找到股動脈近端分支成隱動脈與股深動脈處，對此位置也進行結扎。股動脈結扎后立即給動物肌注復配的hDel-1質粒、hVEGF質粒或者對照組質粒(非編碼質粒)，注射時使用規格為1/2″的針頭，對股部與下肢分五個不同的部位進行注射(每個后肢的注射總劑量是70mg，其中脛前肌10mg，腓腸肌20mg，股四頭肌40mg，術后立即給藥)，每次注射的配方配有濃度為1mg/ml的泊洛沙姆0.1ml。接下來對實驗動物進行活動平板生理極限測試和半定量的蛋白印跡CD-31分析，這樣就可以對局部缺血動物模型的血運重建進行評估。術后對動物進行功能耐量檢測，每周一次，持續4周。由于已有很多研究顯示VEGF的過度表達可以增強局部缺血組織的血運重建，所以實驗中應用了復配的VEGF表達質粒作為對比。
圖7顯示的數據表示的是平均值+/-標準誤差(n＝7-8實驗動物/組)。與不同組相對應的不同的上標，表明不同組的運動是不同的，具有差異性(p＜0.05)。圖7顯示的結果表明Del和VEGF治療組相對與對照組都可以增加動物的運動耐量，具有差異性(p＜0.05)。一項旨在評價超過6個月后Del-1質粒對小鼠骨骼肌治療情況的檢查(qRT-PCR)表明，6個月后，復配的Del-1質粒在小鼠骨骼肌中的表達水平并沒有顯著下降。
實施例6復配的Del-1質粒對大白兔股動脈切除的局部缺血模型的治療效果股動脈切除的大白兔模型是用來研究局部缺血后肢中血管生成因子情況的最常用的動物模型。應用與上述小鼠相似的設計建立第一批14只雄性新西蘭大白兔(4kg)后肢局部缺血模型。簡要的說，首先使用氯胺酮(20mg/kg)、噻拉嗪(5mg/kg)、阿西喹林(2.5mg/kg)使大白兔麻醉，然后切除其左側股動脈。在用藥側肢體腹股溝韌帶下方與髕骨近端之間做一個縱向的切口，接著游離股動脈并且游離結扎與之相連的動脈分支。現在切除股動脈，切除的解剖位點是股動脈起始于髂外動脈處以及股動脈分支為隱動脈(sapheneous artery)與股深動脈分叉處。
對于后肢局部缺血的大白兔模型，術后三天，分別將復配的非病毒性編碼Del-1的DNA、VEGF-165或者作為對照組的非編碼質粒注射到其股中部10個不同的部位，注射時使用規格為1/2″的針頭。注射使用的DNA的濃度是1mg/ml，配方中含有泊洛沙姆188，每次注射0.5ml，DNA量共5mg。
術后立即對模型行血管造影術，術后一月再做一次。治療30天后對缺血患肢的血運重建水平作出評估，評估方法包括對CD31的半定量蛋白印跡分析和血管造影分析。在股中部交叉分布的新生側枝血管的數字統計結果如圖8所示。其中，對照組n＝3，Del組n＝5，VEGF組n＝6。條形圖示的是股中部新生側枝血管的mean(均數)+/-SEM(標準誤差)。具有不同上標的條形圖之間是有差別的，差別具有統計學意義(p＜0.01)。經過一個月的治療，Del和VEGF引發的血管生成增加了兩倍多，具有統計學意義(p＜0.05)。
實施例7配方的優化以及轉移Del-1質粒到心肌細胞一些關于證明和使配方優化以及轉移Del-1質粒到心肌細胞中的實驗已經完成。實驗結果表明，通過逆行性靜脈注射聚合物配方，可以獲得對左室最佳的轉移效果。將復配的質粒通過這種途徑給予8只豬(其中4只給予的配方中含有泊洛沙姆，另4只配方中含有陽離子脂質體)，在基因藥物轉移過程中豬的耐受情況良好。然而7天后，接受含有陽離子脂質體配方的豬，其心肌出現了嚴重的病理改變。通過相同程序將對照介質或者染劑注入，發現這些物質產生了局部的外滲并進入到左室的主質(parenchyma)內。接受含有泊洛沙姆配方的豬的Del-1mRNA的表達水平最高。一些實驗將不同的配方按照直接心肌內注射的方式導入小鼠模型中，對此實驗的評估表明，無論是添加縮聚葡萄糖的配方還是將質粒的濃度從1mg/ml提高到3mg/ml的配方，當用注射針頭注射后，兩者都可提高質粒在心肌中的轉移。
實施例8經皮轉移基因藥物到心肌基于安全性、技術上的易行性以及質粒轉移的高效性，具有潛能的經皮轉移形式在豬模型中得到了測試和對比。關于這些實驗的基因表達以及耐受能力數據總結于表1中。對于所有進行的經皮轉移實驗，需要對主要的器官進行樣品采集(通常在給藥7天后進行)，這樣就可以對質粒的生物分布進行評估。結果(未示出)揭示質粒最初定位于心臟，與注射的途徑和配方無關。
應用針注射導管轉移基因藥物設計兩個實驗取實驗豬共6只，其中4只接受配方中含有泊洛沙姆188的Del-1質粒DNA，其余兩只接受的配方中含有鹽水而無泊洛沙姆188，注射使用BioCardia公司提供的螺旋針注射導管。在轉移過程中，所有的實驗動物耐受情況良好，沒有見到嚴重的病變發生。表1中基因表達數據表明，在應用IM針導管轉移方式的左心室內，Del-1的表達水平較低，而應用逆行靜脈轉移方式，Del-1獲得了高水平的表達。
表1Del-1mRNA 陽性部位 Del-1mRNA在陽性部在LV1中 百分比 位中2IM導管23,589 20 120,184(10個部位)6,136 16 18,949逆行性IV 114,02028 405,075806,55541 2,177,9321總DNA(所有部分)中每mg單位所含的Del-1拷貝份數，LOQ＝500拷貝份數/mg)(500,000-1,000,000的典型水平在小鼠后肢肌肉中實現)2總DNA(陽性部分的均值)中每mg單位所含的Del-1拷貝數使用針注射導管將復配的DNA轉移到心肌與使用針頭和注射器進行肌肉內注射的情況非常類似。對小鼠實驗的研究結果顯示，對心肌而言，通過肌肉內注將基因藥物導入產生的效果不如骨骼肌。
轉移基因藥物到心包腔使用Comedicus公司生產的套管針器械完成了將基因藥物轉移到心包腔的實驗。通過這條途徑，帶有陽離子的脂質體配方得到了測試，動物在實驗過程中的耐受情況良好，并心肌組織中檢測到了Del-1mRNA的低水平表達(Del-1mRNA＜500拷貝份數/mg總DNA)。
