調節含有變構調節位點的α/β蛋白的配體結合/酶活性的物質和方法
                            
            
                            
            文檔序號：1162714閱讀：1181來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：調節含有變構調節位點的α/β蛋白的配體結合/酶活性的物質和方法
            
技術領域：
            本發明提供調節含有變構調節位點的α/β分子的結合活性的物質和方法。
            
背景技術：
            蛋白的α/β結構域超家族包括大約97種通過特殊折疊結構確定的家族。超家族中的蛋白通常具有特殊的折疊結構，如TIM桶，一種馬頭折疊，或β-α-β結構，其中的中心β折疊被α螺旋環繞，而且它是由以平行，反向平行或混合方向排列的多個β鏈結構域形成的。
            
超家族的很多成員，包括含有整聯蛋白I結構域的蛋白，含有A域結構的馮維勒布蘭德因子，和各種酶均具有開放的扭型β折疊，其可在蛋白的三維結構中引起折疊。這種折疊通常被稱作羅斯曼折疊，羅斯曼樣折疊，或二核苷酸結合折疊。很多功能不同的蛋白均含有羅斯曼折疊，而且這些蛋白可利用SCOP，SMART和CATH數據庫鑒定。原型羅斯曼折疊是在甘油醛-3-磷酸脫氫酶中的NADP結合位點發現的。
            
很多羅斯曼結構域均在中心β折疊的“上表面”含有功能性位點。整聯蛋白I結構域，Rho/Rac GTP酶，和異三聚GTP酶中的這種位點允許配位金屬離子結合。至少在某些整聯蛋白I結構域中，結合金屬離子與結合配體形成臨界的直接接觸，金屬離子結合的這個位點被稱作金屬離子依賴性粘著位點(MIDAS)。其它蛋白中的金屬離子結合位點也接近配體結合，包括，例如，GTP/GDP與GTP酶的結合，和輔因子(即，NAD和FAD)與細菌性蛋白ENR的結合。先前的工作已經顯示出至少對于某些蛋白，包括GTP酶，LFA-1[Huth等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)975231-5236(2000)]，Mac-1[Oxvig等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)962215-20(1999)]和α2[Emsley等，Cell10147-56(2000)]而言，MIDAS區的配體結合需要蛋白活性狀態和非活性狀態間的構像轉變。
            
已經詳細描述過整聯蛋白的I域結構。在其中的I域結構已經鑒定過的整聯蛋白中，一級氨基酸序列的比較顯示，總的同源性可在不同的整聯蛋白家族成員之間廣泛地變化。盡管在同源性方面存在著這種差異，但有一些殘基在許多整聯蛋白中是高度保守的。此外，目前還不清楚所觀察到的，氨基酸序列同源性的差異是否會導致各個亞基內I結構域的三級結構或異二聚體中的四級結構的巨大差異。
            
已經結晶出αM[Lee等，Cell 80631-638(1995)]，αL[Qu等，Structure 4931-942(1996)]，α1[Rich，J.Biol.Chem.，27424906-24913(1999)]，和α2[Emsley等，J.Biol.Chem.27228512-28517(1997)]的I結構域，由此詳細分析了先前推測的功能區。αM晶體結構清楚地鑒定了羅斯曼折疊，該羅斯曼折疊含有沿著中心疏水β折疊的頂部形成的配體結合裂隙，其中的β折疊被多個兩親α螺旋環繞[Dickeson等，Cell.Mol.Life.Sci.54556-566(1998)]。與先前的觀察結果一致，αM和αL的晶體I結構域也含有MIDAS區。
            
晶體αMI結構域的一般性結構觀察顯示與αL的晶體結構相互關聯。這些觀察結果清楚地表明，αL在發生配體結合之前，經歷了從非活性狀態到活性狀態的轉化。該觀察結果已經在NMR研究中加以證實，其中ICAM-1與αLI結構域的結合需要αLMIDAS區與第二區中氨基酸殘基的位置干擾，所述第二區仍然位于I結構域內，但與MIDAS區相距較遠[Huth等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)975231-5236(2000)]。
            
所述第二區中的定點誘變已經表明，其中的殘基不是ICAM-1結合位點的一部分，即，這些殘基不與配體直接相互作用，但這些殘基至少在調節ICAM-1的結合方面部分發揮作用。含有該區的氨基酸殘基被稱作I結構域變構位點(IDAS)[Id.]，并假設該區經歷和/或誘導一種可由小分子調節的，功能相關的構像轉變。如果總的四級結構是在其它蛋白的I或A結構域中保存的，那么這種位點可為調節這些蛋白的配體結合提供吸引人的目標。
            
此外，近來報道了整聯蛋白αVβ3的整個胞外區的晶體結構[Cousin，Science，2931743-1746(2001.9.7)]。所述晶體結構證實了所有整聯蛋白的β亞基均含有I結構域的預測。因為這種I結構域涉及調節整聯蛋白的功能，因此它是調節這些蛋白的配體結合的額外潛在位點。這種調節區的鑒定提供了鑒定配體結合的調節劑，即激動劑和拮抗劑的方法。這種調節劑的鑒定可提供侯選化合物，該侯選化合物可保護，并緩解各種與α/β蛋白的異常活性有關的病理狀況。
            
因此，現有技術需要確定調節α/β蛋白的方式，其具有各種功能和一級結構，以這種方式影響它們的生物活性。
            
發明概述一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。此處所用術語，分子的“α/β結構”是指一類普通的分子，它含有一種特殊的結構，其不是必須表示，例如，具有多個亞基，如α和β亞基的分子。這類普通的分子，然而，可包括具有多個亞基，如α和β亞基的分子。本發明還提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子含有二芳基化合物，所述二芳基化合物與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。另一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子選自二芳基硫化物和二芳基酰胺化合物，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
在其中一個實施方案中，本發明的方法利用含有羅斯曼折疊結構的第一分子，所述羅斯曼折疊結構含有所述變構調節位點。此處所用術語羅斯曼折疊結構包括本領域已知的羅斯曼樣折疊結構和二核苷酸折疊結構。在所述方法中，第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以321456或231456方向定位的β折疊鏈。可選擇地，第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以3214567方向定位的β折疊鏈。另一方面，所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以32145方向定位的β折疊鏈。此處所用術語定向是指β折疊的各個鏈按平行，反向平行或混合構型定位。優選該方法使用含有I域結構或A域結構的第一分子。
            
本發明還提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與
            

            
圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。本發明的變構調節位點包括“I樣結構域”或“IDAS樣結構域”，及IDAS結構域。此處所用術語I樣結構域和IDAS樣結構域是指不同于(即，可區別于)MIDAS區(在含MIDAS的分子中)的，及不同于(即，可區別于)配體，底物或輔因子結合位點的調節位點，其本身無須含有完整的I結構域，但會經歷和/或誘導一種在功能上相關的構像轉換，這種構像轉換可通過小分子調節，從而增加或降低第一分子與結合配偶體分子間的結合。另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子含有二芳基化合物，所述二芳基化合物與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子選自二芳基硫化物和二芳基酰胺化合物，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在優選實施方案中，每個方法中的第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。另一方面，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有變構調節位點，且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。另一方面，本發明的方法使用了這樣一種第一分子，即，所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以321456或231456方向定位的β折疊鏈，且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。另一方面，該方法使用了這樣一種蛋白，即，所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以3214567方向定位的β折疊鏈，且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。另一方面，該方法使用了具有羅斯曼折疊結構的第一分子，其中所述羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以32145方向定位的β折疊鏈，且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。優選第一分子含有I域結構且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。在另一優選實施方案中，第一分子含有A域結構，且第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
在本發明的方法中，調節劑可促進所述第一分子的配體結合結構域中增加所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像，一方面，第一分子與第二分子間結合的增加可使第一分子的酶活性增加。在另一實施方案中，調節劑促進所述第一分子的配體結合結構域中減小所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像，且第一分子與第二分子間結合的減小可使第一分子的酶活性降低。
            
所述方法包括使用選自表1所列蛋白及有包括I或A結構域，G蛋白，異三聚G蛋白，和微管蛋白GTP酶的其它蛋白的第一分子。優選本發明的方法使用選自表1所列蛋白的第一分子。一方面，第一分子是一種真核生物的分子。優選第一分子是一種人類的分子。另一方面，第一分子是一種原核生物的分子。在其中一個實施方案中，第一分子是一種細菌的分子。
            
更優選第一分子選自αMβ2，補體蛋白C2，補體蛋白B因子，αEβ7，α4β7，αVβ3，α4β1，αdβ2，馮維勒布蘭德因子，Rac-1，HPPK，ftsZ，和ENR。在所述方法中，第一分子是αMβ2，而結合配偶體蛋白是纖連蛋白；第一分子是αMβ2，而結合配偶體蛋白是iC3b；第一分子是αEβ7，而結合配偶體蛋白是E-鈣粘著蛋白；第一分子是α4β7，而結合配偶體蛋白是MadCAM-1；第一分子是αVβ3，而結合配偶體蛋白是玻連蛋白；第一分子是α4β1，而結合配偶體蛋白是VCAM；第一分子是αdβ2，而結合配偶體蛋白是VCAM；第一分子是馮維勒布蘭德因子，而結合配偶體蛋白是gpIb；第一分子是補體蛋白C2，而結合配偶體蛋白是補體蛋白C4b；第一分子是補體蛋白B因子，而結合配偶體蛋白是補體蛋白C3b；第一分子是Rac-1，而結合配偶體是GTP；第一分子是HPPK，而結合配偶體是ATP或HMDP；第一分子是ftsZ，而結合配偶體蛋白GTP；第一分子是ENR，而結合配偶體是NADH。
            
發明詳述一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。此處所用術語“結合配偶體分子”包括配體，底物和輔因子，其結合需影響第一分子的一種或多種生物活性。LFA-1的I結構域片段是LFA-1的多肽部分或片段(即，小于圖2所示全長LFA-1的多肽)，其含有(i)LFA-1的I結構域，或(ii)LFA-1 I結構域的一部分，其保持了LFA-1 I結構域的生物活性特征。可復制或影響LFA-1 I結構域的一種或多種生物活性的LFA-1 I結構域的合成模擬物，包括肽模擬物，也包括在此定義中。蛋白的α/β超家族包括具有β-α-β結構的那些蛋白，其中，中心β折疊結構域通過一個或多個α螺旋結構域位于折疊兩側的側翼。
            
另一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。蛋白中的羅斯曼折疊結構含有β折疊結構，其中蛋白的各β折疊結構域是按平行，反向平行或混合方向定位的。在本發明的優選方面中，第一分子的β折疊是由各個β折疊鏈組成的。各個β折疊鏈的數字命名是根據它們在第一蛋白一級氨基酸序列中的位置命名的，第一β折疊鏈與蛋白序列的氨基末端相距最近。羅斯曼折疊結構的特征還在于β折疊三維結構中的配體結合折疊，袋，或位點的存在，其通常位于β折疊結構的“頂端”。
            
另一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有β折疊和變構調節位點，該β折疊具有以321456或231456方向定位的β鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。另一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有β折疊和變構調節位點，該β折疊具有以3214567方向定位的β鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。本發明還提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有β折疊和變構調節位點，該β折疊具有以32145方向定位的β鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。第一分子中的各個β折疊的數字命名如上所述。
            
另一方面，本發明提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段或模擬物的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有I域結構，所述I域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述I域結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。現有技術已知I域結構含有大約200個氨基酸，這是通過在很多整聯蛋白中鑒定的結構域舉例說明的[見Dickeson等，Cell.Mol.LifeSci.54556-566(1998)]。
            
本發明還提供調節不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有A域結構，所述A域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述A域結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。現有技術已知A結構域基序與I結構域共有同源性，這是通過在馮維勒布蘭德因子中發現的結構域舉例說明的。
            
本發明還提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所列]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性少于約90％，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。此處所用的同一性可使用利用了缺省參數的基礎BLAST分析來計算。百分比同一性的值反映了圖1所示貫穿整個LFA-1序列I結構域的氨基酸殘基與第一分子中相同或相似長度的氨基酸殘基區之間的一對一對應關系。在本方法的另一實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構和變構調節位點，該羅斯曼折疊結構具有以321456或231456方向定位的β折疊鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構和變構調節位點，該羅斯曼折疊結構具有以3214567方向定位的β折疊鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
本發明還提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有羅斯曼折疊結構和變構調節位點，該羅斯曼折疊結構具有以32145方向定位的β折疊鏈，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述羅斯曼折疊結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
本發明還提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有I域結構，所述I域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述I域結構的配體結合結構域中從而調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
另一方面，本發明提供調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與[圖1所示]LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有A域結構，所述A域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述A域結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。在該方法的選擇性實施方案中，第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
在本發明的各種方法中，調節劑可促進所述第一分子的配體結合結構域中增加所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。可選擇性地，調節劑可促進所述第一分子的配體結合結構域中減小所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。優選該方法包括選自表1所列或此處所述其它分子的第一分子。更優選該方法使用選自αMβ2，補體蛋白C2，補體蛋白B因子，αEβ7，α4β7，αVβ3，α4β1，αdβ2，馮維勒布蘭德因子，Rac-1，HPPK，ftsZ，和ENR的第一分子。此外，優選本發明的方法和組合物使用的調節劑是二芳基化合物。更優選本發明的方法和組合物使用的調節劑選自二芳基硫化物和二芳基酰胺化合物。最優選本發明的方法和組合物使用的調節劑是二芳基硫化物。
            
在第一分子是αMβ2的方法中，優選的結合配偶體蛋白是血纖蛋白原，而優選的調節劑選自表2所列的Cmpd S，Cmpd R，Cmpd N，CmpdO，Cmpd P，Cmpd Q，Cmpd L，Cmpd V，Cmpd F，Cmpd AA，和Cmpd AC。在第一分子是αMβ2的方法中，替代的優選結合配偶體蛋白是iC3b，而優選的調節劑選自Cmpd H，Cmpd I，和Cmpd C。在第一分子是αEβ7的方法中，優選的結合配偶體蛋白是E-鈣粘著蛋白，而優選的調節劑選自此處表2所列的化合物。在第一分子是α4β7的方法中，優選的結合配偶體蛋白是MAdCAM-1。在第一分子是αVβ3的方法中，優選的結合配偶體蛋白是玻連蛋白。在第一分子是α4β1的方法中，優選的結合配偶體蛋白是VCAM。在第一分子是αdβ2的方法中，優選的結合配偶體蛋白是VCAM。在第一分子是馮維勒布蘭德因子，優選的結合配偶體蛋白是gpIb。在第一分子是補體蛋白C2的方法中，優選的結合配偶體蛋白是補體蛋白C4b。在第一分子是補體蛋白B因子的方法中，優選的結合配偶體蛋白是補體蛋白C3b。在第一分子是α1β1，α2β1，α11β1中的任何一個的方法中，優選的結合配偶體是膠原。在第一分子是α2β1的方法中，優選的結合配偶體是膠原，而優選的調節劑選自此處表2所列的化合物。在第一分子是Rac-1的方法中，優選的結合配偶體是GDP/GTP，而優選的調節劑是GTP。在第一分子是HPPK的方法中，優選的結合配偶體是ATP或HMDP。在第一分子是ftsZ的方法中，優選的結合配偶體是GTP。在第一分子是ENR的方法中，優選的結合配偶體是NADH。
            
本發明的方法包括其中的第一分子，結合配偶體分子或兩者均是分離蛋白或其結合片段的那些，它們是從天然來源或被修飾的細胞獲得的，所述被修飾的細胞可將分子表達為異源蛋白。該方法還包括使用第一分子或其結合片段，結合配偶體分子或其結合片段，兩者均是在細胞表面表達的，該細胞可將分子表達為異源蛋白，或該細胞已經被修飾表達異源蛋白。考慮了體內和體外方法。
            
預期體內方法可緩解和/或預防由于第一分子與結合配偶體分子間的異常結合活性所導致的病理狀況。例如，預期本發明的方法能夠緩解或預防的，與不適當補體激活有關的適應癥包括(i)涉及抗體/補體沉積的疾病，包括系統性紅斑狼瘡(SLE)，古德帕斯徹氏病，類風濕性關節炎，重癥肌無力，自身免疫性溶血性貧血，自身免疫性血小板減少性紫癜，和臘斯默森氏腦炎；(ii)涉及局部缺血-再灌注損傷的疾病，包括中風，心肌梗塞，心肺旁路，急性血容量減少疾病，腎衰竭，和異體移植術；(iii)中樞神經系統病變，如阿耳茨海默氏病和多發性硬化；和(iv)各種適應癥，如創傷，化學或熱損傷，及異種移植。
            
同樣，預期α1，α2，和α11的抑制劑也能用于治療癌癥。在轉移過程中，腫瘤細胞必須在進入血管和隨后溢出血管之前穿過胞外基質。穿過這些區域的遷移取決于整聯蛋白的活性。此外，已經顯示出使用單克隆抗體阻斷α1或α2的活性[Locher等，Mol.Biol.Cell.10271-282(1999)]或除去剔除小鼠中的α1活性[Pozzi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)972202-2207(2000)]可導致基質金屬蛋白酶(MMP)水平的改變。MMPs是胞外基質降解酶，已經提出其在各種類型的癌癥中發揮作用[見Nelson等，J.Clin.Oncol.181135-1149(2000)]。目前正在試驗MMPs抑制劑在治療多種類型癌癥中的臨床用途。迄今為止，MMP抑制劑還沒有像在動物模型中一樣可有效地用于人類中。通過抑制整聯蛋白活性來調節MMP的表達更為有效，這是通過分別調節不同的MMP水平，并將這種MMP調節特異性地導向于α1，α2，或α11表達細胞加以證實的。
            
更具體而言，已經證實了α11是在動脈粥樣硬化斑塊及類風濕性關節炎患者滑膜的巨噬細胞的亞型泡沫狀巨噬細胞上表達的。在源于巨噬細胞的非活化單核細胞中沒有見到表達。α11/配體結合相互作用的抑制劑可因此用于減少與各種炎性過程有關的巨噬細胞的遷移和/或信號傳遞事件。因此，α11抑制劑代表了用于治療炎性疾病，包括動脈粥樣硬化和類風濕性關節炎的有效療法。
            
同樣，α1和α2整聯蛋白已經顯示出可在刺激之后，在某些細胞(包括T細胞和單核細胞)上被上調。而且已經證實了使用單克隆抗體阻斷α1或α2與它們的配體間的相互作用可抑制延遲型過敏，接觸過敏及關節炎的小鼠模型中的炎癥應答[deFougerolles等，J.Clin.Invest.105721-729(2000)]。α1和α2的拮抗劑可通過各種機理來抑制炎癥，包括抑制細胞的遷移，細胞的增殖和炎性介質如基質金屬蛋白酶3，腫瘤壞死因子α和白介素-1的產生。因此，α1和α2締合(配體結合)的小分子抑制劑或拮抗劑，即變構效應分子，可用于治療炎性疾病，如關節炎，纖維化疾病和癌癥。
            
纖維化疾病狀態在于某些細胞類型被不適當地激活，從而產生過量的纖維性胞外基質。據信纖維性胞外基質形成的機理至少部分與α/β蛋白的活性有關。因此，通過抑制α/β蛋白，本發明提供用于治療和預防各種纖維化疾病的方法和組合物，所述纖維化疾病包括硬皮病(硬斑病，泛發性硬斑病，線形硬皮病)，疤痕疙瘩，肥大性疤痕，結節性筋膜炎，嗜酸性筋膜炎，杜普伊特倫氏攣縮，腎纖維化，肺纖維化，化療/放療誘發的肺纖維化，動脈粥樣硬化斑塊，炎性腸疾病，克羅恩氏病，關節炎，侵入性乳腺癌硬性纖維組織生成，皮膚纖維瘤，內皮細胞表達，血管脂肪瘤，血管平滑肌瘤，肉樣瘤病，肝硬化，原發間質性肺病，原發性肺纖維化(4種病理類型)，伴有肺綜合征的膠原血管疾病，隱原性組織肺炎，古德帕斯徹氏綜合征，韋格內氏肉芽腫病，嗜曙紅細胞肉芽腫病，醫原性肺疾病，肺塵埃沉著病(石棉沉著病，石末沉著病)，過敏性pneumonitides(農民肺，鳥愛好者肺等)，間質性肺纖維化，化學性肺炎，過敏性肺炎等。
            
就細菌蛋白而言，ENR已經成為抗結核藥物的靶和廣譜殺蟲劑三氯生的靶。因此，小分子可被用作抗結核的藥物。此外，ENR和DapB抑制劑的活性譜可作為革蘭氏陰性抑制劑。此外，由于ERA-GTP酶在細菌中高度保守，因此抑制劑可用于抗廣譜的細菌，這取決于滲透性。此外，各種細菌蛋白的抑制劑可用于治療與革蘭氏陰性菌有關的細菌性疾病和不明細菌性病原體的感染。
            