通過逆行靜脈注射將基因藥物轉移到左心室通過逆行靜脈注射將基因藥物轉移到左心室的實驗已經完成，實驗使用的是一個7F的氣囊導管(10，如圖11A和11B所示)，導管通過冠狀竇(20，圖11A)，經心大靜脈(30，圖11B)，到達前室間靜脈中部(40)。給氣囊充氣(15)以防止靜脈的流出，接著或以最大的手壓或以可控制的比率注入10ml復配的質粒，速率可以是容量/時間比，如1ml/秒，也可以是預定的壓力。將對比介質或者染劑按此途徑注入，可以觀察到這些物質局部地外滲到左心室的主質中。圖11A和11B中的箭頭(60和70)指示的是質粒在導管中的流動方向，而箭頭(80和90)表示的靜脈的血流方向。
接下來使充氣的氣囊在一些地方停留幾分鐘(時間依實驗而定，豬2-10分鐘)以利于增加配方在組織中的滯留時間。通過這種方式將質粒導入8只豬體內，其中4只接受的配方中含有泊洛沙姆，其余4只接受的配方中含有陽離子脂質體。所有的動物在質粒轉移過程中的耐受情況良好。然而給藥7天后，接受含有陽離子脂質體配方的豬心肌出現了嚴重的病變，并且病變豬中接受1∶3(+/-)配方的病變程度要比接受1∶0.5(+/-0)的更加嚴重。
接受含有泊洛沙姆配方的豬，其Del-1mRNA的表達水平最高，而接受含有較高濃度陽離子脂質體配方的豬，其Del-1mRNA的表達水平顯著下降，如表2所示。對基因藥物的各種轉移方式和配方進行測試，發現只有含泊洛沙姆配方并且通過逆行性靜脈注射方式產生的基因表達水平最佳，其表達水平與小鼠以肌注方式產生的基因表達水平相當。
無論是心肌內直接注射方式還是逆行性靜脈注射方式，接受含有泊洛沙姆配方的實驗豬的耐受情況都很良好。
表2經皮心肌轉移研究數據概要配方 技術成功1Del-1 mRNA2總體病理IM導管泊洛沙姆188 5％6/6 可檢測的3陰性(n＝4)心包 陽離子脂質體(1∶3，-/+)1/3 ＜LOQ (n＝3) 輕度逆行性IV 陽離子脂質體(1∶3，-/+)2/2 ＜LOQ (n＝2) 中/重度逆行性IV 陽離子脂質體(1∶0.5，-/+) 2/2 3997(n＝2) 輕/中度逆行性IV 陽離子脂質體188 5％4/4 397279 (n＝2) 陰性1技術成功是指完成轉移過程而沒有出現明顯的問題；2每mg單位總DNA中含有2個Del-1mRNA的拷貝份數，LOQ＝500拷貝份數(小鼠骨骼肌中以獲得了500,000-1,000,000的典型水平)；3在這些樣品中，運輸過程中RNA的部分降解扣除了Del-1mRNA的量。
實施例9通過心肌內直接注射法將預配制的質粒注入小鼠心臟由于可以對嚙齒類動物實施直接心肌注射法，通過這種方法可以對各類轉移基因藥物的聚合物配方的療效進行評估。在這些實驗中，在對配方檢驗參數的選擇上要考慮觀測數據。下面所有的實驗都以小鼠為實施對象，實驗中需使用熒光素酶蛋白報告質粒pLC0888。簡要地說就是，首先用戊巴比妥麻醉小鼠，插管，接著沿胸骨中線切開使胸部開放。消毒后，用胰島素注射器將復配的質粒注射到小鼠心臟中，在這些作用下，小鼠的心率可以緩慢地升高到500-600次/分。除非受到質粒其它方面毒性的影響，注射后小鼠的存活率超過80％。出于對比的目的，注射pLC1088(配有5％泊洛沙姆)7天后，熒光素酶在小鼠骨骼肌中的表達水平應該被記錄下，大約是107RLU/mg蛋白。
這項實驗的目的是確定是否增加泊洛沙姆188配方中的質粒濃度就可以增強pLC0888的轉移。不過，下面圖9的實驗結果表明將5％泊洛沙姆188配方中的質粒濃度從1mg/ml增加到3mg/ml可以增強向心肌的轉移效率。給出的數據代表的是n＝3/組的mean+/-SD。CD-1小鼠接受1，3和12/ml注射配方，而C57 BL6小鼠接受6/ml注射配方。
進一步的實驗表明直接IM注射1mg/ml質粒，5％泊洛沙姆配方的確引起注射心臟中熒光素酶的適當表達。
通過直接心肌注射，將各種配方轉移質粒到心肌，以進行比較。結果如圖10a所示，結果表明多聚谷氨酸配方中的質粒產生的轉移效果要優于其它檢測的配方。一項附加的實驗結果如圖10b所示，這項實驗相對鹽水配方進一步證明了上述結果。數據分別代表的是n＝3/組(平面A)以及n＝4-5/組(平面B)的mean+/-SD。
實施例10非縮合聚合物配制的質粒在本發明的一個具體實施方案中，復合物可以與添加其中的DNA通過以下一種或者多種方法相互作用FTIR、ITC、DELSA和熒光淬火。在一定的環境中，復合物可以表現出抗核酸酶特性從而對DNA提供保護。優選的復合物不引起DNA的縮合、凝聚，而是應該有利于其在固體組織(如肌肉、腫瘤)中擴散和轉移，并且能夠增強DNA的表達水平。如圖12所示，優選的復合物使得DNA表達能力重現性增強。
實施例11預先配制的Del-1表達質粒的藥物產品在本發明的一個具體實施方案中，泊洛沙姆188是質粒表達的促進劑，其化學結構式如下HO(CH2CH2O)80(CH(CH3)CH2O)27(CH2CH2O)80HDel-1藥品包括

在具體實施方案中，復配的DNA的制備是通過將等量的質粒DNA、pDL1680和poloxamer(泊洛沙姆)無菌混合而成，如下所示

過濾完成后，將成分或者混合物凍干并貯藏。需要使用時，以凍干的成分可以在普通鹽溶液中解凍。
實施例12應用電穿孔技術轉移復配的Del-1質粒這里所謂的“脈沖電壓器”或者“脈沖電壓注射器”是指一種儀器，這種儀器可以向器官細胞發射一種定位的電脈沖，引起細胞膜發生去穩定并且導致細胞膜通道開放，從而誘發細胞吸收核苷酸的活動。這種傳統的設備可以定標以允許使用者選擇和/或調節預設的電壓幅度，并且/或者調節脈沖持續的時間，因此人們希望將來的儀器也可以通過定標的方式來完成這項功能。這種注射儀器并不對本實驗構成影響。事實上，脈沖電壓器的首位重要性是其促進發明成分進入器官細胞的能力。脈沖電壓注射器包括一個電穿孔裝置，如U.S.專利5,439,440、U.S.專利5,704,908或者U.S.專利5,702,384所描述的，或者在PCT WO 96/12520、PCT WO 96/12006、PCT WO 95/19805和PCT WO 97/07826在所公布的，此處上述所有專利均作為參考文獻。
這里所謂的“裝置”與一組結合的元件有關，這些元件通過發射脈沖的方法可以使本發明的混合物轉移到器官的細胞中。本發明裝置的組成部件包括一個或一組注射器、各種電極、定位器及電脈沖發生器。定位器可以通過光學纖維和視頻監控發揮作用，脈沖發生器可以對電壓幅度、持續時間、循環次數進行定標。電極有各式各樣的尺寸，并且能夠選擇性的將本發明的混合物注射到不同的轉移深度，如哺乳動物器官的表面，或者轉過表面進入主質中。
構建的基因藥物進入器官細胞可以通過電脈沖聯合針注射的方法，或者直接利用電脈沖。以電穿孔裝置的電極直接插入靶器官或靶細胞(如表皮細胞)的方式，脈沖應用前后及時地給予載體并且使其到達靶器官細胞。
所選載體構成物的給藥途徑依賴于表達載體的特殊用途。總的來說，對每一個載體構成物的特殊配方研究集中在載體的轉移方面，既要考慮特定的靶組織，又要考慮電脈沖轉移參數，接下來需要對功效進行論證。轉移研究包括評價細胞攝取載體的吸收情況分析以及選擇DNA的表達情況分析，分析還包括目的DNA攝取后的定位以及維持表達蛋白穩定濃度所需要的條件，然后可以檢測功效與細胞毒性。毒性作用既包括對細胞生存力的影響也包括對細胞功能的影響，肌細胞具有獨特的攝取細胞外間隙中DNA的能力，所以當DNA分子以溶液、懸濁液或者固態形式注射到肌肉中后可以被肌細胞攝取，這種方法可以使DNA的表達持續幾個月。
我們實施了一項實驗，旨在研究當Del-1作為一種基因藥物通過肌注的方法轉移到的小鼠后肢肌肉中后，其增加血管密度的潛能。簡要地說，將10mg聚合物復配的PINCTMmDel-1、hDel-1或者hVEGF165質粒(10mg質粒劑量)注射到雄性CD-1小鼠的脛前肌內。在一些例子中，輔助應用電穿孔以增強肌纖維的轉染效率。治療7天后，采集肌肉，快速冰凍，并且對毛細血管內皮細胞表面抗原CD 31、Del-1和VEGF165進行免疫組織化學分析。接著應用OPTIMAS圖象分析軟件進行圖象分析，此軟件裝配有一個客戶宏可以計算骨骼肌中毛細血管/肌纖維比率。電穿孔可以增加轉染的效率，增強轉基因的表達，其增幅將近100倍。電穿孔非治療性肌肉只出現輕微或者不出現病理變化，不影響毛細血管/肌纖維比率(2.56(非電穿孔肌肉)2.52(電穿孔肌肉))。無論注射Del-1表達質粒或是VEGF165表達質粒，兩者均可引起毛細血管/肌纖維比率的顯著增加(p＜0.05)，較對照組高出30％-50％。由電穿孔增強的轉基因表達進一步使毛細血管/肌纖維比率較對照組高出70％，但是電穿孔本身對所有實施例的作用均不顯著。在轉基因表達的區域附近觀察到了增強的CD 31免疫染色，CD 31免疫染色的方式與Del-1、VEGF165表達質粒在注射肌肉中免疫染色的方式類似。然而，通過電穿孔技術得到的VEGF165的藥理學水平與血管叢集及嚴重的局部水腫有關，這在其他治療組中并未發現。這些結果表明，非病毒介導的Del-1表達系統能夠刺激缺血組織中血運重建，同時還表明，電穿孔技術可作研究該效應的工具及非病毒基因治療的治療指數。
實施例13以鹽水或泊洛沙姆制備的質粒轉移至受體豬的心肌組織對測得的表達水平進行比較將以鹽水或5％泊洛沙姆制備的質粒(1毫克/毫升)轉移后對測得的表達水平進行比較，將5％泊洛沙姆制備的pDL1680(1毫克/毫升)與等滲鹽水制備的pDL1680(1毫克/毫升)作比較，實驗采用的是滑潔級Yorkshire受體豬(大約50千克)。
通過氣囊導管，用rIV灌注，把待測物(10毫升，質粒劑量10毫克)轉移至AIV(如果找不到AIV就用其他靜脈代替)的中段。在X射線透視指引下(若有必要作放射顯影對比)將導管置于目的靜脈，通過利用對比介質分布范圍(比如顏色發紅)及估計轉移位點，并以此校正導管位置使側支分液最小。接下來將已定位導管中10毫升Del-1質粒以最大手掌壓力或在約10秒或小于10秒的時間內推入轉移部位。結果表明與控制壓力推入者相比，以最大手掌壓力推入者提高了心肌轉染率。
在應用對比介質后馬上應用已獲得的被切成1×1立方厘米大小的待測片段(總面積約4.5×4.5平方厘米)，顏色最紅的區域即心肌的靶點，這些組織標本及從靶點遠處心肌獲得的標本以及從肺、腎、血清中采集的標本都被用來作hDel-1轉基因mRNA的定量重組RCR檢測。另外，對從心肌轉移的靶區域獲得的樣本作hDel-1蛋白的免疫組織化學分析。
上述心肌在轉移過程中呈現良好耐受，并且無明顯的體內變化及肉眼可見的病理變化，在部分受體豬發現于氣囊充氣部位有輕微挫傷。圖15顯示了將pDL1680鹽溶液或pDL1680 5％的泊洛沙姆188溶液制備的rIV轉移至受體豬后hDel-1 mRNA在其心肌組織中的表現。這些數據點代表了hDel-1 mRNA在轉移的4.5×4.5平方厘米靶區域的平均水平，實心圓代表以最大手掌壓力推入的結果，虛心圓代表多次轉移的結果。
所有處理組的均值在圖中都以水平線表示。圖15中hDel-1mRNA的結果表明(無論是否以最大手掌壓力推入或多次轉移)以5％泊洛沙姆188制備的rIV在心肌靶區域產生的hDel-1mRNA大約為鹽水制備組的6倍，Del-1轉基因在心肌靶區域遠處部位及遠側器官中的表達非常少或者可以忽略不計，而且不受制備方法的影響。