其它化學療法，如磺胺，可通過拮抗從頭的葉酸鹽生物合成途徑來抑制細菌的生長[Mandell和Petri，磺胺，三甲氧芐二氨嘧啶-新諾明，喹諾酮，和用于泌尿道感染的藥劑，The Pharmacological Basisof Therapeutics(Goodman和Gilman eds.，1996)]。抗葉酸鹽療法的主要目的是減少還原葉酸鹽的胞內沉積，從而抑制由于胸腺嘧啶核苷水平不足所導致的DNA復制[Hitchings和Baccanari，作為抗微生物劑的葉酸鹽拮抗劑的設計與合成，Folate Antagonists asTherapeutic Agents(1984)]。
            
酶6-羥甲基-7，8-二氫蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)可催化從頭的葉酸鹽生物合成途徑中焦磷酸鹽從ATP到6-羥基-7，8-二氫蝶呤(HMDP)的轉移[Richey和Brown，J.Biol.Chem.，2441582-1592(1969)]。HPPK可在革蘭氏陰性和革蘭氏陰性細菌，真菌，和原生動物中表達，但不在高等真核動物中表達，而且HPPK代表了開發具有抗-葉酸鹽活性的抗生素的重要目標。通過抑制HPPK，本發明還可提供治療和預防各種細菌和真菌感染的方法和組合物。
            
FtsZ是一種參與細胞分裂的關鍵的細菌基因產物。FtsZ可結合并水解GTP，并且當與GTP結合時，它可形成長的線形聚合物。ftsZ的GTP-依賴性聚合作用與其在細菌細胞分裂中的功能有關。在分離過程中，ftsZ形成一個環，從而確定了細胞分裂的平面。缺乏ftsZ的細胞不能經歷分離，不會分裂和死亡。FtsZ在細菌界高度保守(大約60％)。因此，通過抑制ftsZ，本發明的組合物和方法提供了廣譜抗生素。ftsZ的原子結構顯示出它是一種α/β蛋白[Nogales等，(1998)Nature Structural Biology 5451-458]。
            
vWF結合的調節劑可用于治療血栓形成性血管疾病，如心肌梗塞(MI)和血栓形成性中風。vWF A1-結構域結合拮抗劑的快速給藥可降低高危患者，如具有不穩定心絞痛，或隨后的PTCA或放置支架的患者的冠狀血管堵塞危險。近來，已經有很多gpIIb/IIIa拮抗劑被批準在臨床上用于這些情況(ReoPro，Itrafiban，sibrafiban)。雖然這些藥劑是有效的，但它們的使用會伴有出血，從而限制了它們的有效給藥。如果限制了A1-結構域抑制劑的出血副作用，那么可將它長期用于有血管堵塞危險的個體中。這些個體包括心絞痛，跛行的患者，和那些有MI或中風史的那些。vWF代謝的異常是血栓形成性血小板減少性紫癜中堵塞性血栓的原因，暗示了A1結構域抑制劑也可用于這種情況。
            
Rac1，Rac2和Rac3是小分子量(大約22-25kDa)GTP酶的Ras超家族成員，其中有很多都是α/β蛋白[Edwards和Perkins，FEBSLett 358283(1995)；De Vos等，Science 239888(1988)；Worthylake等，Nature 408682(2000)]。一級氨基酸序列的比較表明Rac蛋白的總同源性大約88％-大約92％相同。已知Rac1和Rac2蛋白在細胞的存活，增殖，轉移和活性氧種類(ROS)的產生中起著決定性的作用[Symons，Curr.Opin.in Biotech.，6668(1995)；和Scita，EMBOJ.，19(11)2393(2000)]。由于Rac蛋白在控制細胞增殖中的重要作用，Rac鳥嘌呤核苷酸交換反應的拮抗劑，特別是，在Tiam1存在情況下阻礙把Rac1的GDP換為GTP的小分子是本發明方法和組合物的重要目標。
            
根據上面所述的適應癥，本發明進一步提供了減輕或預防由于不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的異常結合所引起的疾病的方法，其中所述第一分子是一種選自表1所列蛋白的α/β蛋白，該方法包括在個體需要時，給予其有效量的調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的調節劑。此處所用術語有效量是指所足以達到預期目的量的調節劑的給藥。更具體而言，“治療有效量”是指有效治療或防止受治療者發展，減輕受治療者已有癥狀的量。有效量的確定對于本領域的那些技術人員而言是熟知的，特別是根據此處提供的詳細公開。
            
一方面，本發明提供其中的α/β蛋白含有羅斯曼折疊的治療方法。另一方面，提供了目標蛋白中的羅斯曼折疊含有5，6或7個β鏈，它們組成中心β折疊結構的治療方法。當羅斯曼折疊含有5個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的32145。當羅斯曼折疊含有6個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的321456或231456。當羅斯曼折疊含有7個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的3214567。本發明的治療方法包括其中第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％的那些。優選第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。本發明這方面所述的序列同一性是使用，例如，具有缺省參數的基礎BLAST檢索分析計算的。
            
本發明還提供鑒定不是LFA-1或其I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合的調節劑的方法，其中所述第一分子是一種選自表1所列蛋白的α/β蛋白，該方法包括在有和沒有試驗化合物存在的情況下，測量第一分子與結合配偶體分子間的結合的步驟，并對有和沒有試驗化合物存在情況下的結合進行比較，當檢測到第一分子與結合配偶體分子間的結合發生改變時，鑒定作為結合調節劑的試驗化合物。一方面，本發明提供其中的α/β蛋白含有羅斯曼折疊的方法。另一方面，提供了目標蛋白中的羅斯曼折疊含有5，6或7個β鏈，它們組成中心β折疊結構的方法。當羅斯曼折疊含有5個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的32145。當羅斯曼折疊含有6個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的321456或231456。當羅斯曼折疊含有7個β鏈時，優選各鏈的定位是上述的3214567。本發明的方法包括其中所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％的那些。優選第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。本發明這方面所述的序列同一性是使用，例如，具有缺省參數的基礎BLAST檢索分析計算的。
            
本發明還提供不是LFA-1或其I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合的調節劑，其中所述第一分子是一種選自表1所列蛋白的α/β蛋白。一方面，調節劑是影響含有羅斯曼折疊的α/β蛋白的結合的那些。另一方面，提供了當目標蛋白中的羅斯曼折疊含有5，6或7個β鏈，它們組成中心β折疊結構時，影響結合的調節劑。當羅斯曼折疊含有5個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的32145。當羅斯曼折疊含有6個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的321456或231456。當羅斯曼折疊含有7個β鏈時，優選各鏈的定位是如上所述的3214567。還提供了第一分子的調節劑，其中第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％。優選第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。本發明這方面所述的序列同一性是使用，例如，具有缺省參數的基礎BLAST檢索分析計算的。
            
本發明還提供含有調節劑的組合物。優選的組合物是藥物組合物。本發明的藥物組合物含有一種或多種本發明的調節劑，優選還含有一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。此處所用術語“藥學上可接受的載體”是指適合與受體動物，優選哺乳動物，更優選人類接觸的化合物，而且它的毒性，刺激性，或變態反應與合理的效益/危險比相稱，并可有效用于它們預期的用途。
            
本發明還提供以前體藥物形式存在的調節劑。此處所用術語“前體藥物”是指通過水解，在體內被迅速轉化成母體，或活性調節劑化合物的化合物。詳盡的討論在Higuchi等，作為新的遞送系統的前體藥物，A.C.S.D.Symposium Series的第14卷，和Roche(ed)，藥物設計中的生物可逆載體，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中提供，它們都引入此處作為參考。前體藥物的設計通常在Hardma等，(Eds.)，Goodman & Gilman的治療的藥理學基礎，第9版，New York，New York(1996)，第11-16頁中討論。簡單地說，給藥之后，藥物自身體消除或某些進行生物轉化，藥物的生物活性由此被降低或被消除。選擇性地，生物轉化過程可產生代謝副產物，其活性與最初給予的藥物相比更高或相等。隨著對這些生物轉化過程理解的加深，設計了所謂的“前體藥物”，其在生物轉化過程之后，以改變過的狀態在生理學方面更有活性。因此，前體藥物在藥理學方面是非活性的化合物，它被轉化成生物活性的代謝物。在某些形式中，前體藥物是通過酯鍵或酰胺鍵的水解，有時是通過在前體藥物上引入官能團或使前體藥物上的官能團暴露出來，而產生藥理學活性的。如此修飾的藥物還可與內生化合物反應，形成水溶性綴合物，其可進一步增加化合物的藥理學性，例如，提高循環半衰期。
            
作為另外一種選擇，前體藥物還可被設計成在官能團上經歷共價修飾，例如，與葡萄糖醛酸硫酸酯，谷胱甘肽，氨基酸，或醋酸酯。所得綴合物可以是非活性的，并在尿中排泄，或比母體化合物更有效。高分子量的綴合物還可能被排泄到膽汁中，經過酶裂解，釋放回循環中，由此有效地提高最初所給予化合物的生物半衰期。
            
本發明的化合物可以立體異構體的形態存在，其中存在不對稱中心或手性中心。根據手性碳原子周圍取代基的排列，可將立體異構體標記為“S”或“R”。本發明包括了立體異構體的混合物。立體異構體包括對映異構體，非對映異構體，及其混合物。本發明化合物的各個立體異構體可從市售的含有不對稱或手性中心的原材料合成制備，或通過制備外消旋混合物，接著通過本領域熟知的分離或拆分技術制備。拆分的方法包括(1)使對映異構體的混合物與手性助劑連接，通過再結晶或色譜法分離所得的混合物，并從助劑中釋放旋光純的產物；(2)使用旋光拆解試劑形成鹽，和(3)在手性色譜柱上直接分離旋光對映異構體的混合物。
            
本發明的藥物組合物可通過任何適宜的途徑給予人類和其它動物。例如，所述組合物可口服，直腸，腸胃外，腦池內，陰道內，腹膜內，局部(如通過粉劑，軟膏劑，或滴劑)，經頰或鼻內給藥。此處所用術語“腸胃外”給藥是指給藥的方式，包括靜脈內，動脈內，肌肉內，腹膜內，胸骨內，鞘內，皮下和關節內注射及輸注。
            
本發明用于腸胃外注射的藥物組合物包括藥學上可接受的無菌水溶液或非水溶液，分散液，混懸液或乳狀液，在使用之前，用于重新構成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體，稀釋劑，溶劑或賦形劑的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，及其適宜的混合物，植物油(如橄欖油)，和可注射的有機酯，如油酸乙酯。通過使用包衣材料如卵磷脂，通過維持分散液所需的粒度，通過使用表面活性劑可維持適宜的流動性。
            
這些組合物還可含有輔助劑如防腐劑，濕潤劑，乳化劑，和分散劑。微生物作用的預防可通過加入各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯類，三氯叔丁醇，苯酚山梨酸等達到。它還可包括等滲劑，如糖，氯化鈉等。可注射藥物形式的持續吸收可通過加入延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠達到。
            
在某些情況下，為了延長藥物的作用，希望能夠減慢藥物從皮下或肌肉內注射的吸收。這種結果可使用具有較差水溶性的無定形材料或結晶的液體混懸液達到。藥物的吸收速率取決于它的溶解速率，其可能取決于結晶的大小和結晶的形式。選擇性地，腸胃外給藥的藥物的延遲吸收是通過將藥物溶解或懸浮在油性賦形劑中達到的。
            
可注射的儲存形式是通過在生物可降解的聚合物，如聚交酯-聚乙交酯中形成微膠囊基質而制成的。根據藥物與聚合物的比例及所用特殊聚合物的性質，可控制藥物釋放的速率。其它生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。儲存可注射的制劑還可通過將藥物包埋到與機體組織相容的脂質體或微乳劑中制備。
            
可注射制劑可通過留存細菌或病毒的過濾器過濾，或通過加入無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌，其中所述無菌固體組合物形式的滅菌劑可在使用前溶解或分散在無菌水或其它無菌可注射介質中。
            
口服給藥的固體劑型包括膠囊劑，片劑，丸劑，粉劑和顆粒劑。在這種固體劑型中，活性化合物與至少一種惰性的，藥學上可接受的賦形劑或載體，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或(a)充填劑或膨脹劑，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖醇，和硅酸，(b)粘合劑如羧甲基纖維素，樹膠(例如，藻酸鹽，阿拉伯膠)明膠，聚乙烯吡咯烷酮，和蔗糖，(c)濕潤劑如甘油，(d)崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽，和碳酸鈉，(e)溶液阻滯劑如石蠟，(f)吸收促進劑如季銨化合物，(g)濕潤劑如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯，(h)吸收劑如高嶺土和膨潤土，(i)潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，十二烷基硫酸鈉，及其混合物進行混合。在膠囊劑，片劑和丸劑中，劑型還可含有緩沖劑。
            
使用這種賦形劑如乳糖或奶糖及高分子量的聚乙二醇等，還可使相似類型的固體組合物用作軟-和硬-填充明膠膠囊中的充填劑。
            
片劑，糖衣丸，膠囊劑，丸劑，和顆粒劑的固體劑型還可使用藥物制劑領域熟知的包衣層及殼體，如腸溶衣和其它包衣層來制備。它們可選擇性地含有不透明劑，而且它們還可以是僅僅釋放活性成分的組合物，或優選以延遲形式選擇性地在腸道部分釋放活性成分的組合物。代表性的材料包括具有pH靈敏溶解性的聚合物，包括市售材料如Eudragit。所用包埋組合物的例子包括聚合物和蠟。
            
如果適合，活性化合物還可以是具有一種或多種上述賦形劑的微膠囊形式。
            
口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳狀液，溶液，混懸液，糖漿劑和酏劑。除了活性化合物外，液體劑型可含有本領域通常所用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑如乙醇，異丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸芐酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(特別是，棉籽，花生，玉米，胚芽，橄欖，蓖麻，和芝麻油)，甘油，四氫糠醇，聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。
            
除了惰性稀釋劑外，口服組合物還可含有佐劑，如濕潤劑，乳化劑和混懸劑，甜味劑，調味劑和香味劑。
            
除了活性化合物外，混懸液還可含有混懸劑如乙氧基化的異十八烷醇，聚氧化乙烯山梨糖醇和脫水山梨糖醇酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂，和黃芪膠及其混合物。
            
直腸或陰道給藥的組合物優選栓劑，它可通過將本發明化合物與適宜的非刺激性賦形劑或載體，如椰子油，聚乙二醇或栓劑用蠟混合而制備，其在室溫時是固體，但在體溫時是液體。因此，這種載體可在直腸或陰道中熔化，釋放活性化合物。
            
本發明的化合物還可以脂質體的形式給藥。正如本領域已知的，脂質體通常來源于磷脂或其它脂類物質。脂質體是由分散在含水介質中的單層或多層水合液晶形成的。任何無毒的，生理上可接受和可代謝的脂類都能夠形成所用的脂質體。本發明脂質體形式的組合物除了本發明的化合物外，還可含有穩定劑，防腐劑，賦形劑等。優選的脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，它們可以是天然的及合成的。形成脂質體的方法是本領域已知的。見，例如，Prescott，Ed.，細胞生物學的方法，第XIV卷，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，p.33 et seq.。
            
本發明的化合物可以無機酸或有機酸的藥學上可接受鹽的形式使用。“藥學上可接受的鹽”包括正確醫療判斷范圍內的那些鹽，它們適于與人類和低等動物的組織接觸，而且沒有不適當的毒性，刺激性，變態反應等，并與合理的效益/危險比相稱。藥學上可接受的鹽是本領域熟知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，661(1977)中詳細描述的藥學上可接受的鹽，其全部引入此處作為參考。鹽可在本發明化合物最后的分離和純化過程中現場制備，或通過使游離堿與適宜的酸反應而分離。代表性的酸加成鹽包括，但不限制于醋酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，檸檬酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，二葡糖酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，延胡索酸鹽，氫氯酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽(異硫代硫酸鹽)，乳酸鹽，順丁烯二酸鹽，甲磺酸鹽，煙酸鹽，2-萘磺酸鹽，乙二酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酯酸鹽，過硫酸鹽，3-苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，丁二酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，磷酸鹽，谷氨酸鹽，碳酸氫鹽，對-甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。可用于形成藥學上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括無機酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸和磷酸，及這種有機酸如乙二酸，順丁烯二酸，丁二酸和檸檬酸。
            
堿性含氮基團可使用低級烷基的鹵化物，包括甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物；二烷基硫酸鹽如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸鹽；長鏈鹵化物如癸基，十二烷基，十四烷基和硬脂酰基的氯化物，溴化物和碘化物；芳烷基的鹵化物如苯甲基和苯乙基的溴化物等季銨化。由此獲得水或油-溶性的或可分散的產物。
            
堿加成鹽可在本發明化合物最后的分離和純化過程中，通過使含羧酸的部分與適宜的堿，如藥學上可接受金屬離子的氫氧化物，碳酸鹽或碳酸氫鹽反應，或與氨反應，或與有機的伯，仲，叔胺反應而現場制備。藥學上可接受的堿加成鹽包括，但不限制于，基于堿金屬或堿土金屬的陽離子，如鋰，鈉，鉀，鈣，鎂和鋁鹽等，和無毒的季銨，和胺陽離子，包括銨，四甲銨，四乙銨，甲胺，二甲胺，三甲胺，三乙胺，二乙胺，乙胺等。其它用于形成堿加成鹽的代表性有機胺包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌啶，哌嗪等。
            
本發明化合物局部給藥的劑型包括粉劑，噴霧劑，軟膏劑和吸入劑。活性化合物是在無菌條件下與藥學上可接受的載體和任何所需的防腐劑，緩沖劑或推進劑混合的。眼用制劑，眼藥膏，粉劑和溶液也包括在本發明的范圍之內。
            
根據特殊的患者，組合物及給藥方式改變本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平，從而獲得可有效達到所期望治療反應的活性化合物量。所選擇的劑量水平取決于特定化合物的活性，給藥途徑，所治療疾病的嚴重程度，所治療患者的狀況和先前的病史。然而，在本領域技術人員的范圍內，化合物的起始劑量水平比獲得期望治療效果所需的要低，并逐漸增加劑量直到獲得所期望的效果。
            
通常以每天約0.1-約1000mg，約0.5-約500mg，約1-約250mg，約1.5-約100mg，優選約5-約20mg活性化合物/kg體重口服或靜脈內給予哺乳動物患者。如果需要，為了進行給藥，可將有效的每日劑量分成多個劑量，例如每天給予2-4個單獨的劑量。
            
研究了本發明化合物的功效，并通過參數，如EC50和LC50進行了描述。此處所用術語EC50是指在基于細胞的測定法中，抑制50％活性所需的有效濃度。此處所用術語IC50是指在生化測定法中，抑制50％蛋白活性所需的濃度。此處所用術語LD50是指在毒性測定法中，在規定的時間段內殺死50％細胞所需的化合物濃度。
            
表1含I或A結構域的蛋白，G蛋白，異三聚G蛋白，和微管蛋白GTP酶1.TIM β/α-桶(23)含有平行的β-折疊桶，封閉的；n＝8，S＝8；鏈的順序12345678前6個超家族具有相似的磷酸結合位點1.磷酸丙糖異構酶(TIM)(1)1.磷酸丙糖異構酶(TIM)(12)2.磷酸核酮糖結合桶(4)1.組氨酸生物合成酶(2)桶折疊內基因復制的結構證據2.D-核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶(1)3.乳清酸核苷5’-單磷酸脫羧酶(OMP脫羧酶)(4)4.色氨酸生物合成酶(6)3.磷酸硫胺素合酶(1)1.磷酸硫胺素合酶(1)
            
4.FMN-連接的氧化還原酶(1)1.FMN-連接的氧化還原酶(9)5.單磷酸肌苷脫氫酶(IMPDH)(1)在‘共同的’磷酸結合位點中結合的底物磷酸部分1.單磷酸肌苷脫氫酶(IMPDH)(4)6.PLP-結合桶(2)正則折疊的循環交替變換用α螺旋開始，并用β鏈結束1.丙氨酸消旋酶樣，N-末端結構域(4)2.“假擬”蛋白yb1036c(1)7.NAD(P)-連接的氧化還原酶(1)1.醛-酮還原酶(NADP)(7)共有折疊包被整個蛋白結構8.(轉)糖苷酶(7)1.α-淀粉酶，N-末端結構域(22)共有折疊結構域是被小的鈣-結合亞結構域間斷的該結構域后為家族共有的全β-結構域2.β-淀粉酶(4)3.β-glycanase(21)由許多序列家族組成4.葡基水解酶的家族1(8)5.II型殼多糖酶(9)糖基化酶家族186.細菌殼二糖酶(β-N-乙酰氨基己醣苷酶)，催化結構域(1)葡基水解酶家族207.β-D-葡聚糖外水解酶，N-末端結構域(1)9.金屬-依賴性水解酶(3)β-折疊桶是類似旋扭的，并由C-末端螺旋加帽，具有桶內結合的過渡金屬離子1.腺苷脫氨酶(ADA)(1)2.脲酶的α-亞基，催化結構域(2)3.磷酸三酯酶樣(2)10.醛縮酶(4)
            