實施14在血管生成中聯合應用Del-1和VEGF編碼VEGF165的cDNA被化學合成及克隆到哺乳動物表達質粒中，此質粒包含一個(CMV)啟動子、一個5’合成內含子、hDel-1cDNA、3’聚腺苷酸信號以及如圖3b所示的Del-1表達質粒中的一段由人生長激素基因，而來的非翻譯區段，將VEGF165與已知的高表達人蛋白中發現的優選密碼子進行分析比較，僅代表已經使用的天然VEGF165序列中的八個密碼子均被加以改造以和高表達人蛋白中的密碼子相一致。圖16中顯示了這些經改造的密碼子，其中天然密碼子已在這些鏈中加以標記。
Del-1與VEGF組合對小管形成的體外分析分別在含有了Del-1、VEGF、Del-1/VEGF的3D-股原凝膠中加入人臍靜脈初始內皮細胞(HUVEC細胞)。2天后給細胞拍照來比較Del-1、VEGF或者兩者組合的情況下對小管形成的影響。與對照組、Del-1組及VEGF組相比，Del-1與VEGF的組合組能更好的促進小管形成。
Del-1與VEGF組合對毛細血管發育的體內分析將編碼Del-1(10毫克)、VEGF(10毫克)、Del-1及VEGF(每種質粒5毫克)或者空白對照載體的、共10毫克5％泊洛沙姆188復配的質粒DNA注入雄性CD-1小鼠脛前肌。在注射復配的質粒DNA，馬上進行點穿孔法。大約在注射后2分鐘，用Eledtro SquarePorator(T820，Genetronics，San Diego，CA)產生375V/cm電壓以及每次25毫秒的2平方波長脈沖(每秒一次)。嵌位電極包含兩個平行的不銹鋼板測徑口(1.5平方厘米)，將它置于皮膚之上以使腿部在脈沖過程中處于半伸展位。通常情況下，小鼠的腿部被固定在兩個板之間，兩板之間相距3-4毫米，分別于第7天和第28天用rt-PCR技術檢測轉基因mRNA表達，并在以抗CD31染色的組織進行免疫組織化學分析來計算毛細血管/心肌細胞比值(”C/M”比)。在第7天，轉基因mRNA表達增強，而在第28天則降低了幾個數量級。如圖17所示，單獨的Del-1組及VEGF組的C/M比值是空白載體對照組的1.5-2倍，證實了以前的實驗。與最適劑量的(為各自劑量的2倍)單獨基因相比，亞最佳量下的Del-1及VEGF聯合應用，會使得毛細血管內皮細胞密度的顯著增加。在Del-1/VEGF組合組中，CD-31陽性結果的內皮細胞數目繁多難以計數；而且，實驗發現，與空白對照質粒組及VEGF組對比，Del-1及VEGF聯合應用能增加受體對運動的耐受能力。
盡管在樣品中Del-1及VEGF的組合是用兩種不同質粒制備的，本領域熟練人員應當知道，Del-1及VEGF的表達也可以通過一個攜帶有兩個轉錄表達單位的單一質粒，或者通過一個含有內部核糖體進入位點的單一轉錄表達單位。
實施例15逆行法基因轉移的泊洛沙姆配方在泊洛沙姆的命名法中，非專有的“泊洛沙姆”名稱后有一個數字，其中，前兩位若乘以100，大約就等于聚氧丙稀(POP)的分子量，第三位數若乘以10，大約就等于聚氧乙烯(POE)重量的百分比。因而，泊洛沙姆188中聚氧丙稀的分子量大約1800，聚氧乙烯的重量大約為分子總量的80％。根據泊洛沙姆命名法，泊洛沙姆188(a.k.a.F68)的聚氧丙稀平均數目如下1800/58(C3H6O的分子量)＝31，泊洛沙姆188的總分子量是1800/(1-80％)＝9000，其聚氧乙烯的平均數目如下(9000-18000)/44(C2H4O的分子量)＝163。因此，泊洛沙姆188(a.k.a.F68)的分子式即HO-(C2H4O)82-(C3H6O)31-(C2H4O)82-H。
另外，根據已知變量可由通式HO-(C2H4O)x-(C3H6O)y-(C2H4O)x-H來推測其平均分子量、聚氧乙烯的比例及數量以及聚氧丙稀的數量。這樣，若知道總的分子量及聚氧乙烯的比例也可以推測其分子式聚氧乙烯的平均數可以這樣得到(總的大約分子量-18(終端氫和羥基基團的分子量)×聚氧乙烯重量百分比＝聚氧乙烯的分子量÷44(C2H4O的分子量)＝POE基團個數，因此，對于F68來說其個數就等于((8400-18)×80％)＝6705.6÷44＝152.4(÷2＝76)在BASF命名法中，描述泊洛沙姆物理形式的字母后的第一個數字任意代表POP的分子量，第二個字母代表POE的百分比——F68是泊洛沙姆188的BASF商品名，以BASF法計算F68的平均分子量為8400，F68NF級的平均分子量即8600，那么POE的個數為80，所以百分比為81.6％，POP的個數為27，分子量為1566，則整個分子式為HO-(C2H4O)80-(C3H6O)27-(C3HO)80-H，由此計算，其分子量是18+7040+1566＝8624在實際操作中，泊洛沙姆是在產生具有期望分子量的疏水基因的過程中而合成，在此過程中需要有控制地將環氧丙烷加到丙二醇的兩個羥基基因，之后添加環氧乙烷，使疏水基團在兩個親水基因之間，呈三明治結構，從而得到具有一定分子量的分子聚集，及親水基團的平均百分比。
由于在這個表面活性劑家族中，EO及PO的比例及重量均不相同，BASF研制出了PLURONIC格以用圖例表示聚合物分子結構、物理形態及表面活性劑特征間的關系。在PLURONIC表面活性劑格中，以每分子中疏水基因(PO)的分子量范圍及親水基因(EO)的分子量百分比作圖。根據泊洛沙姆在PLURONIC格上的定位所劃分的泊洛沙姆系列，在其分子量與相關疏水性方面可能有共同特征。
正如圖18所示，PLURONIC格闡明了字母組合的用途以辨別PLURONIC的不同產品系列，字母序列代表了產物的物理形態“L”即液體；“P”即糊狀物，“F”即固體。數字中第一位數(三位數中的兩位數)乘以300，代表疏水基因的大致分子量(格子左邊的垂直軸)，最后1位數乘以10代表分子中也環氧乙烷的大致含量(水平軸)。
圖19顯示了能夠提高質粒DNA轉移至肌肉效率的泊洛沙姆系列的特征，優選的泊洛沙姆已在圖18中圈出，并且包括PLURONICSF38、F68、F87、F88、F108和F127表示的泊洛沙姆188。本發明者發現F68能顯著提高質粒DNA在骨骼肌及心肌的轉移效率，同時伴有血管生成轉基因表達。
實施例16圖3B及3C描述了向局部缺血組織轉移血管生成的優選質粒載體的結構，如圖所示，此質粒包括后轉錄成分(包括合成內含子及hGH聚腺苷酸信號的5’UTR)以提高蛋白表達的水平及準確性。在此方案中，如圖3B所示，表達盒除了一個5’UTR中的合成內含子IVS8，還包括一個被稱作UT12(SEQ ID NO8)的CMV5’UTR。
UT12序列(SEQ ID NO8)如下5’TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTG3’真核表達載體轉錄子的隱蔽剪接顯然不理想。為了控制剪接方式及使基因表達最大化，可用強式內含子代替亞佳內含子(suboptimalintron)。為此，具有共有剪接序列的內含子應是最優選擇。在本方案(IVS 8)中，合成內含子包括5’剪接位、3’剪接位和分支位點的共有序列。當合成內含子并入用來表達治療性基因的真核載體中，其將引導RNA轉錄子高效、準確地剪接，因此，可使隱蔽剪接最小化，使目的基因產物地最大化。
5’剪接位共有序列的第一位和第六位是多義的。5’剪接位與U1snRNA配對。所選序列使得U1 snRNA與合成5’剪接位之間形成螺旋結構的自由能最小化。
5′ss 5′CAGGUAAGU 3′ SEQ.ID.NO9|||||||||U1 RNA3′GUCCAUUCA 5′ SEQ.ID.NO10在哺乳動物中，分支位點序列非常多義。分支位點序列中除了一膨出的A殘基，均與U2 snRNA配對。此選擇序列能使U2 RNA與合成分支位點序列形成螺旋結構的自由能最小；它也和酵母前mRNA剪接必須的分支位點序列匹配。分支位點通常位于3’剪接位上游18-38個nt處；合成內含子的分支位點位于3’剪接位上游24個nt處。
RP5′UACUAAC 3′ SEQ.ID.NO11||||||U2 RNA3′AUGAU G 5′ SEQ.ID.NO123’剪接位共有序列的聚嘧啶序列還未確切闡明。若使3’剪接位功能達到最佳，至少需要5個連續的尿嘧啶殘基。這一點可以結合到合成內含子的聚嘧啶序列，而聚嘧啶序列具有7個連續的尿嘧啶殘基。
在體外，若內含子長度大于80個nt，則剪接可達到最佳。盡管許多內含子具有千上萬個堿基，大部分野生型的內含子長度是90-200個nt。在優選的方案IVS8中，合成內含子的長度是118個核苷酸，IVS8的序列(SEQ ID NO13)如下所示
5′ssPacI|BbsI PstINheIATTCTGCTCAACCTTCCTATCAGAAACTGCAGTATCTGTATTTTTGCTAGCAGTTBP 3′ss|EarI|NcoI 其中，外顯子的序列是黑體的。N代表任何堿基。共有剪接信號下加雙劃線。限制酶辨以點加上劃線，可用限制酶Bbsl準確地在5’剪接位裂解DNA，用限制酶EarI準確地在3’剪接位裂解DNA。這兩個位于合成內含子地限制點BbsI基EarI使得內含子可以被容易而準確地去除。PstI及NheI位點有助于核對克隆序列。此序列的雙鏈DNA可經成熟前長鏈寡聚核苷酸制備而得。
為了更密切地與通常包含許多內含子野生型基因結構匹配，要將合成內含子在許多個位點插入感興趣的基因。插入多個內含子后，要注意使因此而得的內在的外顯子長度小于300個核苷酸，如果內在外顯子長于300個核苷酸，就會發生外顯子跳讀。
前面對本發明的公開和描述只是敘述性和解釋性的；在不偏離本發明精神的前提下，可以對其大小、形狀、材料以及所述體系的細節作出多種改變。本發明權利要求所用術語的含義，取決于本領域之前所推定的含義，即一個特征的引用，會涵蓋一個或多個的特征，而二個特征的引用，會涵蓋二個或多個的特征，如此類推。
序列表<110>瓦倫提斯有限公司<120>治療局部缺血的基因轉移配方及方法<130>265/043<140>尚未轉讓<141>2001-10-19<150>US 60/242,277<151>2000-10-20<150>US 60/294,454<151>2001-05-29<160>13<170>PatentIn 3.1版<210>1<211>1443<212>DNA<213>人類(H0mo sapiens)<400>1atgaagcgct cggtagccgt ctggctcttg gtcgggctca gcctcggtgt cccccagttc60ggcaaaggtg atatttgtga tcccaatcca tgtgaaaatg gaggtatctg tttgccagga 120ttggctgatg gttccttttc ctgtgagtgt ccagatggct tcacagaccc caactgttct 180agtgttgtgg aggttgcatc agatgaagaa gaaccaactt cagcaggtcc ctgcactcct 240aatccatgcc ataatggagg aacctgtgaa ataagtgaag cataccgagg ggatacattc 300ataggctatg tttgtaaatg tccccgagga tttaatggga ttcactgtca gcacaacata 360aatgaatgcg aagttgagcc ttgcaaaaat ggtggaatat gtacagatct tgttgctaac 420tattcctgtg agtgcccagg cgaatttatg ggaagaaatt gtcaatacaa atgctcaggc 