共有折疊包被整個蛋白結構1.I類醛縮酶(14)催化賴氨酸形成具有底物的席夫堿中間體2.II類醛縮酶(1)金屬-依賴性3.5-氨基乙酰丙酸鹽脫水酶，ALAD(膽色素原合酶)(3)I類和II類醛縮酶的雜交體4.I類DAHP合成酶(2)11.烯醇化酶C-末端結構域樣(2)在桶內的保守位點結合金屬離子(鎂或錳)N-末端α+β結構域對于該家族是共有的1.烯醇化酶(2)2.D-葡糖二酸鹽脫水酶樣(6)12.磷酸烯醇丙酮酸/丙酮酸結構域(6)1.丙酮酸激酶(5)2.丙酮酸磷酸二激酶，C-末端結構域(1)3.磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(1)4.磷酸烯醇丙酮酸變位酶(1)形成交換二聚物5.2-脫氫-3-脫氧-半乳糖二酸醛縮酶(1)形成交換二聚物；含有PK型金屬結合位點6.異檸檬酸鹽裂合酶(2)形成交換二聚物；用額外的亞結構域加工13.蘋果酸鹽合酶G(1)1.蘋果酸鹽合酶G(1)14.RuBisCo，C-末端結構域(1)1.RuBisCo，大亞基，C-末端結構域(6)N-末端結構域是α+β15.木糖異構酶樣(3)不同的家族共有相似但不完全相同的金屬結合位點1.內切核酸酶IV(1)2.L-鼠李糖異構酶(1)
            
3.木糖異構酶(12)16.細菌熒光素酶樣(3)由明顯相關的某些不同折疊的家族組成1.細菌熒光素酶(鏈烷醛單加氧酶)(1)典型的(α/β)8-桶折疊2.非-熒光黃素蛋白(1uxF，FP390)(2)具有7個鏈的混合β折疊的不完全β/α桶3.輔酶F420依賴性四氫橋亞甲基蝶呤還原酶(1)17.喹啉酸磷酸核糖基轉移酶，C-末端結構域(1)具有7個鏈的平行β折疊的不完全β/α桶1.喹啉酸磷酸核糖基轉移酶，C-末端結構域(2)18.磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶C(PI-PLC)(2)1.哺乳動物的PLC(1)2.細菌的PLC(2)19.鈷胺素(維生素B12)-依賴性酶(3)1.甲基丙二酰基-CoA變位酶，N-末端(CoA-結合)結構域(1)2.谷氨酸變位酶，大亞基(1)3.二醇脫水酶，α亞基(1)20.tRNA-鳥嘌呤轉糖基酶(1)1.tRNA-鳥嘌呤轉糖基酶(1)21.二氫喋酸合成酶樣(2)1.二氫喋酸合成酶(3)2.甲基四氫葉酸類咕啉/鐵-硫蛋白甲基轉移酶MetR(1)22.尿卟啉原脫羧酶，UROD(1)1.尿卟啉原脫羧酶，UROD(1)23.亞甲基四氫葉酸還原酶(1)1.亞甲基四氫葉酸還原酶(1)2.NAD(P)-結合羅斯曼折疊結構域(1)核心3層，a/b/a；6個鏈的平行β-折疊，順序321456其核苷酸結合方式與下兩個折疊/超家族相似1.NAD(P)-結合羅斯曼-折疊結構域(8)1.醇/葡萄糖脫氫酶，C-末端結構域(9)
            
N-末端全β結構域確定家族2.酪氨酸-依賴性氧化還原酶(27)也稱為短鏈脫氫酶且SDR家族的平行β折疊是通過第7個鏈延伸的，順序3214567；鏈6和7之間左手交叉連接3.甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣，N-末端結構域(20)家族成員還共有C-末端結構域中的α+β折疊4.甲酸/甘油酸脫氫酶，NAD-結構域(9)該結構域間斷確定家族的其它結構域5.乳酸&蘋果酸脫氫酶，N-末端結構域(16)6.6-磷酸葡糖酸脫氫酶樣，N-末端結構域(8)β折疊擴展至8個鏈，順序32145678；鏈7&8與其余的反向平行C-末端結構域也表現出某些相似性7.氨基酸脫氫酶樣，C-末端結構域(11)8.琥珀酰-CoA合成酶，α-鏈，N-末端(CoA-結合)結構域(2)3.FAD/NAD(P)-結合結構域(1)核心3層，b/b/a；5個鏈的中心平行β-折疊，順序32145；3個鏈的頂部反向平行的β-折疊，蜿蜒曲折1.FAD/NAD(P)-結合結構域(5)1.腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶的C-末端結構域樣(3)2.FAD-連接的還原酶，N-末端結構域(10)C-末端結構域是家族共有的α+β3.鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑，GDI(1)與兩個結構域中的FAD-連接還原酶相似，但不結合FAD4.琥珀酸脫氫酶/延胡索酸還原酶N-末端結構域(5)5.FAD/NAD-連接的還原酶，N-末端和中心結構域(17)復制兩個結構域具有相似的折疊和功能家族的絕大多數成員均含有共有的C-末端α+β結構域4.核苷酸-結合結構域(1)3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序32145；羅斯曼樣1.核苷酸-結合結構域(2)該超家族共有核苷酸-結合位點，并提供羅斯曼折疊NAD(P)-結合與FAD/NAD(P)-結合結構域間的連接1.腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶的N-末端結構域樣(3)2.D-氨基酸氧化酶，N-末端結構域(2)該家族可能與FAD-連接的還原酶有關，并與它們共有C-末端結構域折疊5.MurD的N-末端結構域(UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸D-谷氨酸連接酶)(1)3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序32145；不完全的羅斯曼樣折疊；結合UDP1.MurD的N-末端結構域(UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸D-谷氨酸連接酶)(1)1.MurD的N-末端結構域(UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸D-谷氨酸連接酶)(1)6.纖維素酶(1)β/α桶的變體；平行的β-折疊桶，封閉的，n＝7，S＝8；鏈的順序12345671.纖維素酶(1)1.纖維素酶(4)7.PFL樣甘氨酰基酶(1)含有桶，封閉的；n＝10，S＝10；適應桶內的發夾環1.PFL樣甘氨酰基酶(3)重復N末端和C-末端部分具有相似的拓撲結構1.甲酸丙酮酸裂解酶，PFL(1)2.核糖核苷酸還原酶的R1亞基，C-末端結構域(1)3.III類厭氧核糖核苷酸三磷酸還原酶NRDD亞基(1)8.“轉環”β/β/α結構域(5)3層b/b/a；中心折疊是平行的，另一個是反向平行的；拓撲結構存在著一些變化該結構域被認為在所有已知含有它的蛋白中是可移動的1.磷酸組氨酸結構域(2)含有桶，封閉的，n＝7，S＝101.磷酸丙酮酸二激酶，中心結構域(1)
            
2.PEP的酶I的N-末端結構域糖磷酸轉移酶系統(1)2.烏頭酸酶，C-末端結構域(1)含有混合的β-折疊桶，封閉的，n＝7，S＝101.烏頭酸酶，C-末端結構域(2)3.氨基甲酰基磷酸合成酶，小亞基N-末端結構域(1)1.氨基甲酰基磷酸合成酶，小亞基N-末端結構域(1)4.轉鐵蛋白受體外結構域，頂端結構域(1)1.轉鐵蛋白受體外結構域，頂端結構域(1)5.GroEL樣陪伴蛋白，頂端結構域(2)1.GroEL(2)2.II組陪伴蛋白(CCT，TRIC)(1)9.芽孢桿菌RNA酶抑制劑樣(2)2層，a/b；3個鏈的平行β折疊，順序1231.芽孢桿菌RNA酶抑制劑(1)1.芽孢桿菌RNA酶抑制劑(1)2.核糖體蛋白L32e(1)1.核糖體蛋白L32e(1)含有到共有折疊的不規則N-末端延伸10.富含亮氨酸的重復，LRR(右手β-α超螺旋)(2)2彎曲層，a/b；平行的β-折疊；順序1234…N1.RNI樣(3)由相似重復組成的規則結構1.核糖核酸酶抑制劑(2)2.Rnalp(1)3.細胞周期蛋白A/CDK2-相關的p19，Skp2(1)2.L結構域樣(5)由可變重復組成的不太規則的結構1.Internalin B LRR結構域(1)2.Rab香葉草基香葉草基轉移酶α-亞基，C-末端結構域(1)3.mRNA輸出因子tap(1)4.U2A’樣(1)
            
重復由5-6個部分不規則的重復組成5.1型胰島素樣生長因子受體的L1和L2結構域(1)11.外臂動力蛋白輕鏈1(1)(β-β-α)n超螺旋1.外臂動力蛋白輕鏈1(1)1.外臂動力蛋白輕鏈1(1)12.核糖體蛋白L15p和L18e(1)核心不規則的(β-β-α)n超螺旋的3次回轉1.核糖體蛋白L15p和L18e(1)1.核糖體蛋白L15p和L18e(2)13.SpαIIaa樣(2)核心(β-α)n超螺旋的4次回轉1.磷脂酰肌醇轉移蛋白secl 4p的C-末端結構域(1)1.磷脂酰肌醇轉移蛋白secl 4p的C-末端結構域(1)2.SpoIIaa(1)1.SpoIIaa(1)14.ClpP/巴豆酸酶(1)核心(β-β-α)n超螺旋的4次回轉1.ClpP/巴豆酸酶(3)1.Clp蛋白酶，ClpP亞基(1)2.光系II D1 C-末端加工蛋白酶，催化結構域(1)3.巴豆酸酶樣(4)15.BRCT結構域(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β折疊，順序21341.BRCT結構域(2)1.DNA-修復蛋白XRCC1(1)2.NAD+依賴性DNA連接酶，結構域4(1)16.2，4-二氧四氫喋啶合酶/核黃素合酶復合物的β-亞基(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序21341.2，4-二氧四氫喋啶合酶/核黃素合酶復合物的β-亞基(1)1.2，4-二氧四氫喋啶合酶/核黃素合酶復合物的β-亞基(4)
            
17.Caspase樣(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序21341.Caspase樣(2)在單一結構域中折疊的異二聚蛋白1.Caspase(3)2.Gingipain R(RgpB)，N-末端結構域(1)18.DNA糖基化酶(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序21341.DNA糖基化酶(2)1.尿嘧啶-DNA糖基化酶(3)2.GT/U錯配-特異性DNA糖基化酶(1)19.丙二酰-CoA ACP轉酰酶的催化結構域(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序21341.丙二酰-CoA ACP轉酰酶的催化結構域(1)1.丙二酰-CoA ACP轉酰酶的催化結構域(1)20.起始因子IF2/eIF5b，結構域3(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序21341.起始因子IF2/eIF5b，結構域3(1)1.起始因子IF2/eIF5b，結構域3(1)21.核糖體蛋白L13(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序32141.核糖體蛋白L13(1)1.核糖體蛋白L13(1)22.核糖體蛋白L4(1)3層，a/b/a；核心4個鏈的平行β-折疊，順序14231.核糖體蛋白L4(1)1.核糖體蛋白L4(2)23.黃素氧還蛋白樣(16)3層，a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序213451.CheY樣(3)1.CheY-相關的(11)2.乙烯受體的接收結構域(1)
            
3.酰胺酶操縱子AmiR的負調節劑(1)2.Toll/白介素受體TIR結構域(1)1.Toll/白介素受體TIR結構域(2)3.假擬蛋白MTH538(1)1.假擬蛋白MTH538(1)4.琥珀酰-CoA合成酶結構域(1)1.琥珀酰-CoA合成酶結構域(4)含有額外的N-末端鏈“0”，與鏈2反向平行5.黃素蛋白(3)1.黃素氧還蛋白相關的(8)結合FMN2.NADPH-細胞色素p450還原酶，N-末端結構域(2)3.醌還原酶(4)結合FAD6.鈷胺素(維生素B12)-結合結構域(1)1.鈷胺素(維生素B12)-結合結構域(4)7.鳥氨酸脫羧酶N-末端“翅膀”結構域(1)1.鳥氨酸脫羧酶N-末端“翅膀”結構域(1)8.N5-羧氨基咪唑核糖核苷酸(N5-CAIR)變位酶PurE(1)1.N5-羧氨基咪唑核糖核苷酸(N5-CAIR)變位酶PurE(1)9.Cutinase樣(1)1.Cutinase樣(1)該家族還可被分成α/β水解酶超家族10.酯酶/乙酰水解酶(4)1.酯酶(1)2.血細胞凝集素-酯酶-融合糖蛋白HEF1的酯酶結構域(1)3.乙酰基水解酶(1)4.鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶(1)11.β-I-葡聚糖外水解酶，C-末端結構域(1)1.β-D-葡聚糖外水解酶，C-末端結構域(1)12.甲酸/甘油酸脫氫酶催化結構域樣(3)
            
1.甲酸/甘油酸脫氫酶，底物-結合結構域(6)該結構域是由羅斯曼折疊結構域間斷的2.L-丙氨酸脫氫酶(1)3.S-腺嘌呤核苷基高半胱氨酸水解酶(2)13.II型3-脫氫奎尼酸脫水酶(1)1.II型3-脫氫奎尼酸脫水酶(1)14.核苷2-脫氧核糖基轉移酶(1)1.核苷2-脫氧核糖基轉移酶(1)15.核糖體蛋白S2(1)用額外結構加工的折疊1.核糖體蛋白S2(1)16.I類谷氨酰胺轉酰胺酶樣(4)氧陰離子空穴和催化親核試劑的保守位置；不同的組成家族含有不同的額外結構1.I類谷氨酰胺轉酰胺酶(GAT)(3)含有催化的Cys-His-Glu三聯體2.胞內蛋白酶(1)含有與I類GAT三聯體不同的催化Cys-His-Glu三聯體3.過氧化氫酶，C-末端結構域(1)4.天冬氨酰二肽酶PepE(1)共同核心中可能的循環交替變換；含有催化的Ser-His-Glu三聯體24.甲基乙二醛合酶樣(1)3層，a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序321451.甲基乙二醛合酶樣(1)含有共有的磷酸結合位點1.氨基甲酰基磷酸合成酶，共有大亞基變構的，C-末端結構域(1)2.甲基乙二醛合成酶，MgsA(1)25.鐵氧還蛋白還原酶樣，C-末端NADP-連接的結構域(1)3層，a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序321451.鐵氧還蛋白還原酶樣，C-末端NADP-連接的結構域(5)
            
結合不同于經典羅斯曼折疊的NADPN-末端FAD-連接的結構域含(6，10)桶1.還原酶(10)2.鄰苯二甲酸鹽雙加氧酶還原酶(1)含有額外的2Fe-2S鐵氧還蛋白結構域3.二氫乳清酸脫氫酶B，PyrK亞基(1)在C-末端延展中含有2Fe-2S簇4.NADPH-細胞色素p450還原酶樣(2)5.黃素血紅蛋白，C-末端結構域(1)含有額外的珠蛋白結構域26.腺嘌呤核苷酸α水解酶樣(3)核心3層，a/b/a；5個鏈的平行β折疊，順序321451.核苷酸轉移酶(3)1.I類氨酰基-tRNA合成酶(RS)，催化結構域(10)在C-末端延伸含有保守的全α亞結構域2.胞苷酸轉移酶(1)3.腺嘌呤轉移酶(2)2.腺嘌呤核苷酸α水解酶(2)1.N-型ATP焦磷酸酶(3)2.磷酸腺嘌呤基硫酸(PAPS)還原酶(1)3.UDP-葡萄糖脫氫酶(UDPGDH)，C-末端(UDP-結合)結構域(1)1.UDP-葡萄糖脫氫酶(UDPGDH)，C-末端(UDP-結合)結構域(1)27.嘧啶核苷磷酸化酶中心結構域(1)3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序32145；羅斯曼樣1.嘧啶核苷磷酸化酶中心結構域(1)1.嘧啶核苷磷酸化酶中心結構域(2)28.DNA光裂合酶的N-末端結構域(1)3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序32145；羅斯曼樣1.DNA光裂合酶的N-末端結構域(1)1.DNA光裂合酶的N-末端結構域(2)
            
29.ETFP腺嘌呤核苷酸-結合結構域樣(1)3層a/b/a；核心5個鏈的平行β-折疊，順序321451.ETFP腺嘌呤核苷酸-結合結構域樣(2)1.電子轉移黃素蛋白，ETFP(2)在核心折疊兩邊均含有額外鏈2.“假擬”蛋白MJ0577(1)30.生物素羧化酶N-末端結構域樣(1)3層a/b/a；4-6個鏈的平行或混合β-折疊羅斯曼折疊結構域可能的殘留形式1.生物素羧化酶N-末端結構域樣(5)超家族是由接在這一個后面的共有ATP-結合結構域確定的1.生物素羧化酶/氨基甲酰基磷酸合成酶(5)2.D-丙氨酸連接酶N-末端結構域(2)3.原核谷胱甘肽合成酶，N-末端結構域(1)4.真核谷胱甘肽合成酶(1)原核酶的循環交替變換形式5.突觸蛋白Ia結構域(1)31.DHS樣NAD/FAD-結合結構域(1)3層a/b/a；6個鏈的平行β-折疊，順序321456；羅斯曼樣1.DHS樣NAD/FAD-結合結構域(4)結合相反方向的輔因子，而不結合經典的羅斯曼折疊1.脫氧hypusine合酶，DHS(1)2.電子轉移黃素蛋白α亞基的C-末端結構域(2)缺少鏈3；與丙酮酸氧化酶結構域共有FAD-結合方式3.丙酮酸鹽氧化酶和脫羧酶，中間結構域(5)N-末端結構域是Pyr模塊，且C-末端結構域是二磷酸硫胺素-結合折疊的PP模塊4.轉氫酶結構域III(dIII)(3)結合NADP，與丙酮酸鹽氧化酶FAD-結合結構域共有一個共同的ADP-結合方式32.微管蛋白，GTP酶結構域(1)
            
3層a/b/a；6個鏈的平行β-折疊，順序3214561.微管蛋白，GTP酶結構域(1)1.微管蛋白，GTP酶結構域(3)33.半胱氨酸水解酶(1)3層a/b/a；；6個鏈的平行β-折疊，順序3214561.半胱氨酸水解酶(2)1.N-氨基甲酰基肌氨酸酰胺水解酶(1)2.YcaC(1)34.耐鹽蛋白Hal3(1)3層a/b/a；；6個鏈的平行β-折疊，順序3214561.耐鹽蛋白Hal3(1)1.耐鹽蛋白Hal3(1)35.葡糖胺6-磷酸鹽脫氨基酶/異構酶(1)3層a/b/a；；6個鏈的平行β-折疊，順序3245611.葡糖胺6-磷酸鹽脫氨基酶/異構酶(1)1.葡糖胺6-磷酸鹽脫氨基酶/異構酶(2)36.二磷酸硫胺素-結合折疊(THDP-結合)(1)3層a/b/a；6個鏈的平行β-折疊，順序2134651.二磷酸硫胺素-結合折疊(THDP-結合)(4)吡啶(Pyr-)和焦磷酸鹽(PP)-結合模塊都具有該折疊保守核心是由兩個Pyr和兩個PP-模塊組成的，并結合兩種輔酶分子1.丙酮酸氧化酶和脫羧酶(5)Pyr模塊是N-末端結構域，PP模塊是C-末端結構域羅斯曼樣結構域位于它們之間2.轉羥乙醛酶，TK(1)3.支鏈α-酮酸脫氫酶(2)TK和PFOR的親代家族與TK有關的異二聚蛋白；α-亞蛋白是PP模塊β-亞基的N-末端結構域是Pyr模塊4.丙酮酸鹽-鐵氧還蛋白氧化還原酶，PFOR，I和VI結構域(1)
            