480ccactgggaa ttgaaggtgg aattatatca aaccagcaaa tcacagcttc ctctactcac 540cgagctcttt ttggactcca aaaatggtat ccctactatg cacgtcttaa taagaagggg 600cttataaatg cgtggacagc tgcagaaaat gacagatggc cgtggattca gataaatttg 660caaaggaaaa tgagagttac tggtgtgatt acccaaggag ccaagaggat tggaagccca 720gagtatataa aatcctacaa aattgcctac agtaatgatg gaaagacttg ggcaatgtac 780aaagtgaaag gcaccaatga agacatggtg tttcgtggaa acattgataa caacactcca 840tatgctaact ctttcacacc ccccataaaa gctcagtatg taagactcta tccccaagtt 900tgtcgaagac attgcacttt gcgaatggaa cttcttggct gtgaactgtc gggttgttct 960gagcctctgg gtatgaaatc aggacatata caagactatc agatcactgc ctccagcatc 1020
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<223>pDL1680人類Del-1表達質粒的序列<400>2ggtacggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc60cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 420aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 480aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc 540tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc 600cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ttaattaaca ggtaagtgtc 660ttcctcctgt ttccttcccc tgctattctg ctcaaccttc ctatcagaaa ctgcagtatc 720tgtatttttg ctagcagtaa tactaacggt tctttttttc tcttcacagg ccaccaagct 780tatgaagcgc tcggtagccg tctggctctt ggtcgggctc agcctcggtg tcccccagtt 840cggcaaaggt gatatttgtg atcccaatcc atgtgaaaat ggaggtatct gtttgccagg 900attggctgat ggttcctttt cctgtgagtg tccagatggc ttcacagacc ccaactgttc 960tagtgttgtg gaggttgcat cagatgaaga agaaccaact tcagcaggtc cctgcactcc 1020taatccatgc cataatggag gaacctgtga aataagtgaa gcataccgag gggatacatt 1080
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<223>密碼子優化的VEGF 165<400>3atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agcctggccc tgctgctcta cctccaccat 60gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240atgcgctgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat cggagagatg 360agcttcctgc agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420aatccctgtg ggccttgctc cgagcggaga aagcatctgt ttgtgcaaga tccgcagacg 480tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga576<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Del-1有義PCR引物<400>4tgacctccat agaagacacc gggac 25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Del-1反義PCR引物<400>5gtgatgcaac ctccacaaca ctaga 25<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>VEGF反義PCR引物<400>6ggaggggtca cagggatgc19<210>7<211>576<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<400>7atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga576<210>8<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自CMV定義UT12的5’未翻譯區域<400>8tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 60atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg 110<210>9<211>9