結構域VI，I和II按照與TK N，M和C結構域相同的方式排列37.含核苷酸三磷酸水解酶的P-環(1)3層a/b/a，可變大小的平行或混合β-折疊1.含核苷酸三磷酸水解酶的P-環(14)根據β-折疊的拓撲結構分成不同的家族1.核苷酸和核苷激酶(16)5個鏈的平行β-折疊，順序231452.莽草酸激酶(1)與核苷酸/核苷激酶相似，但作用于不同的底物3.氯霉素磷酸轉移酶(1)與核苷酸/核苷激酶相似，但作用于不同的底物4.腺苷-5’磷酸硫酸激酶(APS激酶)(1)5.PAPS磺基轉移酶(4)與核苷酸/核苷激酶相似，但轉移硫酸基團6.磷酸核酮糖激酶/泛酸激酶(2)7.6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶，激酶結構域(1)8.G蛋白(28)核心6個鏈的混合β-折疊，順序231456；鏈2與其余的反向平行9.動力蛋白(7)10.固氮酶鐵蛋白樣(10)核心7個鏈的平行β-折疊，順序324156711.RecA蛋白樣(ATP酶-結構域)(9)核心8個鏈的混合β-折疊，順序32451678；鏈7與其余的反向平行12.ABC轉運蛋白ATP酶結構域樣(7)存在2個插入到中心核心中的額外亞結構域，其具有RecA樣拓撲結構13.延伸的AAA-ATP酶結構域(13)折疊與RecA的相似，但缺少最后兩個鏈，后面接有家族-特異性全αArg-指結構域14.RNA解旋酶(1)重復由兩個相似的結構域組成，其中一個結合NTP，且另一個結合RNA；而且在C-末端延伸中還含有全α亞結構域38.果糖透酶，亞基IIb(1)3層a/b/a，6個鏈的平行β-折疊，順序3241561.果糖透酶，亞基IIb(1)1.果糖透酶，亞基IIb(1)39.煙酸單核苷酸5，6-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉移酶(CobT)(1)3層a/b/a，7個鏈的平行β-折疊，順序32145671.煙酸單核苷酸5，6-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉移酶(CobT)(1)1.煙酸單核苷酸5，6-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉移酶(CobT)(1)40.甲基酯酶CheB，C-末端結構域(1)3層a/b/a，7個鏈的平行β-折疊，順序34215671.甲基酯酶CheB，C-末端結構域(1)1.甲基酯酶CheB，C-末端結構域(1)41.枯草桿菌蛋白酶樣(1)3層a/b/a，7個鏈的平行β-折疊，順序2314567；鏈2&3之間左手交叉連接1.枯草桿菌蛋白酶樣(2)1.subtilases(12)2.絲氨酸-羧基蛋白酶PSCP(1)用額外結構加工的42.精氨酸酶/去乙酰酶(1)3層a/b/a，8個鏈的平行β-折疊，順序213874561.精氨酸酶/去乙酰酶(2)1.精氨酸酶(2)2.組蛋白去乙酰酶，HDAC(1)43.CoA-依賴性酰基轉移酶(1)
            
核心2層，a/b；6個鏈的混合β-折疊，順序324561；鏈3&6與其余的反向平行1.CoA-依賴性酰基轉移酶(1)1.CoA-依賴性酰基轉移酶(5)44.磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶I樣(2)3層a/b/a；4個鏈的平行β-折疊，順序21341.磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶I(1)與家族II共有共同的活性位點結構1.低分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(3)2.酶IIB-纖維二糖(1)1.酶IIB-纖維二糖(1)45.(磷酸酪氨酸蛋白)磷酸酶II(1)核心3層a/b/a；4個鏈的平行β-折疊，順序14321.(磷酸酪氨酸蛋白)磷酸酶II(3)與家族I共有具有循環交替變換的拓撲結構的共同活性位點結構1.二-特異性磷酸酶(2)2.高分子量的磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(8)擴展到鏈4之前的3個反向平行鏈的β-折疊3.磷酸肌醇磷酸酶Pten(Pten腫瘤抑制劑)，N-末端結構域(1)46.硫氰酸生成酶/細胞周期控制磷酸酶(1)3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊，順序324511.硫氰酸生成酶/細胞周期控制磷酸酶(2)活性位點結構與家族I和II蛋白磷酸酶的那些相似；拓撲結構通過不同的循環交替變換與家族I的拓撲結構相關1.細胞周期控制磷酸酶，催化結構域(2)2.硫轉移酶(硫氰酸生成酶)(2)重復，由該折疊的兩個結構域組成47.硫氧還蛋白折疊(3)核心3層，a/b/a；4個鏈的混合β-折疊，順序4312；鏈3與其余的反向平行
            
1.硫氧還蛋白樣(10)1.硫醇轉移酶(12)2.PDI樣(3)重復含有該折疊的2個串聯重復3.肌集鈣蛋白重復含有該折疊的3個串聯重復4.二硫鍵形成促進劑(DSBA)(2)5.谷胱甘肽S-轉移酶，N-末端結構域(23)6.Phosducin(2)7.內質網蛋白ERP29，N-結構域(1)8.剪接體蛋白U5-15Kd(1)9.二硫鍵異構酶，DsbC，C-末端結構域(1)加工的共有折疊10.谷胱甘肽過氧化物酶樣(6)2.RNA 3’末端磷酸環化酶，RPTC，插入結構域(1)1.RNA 3’-末端磷酸環化酶，RPTC，插入結構域(1)3.硫氧還蛋白樣2Fe-2S鐵氧還蛋白(1)1.硫氧還蛋白樣2Fe-2S鐵氧還蛋白(1)48.轉羥乙醛酶C-末端結構域樣(1)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序13245，鏈1與其余的反向平行1.轉羥乙醛酶C-末端結構域樣(3)1.轉羥乙醛酶(1)2.支鏈α-酮酸脫氫酶β-亞基，C-結構域(2)3.丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶，PFOR，結構域II(1)49.丙酮酸激酶C-末端結構域樣(2)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序32145，鏈5與其余的反向平行1.丙酮酸激酶C-末端結構域(1)1.丙酮酸激酶C-末端結構域(5)2.ATP合酶(F1-ATP酶)，γ亞基(1)含有通過至共有折疊的anb C-末端延伸片段形成的反向平行的卷曲螺旋1.ATP合酶(F1-ATP酶)，γ亞基(2)50.亮氨酸氨肽酶，N-末端結構域(1)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序23145，鏈2與其余的反向平行1.亮氨酸氨肽酶，N-末端結構域(1)1.亮氨酸氨肽酶，N-末端結構域(1)51.反密碼子-結合結構域樣(4)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序21345，鏈4與其余的反向平行1.II類aaRS的反密碼子-結合結構域(1)1.II類aaRS的反密碼子-結合結構域(5)2.TolB，N-末端結構域(1)1.TolB，N-末端結構域(1)3.二醇脫水酶，β亞基(1)1.二醇脫水酶，β亞基(1)C-末端延伸中含有額外結構4.Maf/Haml(2)用插入在共有折疊中的額外結構加工的1.Haml(1)2.Maf蛋白(1)52.限制性內切核酸酶樣(3)核心3層，a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序12345，鏈2以及某些家族中的鏈5與其余的反向平行1.限制性內切核酸酶樣(17)1.限制性內切核酸酶EcoRI(1)2.限制性內切核酸酶EcoRV(1)3.限制性內切核酸酶BamHI(1)4.限制性內切核酸酶BglI(1)5.限制性內切核酸酶BglII(1)6.限制性內切核酸酶PvuII(1)7.限制性內切核酸酶Cfr10I(1)
            
8.限制性內切核酸酶MunI(1)9.限制性內切核酸酶NaeI(1)10.限制性內切核酸酶NgoIV(1)11.限制性內切核酸酶BsobI(1)12.限制性內切核酸酶FokI，C-末端(催化)結構域(1)13.λ外切核酸酶(1)14.DNA錯配修復蛋白MutH(1)15.非常短的膜片修復(VSR)內切核酸酶(1)16.TnsA內切核酸酶，N-末端結構域(1)17.霍利迪連結體解離酶(內切核酸酶)(1)2.tRNA剪接內切核酸酶，C-末端結構域(1)1.tRNA剪接內切核酸酶，C-末端結構域(1)3.真核RPBS N-末端結構域(1)1.真核RPBS N-末端結構域(1)53.解離酶樣(2)核心3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序21345；鏈5與其余的反向平行1.解離酶樣(2)1.γ，δ解離酶，大片段(1)2.5’至3’外切核酸酶含有額外鏈和α-螺旋弓，鏈的順序321456；鏈6與其余的反向平行2.β-碳酸酐酶(1)1.β-碳酸酐酶(2)54.甘露糖轉運蛋白的IIA結構域，IIA-Man(1)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序21345；鏈5與其余的反向平行1.甘露糖轉運蛋白的IIA結構域，IIA-Man(1)活性二聚物是通過鏈5交換形成的1.甘露糖轉運蛋白的IIA結構域，IIA-Man(1)55.核糖核酸酶H樣基序(7)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序32145；鏈2與其余的反向平行1.肌動蛋白樣ATP酶結構域(4)復制含有該折疊的兩個結構域1.肌動蛋白/HSP70(8)2.醋酸激酶(1)3.己糖激酶(3)4.甘油激酶(1)2.肌酸酶/脯氨酸肽酶N-末端結構域(1)1.肌酸酶/脯氨酸肽酶N-末端結構域(2)3.核糖核酸酶H樣(6)由該折疊的一個結構域組成1.核糖核酸酶H(4)2.逆轉錄病毒整合酶，催化結構域(3)3.mu轉座酶，核心結構域(1)4.轉座酶抑制劑(Tn5轉座酶)(1)5.DnaQ樣3’-5’外切核酸酶(11)6.RuvC解離酶(1)4.翻譯機制成分(2)1.核糖體蛋白L18和S11(2)2.真核肽鏈釋放因子亞基1的中間結構域，ERF1(1)5.假擬蛋白MTH1175(1)1.假擬蛋白MTH1175(1)6.DNA修復蛋白MutS，結構域II(1)1.DNA修復蛋白MutS，結構域II(2)7.甲基化DNA-蛋白半胱氨酸甲基轉移酶結構域(1)1.甲基化DNA-蛋白半胱氨酸甲基轉移酶結構域(3)56.磷酸化酶/水解酶樣(6)核心3層，a/b/a；5個鏈的混合折疊順序21354；鏈4與其余的反向平行；含有交叉環1.使內肽酶HybD成熟的氫化酶(1)該折疊與共有序列的核心結構一致1.使內肽酶HybD成熟的氫化酶(1)
            
2.嘌呤和尿苷磷酸化酶(1)復合結構；含有8個鏈的混合β-折疊，順序23415867，鏈3，6&7與其余的反向平行；還含有桶，封閉的；n＝5，S＝81.嘌呤和尿苷磷酸化酶(6)3.肽基-tRNA水解酶(1)1.肽基-tRNA水解酶(1)4.吡咯烷酮羧基肽酶(焦谷氨酸鹽氨基肽酶)(1)1.吡咯烷酮羧基肽酶(焦谷氨酸鹽氨基肽酶)(2)5.Zn-依賴性外肽酶(5)核心；8個鏈的混合β-折疊，順序12435867，鏈2，6&7與其余的反向平行1.胰羧肽酶(6)2.羧肽酶T(1)3.亮氨酸氨基肽酶，C-末端結構域(1)4.細菌外肽酶(3)5.轉鐵蛋白受體外結構域，蛋白酶樣結構域(1)6.芳香開環二加氧酶LigAB的LigB亞基(1)共有折疊的循環交替變換，絕大多數與PNP折疊相似1.芳香開環二加氧酶LigAB的LigB亞基(1)57.鉬輔因子生物合成蛋白MogA(1)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊；順序21354，鏈5與其余的反向平行；磷酸化酶/水解酶樣折疊的交替變換1.鉬輔因子生物合成蛋白MogA(1)1.鉬輔因子生物合成蛋白MogA(1)58.氨基酸脫氫酶樣，N-末端結構域(1)3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊；順序12435，鏈2與其余的反向平行1.氨基酸脫氫酶樣，N-末端結構域(3)1.氨基酸脫氫酶(7)二聚結構域2.四氫葉酸脫氫酶/環化水解酶(3)3.線粒體NAD(P)-依賴性蘋果酸酶(1)
            
該結構域是用額外結構裝飾的；含有N-末端額外亞結構域59.谷氨酸連接酶結構域(1)3層a/b/a；6個鏈的混合β-折疊；順序126345，鏈1與其余的反向平行1.谷氨酸連接酶結構域(2)1.MurD/MurF C-末端結構域(2)2.葉酰聚谷氨酸合成酶，C-末端結構域(1)60.磷酸甘油酸鹽變位酶樣(1)核心3層，a/b/a；6個鏈的混合β-折疊；順序324156，鏈5與其余的反向平行1.磷酸甘油酸鹽變位酶樣(4)1.磷酸甘油酸鹽變位酶(1)2.酸性磷酸酶(2)3.肌醇六磷酸酶(肌醇-hexakis磷酸-3-磷酸水解酶)(3)4.6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶，磷酸酶結構域(1)61.PRT酶樣(1)核心3層，a/b/a；6個鏈的混合β-折疊；順序321456，鏈3與其余的反向平行1.PRT酶樣(2)1.磷酸核糖基轉移酶(PRT酶)(14)2.磷酸核糖基焦磷酸合成酶(1)復制由該折疊的2個結構域組成62.整聯蛋白A(或I)結構域(1)核心3層，a/b/a；6個鏈的混合β-折疊；順序321456，鏈3與其余的反向平行1.整聯蛋白A(或I)結構域(1)1.整聯蛋白A(或I)結構域(7)63.戊烯二酸-CoA轉移酶亞基(1)核心3層a/b/a；；6個鏈的平行或混合β-折疊；順序432156；部分折疊是在其自身上折疊的，并形成桶樣結構
            
1.戊烯二酸-CoA轉移酶亞基(1)1.戊烯二酸-CoA轉移酶亞基(2)64.丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶，PFOR，結構域III(1)3層a/b/a；6個鏈的混合β-折疊；順序231456；鏈3與其余的反向平行1.丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶，PFOR，結構域III(1)1.丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶，PFOR，結構域III(1)65.甲酰基轉移酶(1)3層a/b/a；7個鏈的混合β-折疊；順序3214567；鏈6與其余的反向平行1.甲酰基轉移酶(1)1.甲酰基轉移酶(2)66.S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸-依賴性甲基轉移酶(1)核心3層a/b/a；；7個鏈的混合β-折疊；順序3214576；鏈7與其余的反向平行1.S-腺嘌呤核苷基-L-甲硫氨酸-依賴性甲基轉移酶(11)1.兒茶酚O-甲基轉移酶，COMT(1)2.RNA甲基轉移酶FtsJ(1)3.核仁纖維蛋白同系物(1)4.假擬蛋白MJ0882(1)5.甘氨酸N-甲基轉移酶(1)6.精氨酸甲基轉移酶，HMT1(1)缺少用β-夾層低聚亞結構域替換的共有折疊的最后2個鏈7.蛋白-L-異天冬氨酸O-甲基轉移酶(1)具有額外α+β亞結構域的共有折疊的另一個C-末端變異8.趨化性受體甲基轉移酶CheR，C-末端結構域(1)含有額外的N-末端全部-α結構域，res.11-919.RNA甲基化酶(3)10.DNA甲基化酶(5)11.II型DNA甲基化酶(2)
            
共有折疊的循環交替變換形式67.PLP-依賴性轉移酶(1)主要的結構域3層a/b/a；；7個鏈的混合β-折疊；順序3245671；鏈7與其余的反向平行1.PLP-依賴性轉移酶(5)1.AAT樣(9)2.β-消除裂合酶(2)3.胱硫醚合酶樣(8)4.ω-氨基酸丙酮酸氨基轉移酶樣(15)5.鳥氨酸脫羧酶主要的結構域(1)68.核苷酸-二磷糖轉移酶(1)3層a/b/a；7個鏈的混合β-折疊；順序3214657；鏈6與其余的反向平行1.核苷酸-二磷糖轉移酶(8)1.芽孢外被多糖生物合成蛋白SpsA(1)2.β-1，4半乳糖基轉移酶(b4GalT1)(1)3.CMP酰基神經氨酸鹽合成酶(1)4.半乳糖基轉移酶LgtC(1)5.N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸尿苷酰轉移酶GlmU，N-末端結構域(1)6.葡萄糖-1-磷酸胸腺嘧啶核苷酸基轉移酶RmlA(1)7.1，3-葡糖醛酸基轉移酶I(glcAT-1)(1)8.鉬輔因子生物合成蛋白MobA(1)69.α/β-水解酶(1)核心3層，a/b/a；8個鏈的混合β-折疊；順序12435678；鏈2與其余的反向平行1.α/β-水解酶(20)很多成員在鏈8與額外的鏈9之間都具有左手交叉連接1.乙酰膽堿酯酶樣(8)2.羧酸酯酶(2)3.分支桿菌抗原(2)4.脯氨酰基寡肽酶，C-末端結構域(1)
            
5.絲氨酸羧肽酶(4)6.胃脂肪酶(1)7.脯氨酸亞氨肽酶(2)8.鹵烷烴脫鹵素酶(3)9.雙烯內酯水解酶(2)10.碳-碳鍵水解酶(1)11.環氧化物水解酶(3)12.鹵過氧化物酶(5)13.硫酯酶(2)14.羧酯酶/硫酯酶1(2)15.新的細菌性酯酶(1)16.脂酶(1)17.真菌脂酶(9)18.細菌脂酶(5)19.胰脂酶，N-末端結構域(6)20.羥基腈裂合酶(2)70.核苷水解酶(1)核心3層，a/b/a；；8個鏈的混合β-折疊；順序32145687；鏈7與其余的反向平行1.核苷水解酶(1)1.核苷水解酶(2)71.二氫葉酸還原酶(1)3層，a/b/a；8個鏈的混合β-折疊；順序34251687；鏈8與其余的反向平行1.二氫葉酸還原酶(1)1.二氫葉酸還原酶(10)72.核糖激酶樣(2)核心3層，a/b/a；8個鏈的混合β-折疊；順序21345678；鏈7與其余的反向平行潛在的超家族該折疊的成員具有相似的功能和不同的ATP-結合位點1.核糖激酶樣(2)
            
具有位于鏈2和3之間的額外鏈1.核糖激酶樣(3)2.羥乙基噻唑激酶(thz激酶)(1)2.MurD樣肽連接酶，催化結構域(2)具有位于鏈1和2之間的額外鏈1.MurD/MurF(2)2.葉酰聚谷氨酸鹽合成酶(1)73.氨基甲酸激酶樣(1)3層a/b/a；8個鏈的混合(主要是平行)β-折疊；順序34215786；鏈8與其余的反向平行1.氨基甲酸激酶樣(1)與磷酸甘油酸激酶的N-末端結構域在拓撲結構上相似1.氨基甲酸激酶樣(2)74.II類醛縮酶(1)3層a/b/a；9個鏈的混合(主要是反向平行)β-折疊；順序432159876；鏈4和5之間左手交叉1.II類醛縮酶(1)1.II類醛縮酶(1)金屬(鋅)-離子依賴性75.胞質磷脂酶A2催化結構域(1)3層a/b/a；9個鏈的混合β-折疊；順序654321789；鏈4，6和8與其余的反向平行1.胞質磷脂酶A2催化結構域(1)1.胞質磷脂酶A2催化結構域(1)76.磷酸酶/硫酸酶(1)3層a/b/a；10個鏈的混合β-折疊；順序564371892A，(A＝10)鏈9與其余的反向平行1.磷酸酶/硫酸酶(2)1.堿性磷酸酶(1)2.芳基硫酸酯酶(2)77.異檸檬酸&異丙基蘋果酸脫氫酶(1)由通過假二聯體關聯的兩個纏繞(亞)結構域組成；重復
            
3層a/b/a；10個鏈的單混合β-折疊；順序213A945867，(A＝10)鏈5-9與其余的反向平行1.異檸檬酸鹽&異丙基蘋果酸鹽脫氫酶(1)1.異檸檬酸鹽&異丙基蘋果酸鹽脫氫酶(7)78.ATC樣(2)由通過假二聯體關聯的兩個相似結構域組成；重復核心3層a/b/a；4個鏈的平行β-折疊；順序21341.天冬氨酸/鳥氨酸氨基甲酰基轉移酶(1)1.天冬氨酸鹽/鳥氨酸氨基甲酰基轉移酶(6)2.谷氨酸鹽消旋酶(1)1.谷氨酸鹽消旋酶(1)將C-末端延伸加到N-末端結構域79.色氨酸合酶β亞基樣PLP-依賴性酶(1)由通過假二聯體關聯的兩個相似結構域組成；重復核心3層a/b/a；4個鏈的平行β-折疊；順序32141.色氨酸合酶β亞基樣PLP-依賴性酶(1)1.色氨酸合酶β亞基樣PLP-依賴性酶(4)80.SIS結構域(1)由通過假二聯體關聯的兩個相似結構域組成；重復3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊；順序213451.SIS結構域(2)1.氨基葡萄糖6-磷酸合酶的“異構酶結構域”(GLMS)(1)2.磷酸葡萄糖異構酶，PGI(2)超家族折疊的交替變換81.甲酸脫氫酶/DMSO還原酶，結構域1-3(1)由通過假二聯體關聯的兩個相似纏繞結構域組成；重復核心3層a/b/a；5個鏈的平行β-折疊；順序324511.甲酸鹽脫氫酶/DMSO還原酶，結構域1-3(1)鉬喋呤酶1.甲酸鹽脫氫酶/DMSO還原酶，結構域1-3(6)結構域I(殘基1-55)結合FDH中的Fe4S4聚簇，但不結合DMSO還原酶
            
82.醛還原酶(脫氫酶)，ALDH(1)由每個具有3層(a/b/a)的兩個相似結構域組成；重復核心5個鏈的平行β-折疊，順序321451.醛還原酶(脫氫酶)，ALDH(1)結合來源于其它NAD(P)-依賴性氧化還原酶的NAD1.醛還原酶(脫氫酶)，ALDH(8)83.烏頭酸酶，前3個結構域(1)由每個具有3層(a/b/a)的三個相似結構域組成；重復核心5個鏈的平行β-折疊，順序321451.烏頭酸酶，前3個結構域(1)1.烏頭酸酶，前3個結構域(2)含有Fe(4)-S(4)簇84.磷酸葡萄糖變位酶，前3個結構域(1)由每個具有3層(a/b/a)的三個相似結構域組成；重復核心4個鏈的混合β-折疊，順序2134，鏈4與其余的反向平行1.磷酸葡萄糖變位酶，前3個結構域(1)1.磷酸葡萄糖變位酶，前3個結構域(1)85.L-巖藻糖異構酶，N-末端和第二結構域(1)由相似拓撲結構的兩個結構域組成，各3層(a/b/a)結構域1(1-173)具有5個鏈的平行β-折疊，順序21345結構域2(174-355)具有4個鏈的平行β-折疊，順序21341.L-巖藻糖異構酶，N-末端和第二結構域(1)1.L-巖藻糖異構酶，N-末端和第二結構域(1)86.磷酸甘油酸激酶(1)由兩個不相似的結構域組成，各3層(a/b/a)結構域1具有6個鏈的平行β-折疊，順序342156結構域2具有6個鏈的平行β-折疊，順序3214561.磷酸甘油酸激酶(1)1.磷酸甘油酸激酶(4)結構域2結合ATP87.UDP-糖基轉移酶/糖原磷酸化酶(1)
            
由每個具有3層(a/b/a)的兩個不相似結構域組成結構域1具有7個鏈的平行β-折疊，順序3421567結構域2具有6個鏈的平行β-折疊，順序3214561.UDP-糖基轉移酶/糖原磷酸化酶(4)1.β-糖基轉移酶(DNA-修飾)(1)2.肽聚糖生物合成糖基轉移酶MurG(1)3.UDP-N-乙酰基氨基葡萄糖2-差向異構酶(1)4.寡糖磷酸化酶(4)88.谷氨酰胺酶/天冬酰胺酶(1)由每個3層(a/b/a)的兩個不相似α/β結構域組成，結構域1具有6個鏈的混合β-折疊，順序213456，鏈6與其余的反向平行；鏈4與5之間左手交叉連接結構域2具有4個鏈的平行β-折疊，順序12341.谷氨酰胺酶/天冬酰胺酶(1)1.谷氨酰胺酶/天冬酰胺酶(5)89.磷酸果糖激酶(1)由每個3層(a/b/a)的兩個不相似α/β結構域組成，結構域1具有7個鏈的混合折疊，順序3214567，鏈3&7與其余的反向平行結構域2具有4個鏈的平行折疊，順序23141.磷酸果糖激酶(1)1.磷酸果糖激酶(2)結構域1結合ATP90.鈷precorrin-4甲基轉移酶CbiF(1)由兩個不相似的結構域組成結構域1具有5個鏈的反向平行折疊，順序32415結構域2具有5個鏈的混合折疊，順序12534；鏈4&5與其余的反向平行1.鈷precorrin-4甲基轉移酶CbiF(1)1.鈷precorrin-4甲基轉移酶CbiF(1)91.磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ATP-草酰乙酸羧基化酶)(1)由兩個α/β結構域組成復制結構域共有2個螺旋的少見折疊和6鏈的混合折疊；β(2)-α-β(4)-α；順序312465，鏈1和5與其余的反向平行1.磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ATP-草酰乙酸羧化酶)(1)結構域2含有P-環ATP-結合基序1.磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ATP-草酰乙酸羧化酶)(1)92.螯合酶樣(2)復制兩個結構域的串聯反復3層(a/b/a)；4個鏈的平行β-折疊，順序21341.螯合酶(2)結構域間的接頭比較短；交換兩個結構域間的C-末端螺旋1.亞鐵螯合酶2.鈷螯合酶CbiK(1)2.“螺旋狀主鏈”金屬受體(3)在結構域間的接頭中含有一個較長的α螺旋插入物1.周質鐵載體結合蛋白FhuD(1)2.TroA樣(2)3.固氮酶鐵-鉬蛋白(3)含有該折疊的3個結構域“螺旋狀主鏈”具有結構域2和393.周質結合蛋白樣I(1)由每個具有3層(a/b/a)的兩個相似纏繞結構域組成復制6個鏈的平行β-折疊，順序2134561.周質結合蛋白樣I(1)結構與超家族II相似，但拓撲結構部分不同1.L-阿拉伯糖結合蛋白樣(13)94.周質結合蛋白樣II(1)由每個具有3層(a/b/a)的兩個相似纏繞結構域組成復制5個鏈的混合β-折疊，順序21354；鏈5與其余的反向平行1.周質結合蛋白樣II(1)結構與超家族I相似，但拓撲結構部分不同1.磷酸結合蛋白樣(20)2.轉鐵蛋白(8)
            
進一步復制由兩個二結構域葉組成95.硫解酶樣(1)由通過假二聯體關聯的2個相似結構域組成；復制3層a/b/a；5個鏈的混合β-折疊，順序32451；鏈1&5與其余的反向平行1.硫解酶樣(2)1.硫解酶-相關的(6)2.查耳酮合酶(2)96.僅僅Fe(Fe-only)的氫化酶(1)由兩個纏繞結構域組成；含有部分復制1.僅僅Fe的氫化酶(1)1.僅僅Fe的氫化酶(2)97.胞苷脫氨基酶(1)由每個具有3層(a/b/a)的兩個非常相似的結構域組成；復制4個鏈的混合β-折疊，順序2134；鏈2與其余的反向平行1.胞苷脫氨基酶(1)1.胞苷脫氨基酶(1)
            
表2   本發明是通過下列實施例舉例說明的。
            
實施例1α/β蛋白和變構調節位點的鑒定本發明還提供鑒定不是LFA-1或其含I結構域片段的分子的方法，所述分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點。當所述分子與變構效應分子接觸時，變構調節位點，如，I結構域的變構位點與所述變構效應分子相互作用，促進所述α/β結構配體結合結構域中調節第一分子與其結合配偶體分子間的結合的構像。
            
變構調節位點可通過比較侯選蛋白與具有已知變構調節位點的蛋白來鑒定。例如，具有變構調節位點的α/β蛋白可通過使用檢索工具，如NCBI載體比對檢索工具(或“VAST”檢索)來鑒定，它能夠鑒定與預定的三維結構相似的蛋白[Gibrat等，Curr.Opin.Struct.Biol.6377-385(1996)]，其全部引入此處作為參考；和Madej等，Proteins 23356-369(1995)，其全部引入此處作為參考]。關于這些方法，LFA-1可被用作比較或詢問蛋白，這是因為已知LFA-1含有I結構域變構位點。同樣，其它已知含有變構位點的α/β蛋白也可被用作鑒定其它含I結構域變構位點的α/β蛋白的參照。在其中一個實施方案中，具有7或更大VAST值或0.005或更小P值的蛋白被確定為與比較蛋白足夠相關，以確保進行進一步的研究。
            
變構調節位點還可通過使用預測構像矛盾(ambivalence)的算法來鑒定[Young等，Protein Science 81752-1764(1999)，其全部引入此處作為參考；和，Kirshenbaum等，Protein Science8(9)1806-1815(1999)，其全部引入此處作為參考]。該算法，也稱為矛盾結構預測(“ASP”)，可預測根據氨基酸序列的信息預測三維構像重排的區域。該算法使用源于二級結構預測算法的折合概率，Profile Network Prediction Heidelberg(“PHD”)[Rost，Meth.Enzymol.266525-539(1996)，其全部引入此處作為參考]鑒定結構矛盾的序列元件。具有低于α/β結構域的平均殘基矛盾評分標準差-1.75的z值的殘基被視為與本發明所用類型的變構調節位點一致。
            
例如，表3顯示整聯蛋白α/β結構域及其近親具有大約10或更大的高VAST評分，和大約0.0009或更小的P值，或與兩個代表性的LFA-1和Mac-1不太相關。此外，表3還表明結構矛盾的序列元件(SASE)的位置與這些結構域已知或預測的C-末端剛體運動一致。因此，這些及該類型其它緊密相關的結構域被預測具有典型的IDAS。此外，根據表3給出的計算結果可證實，某些Ras超家族成員，如RhoA和酶，如ENR也被預測具有典型的IDAS。
            
此外，某些更不相關的非-整聯蛋白α/β結構域，通過VAST分析也被證實似乎在與典型整聯蛋白IDAS不同的位點具有SASE。這些α/β結構域可具有IDAS樣位點，也能夠用小分子，如二芳基化合物調節。
            
很多α/β結構域共有小于35％的氨基酸同一性。因此，可比較詢問序列與其結構域序列數據庫的，基于網絡的簡單模塊結構檢索工具，SMART，[見Schultz等，Nuc.Acids Res.，28231-234(2000)，其全部引入此處作為參考；Copley等，Curr.Opin.Struct.Biol.9408-415(1999)，其全部引入此處作為參考；Ponting等，Nuc.Acids Res.27229-232(1999)，其全部引入此處作為參考；和，Schultz等，PNAS USA 955857-5864(1998)，其全部引入此處作為參考]被用于鑒定額外的趨異家族成員。SMART使用代表性家族成員的多序列序列比對。這些序列比對是人工優化的，隨后產生隱藏的Markov模型，可用于檢索序列數據庫。將顯著相似的序列加入到序列比對中，由此精制用于隨后檢索的模型。因此，SMART數據庫可被用于鑒定目標額外α/β結構域的來源，從而分析變構調節位點的存在。
            
表3 
            
*SASE結構矛盾的序列元件+沒有被ASP缺省設置檢測出來的C-末端SASE++SASE的第二個位點可代表IDAS樣位點實施例2CD11b I結構域突變體A.CD11b I結構域中突變的產生鑒于使用I結構域中發生突變的CD11a變體的前述結果[Huth等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)975231-5236(2000)]，嘗試將突變引入到CD11b中，隨著對結合配偶體ICAM-1和iC3b親和性的增加而鑒定CD11b變體。
            
六次突變都是利用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene)產生的。這些突變體包括Asp156(D156A)，Val254(V254A)，Gln327(Q327A)，Ile332(I332A)，Phe333(F333A)和Glu336(E336A)到Ala的單一改變。簡單地說，合成了兩個誘變寡核苷酸(一個是有義鏈，另一個是反義鏈)，其可用于全長CD11b作為模板的PCR中。突變體D156A，V254A，Q327A，和I332A的PCR條件包括95℃ 30秒循環一次，95℃ 30秒，50℃ 1分鐘和60℃ 18分鐘循環16次。突變體F333A和E336A的PCR條件相同，但區別在于16次循環中最后的延伸步驟是68℃時進行20分鐘。PCR完成之后，37℃時用DpnI消化甲基化的，未突變的模板DNA 1小時，并按照制造商建議的方案將誘變的CD11b DNA用于轉化Supercompetent XL1 Blue細胞(Stratagene)。選取碳霉素抗性集落，使其在液體培養基中生長，分離出質粒DNA后，對插入物進行測序。從具有全長突變體的克隆，將含有基因5’部分的1.3kb的SacI/EcoRV片段亞克隆到親代載體中。對源于這些亞克隆的插入物測序，以證實連接處的完整性和突變的存在。D156A(有義) SEQ ID NO1CATTGCCTTCTTGATTGCGGGCTCTGGTAGCATCV254A(有義) SEQ ID NO2GCCTTTAAGATCCTAGCGGTCATCACGGATGGAGQ327A(有義) SEQ ID NO3
            
GAAGACCATTCAGAACGCGCTTCGGGAGAAGATCI332A(有義)  SEQ ID NO4CAGCTTCGGGAGAAGGCGTTTGCGATCGAGGGF333A(有義 ) SEQ ID NO5CTTCGGGAGAAGATCGCGGCGATCGAGGGTACE336A(有義)  SEQ ID NO6GAAGATCTTTGCGATCGCGGGTACTCAGACAGGB.COS-7轉染COS細胞是用CD18/pDC1和野生型CD11b或CD11b的突變體形式共轉染的。轉染基本上是按照前面所述進行的[Huth等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)975231-5236(2000)]。C.FACS分析FACS分析是按照前面所述進行的[Huth等，Proc.Natl.Aca.Sci.(USA)975231-5236(2000)]，但用抗-CD11b單克隆抗體TMG6-5[Diamond等，J.Cell.Biology 1201031-1043(1993)]證實CD11b的表達。D.使用COS轉染細胞和固定化ICAM-1或iC3b的粘附測定法粘附測定法是利用改進的過程[Sadhu等，Cell Adhes.Commun.2429-440(1994)]在96-孔Easy Wash平板(Corning Glass，Corning，NY)中進行的。每個孔在4℃，用50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的50μl血型糖蛋白(Calbiochem)(10μg/ml)，ICAM-1/Fc(5μg/ml)，iC3b(3μg/ml)或抗-CD18單克隆抗體(TS1/18，5μg/ml)和抗-CD11b單克隆抗體(44AACB[ATCC]，5μg/ml)，或單獨的緩沖液包被過夜的。用200μl/孔D-PBS洗平板兩次，并在室溫時，用D-PBS中的1％HAS(100μl/孔)封閉1小時。用100μl粘附緩沖液(含有RPMI和5.0％滅活FBS)洗孔一次，并將100μl粘附緩沖液加入到每個孔中。將另外100μl有或沒有對照抗體(IgG(5a)72，60μg/ml)，封閉性抗體(44AACB，60μg/ml)或活化抗體240Q[Huth等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)975231-5236(2000)]以60μg/ml加入到每個孔中，之后將粘附緩沖液中的COS-7轉染子(100μl，0.75×106細胞/ml)加入到每個孔中。為了進行ICAM-1結合，將平板在37℃時孵育30分鐘，為了進行iC3b結合，孵育15分鐘。粘附細胞是通過加入50μl/孔加入D-PBS中的14％戊二醛固定的，室溫繼續孵育1.5小時。用dH2O洗平板，室溫時用10％乙醇中的0.5％結晶紫以100μl/孔染色5分鐘，并多次更換dH2O進行洗滌。洗滌之后，加入70％乙醇，然后使用SPECTRmax 250微量滴定板分光光度計系統(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，通過在570nm和410nm處測量吸光度而定量粘附細胞。利用下面的公式確定細胞結合的百分比。 結果表明，野生型CD11b與ICAM-1和iC3b的結合分別為3.1％和26.4％。突變體V254A，Q327A，和I332A與ICAM-1(分別為野生型水平的114.7％，105.1％，和123.1％)和iC3b(分別為147.1％，140.5％，和205.2％)的結合明顯更高，而突變體F332A和E336A與ICAM-1(分別為1.1％和0.7％)和iC3b(分別為4.9％和4.3％)的結合則明顯較低。因此，證實可以較高水平結合ICAM-1的突變體可用于鑒定抑制CD18/CD11b(Mac-1)與ICAM-1結合的化合物，隨著ICAM-1結合水平的升高，可提供更高的信噪比。
            
實施例3CD11b激動劑的鑒定前面的工作已經證實各種二芳基化合物均可抑制LFA-1與ICAM-1的結合。鑒于這種觀察結果和上面實施例的結果，設計了實驗來確定是否二芳基化合物可影響CD11b與天然結合配偶體的結合，大概是通過與CD11b變構調節區的相互作用。A.表達αM的HL60與固定化ICAM-1的粘附測定法為了評估試驗化合物調節CD11b(αM)結合的能力，使用HL60細胞和固定化ICAM-1進行粘附測定法。
            
測定法是按照前述過程在粘附緩沖液中封閉性抗-CD18單克隆抗體(TS1/22，10μg/ml)和100μl HL60細胞(1×106細胞/ml)存在的情況下，在96-孔Easy Wash平板(Corning Glass，Corning，NY)中進行的，但是每個孔在4℃，用(i)50μl ICAM-1/Fc(5μg/ml)，(ii)50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的抗-CD18單克隆抗體(22F12C，5μg/ml)和抗-α4單克隆抗體(A4.1，5μg/ml)，或(iii)單獨的緩沖液包被過夜的。細胞結合的百分比是利用下面的公式確定的。 然后利用下列公式將數據標準化 為了進行進一步的研究，鑒定了大約30種化合物。IC50值是在上述HL-60測定法或下述具有血纖蛋白原的嗜中性粒細胞結合測定法(實施例15)中測定的。B.JY/CD11b細胞與固定化iC3b的粘附測定法簡單地說，96-孔平板的每個孔是4℃時，用碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的50μl血型糖蛋白(10μg/ml)，iC3b(5μg/ml)或用抗-CD18單克隆抗體(22F12C，5μg/ml)和抗-CD11b單克隆抗體(44AACB，5μg/ml)包被過夜的。室溫時，用D-PBS中的人類血清白蛋白封閉平板1小時。將用粘附緩沖液中的CD11b(JY/CD11b細胞)(1×106細胞/ml，100μl)轉染的JY細胞加入到每個孔中，37℃孵育30分鐘。將平板固定，并按照上面實施例1所述進行分析。細胞結合的百分比是使用下面的等式確定的。 然后利用下列公式將數據標準化 測定了45種在篩選中被證實抑制的化合物的IC50值，這些化合物中有6種的IC50小于10μM。45種化合物中的12種隨后被用于嗜中性白細胞與血纖蛋白原粘附的結合測定法中(在實施例15中描述)。
            
這種篩選還鑒定了17種具有刺激與iC3b結合能力的化合物。這17種化合物的重滴定揭示了，與對照DMSO治療所觀察到的結果相比，Cmpd H，Cmpd I，和Cmpd C能夠以2倍的水平，以劑量-依賴性的方式刺激CD11b/CD18與iC3b的結合。
            
實施例4補體蛋白C2和B因子的抑制劑的篩選補體蛋白C2和B因子已經顯示出含有A結構域，據信其可調節蛋白及其各自轉化酶的絲氨酸蛋白酶活性。據信這些蛋白中的A結構域可起配體結合位點的作用，并含有一個或多個調節結構域。C2結合補體蛋白C4b，形成C3轉化酶及經典補體途徑中C5轉化酶的一部分，B因子結合C3b，形成替代性補體途徑的C3轉化酶和C5轉化酶的一部分。鑒定C2調節劑或B因子結合的機理大概是控制C3和/或C5轉化酶的活性。
            
經典途徑補體蛋白C2和替代性途徑補體蛋白B因子的抑制劑的篩選包括按照如下所述，在微量滴定板中，使用標準溶血CH50和AH50測定法的改進形式進行初次篩選[見Current Protocols inImmunology，Chapter 13，Unit 13.1，John Wiley & Sons，Inc.，(2000)]。CH50測定法取決于經典途徑和C2的活性，而AH50測定法則取決于替代性途徑和B因子的活性。
            
CH50測定法包括分析用抗-綿羊RBC血清調理過的綿羊紅細胞(RBCs)的補體-依賴性溶解，其依賴于Mg++和Ca++。CH50是37℃時，在1個小時內使調理過的綿羊RBC溶解50％所需的人類血清濃度。C2抑制劑的初次篩選包括使用CH50水平的恒定血清濃度，且該測定法是在有或沒有10μM試驗化合物存在的情況下進行的。用滴定法測量抑制這種初次測定的化合物，并在第二溶血測定法中再測試特異性，其中在有或沒有試驗化合物存在的情況下，連續加入各純化的補體蛋白，從而確定哪個組分被抑制。
            