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成內含子的5’剪接位序列<400>9cagguaagu 9<210>10<211>9<212>RNA<213>人類(Homo sapiens)<400>10guccauuca 9<210>11<211>7<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成內含子的分支點的序列<400>11uacuaac7<210>12<211>6<212>RNA<213>人類(Homo sapiens)<400>12augaug 6<210>13<211>160<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>定義為IVS8的合成內含子，其外顯子序列由n表示，n可以是任何稍長或稍短的堿基<220>
<221>其它特征<222>(1)..(10)<223>任何堿基<220>
<221>其它特征<222>(151)..(160)<223>任何堿基
<400>13nnnnnnnnnn ttaattaaca ggtaagtgtc ttcctcctgt ttccttcccc ctgctattct 60gctcaacctt cctatcagaa actgcagtat ctgtattttt gctagcagtt atactaacgg 120ttcttttttt ctcttcacag gccaccatgg nnnnnnnnnn160
權利要求
1.一種刺激血管生成的組合物，該組合物包含一種功能上編碼Del-1多肽的核酸和一種能夠延長該核酸定域生物利用度的復合物。
2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的能延長核酸定域生物利用度的復合物是泊洛沙姆。
3.如權利要求2所述的組合物，其中，所述的泊洛沙姆在組合物中濃度約為10％(w/v)或小于10％(w/v)。
4.如權利要求3所述的組合物，其中，所述的泊洛沙姆含有80％或者更多的親水成分，其疏水部分的分子量在950-4000道爾頓之間。
5.如權利要求3所述的組合物，其中，所述的泊洛沙姆選自于具有如下特征的一組泊洛沙姆中PluronicsF38、F68、F87、F88、F108以及F127。
6.如權利要求5所述的組合物，其中，所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆188，其濃度約為1-10％(w/v)。
7.如權利要求6所述的組合物，其中，所述的泊洛沙姆188的濃度約為5％。
8.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的能延長核酸定域生物利用度的復合物是聚谷氨酸酯/鹽。
9.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的編碼Del-1多肽的核酸包括序列SEQ ID NO1。
10.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的編碼Del-1多肽的核酸還包括啟動子、5’UTR、合成內含子以及3’UTR。
11.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的核酸為質粒。
12.如權利要求11所述的組合物，其中，所述的質粒具有序列SEQ ID NO2。
13.如權利要求1所述的組合物，該組合物還進一步包括一種編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸。
14.如權利要求13所述的組合物，其中，所述的編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸包括至少5個在人體中能最佳表達的密碼子。
15.如權利要求14所述的組合物，其中，所述的編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸包括序列SEQ ID NO3。
16.如權利要求13所述的組合物，其中，所述的編碼Del-1的核酸和編碼血管內皮生長因子的核酸是分別包含在兩種獨立的質粒載體中。
17.如權利要求13所述的組合物，其中，所述的編碼Del-1的核酸和編碼血管內皮生長因子的核酸是包含于一種單一的質粒載體中。
18.如權利要求所1述的組合物，其中，所述的組合物在2-8℃℃下是穩定的。
19.如權利要求18所述的組合物，其中，所述的組合物為凍干制劑。
20.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的組合物通過逆行靜脈灌注進行轉移。
21.如權利要求20所述的組合物，其中，所述的通過逆行靜脈灌注進行轉移，是指轉移至哺乳動物的一種選自于如下一組的器官中肢體、腎臟、肝臟、大腦及心臟。
22.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的組合物是采用選自于如下的注射方法進行轉移肌肉注射、血管內注射、囊內注射。