AH50測定法包括分析兔紅細胞的直接的補體-依賴性溶解，且其取決于Mg++而不是Ca++，因此該方法是在有EGTA存在的情況下進行的。與CH50相似，AH50是37℃時，在1個小時內使兔RBC溶解50％所需的人類血清濃度。B因子抑制劑的初次篩選包括使用AH50水平的血清濃度，該測定法是在有或沒有10μM試驗化合物存在的情況下進行的。用滴定法測量抑制這種初次測定的化合物，并在第二溶血測定法中再測試特異性，其中在有或沒有化合物存在的情況下，連續加入各純化的補體蛋白，從而確定哪個組分被抑制。
            
Alsevers溶液中的綿羊全血和抗-綿羊溶血素是從ColoradoSerum Co.(Denver，CO)獲得的。紅細胞-抗體復合物(EA)是使用最適濃度的抗-綿羊溶血素產生的，通過滴定法測量是1∶800稀釋的。正常人的血清(NHS)是通過采集10個隨機的健康人供體的新鮮血清，混合，將混合血清等分，在液氮中瞬間冷凍，并在-70℃貯藏而產生的。在每次使用之前，即刻融解新鮮等分試樣。
            
標準測定法是在Costar 96-孔平板圓底或V底微量滴定板中進行的。所有樣品都是一式兩份分析和均化的。首先，滴定NiS，從而測定其在溶解EA(CH50稀釋度)期間線性活性的中點。將含有Mg++和Ca++的明膠-佛羅那緩沖液中的新融解NHS的連續兩倍稀釋物(GVB-，含有0.142M NaCl，4.9mM 5，5’-二乙基巴比妥酸鈉和1.0g/l明膠，用HCl將pH調節至7.35，接著加入CaCl2和MgCl2至最終濃度分別為60μM和400μM)或dH2O(用于測定總溶解)一式兩份放在孔(80μl/孔)中，溫熱至37℃ 5分鐘。加入(80μl/孔)已經用GVB++洗過兩次，并以2×108復合物/ml重懸浮的EA，并在37℃孵育平板60分鐘。加入80μl/孔的0.15M Nacl，以2500rpm將平板離心3分鐘。將100μl/孔的上清液從測定平板轉移到Immulon4 96-孔平底ELISA平板，測量420nm處的吸光度。用含有NHS的所有孔的讀數減去不含NHS孔的吸光度本底讀數，所得比吸光度是以從含有dH2O的孔獲得的百分比(總溶解％)表示的。
            
在37℃，60分鐘內產生50％總溶解所需的NHS稀釋度(CH50)被確定為1∶150。此稀釋度構成NHS溶解活性線性范圍的中點，并用于篩選抑制補體途徑的試驗化合物庫。首先在GVB++/5％ DMSO中稀釋試驗化合物至40μM，并一式兩份將其以40μl/孔等分到Costar 96-孔圓底或V底平板中。還包括含有GVB++(本底)，dH2O(總溶解)，單獨的DMSO，抗-C2多克隆抗血清(40μg/ml；Calbiochem)，正常山羊IgG(40μg/ml；Sigma)，和EGTA(4mM)的對照孔。37℃孵育平板5分鐘。以40μl/孔加入在GVB++中稀釋至1∶75的NHS(產生1∶150的化合物最終稀釋度)，但本底或總溶解孔則分別接受GVB++或dH2O。37℃孵育平板10分鐘。洗EA兩次，在GVB++中以2×108/ml重懸浮，以80μl/孔加入到每個平板中。37℃孵育平板60-70分鐘，以80μ1/孔加入0.15M NaCl，2500rpm將平板離心3分鐘。將每個孔的100μl上清液從測定平板轉移到Immulon4 96-孔平底ELISA平板的各孔中，并分析420nm處的吸光度。用每個孔的吸光度減去不含NHS孔的吸光度本底讀數，所得比吸光度是以從僅僅含有DMSO孔獲得的百分比(DMSO溶解％)表示的。再試驗抑制DMSO溶解超過35％的所有化合物，并在同一測定法中滴定。鑒定了39種IC50值小于或等于20μM的化合物。兩種最有效化合物的IC50值小于5μM，且它對補體抑制具有選擇性，這是因為在濃度大于或等于20μM的標準細胞粘附測定法中，它們不會顯著抑制(i)LFA-1介導的與ICAM-1的粘附，(ii)Mac-1介導的與ICAM-1的粘附，(iii)α2β1介導的與膠原的粘附，(iv)α4β7介導的與MAdCAM-1的粘附，或(v)vWf與gplb的結合。
            
在經典補體途徑(CCP)篩選中，大約30％的血清活性是通過含有C3和C5轉化酶的替代性補體途徑(ACP)B因子擴增的。因此，這種測定法具有分離經典補體途徑轉化酶，凝集素補體途徑(LCP)(其中C3也是一種中間組分)，和選擇性補體途徑的抑制劑的可能性。假設C2和B因子的一級結構高度同源，那么分離出抑制所有三種途徑轉化酶的化合物也是可能的。
            
一旦確定了原始篩選的特性，抑制就可在補體途徑的任何階段發生。為了確定試驗化合物在補體激活的哪個階段抑制活性，獲得了純化的補體蛋白(Advanced Research Technologies，San Diego，CA)，且補體激活是逐步重新構成的。在每個步驟中，加入前導化合物或單獨的DMSO，并按照上面所述測量終點的溶血活性。最初，測試前導化合物在補體激活四個不同階段的抑制能力1)EA表面C1與聚集抗體的結合；2)C4與C1的結合及C4通過C1的裂解；3)C2與C4b的結合，C1-介導的裂解激活C2和C4bC2a-介導的C3裂解(即，C3轉化酶的形成和活性)；和4)C5轉化酶的形成和活性，及隨后補體蛋白C6-C9的沉積，其形成導致細胞溶解的膜攻擊復合物(MAC)。
            
在該測定法中，在Costar 96-孔圓底平板中，一式兩份分析1×107EA/孔。對于測試階段1(如上所述)，將細胞重懸浮在含有7.5μg/ml C1蛋白的GVB++中，30℃孵育15分鐘。為了測試階段2，將細胞重懸浮在含有7.5μg/ml C4蛋白的GVB++中，30℃孵育15分鐘。為了測試階段3，將細胞重懸浮在含有0.4μg/ml C2蛋白的GVB++中，30℃孵育30分鐘。為了測試階段4，將細胞重懸浮在含有4mM EGTA和1∶50稀釋的NHS的GVB++中，37℃孵育60分鐘。對于每個階段而言，對前導化合物進行滴定，其中測試了用DMSO，山羊抗-C2 pIgG，和山羊正常pIgG稀釋的化合物的抑制。每對孔僅在一個階段接受抑制劑。在各階段的孵育期后，2400RPM離心平板3分鐘，用100μl/孔GVB++洗細胞團塊兩次，除去抑制劑和未結合的蛋白。在階段4使用EGTA封閉新加入的源于血清的C1，并因此使最后的階段取決于先前C3b的沉積。在這種構成測定法中，正如我們所期望的，是抗-C2 pIgG而不是正常pIgG阻斷階段3的補體激活。
            
前導化合物以劑量-依賴性的方式抑制階段4，但不抑制階段1，2或3。這些結果表明，所述化合物不能抑制CCP/LCP C3轉化酶的形成或活性，但可抑制C5轉化酶或隨后的MAC，即補體系統最后成分的形成。
            
為了確定前導化合物是否抑制C5轉化酶的活性或隨后MAC的形成，進行了一種簡化的成分測定。得到C2-缺失的NHS(AdvancedResearch Technologies，San Diego，CA)。用GVB++洗EA兩次，并以2×109細胞/ml在GVB++中重懸浮。加入等體積含有1∶50稀釋的C2-缺失NHS的GVB++，30℃孵育細胞7.5分鐘，使C1沉積并激活，隨后C4裂解。用GVB++稀釋細胞混懸液20倍以終止反應，2400RPM離心3分鐘。用GVB-洗細胞團塊3次，并以2×108細胞/ml在GVB++中重懸浮。一式兩份，將處理過的EA以50μl/孔加入到Costar 96-孔圓-底平板的孔中，并以50μl/孔加入含有1μg/ml C2，50μg/ml C3，和1μg/ml C5，有或沒有抗-C2(80μg/ml)正常山羊IgG(80μg/ml)的GVB++。加入前導化合物(80μM)或DMSO，30℃孵育平板20分鐘。以200μl/孔加入GVB++，2400RPM離心平板3分鐘，吸出上清液，并用200μl/孔GVB++洗團塊一次。將細胞團塊在100μl/孔GVB中重懸浮，并以100μl/孔加入含有40mM EDTA和1∶50 NHS的GVB，37℃孵育平板60分鐘。再次離心平板，并以100μl/孔轉移到Immulon4 96-孔平-底平板中，測定420nm處的吸光度。
            
抗-C2 pIgG和前導化合物均可特異性地抑制溶血，表明該化合物可直接抑制CCP/LCP C5轉化酶的活性。這些結果與補體抑制潛在的機理一致，其中試驗化合物結合C2或B因子，并抑制絲氨酸蛋白酶結構域所需的構像改變，從而接近C5底物。B因子絲氨酸蛋白酶結構域的晶體結構數據及其與A結構域相互作用的模型化與這種假設一致[Hua Jng等，EMBO J.19164-173(2000)]。
            
補體蛋白C2和B因子的前5種抑制劑在表4中給出。
            
表4   實施例5αE，E-鈣粘著蛋白，和MAdCAM-1的cDNAs的分離為了確定是否能夠調節其它α/β蛋白的結合活性，如下制備了編碼αE，E-鈣粘著蛋白，和MAdCAM-1的DNA。A.αE1.人類α-E cDNA的分離編碼人類α-E的DNA是使用α-E I結構域的cDNA作為探針，從正常人的腸cDNA文庫(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)中分離出來的。αE I結構域的探針是使用作為模板的人結腸cDNA文庫，和含有α-E I結構域5’和3’末端的引物，通過PCR擴增克隆的。為了促進克隆，將BamHI和XhoI限制位點(加下劃線的序列)設計成5’(SEQ ID NO7)和3’(SEQ ID NO8)引物。ATTGGA TCCGCT GGC ACC GAG ATT GCC ATC   SEQ ID NO7AAT TTC TC GAGGTC TCC AAC CGT GCC TTC C  SEQ ID NO8將一個607bp的I結構域片段擴增，用BamHI和XhoI消化，并將其插入到質粒pBluescriptSK(Stratagene，La Jolla，CA)中。將質粒轉化到細菌中，按照公開的過程制備質粒DNA，并純化BamHI/XhoI插入物。編碼α-E I結構域的片段是利用隨機引物DNA標記試劑盒(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)，用32P-dCTP和32P-dTTP放射性標記的，其可用作雜交探針。
            
如下鑒定編碼全長α-E的DNA。平板接種噬菌體λGT11(CLONTECHLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)中的人類腸cDNA文庫，并利用標準過程與I結構域探針雜交。從兩輪篩選中分離出了6個噬菌體克隆。通過EcoRI消化從噬菌體中分離出cDNA插入物，并將其亞克隆到pBluescriptSK(Stratagene，La Jolla，CA)中，進行測序。一個完全的3.4kb序列是從3個不同的克隆重新構成的含有5’末端的克隆A(3)，含有cDNA中間序列的克隆B(22)，及含有αE cDNA3’末端的克隆C(22)。序列分析表明，與公開的核苷酸序列相比，克隆A(3)在357和464位分別含有兩個胞嘧啶核苷的插入片段和另一個鳥嘌呤的插入片段。這些插入片段導致可讀框中第75個堿基的移碼，其導致加入25個如下所示在先前報道的序列中沒有發現過的額外氨基酸殘基。PKGRHRGVTVVRSHHGVLICIQVLVRR   SEQ ID NO9這25個氨基酸的插入物的序列下游與已經公開的分子剩余部分的αE序列相同。
            
為了將αE cDNA亞克隆到pcDNA3(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中，使用如下所示的5’引物Eo26-H3(SEQ ID NO10)和3’引物Eo-24(SEQ ID NO11)，通過PCR擴增在5’端產生HindIII位點。GAG GGG AAG CTT AGT GGG CC SEQ ID NO10GAA GTT GGC CTG AGC CTG G  SEQ ID NO11用HindIII和NsiI消化PCR產物，并將其連接到載體的相應位點中。
            
將表達載體pMHneo[Hahn等，Gene 127267-268(1993)]和pcDNA3/aE轉化到細菌菌株NEB316，即一種不會使XbaI限制位點甲基化的抑制菌株中，并按照標準過程分離質粒DNA。用HindIII和XbaI限制位點消化pMHneo和pcDNA3/aE，利用瓊脂糖凝膠電泳從pcDNA3/aE中分離3.4kb的αE cDNA片段。將該片段從凝膠上切下來，純化，并連接到HindIII/XbaI-消化的載體pMHneo中。按照制造商的方案，將連接混合物的等分試樣用于轉化XL-1 Blue細菌(Stratagene，La Jolla，CA)，并通過在含有氨芐西林的LBM瓊脂平板上生長而選擇含有pMHneo的細菌菌落。細菌菌落是在含有100μg/ml氨芐西林的LBM培養基中過夜生長的，而質粒DNA是使用WizardPlus Miniprep試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)分離的。所述質粒DNA的特征在于診斷性的限制消化，且含有αE cDNA的質粒，也被稱作pMHneo/aE，可用于按照如下所述穩定地轉染JY細胞系。B.E-鈣粘著蛋白1.E-鈣粘著蛋白cDNA的分離人類E-鈣粘著蛋白的cDNA是利用如下所示的E-cad 5’#1(SEQ IDNO12)和E-cad 3’#1(SEQ ID NO13)引物，通過Marathon-ReadyTM人結腸cDNA文庫(CLONTECH Laboratories，Inc.Palo Alto，California)的PCR擴增分離的。5’-CTGCCTCGCTCGGGCTCCCCGGCCA-3’   SEQ ID NO125’-CTGCACATGGTCTGGGCCGCCTCTCTC-3’ SEQ ID NO13聚合酶鏈反應是在Perkin Elmer Cetus(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)DNA熱循環儀的反應混合物中進行的，所述反應混合物含有源于AdvantageTM-GC cDNA PCR試劑盒(CLONTECHLaboratories，Inc.Palo Alto，California)的5μl文庫cDNA，10μl 5X PCR緩沖液，1μl的50X dNTP混合物，1μl的10μM引物E-cad 5’#1，1μl的10μM引物E-cad 3’#l，1μl的AdvamtageTMKlen Taq聚合酶混合物，和3μl的H2O。擴增條件包括最初的94℃孵育1分鐘，接著是94℃ 30分鐘和72℃ 4分鐘循環5次；94℃ 30秒和70℃ 4分鐘循環5次；94℃ 30秒和68℃ 4分鐘循環25次；最后72℃孵育5分鐘。使用瓊脂糖凝膠電泳分離反應的等分試樣，以測定PCR產物大概的大小，并如所預期的那樣檢測到了約2.7kb的單一帶。按照制造商的方案，使用TA Cloning試劑盒(Invitrogen Corp.，Carlsbad，California)將所述2.7kb的PCR產物連接到質粒pCR2.1中。按照制造商的建議，使用連接反應的等分試樣轉化大腸桿菌菌株INVaF’(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，分離單一的細菌菌落，并使其在含有100μg/ml氨芐西林的LBM培養基中過夜生長。使用Wizard Plus Miniprep試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)從這些培養物中分離出質粒DNA。2.編碼E-鈣粘著蛋白/Ig融合蛋白的DNA的產生E-鈣粘著蛋白的胞外區是由每個大約110個氨基酸的5個串聯重復(結構域)組成的。為了表達E-鈣粘著蛋白-人/人IgG1融合蛋白，使用引物Ecad5’Kozak(SEQ ID NO14)和Ecad3’(Xho)(SEQ IDNO15)，通過E-鈣粘著蛋白cDNA(上述pCR2.1/E-鈣粘著蛋白#3)的PCR擴增產生含有E-鈣粘著蛋白1-5結構域的DNA片段。5’引物Ecad5’Kozak用于加入5’HindIII位點，從而促進隨后5-結構域片段到表達載體pDEF2中的亞克隆(見美國專利US5,888,809)，并重新構成缺少原始E-鈣粘著蛋白cDNA克隆的翻譯起始密碼子的Kozak序列上游。3’引物Ecad3’(Xho)產生了一個新的，含有E-鈣粘著蛋白1-5結構域的片段的3’末端，并將XhoI限制位點加入到片段的3’末端，從而促進隨后5-結構域片段到pDEF2中的亞克隆。5’-GCGTTAAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCA-3’SEQ ID NO145’-AGGCGCTCGAGAATCCCCAGAATGGCAGGAATT-3’  SEQ ID NO15pCR2.1/E-cad#3中所含的E-鈣粘著蛋白cDNA片段是通過PCR反應擴增的，其中含有0.5μl的pCR2.1/E-cad#3，10μl的5X PCR反應緩沖液，1μl的10μM引物E-cad5’Kozak，1μl的10μM引物E-cad3’(Xho)，1μl的AdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物，和35.5μl的H2O。擴增條件包括最初的94℃孵育1分鐘，94℃ 30秒和72℃ 4分鐘循環5次；94℃ 30秒和70℃ 4分鐘循環5次；94℃ 30秒和68℃ 4分鐘循環25次；最后72℃孵育5分鐘。利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR反應的等分試樣，正如所預期 的觀察到了一個2.1kb的單一帶。使用Wizard PCR Purification試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)純化該片段，并在標準條件下用XhoI和HindIII消化。所得片段被稱作5’-HindIII-Kozak-E-鈣粘著蛋白-XhoI-3’。
            
用XbaI和SalI消化質粒pDC1/ICAM3.IgG1，并從低解鏈溫度的瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts，Rockland，ME)純化一個具有5’末端SalI位點和3’末端XbaI位點的908bp的片段(也被稱為5’-SalI-IgG1-XbaI-3’)。該片段含有編碼人類IgG1的CH2-CH3區的序列。表達載體pDEF2是在多克隆位點中，用HindIII和XbaI線性化的，并進行了三向連接反應，其含有5’-HindIII-Kozak-E-鈣粘著蛋白-XhoI-3’片段，線性化的pDEF2，和5’-SalI-IgG1-XbaI-3’片段。在該反應中，5’-HindIII-Kozak-E-鈣粘著蛋白-XhoI-3’中的3’XhoI位點與5’-SalI-IgG1-XbaI-3’在框內連接；XhoI和SalI均具有適合的5’突出端，其可與XhoI或SalI連接，但不能被它們再消化。連接反應的等分試樣用于轉化細菌菌株XL-1 Blue(Stratagene，LaJolla，CA)。各細菌菌落是在含有100μg/ml氨芐西林的LBM中過夜生長的，并用Wizard Plus Miniprep試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)分離質粒DNA。pDEN2/E-cadIgG1質粒DNA是用HindIII和XbaI消化的，消化產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離。對含有2.1kb片段的那些克隆測序，以確保E-鈣粘著蛋白-IgG1嵌合體保留持跨E-鈣粘著蛋白/IgG1連接的可讀框。
            
人們發現pDEF2/E-cadIgG1克隆#3含有跨E-鈣粘著蛋白/IgG1連接的連續可讀框，并可用于下面CHO細胞表達的研究。沒有在其整體中對E-鈣粘著蛋白/IgG1融合的可讀框進行測序，這是因為已經對形成這種嵌合體的DNA片段進行過測序，而且該DNA片段沒有經歷PCR擴增。C.MAdCAM-1-11.人類MAdCAM-1部分cDNA的分離含有MAdCAM-1部分cDNA的片段是使用AdvantageTM-GC cDNA PCR試劑盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)，通過Marathon-ReadyTM人脾cDNA文庫的PCR擴增分離的。聚合酶鏈反應是在Perkin Elmer Cetus(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)DNA熱循環儀中進行的，其中含有5μl的MarathonTM人脾cDNA，1μl的10μM引物MAdCAM-15’#1(SEQ ID NO16)，1μl的10μM引物MAdCAM-13’#5(SEQ ID NO17)，10μl的5.0M GC-MeltTM，1μl的50X dNTP混合物，1μl的AdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物，10μl的5X反應緩沖液，和21μl的H2O。5’-ATGGATTTCGGACTGGCCCTCCTGCT-3’   SEQ ID NO165’-CTCCAAGCCAGGCAGCCTCATCGT-3’ SEQ ID NO17擴增條件包括最初的94℃孵育1分鐘，94℃ 30秒和72℃ 3分鐘循環5次；94℃ 30秒和70℃ 3分鐘循環5次；94℃ 30秒和68℃ 3分鐘循環25次；和最后的68℃孵育5分鐘。反應的等分試樣是通過瓊脂糖凝膠電泳分離的，并檢測到一個640bp的單一片段。該片段被亞克隆到pCR2.1中，并根據制造商的方案，使用TA Clong試劑盒(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)在細菌中擴增。單一的細菌菌落是在含有100μg/ml氨芐西林的LBM中過夜生長的。使用WizardPlus Miniprep試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)從培養物中分離出質粒DNA，并通過DNA序列分析測定亞克隆PCR產物的核苷酸序列。MAdCAM-1的這種部分cDNA是以起始密碼子開始的，并在結構域2中的第640個殘基的3’末端終止。這種部分MAdCAM-1 cDNA的序列與先前報道的相同[Shyjan等，J.Immunol.1562851-2857(1996)]。2.編碼MAdCAM-1結構域1和2的DNA的額外PCR擴增為了將MAdCAM-1的結構域1和2表達為分泌型的免疫球蛋白融合蛋白，下列是必需的(i)恢復起始密碼子的Kozak序列上游，從而使蛋白有效翻譯；(ii)加入5’HindIII位點，促進片段亞克隆到pDEF2中；(iii)延伸存在的部分MAdCAM-1 cDNA的可讀框，從而包含編碼整個第二結構域所必需的額外氨基酸殘基；和(iv)在片段的3’末端引入SalI位點，從而促進亞克隆到pDEF2中。這些修飾是用如下所示的引物Mad5’Kozak(SEQ ID NO18)和Mad 3’#6Sal(SEQ ID NO19)，通過PCR擴增而引入到上述MadCAM-1片段中的。5’-GCGTTAAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGATTTCGGACTGGCCCTCCT-3’SEQ ID NO18GCTAGTCGACGGGGATGGCCTGGCGGTGGCTGAGCTCCAAGCAGGCAGCCTCATCGTSEQ ID NO19PCR反應包括0.5μl的pCR2.1/Mad#4-1模板DNA，10μl的5XPCR緩沖液，10μl的5.0M GC MeltTM，1μl的50X dNTP混合物，1μl的10μM，1μl的10μM，1μl的50X AdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物，和25.5μl的H2O。PCR擴增條件包括94℃ 1分鐘，94℃30秒和72℃ 2分鐘循環5次；94℃ 30秒和70℃ 2分鐘循環5次；94℃ 30秒和68℃ 2分鐘循環20次；和68℃ 5分鐘。反應等分試樣是通過瓊脂糖凝膠電泳分離的，且正如所預期的檢測到了一個約0.7kb的單一片段。使用Wizard PCR Purification試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)純化PCR產物，并在標準條件下用HindIII和SalI消化。在標準條件下，把片段連接到HindIII/SalI消化的pBluescriptSK質粒DNA(Stratagene，La Jolla，CA)中，并測定pBS-SK/Mad#7中MAdCAM-1片段的序列。3.MAdCAM-1/Ig融合蛋白的產生為了產生編碼嵌合結構域1/結構域2MAdCAM-1-IgG1融合蛋白的表達載體，在連接反應中，把pBS/Mad#7的702bp的HindIII-SalI片段，pDC1/ICAM3.IgG的908bp的SalI-XbaI片段，和通過用HindIII及XbaI消化而線性化的pDEF2結合起來。把連接反應的等分試樣用于轉化XL-1 Blue細菌(Stratagene，La Jolla，CA)，并通過用HindIII，XbaI和SalI限制消化而篩選從單一菌落中分離出來的質粒DNA。人們發現，其中一個克隆，pDEF2/MadIg#1含有全部3個片段，并可用于產生下述穩定轉染的CHO細胞系。
            
實施例6MAdCAM-1/Ig和E-鈣粘著蛋白/Ig的表達A.表達MAdCAM-1/Ig和E-鈣粘著蛋白/Ig的穩定CHO細胞系的產生為了轉染具有pDEF2/MAdIg或pDEF2/EcadIg的宿主CHO DG44細胞，通過用限制酶PvuI消化而使50-100μg的質粒線性化。在也被稱作“HT”的，補充有次黃嘌呤(0.01mM的最終濃度)和胸腺嘧啶核苷(0.0016mM的最終濃度)的DMEM/F-12培養基中培養DG44細胞。用于轉染的DG44細胞是通過使培養物生長至在處理過的150cm2組織培養物聚苯乙烯瓶(Corning Inc.，Corning，NY)中的融合大約為50％或更少而制備的。收集細胞，并使其在0.8ml含有HeBS緩沖液(20mMHepes，pH7.0，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM，Na2HPO4和6mM葡萄糖)及所需質粒DNA的溶液中重懸浮。室溫時，利用290V和960μF(9-11.5毫秒脈沖)的電容器放電將重懸浮的細胞電穿孔。將細胞加入到10ml補充有5％透析FBS和HT的DMEM/F-12中，離心成團塊，在2ml補充有5％透析FBS和HT的DMEM/F-12(“非-選擇性培養基”)中重懸浮，并將其接種在75cm2的聚苯乙烯組織培養瓶中。生長2天后，收集細胞，并以各種稀釋度接種在補充有5％透析FBS且沒有HT的DMEM/F-12(“選擇性培養基”)中。
            
只要選擇是完全的，并可鑒定出單一的細胞克隆，那么可通過胰蛋白酶消化制備混合CHO轉染子的單一細胞混懸液。為了分離各個克隆，在選擇性條件下，以大約1個細胞/孔的密度在Immulon-4 96孔平板(Dynex Technologies，Inc.，Chantilly，VA)中平板接種CHO/MAdCAM-1 Ig和CHO/E-cadIg轉染子。一旦在96-孔平板中檢測到了單一集落，則篩選各孔的上清液是否存在MAdCAM-1/Ig或E-鈣粘著蛋白/Ig融合蛋白。使產生人IgG1蛋白成分的單一細胞CHO克隆膨脹，選擇產生最高水平MAdCAM-1/Ig或E-鈣粘著蛋白/Ig融合蛋白的那些克隆用于大規模的蛋白生產。
            
在大規模的蛋白生產中，CHO/MadIg和CHO/E-cadIg克隆是37℃時，在含有5％CO2的大氣中，在旋轉燒瓶沒有血清的5.2(HT-)培養基中膨脹的。當細胞密度超過106個細胞/ml時，收集培養基，并將新鮮的5.2(HT-)培養基補充到旋轉燒瓶中。首先將剩余的培養基離心，除去細胞碎片，通過0.22μm的1升過濾器(Corning Inc.，Corning，NY)過濾，4℃貯存。B.MAdCAM-1/Ig的純化MAdCAM-1/Ig是使用CMF-PBS平衡的蛋白A-Sepharose4 FastFlow樹脂柱(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)，通過親和色譜純化的。細胞上清液以4ml/分鐘的速率在柱上循環。上樣后，用CMF-PBS洗柱子，直到洗脫液中檢測不到蛋白的存在。用0.1M醋酸(pH 3.0)將MAdCAM-1/Ig洗脫到含1M Tris，pH 9.0的管中，4℃時用CMF-PBS透析樣品。C.E-鈣粘著蛋白/Ig的純化E-鈣粘著蛋白是使用D-PBS平衡的蛋白A-Sepharose4 FastFlow樹脂柱(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)，通過親和色譜純化的。以大約4ml/分鐘的速率在柱上循環細胞上清液。上樣后，用pH8.0的，含有1mM CaCl2的Tris-緩沖生理鹽水洗柱子，直到洗脫液中檢測不到蛋白的存在。用含有1 mM CaCl2的0.1M醋酸(pH 3.0)將E-鈣粘著蛋白/Ig洗脫到含有1M Tris，pH 9.0的管中。將鈣濃度調節到1mM，4℃時，用含有1 mM CaCl2的Tris-緩沖生理鹽水(pH6.8)透析樣品。
            
實施例7JY/α-E轉染子的產生人B類淋巴母細胞系，JY，是用上述質粒pMHneo/aE轉染的。轉染的細胞群在“選擇性培養基”(含有補充了5％PBS，100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸鏈霉素，2mM L-谷氨酸鹽，1mM丙酮酸鈉，和1.0mg/mlG418的RPMI 1640培養基)中生長，14天后，在5ml含有5μg/ml抗-aP單克隆抗體Ber-ACT8(DAKO Corp.，Carpinteria，CA)的選擇性培養基中重懸浮108G418-抗性JY細胞，并在冰上孵育1小時。離心收集細胞，吸出培養基。在冰上，使用含有1∶200稀釋的綿羊抗-小鼠Ig-FITC(Sigma Corp.，St.Louis，MO)的選擇性培養基將JY/aE轉染子染色1小時。離心除去未結合的抗體，吸出上清液。通過流式細胞術分離αE-表達細胞，隨后通過在選擇性培養基中體外培養而擴展。
            
通過具有Ber-ACT8的流式細胞術對分選JY/aE+種群的再次分析顯示出包含αE-表達和αE-非表達細胞的雙峰細胞群。雙峰群是用前述的Ber-ACT8第二次染色的，并將各JY/aE細胞分到含有選擇性培養基的96孔Immulon-4平板中。體外擴展表達高水平αE的單一細胞JY/aE+克隆，選擇JY/aE克隆#47用于進一步的特性描述。該克隆，而不是親代JY細胞，顯示出與重組E-鈣粘著蛋白/Ig堅固粘附，且該結合是用佛波酯處理細胞而誘導的。JY/aE克隆#47與E-鈣粘著蛋白/Ig的結合是由抗-β7整聯蛋白抗體FIB504(ATCC，Rockville，MD)及E-鈣粘著蛋白抗體(Zymed Corp.，So.SanFrancisco，CA)阻斷的。
            
實施例8JY/αD+克隆的分離為了獲得穩定表達αdβ2整聯蛋白的JY細胞系，使用上述pMHneo/aD將JY細胞電穿孔，并通過在選擇性培養基中生長來選擇穩定的轉染子。選擇了細胞的G418-抗性群后，用抗-αd單克隆抗體212D和綿羊抗-小鼠-FITC(Sigma Corp.，S t.Louis，MO)將JT/aD+細胞染色。按照前述用于分離單一細胞JY/aD+克隆的流式細胞計，通過細胞分選分離單一細胞的JY/aD+克隆。
            
實施例9JY/aE+粘附測定法A.化合物稀釋把粘附培養基(350μl)(含有青霉素和鏈霉素，L-谷氨酸鹽，NaPy，和5％PBS的RPMI 1640)等分到深孔96-孔滴定平板(BeckmanInstruments，Inc.，Fullerton，CA)1-11列，A，C，E，G行的每個孔中，其中每個孔的容量為2.0ml。將所有篩選過的化合物溶解在DMSO中至最終濃度達到10mM。在-20℃貯存化合物，并于使用當天，在37℃的孵育箱中融化。將每種化合物(2.1μl)吸量到深孔滴定平板3-11列，A，C，E，和G行的單孔中。將2.1μl DMSO加入到不含化合物的孔(A1&A2，C1&C2，E1&E2，G1&G2)中。把抗-β7單克隆抗體，FIB504(ATCC，Rockyille，MD)，其阻斷αEβ7的結合活性，以7.5μg/ml的濃度加入到孔C2和G2中。包被每個深孔滴定板以防止干燥，并在37℃的孵育箱中貯存直到使用。B.粘附測定法粘附測定法是如下在96孔Immunlon 4平板(DynexTechnologies，Inc.，Chantilly，VA)中進行的。用D-PBS中的50μl E-鈣粘著蛋白/Ig(3.0μg/ml)包被每個孔。用捕獲抗體FIB504包被對照孔以量化100％輸入細胞的結合，或僅僅用包被緩沖液包被以測定本底結合。4℃過夜孵育后，用200μl/孔D-PBS洗平板3次，并用D-PBS中的1％BSA封閉至少1小時。除去BSA溶液，將100μl粘附培養基(含有青霉素和鏈霉素，L-谷氨酸鹽，丙酮酸鈉，0.1％BSA，和60ng/ml PMA的RPMI 1640)加到B-G行，1-11列的孔中。
            
在該點，將100μl濃度為60μM的，含有試驗化合物的粘附培養基一式三份從深孔96-孔滴定平板轉移到E-鈣粘著蛋白/Ig包被的粘附平板中。外側行的孔中填充有300μl D-PBS。將這些平板轉移到大氣中含有5％CO2的濕潤37℃孵育箱中。
            
粘附測定法通過將100μl JY/aE+細胞混懸液加入到E-鈣粘著蛋白-包被的平板的每個孔中而抑制。每個孔的最終體積是300μl含有105個細胞，PMA(最終濃度20ng/ml)，和試驗化合物(最終濃度20μM)的粘附培養基。37℃孵育平板30分鐘。一式三份測試每種化合物。
            
粘附細胞是通過加入50μl D-PBS中的14％戊二醛固定的。水洗平板，用100μl/孔的0.5％結晶紫(Sigma Corp.，St.Louis，MO)溶液染色5分鐘。加入300μl/孔70％乙醇，通過測定570nm處的吸光度來量化粘附細胞。細胞結合的百分比是通過使用已知測定法中三次測量的平均值在下列公式中確定的。 C.IC50的測定在試驗化合物最初的篩選過程中，每種化學實體是以20μM的固定濃度在細胞粘附測定法中試驗的。隨后，以多種濃度再次試驗可阻斷50％或更多的JY/αEβ7與E-鈣粘著蛋白/Ig依賴性粘附的化合物，以測定細胞結合減少50％時的抑制濃度，即IC50值。
            
在所篩選的化合物中，40，或總庫的1.4％可抑制40％或更多的αEβ7-E-鈣粘著蛋白粘附。在二芳基酰胺庫中鑒定了大約18種化合物，在二芳基硫化物庫中鑒定了22種化合物。在IC50測定法中，對這些原始采樣數再次分析之后，40種化合物中有4種顯示出能夠抑制JY/aE+與E-鈣粘著蛋白的結合，其IC50值不超過10μM。對很多原始采樣數都沒有做進一步的特性描述是因為它們最初的抑制活性不能再現；或化合物顯示出可抑制多種整聯蛋白-依賴性粘附事件；或IC50值超過10μM；或它顯示出任一細胞病變或細胞毒性作用。下列化合物在低于10μM的化合物濃度時，表現出可再現的抑制活性如表2所列的CmpdK，Cmpd W，Cmpd Z，Cmpd D。還有很多化合物可在初次篩選中表現出顯著的抑制活性，但再次分析之后，它們不能抑制JY/aE+/E-鈣粘著蛋白的結合。很可能某些二芳基化合物的活性是在反復冷凍和融化之后消失的。
            
為了評估每種化合物的選擇性，測定了額外結合配偶體化合物JY/αVβ3和玻連蛋白，JY/α4β1和VCAM/Ig，JY/αdβ2和VCAM，JY/αLβ2和ICAM-1，JY/αMβ2和iC3b，及JY/α4β7和MAdCAM-1的IC50值。
            
對于IC50測定法而言，把在50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋的50μl配體分散到Immulon-4平板的每個孔中。一個平板可用于試驗兩種不同的配體，每種一式三份。各種配體的包被濃度如下VCAM-1/Ig 2.0μg/ml；ICAM-1/Ig 5.0μg/ml；玻連蛋白0.5μg/ml；MAdCAM-1/Ig 3.0μg/ml；和iC3b 5.0μg/ml。以50μl/孔加入濃度為10μg/ml的捕獲抗體，例如抗-CD18單克隆抗體TS1/22。包被涂有配體的平板，并在4℃過夜貯存。第二天，傾出每個孔的內含物，并用200μl/孔的D-PBS把每個孔洗3次。然后通過加入300μl/孔的1％BSA/D-PBS溶液封閉平板。再次包被各平板，并在室溫孵育至少1小時。
            
對于IC50測定法而言，在DMSO中連續稀釋試驗化合物，以40μM，20μM，10μM，5.0μM，2.5μM，1.25μM，0.63μM，0.32μM和0.16μM的最終濃度進行試驗。在轉移到粘附平板之前，首先通過將4.2μl稀釋化合物轉移到預熱至37℃的96-孔深孔滴定平板中而稀釋，該平板含有0.7ml/孔RPMI 1640，0.1％BSA，和3ng/ml PMA(SigmaCorp.，St.Louis，MO)。把1％BSA/D-PBS封閉溶液從96-孔Immulon-4平板中傾出，并用0.2ml的稀釋化合物替換。對于要篩選的每個96-孔平板而言，離心收集大約8×106個細胞，并將其重懸浮在粘附培養基(含有0.1％BSA的RPMI 1640)中，使最終濃度達到106/ml。為了防止粘附測定法中的PMA-依賴性同型聚集，把抗-CD18抗體22F12C(ICOS Corp.，Bothell，WA)加入到細胞混懸液中，至最終濃度達到10μg/ml，37℃孵育細胞15分鐘。沒有將這種抗體加入到涉及JY/αLβ2，JY/αdβ2或JY/αMβ2及其相應配體ICAM-1，VCAM-1，或iC3b的CD18-依賴性粘附測定法中。
            
粘附測定是通過向Immulon-4平板的每個孔中加入100μl細胞混懸液而抑制的。37℃孵育平板30分鐘，通過加入50μl D-PBS中的14％戊二醛而使粘附細胞固定至少1小時。水洗平板，并用100μl/孔的0.5％結晶紫(Sigma Corp.，St.Louis，MO)溶液染色5分鐘。第二次水洗平板，以除去多余的結晶紫顏色，并向每個孔中加入300μl的70％乙醇。在平板分光光度計中，通過測定570nm處的吸光度而量化粘附細胞。細胞結合的百分比是通過使用已知測定法中的三次測量平均值而在下列公式中確定的。 
            
選擇在初次篩選中鑒定的4個化合物Cmpd K，Cmpd W，Cmpd Z，Cmpd D進行進一步的特異性描述，由此在額外的整聯蛋白-依賴性粘附事件中測定它們的IC50值。總之，在測定過程中，用2ng/ml PMA處理結合測定中所用的指示細胞系，以刺激整聯蛋白依賴性粘附。這4個化合物的IC50值是按照表5所示在粘附測定法中測定的。
            
表5 
            
實施例10α1，α2和α11 I結構域的克隆，表達和純化膠原結合整聯蛋白α1，α2和α11所含的I結構域序列與白細胞整聯蛋白αL，αM，αX和αd所含的I結構域序列同源。為了研究這些分子通過變構調節位點進行調節的可能性，評估了試驗化合物庫抑制這些整聯蛋白與其配體膠原和層粘連蛋白間相互作用的能力。
            
把α1和α2的I結構域序列和α11克隆到細菌表達載體pET15b(Novagen)中。這些構建體在大腸桿菌中的表達可產生具有氨基末端組氨酸標記物的蛋白，且“標記”蛋白可利用鎳柱純化。α11的克隆是按照先前所述進行的[Velling等，J.Biol.Chem.27425735-25742(1999)]。
            
在PCR擴增之后，將α1和α2的I結構域序列均克隆到pET15b中，加入限制位點，使I結構域被克隆到載體中具有組氨酸標記物的讀框中。α1 I結構域PCR反應的模板是全長α1 cDNA，其是按照先前所述，通過雜交從載體pcDNA-1Amp中的脾cDNA文庫克隆的。用于這種篩選的雜交探針是分別使用下列α1.5(SEQ ID NO20)和α1.3(SEQ ID NO21)引物的PCR反應產物5’-GACTTTCAGCGGCCCGGTGGAAGACATG-3’  SEQ ID NO205’-CCAGTTGAGTGCTGCATTCTTGTACAGG-3’  SEQ ID NO21樣品最初是在94℃孵育30秒，接著是94℃ 5秒和72℃ 2分鐘循環5次；94℃ 5秒和70℃ 2分鐘循環5次；94℃ 5秒和68℃ 2分鐘循環25次；最后在72℃孵育7分鐘。把PCR產物克隆到TOPO TA載體pCRII(Invitrogen)中并測序。所得克隆可用作與上面條件相同的PCR中的模板，凝膠純化所得擴增產物，并利用隨機引物標記試劑盒(Boehringer Mannheim)用32P標記，其可用作雜交探針。雜交是在與篩選全長α11 cDNA所用的相同條件下，使用ExpressHyb雜交溶液(Clontech)進行的。所得克隆，α1/pcdna/111被用作模板，從而亞克隆α1 I結構域。
            
α1 I結構域是使用如下所示的A1.5Nde(SEQ ID NO22)和A1.3Bam(SEQ ID NO23)引物，通過PCR擴增的。5’-ATATCATATGGACATAGTCATAGTGCTGG-3’SEQ ID NO225-ATATGGATCCCTAAGACATTTCCATTTCAAATG-3’  SEQ ID NO23α2 I結構域是使用載體pcDNA-1 Amp中的HUVEC cDNA文庫作為模板，利用如下所示的A2.5Nde(SEQ ID NO24)和A2.3Bam(SEQ IDNO25)引物，通過PCR克隆的。5’-ATATCATATGGATGTTGTGGTTGTGTGTG-3’SEQ ID NO245’-ATATGGATCCCTATGACATTTCCATCTGAAAG-3’ SEQ ID NO25擴增兩個I結構域的PCR條件包括最初在94℃孵育2分鐘，接著是94℃ 20秒；55℃ 30秒和72℃ 45秒循環30次；最后在72℃孵育7分鐘。凝膠純化PCR產物，用NdeI和BamHI消化，再次凝膠純化，并將其克隆到先前用同一種酶消化的pET15b中。對所得克隆α1/pet/2和α2/pet/27進行測序。
            