23.如權利要求1所述的組合物，其中，所述的延長核酸定域生物利用度的復合物并不濃縮該核酸。
24.一種刺激血管生成的組合物，該組合物包含載體，該載體含有編碼血管生成蛋白的核酸序列，并復配有非濃縮的、選自于如下一組的聚合物泊洛沙姆、泊洛沙胺、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚谷氨酸酯/鹽及其共聚物。
25.如權利要求24所述的組合物，其中，所述的血管生成蛋白能與αvβ3-整連蛋白受體結合。
26.如權利要求25所述的組合物，其中，所述的血管生成蛋白是Del-1。
27.如權利要求24所述的組合物，其中，所述的血管生成蛋白是血管內皮生長因子蛋白，所述的編碼血管內皮生長因子的核酸序列包含至少5個在人體中能最佳表達的密碼子。
28.如權利要求27所述的組合物，其中，所述的對于血管內皮生長因子最佳的密碼子序列是SRQ ID NO3。
29.如權利要求24所述的組合物，其中，所述的載體是含有啟動子、5’UTR、合成內含子及3’UTR的質粒。
30.如權利要求26所述的組合物，該組合物還進一步含有編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸；對于在人體中表達，該血管內皮生長因子蛋白是密碼子優化的。
31.如權利要求24所述的組合物，其中，所述的載體為復配有泊洛沙姆的病毒載體，并能通過逆行靜脈灌注轉移至哺乳動物。
32.一種促進局部缺血組織中側支血管形成的方法，包括以下步驟將編碼血管生成蛋白的核酸以復配物的形式定域轉移至局部缺血組織，所述復配物中含有濃度小于10％(w/v)的泊洛沙姆。
33.如權利要求32所述的方法，其中，所述的復配的核酸通過直接注射的方式轉移至局部缺血組織。
34.如權利要求33所述的方法，其中，所述的局部缺血組織為心肌組織，所述復配的核酸，通過置于導流至冠狀竇的靜脈中的氣囊導管，采用逆行靜脈灌注方法進行轉移。
35.如權利要求34所述的方法，其中，所述的導流至冠狀竇的靜脈選自于心大靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)、左室后靜脈(PVLV)、室間前靜脈以及它們的任意分支。
36.一種促進哺乳動物心臟的局部缺血區域內側支血管生成的方法，包括如下步驟將功能上編碼Del-1蛋白的核酸復配為包含泊洛沙姆的組合物，所述泊洛沙姆含有80％或者更多的親水成分，而其疏水的分子量在950-4000道爾頓之間；其中，所述的組合物適于利用如下方法輸送至心肌組織通過置于引流至冠狀竇的靜脈中的氣囊導管，將復配的核酸按與正常血流相反的方向并給予足夠壓力灌注至靜脈，使得復配的核酸外滲至局部缺血組織的區域。
37.如權利要求36所述的方法，其中，所述的引流至冠狀竇的靜脈選自于心大靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)、左室后靜脈(PVLV)、前室間靜脈(AIV)及其任意分支。
38.如權利要求36所述的方法，其中所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆188，其濃度約為1-10％(w/v)。
39.如權利要求38所述的方法，其中，所述的組合物還進一步包括編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸。
40.一種促進哺乳動物心臟的局部缺血區域內側支血管生成的方法，包括如下步驟將包含功能上編碼血管生成蛋白核酸的載體復配為包含泊洛沙姆水溶液的組合物；其中，所述的復配的核酸利用如下方法輸送至心肌組織在引流至冠狀竇的靜脈中設置氣囊導管，將復配的核酸按與正常血流相反的方向并給予足夠壓力灌注至靜脈，并使復配的核酸外滲至局部缺血組織的區域。
41.如權利要求40所述的方法，其中，所述的引流至冠狀竇的靜脈選自于心大靜脈(GCV)、心中靜脈(MCV)、左室后靜脈(PVLV)、前室間靜脈(AIV)及其任意分支。
42.如權利要求40所述的方法，其中，所述的血管生成蛋白為Del-1。
43.如權利要求46所述的方法，其中，所述的組合物還進一步包括編碼血管內皮生長因子蛋白的核酸。
44.如權利要求44所述的方法，其中，所述的血管生成蛋白是血管內皮生長因子蛋白，所述的編碼血管內皮生長因子的核酸序列包含至少5個在人體中能最佳表達的密碼子。
45.如權利要求40所述的方法，其中，所述的載體為病毒。
46.一種包含質粒的藥物組合物，所述質粒包含能夠編碼Del-1的核酸序列，其中，所述的質粒復配有濃度為5％(w/v)的泊洛沙姆188和5.0mM的Tris-HCl緩沖液。
47.一種藥物組合物瓶裝制劑，其包括5毫克pDL1680、250毫克泊洛沙姆188、0.45毫克TRIS及0.70毫克的Tris-HCl。
全文摘要
本發明者發明了一種新型的轉移心臟及外周血管的生成因子的方法，此方法能夠避免目前已有的其他轉移技術所導致的毒性作用。攜帶能夠編碼內皮細胞發育位點－1序列或內皮細胞生長因子序列或者兩者兼有的載體，可用泊洛沙姆試劑或其他聚合物預先準備，然后將其轉移入局部缺血組織以及通過逆行靜脈注入心臟。
文檔編號A61K38/18GK1531422SQ01820655
公開日2004年9月22日 申請日期2001年10月19日 優先權日2000年10月20日
發明者邁克爾·E·科爾曼, 邁克爾 E 科爾曼, 麥克羅林, 菲奧納·麥克羅林, L 西塞, 王紀軍, 特 揚, 瑪麗·L·西塞, L 諾德斯特羅姆, 斯圖爾特·揚, 杰弗里·L·諾德斯特羅姆 申請人:瓦倫提斯有限公司