將α1，α2和α11 pET15b克隆轉化到細菌菌株BL21(DE3)pLysS(Stratagene)中用于表達。利用Ni-NTA瓊脂糖柱(QIAGEN)從大腸桿菌溶菌產物的可溶部分中分離出組氨酸標記的蛋白，并用咪唑梯度洗脫。相對于CMF-PBS透析洗脫的蛋白，并按照制造商建議的方案使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)將其生物素酰化。
            
用于測量96孔平板中α1或α2 I結構域與膠原結合的測定法包括使膠原與96孔平板的孔結合，向孔中加入生物素酰化的α1或α2蛋白，并利用銪-偶聯的鏈霉抗生物素蛋白和時間分辨熒光測量結合I結構域的膠原量。4℃時，用20μl/ml CMF-PBS中的大鼠I型膠原(Sigma)包被Immulon4 96-孔平板過夜。用250μl CMF-PBS把孔洗2次，并在30℃時用CMF-PBS中的2.5％ BSA封閉1小時。用200μl CMF-PBS洗孔，并以1μg/ml向孔中加入具有2mM MgCl2和1％BSA的CMF-PBS中的生物素酰化蛋白，或加入具有2mM MnCl2和1％BSA的TBS中的生物素酰化蛋白，37℃孵育3小時。用200μl相同的孵育緩沖液(沒有I結構域蛋白)將孔洗2次，加入100μl在SA-Eu稀釋緩沖液(Wallac)中1∶1000稀釋的鏈霉生物素蛋白銪(SA-Eu；Wallac)，從而檢測結合生物素酰化蛋白的膠原。室溫孵育1小時。用200μl孵育緩沖液將孔洗6次，向每個孔中加入100μlEnhancement溶液(Wallac；用水1∶1稀釋)，室溫保持5分鐘。利用Eugen程序測量熒光。
            
實施例11膠原結合的α2拮抗劑的鑒定FACS分析表明，Jurkat細胞可表達α1和α2整聯蛋白。利用單克隆抗體與這些整聯蛋白的結合研究顯示，Jurkat細胞與大鼠I型膠原的粘附主要是通過與α2相互作用介導的。例如，α2阻斷單克隆抗體已經顯示出可完全抑制Jrukat細胞與I型膠原的結合。鑒于這種結果，可將Jurkat細胞用于下述粘附測定法中，以鑒定α2結合的抑制劑。該測定法是對前述過程進行改進后進行的[Sadhu等，supra]。
            
Immulon 4平板(Dynex Technologies，Chantilly，VA)是4℃時，用(i)50μl大鼠I型膠原(Sigma)(在CMF-PBS中為20μg/ml)，(ii)pH9.6的碳酸氫鹽緩沖液中的抗-β1單克隆抗體3S3(5μg/ml)，(iii)或單獨的碳酸氫鹽緩沖液包被過夜的。用200μl/孔D-PBS洗平板一次，并在室溫時用D-PBS中的1％BSA(100μl/孔)封閉1小時。用100μl含有RPMI和1％滅活FBS的粘附緩沖液洗孔1次，并向每個孔中加入100μl含有PMA(10ng/ml的最終濃度)的粘附緩沖液。將有或沒有侯選抑制劑(最終濃度為20μM)的粘附緩沖液(100μl)加入到每個孔中，接著加入100μl粘附緩沖液中的Jurkat細胞(1×106個細胞/ml)，37℃孵育30分鐘。以50μl/孔加入D-PBS中的14％戊二醛來固定粘附細胞，室溫孵育2小時。用dH2O洗平板，并用50μl/孔10％乙醇中的0.5％結晶紫室溫染色5分鐘。多次更換dH2O洗平板，之后加入70％乙醇。利用SPECTRmax 250微量滴定板分光光度計系統(Molecular Devices，Sunnyvale CA)，通過在570nm和410nm處測量吸光度而量化粘附細胞。利用下列公式測定細胞結合的百分比。 利用下列公式將數據標準化  
            
有121種化合物可以對照組的50％或更高的水平抑制Jurkat與大鼠I型膠原的粘附。這些抑制劑的IC50測定是按照前面所述在Jurkat粘附測定法中確定的，區別在于抑制劑是在0.15-40μM的濃度范圍內，以兩倍的稀釋度測試的。測定了121種化合物中113種的IC50值，并根據測定法中2-17μMIC50范圍的效能選擇了這121種中的21種，它們在α4β7結合測定法(此處所述)和馮維勒布蘭德因子結合測定法(此處所述)中顯示出低水平抑制的特異性。進一步分析了這21種化合物的特異性和毒性。在特異性測定中，以0.15μM-20μM的濃度范圍測試了化合物抑制Jurkat細胞與固定化VCAM-1/Ig結合的能力。該測定法是按照與上述膠原粘附測定法相似的方式進行的，區別在于細胞是用VCAM-1/Ig代替膠原包被的。與VCAM-1的結合取決于α4β1的表面表達。這些結果在表6中給出。
            
對于這21種化合物而言，Jurkat細胞的毒性是在孵育4小時或24小時之后評估的。LD50濃度是按照制造商建議的方案，使用CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation AssaySystem(Promega)測定的。以40μM-0.15μM的濃度范圍測試兩倍連續稀釋的每種化合物。毒性測定法的結果在表6中給出。
            
表6 
            
實施例12膠原結合的α1拮抗劑的鑒定中國倉鼠卵巢(CHO)細胞不表達內源性膠原的受體。因此，CHO細胞是用全長α1表達構建體，α1/pDC-1/1轉染的。從載體pLEN的克隆中除去全長α1的插入物[Briesewitz等，JBC 2682989-2996(1993)]，并將該插入物亞克隆到pDC-1中，從而產生克隆α1/pDC-1/1。轉染于是在選擇性培養基(具有10％FBS的DMEM/F12)中生長的，并通過有限稀釋而克隆。α1表達克隆是通過用封閉性α1單克隆抗體(抗體5E8D9；Upstate Biotech)染色，并由FACS分析測定表達水平而鑒定的。這些細胞被證實是利用封閉性α1單克隆抗體(Upstate Biotech；克隆5E8D9)，以α1-依賴性的方式與IV型膠原粘附的，其中所述α1單克隆抗體可抑制這種粘附。鑒于這種結果，將α1轉染的CHO細胞用于下述粘附測定法中，以鑒定α1結合的抑制劑。這種測定法是上述鑒定α2拮抗劑的過程的改進。
            
Immulon 4平板是4℃時，用(i)50μl/孔的人IV型膠原(Sigma)(在CMF-PBS中為0.5μg/ml)，(ii)pH9.6的碳酸氫鹽緩沖液中的抗-α1單克隆抗體5E8D9，或(iii)單獨的碳酸氫鹽緩沖液包被過夜的。用D-PBS洗平板兩次，并在室溫時，用D-PBS中的1％BSA(100μl/孔)封閉1小時。用100μl/孔的粘附緩沖液(沒有血清的DMEM/F12培養基)洗孔一次。將有或沒有侯選抑制劑的粘附緩沖液(200μl)加入到每個孔中，接著加入100μl粘附緩沖液中的α1轉染的CHO細胞。CHO細胞是用維爾烯回收的，并在含有10％FBS的DMEM/F12培養基中洗3次。以0.75×106個細胞/ml的密度將細胞重懸浮在粘附緩沖液中。37℃時，在IV型膠原上孵育α1-轉染的CHO細胞30分鐘。粘附細胞是通過加入50μl/孔D-PBS中的14％戊二醛固定的，室溫孵育2小時。用dH2O洗平板，并用50μl/孔10％乙醇中的0.5％結晶紫室溫染色5分鐘。多次更換dH2O洗平板，之后加入70％乙醇。利用SPECTRmax250微量滴定板分光光度計系統(Molecular Devices，SunnyvaleCA)，通過在570nm和410nm處測定吸光度而量化粘附細胞。利用下列公式測定細胞結合的百分比。 利用下列公式使數據標準化  
            
有64種化合物可以DMSO-對照組的50％或更高的水平抑制α1-轉染的CHO細胞與IV型膠原的粘附。這些化合物的EC50測定是在上述α1-轉染的CHO細胞粘附測定法中測定的，區別在于抑制劑是在0.15μM-20μM(即，0.15μM，0.3125μM，0.625μM，1.25μM，2.50μM，5μM，10μM，20μM)的濃度范圍內，以兩倍的稀釋度測定的。這些化合物EC50值為0.5μM-18μM。進一步分析了這些化合物的選擇性和毒性。
            
對于最初的特異性測試而言，化合物是以0.15μM-20μM的濃度范圍測試其抑制α2-轉染的CHO細胞與I型膠原粘附的能力的。對于該測定法而言，CHO細胞是用α2表達構建體，α2/pDC-1/8轉染的。原始的α2構建體位于表達載體pcDNA-3中，而且它是一種從Invitrogen購買的Genestorm克隆。將α2序列亞克隆到產生克隆α2/pDC-1/8的pDC-1中。克隆α2-表達細胞，并使用α2單克隆抗體，A2-IIE10(Upstate Biotech)，通過FACS進行分析。鑒定表達中等水平α2的CHO細胞系，并將其用于上述α1的粘附測定法中。α2粘附測定法的唯一差別是(i)使用固定化的大鼠I型膠原(Sigma)替換I V型膠原，和(ii)使用α2單克隆抗體A2-IIE10替換α1單克隆抗體。與α2相比，絕大多數化合物都對α1的特異性范圍較窄。這些化合物對α1依賴性粘附的抑制比對α2依賴性粘附的抑制要有效大約1-3倍。
            
使用α1-轉染的CHO細胞在4小時測定法中評估化合物的毒性。此處所用的LD50濃度(或“致死劑量50”)是在規定的時間間隔內，殺死50％細胞所需的化合物濃度。LD50濃度是按照制造商建議的方案，使用CellTiter 96 Aqueous One溶液細胞增殖測定系統(Promega)測定的。每種化合物是在40μM-0.15μM的濃度范圍中，以兩倍的連續稀釋液測試的。這些化合物的毒性為2.5μM-40μM。
            
進一步分析了根據有效性，選擇性和毒性分布選擇出來的32種化合物的特異性。測試了化合物對于不太相關的含有I結構域的整聯蛋白αL(LFA-1)與αM(Mac-1)粘附的抑制。對于αL而言，測試了化合物對JY8細胞與ICAM-1粘附的抑制。ICAM-1/JY-8細胞粘附測定法本發明化合物的生物相關活性是利用細胞粘附測定法測量化合物阻斷JV-8細胞(一種在其表面表達LFA-1的，人類EBV-轉化的B細胞系)與固定化的ICAM-1粘附的能力加以證實的。按照α1測定法所述，在進行某些改進的情況下，篩選可抑制LFA-1依賴性粘附的化合物。用ICAM-1 Ig蛋白(在碳酸氫鈉緩沖溶液中為5μg/ml)替換IV型膠原包被平板。用JY細胞替代K562[α1]細胞。所用的捕獲單克隆抗體是22F12C(在碳酸氫鈉緩沖溶液中為5μg/ml)，用來替換α1單克隆抗體。
            
對于αM而言，測試了化合物對Mac-1轉染的JY細胞與iC3b粘附(實施例2所述的測定法)的抑制。對于兩種測定法來說，化合物均是在20μM-0.15μM的濃度范圍中，以2倍的連續稀釋液測試的。絕大多數化合物對α1依賴性粘附的抑制要比對LFA-1和MAC-1依賴性粘附的抑制有效1-10倍。使用CHO細胞所述的方法使用JY細胞在4小時測定法中分析這些化合物的毒性。
            
為了進一步評估所鑒定的α1拮抗劑，又進行了第二次α1-依賴性細胞粘附測定。用全長α1表達構建體α1/pMHneo/40轉染K562細胞，一種骨髓性白血病細胞系。α1/pMHneo/40構建體是通過將全長α1序列亞克隆到表達載體pMH-neo中產生的[Hahn等，Gene 127267-268(1993)]。選擇具有0.5mg/ml G418的轉染子。為了進一步選擇α1-表達細胞，挑選了與IV型膠原粘附的轉染子。為了進行挑選，37℃時用CMF-PBS中的20mg/ml人類IV型膠原(Sigma)包被組織孵育平板1小時。用結合緩沖液(具有10％FBS的RPMI)洗平板，并把α1-轉染的K562細胞加入到含有20ng/ml PMA的結合緩沖液中。37℃孵育1小時后，洗平板以除去未結合的細胞。用維爾烯除去粘附細胞，并用結合緩沖液稀釋。挑選后，得到表達α1的K562細胞系，并將其用于下述的進一步篩選中。
            
在α1-轉染的K562細胞粘附測定法中，進一步分析了在CHO細胞粘附測定法中鑒定的21種α1拮抗劑。所述細胞粘附測定法是按照前述CHO細胞粘附測定法進行的，區別在于將RPMI用作粘附緩沖液。在K562和CHO細胞粘附測定法中，α1拮抗劑的有效性是相似的，絕大多數化合物的最大EC50值落在兩種測定法間的1-3倍范圍內。使用上述CellTiter 96 Aqueous One溶液細胞增殖測定系統，在4小時測定法中，用K562細胞分析化合物的毒性。在K562和CHO測定法中，絕大多數化合物的毒性(LD50)是相似的。對于絕大多數化合物而言，兩種測定法間的LD50值在小于2倍的范圍內變化。
            
5種α1拮抗劑的結構在表7中給出。這些化合物具有0.5-1.5μM的EC50值。與α2相比(1-4倍)，這些化合物對α1的特異性比較窄，對不太相關的整聯蛋白，如LFA-1和Mac-1的選擇性較高(3-10倍)。有效性(EC50)和毒性(LD50)之間的窗為6-20倍。
            
表7  
            
實施例13α1 I結構域的表達和純化及其在生物化學測定法中的用途為了在大腸桿菌中表達作為組氨酸標記蛋白的α1 I結構域，生產了α1 I域結構。把組氨酸標記的蛋白用于共結晶實驗中，以測定與抑制劑結合的α1 I結構域的3維結構。組氨酸標記的蛋白也可用于通過測量α1 I結構域與固定化膠原的結合而在生物化學測定法中評估α1拮抗劑。
            
α1 I結構域是如下克隆的。使用如下所示的A1.I.Bam(SEQ IDNO26)和A1.I.Pst(SEQ ID NO27)引物，和作為模板的載體α1/pDC-1/1，通過PCR擴增編碼α1 I結構域的多核苷酸。A1.I.BamCGGATCCCCCACATTTCAAGTCGTGAATSEQ ID NO26A1.I.PstGCTGCAGTCATATTCTTTCTCCCAGAGTTTT SEQ ID NO27PCR條件包括最初在94℃孵育2分鐘，接著是94℃ 30秒；55℃ 30秒和72℃ 30秒循環30次；最終在72℃孵育7分鐘。所得PCR產物凝膠純化，用BamHI和PstI消化，再次凝膠純化，然后克隆到先前用BamHI和PstI消化的載體pQE30(Qiagen)中。所得克隆α1/pQE30/2通過測序加以證實。
            
將α1/pQE30/2構建體轉化到用于蛋白表達的大腸桿菌菌株M15(pREP4)(Qiagen)中。使用6M胍從純化的內含體上將組氨酸-標記的α1 I結構域溶解下來，然后通過在沒有胍的緩沖液中稀釋而急速再折疊。使用N i-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)純化溶解的α1 I結構域，并用咪唑梯度洗脫。
            
將純化的α1 I結構域用于固定化IV型膠原的直接結合測定法中。Costar Immulon4平板(96孔)是用(i)50μl/孔，CMF-PBS中的40μg/ml人膠原IV蛋白(Sigma)，(ii)CMF-PBS中的10μg/ml抗-α1 I結構域單克隆抗體(Immune Diagnostics)(陽性對照)，或(iii)單獨的CMF-PBS(陰性對照)包被過夜的。4℃孵育平板過夜。第二天，除去培養基，并把平板吸干，之后以150μl/孔，加入含有0.05％吐溫-20的CMF-PBS中的2％BSA以封閉平板，37℃再孵育平板1小時。再次除去平板中的培養基并吸干，然后用150μl/孔含有0.05％吐溫-20和5mM MgCl2(PBS/T/Mg)的CMF-PBS洗2次。將大約50μl/孔含有2X化合物，DMSO，抗-α1 I-結構域單克隆抗體，同種型匹配的對照單克隆抗體或沒有抑制劑的PBS/T/Mg加入到平板中，之后50μl/孔加入含有20μg/ml純化α1 I結構域的PBS/T/Mg，37℃孵育平板30分鐘。除去培養基，并把平板吸干，然后用100μl/孔PBS/T/Mg洗2次，之后100μl/孔加入含有1μg/ml抗-五-His單克隆抗體(Qiagen)的PBS/T/Mg。37℃孵育平板30分鐘，然后除去培養基，并把平板吸干。然后用100μl/孔PBS/T/Mg洗平板2次，100μl/孔加入含有1∶20,000稀釋的GAM-HRP的PBS/T/Mg(Sigma)，37℃孵育平板30分鐘。除去培養基，并吸干平板。用100μl/孔PBS/T/Mg洗平板2次，并向每個孔中加入100μl/孔的底物緩沖液，該底物緩沖液含有150μl/l的H2O2和1∶100稀釋的TMB底物原液，室溫時，在黑暗中對平板顯影30分鐘。然后加入50μl/孔15％H2SO4以終止反應，通過A450-A670分光光度計分析該平板。特殊信號是通過減去與“陰性對照”孔結合的本底而測定的。
            
另一個測定法是使用銪-標記的α1 I結構域進行的，結合的I結構域在洗滌后用時間分辨熒光(TRF)直接檢測的。在該測定法中，純化的α1 I結構域是按照制造商建議的方案(Wallac)，利用DELFIA銪標記試劑盒用銪標記的。Costar Immulon4平板(96孔)是用CMF-PBS/1μM MgCl2中，100μl，25μg/ml的人IV型膠原蛋白(Sigma)包被的，并在4℃孵育過夜。然后用200μl/孔TBS/T(20mM Tris，pH8.0；150mM NaCl；0.02％吐溫-20)和200μl/孔1mM MgCl2(TBS/T/Mg)洗平板3次。37℃時，用100μl/孔CMF-PBS/1mM MgCl2/2％BSA封閉平板1小時。再次洗平板，然后用100μl/孔，RPMI/5％TBS/1mM MgCl2中的5g/ml銪I結構域探查，37℃孵育1小時。再次洗平板，通過加入100μl/孔Enhance(Wallac)而顯影，并通過時間分辨熒光在Victor平板讀數器上分析。
            
實施例14α1β1亮氨酸拉鏈蛋白的表達和純化及其在生物化學測定法中的用途為了研究出一種在生理學上更準確的生物化學測定法，制造了α1β1亮氨酸拉鏈蛋白。制備表達構建體，其分別編碼沒有跨膜和胞質尾部多肽序列的α1和β1的全長胞外結構域。除去跨膜區，使這些蛋白從轉染細胞分泌，從而可進行簡易純化。所述跨膜序列分別是用酸性和堿性亮氨酸拉鏈序列替換的。通常見Chang等，PNAS 9111408-11412(1994)。
            
α1的胞外結構域是從pLEN中的原始α1克隆亞克隆的[Briesewitz等，JBC 2682989-2996(1993)]。β1的胞外結構域是從全長β1克隆He6.1.2/pcDNA-1Amp亞克隆的。這種克隆是通過雜交篩選Hela cDNA文庫獲得的。亮氨酸拉鏈序列可促進α1β1異二聚體的形成。這些構建體是利用與2001年6月26日提交的美國專利US6,251,395所述相同的亮氨酸拉鏈序列和載體制造的，其中實施例14有關構建體亮氨酸拉鏈蛋白方法的描述引入此處作為參考。α1和β1亮氨酸拉鏈構建體被共-轉染到CHO細胞中，然后在具有10％透析FBS的DMEM/F12培養基中保持。收集上清液，利用與抗-亮氨酸拉鏈單克隆抗體偶聯的CNBr-活化Sepharose 4B(Pharmacia)色譜純化分泌的α1β1異二聚物，其中所述抗-亮氨酸拉鏈單克隆抗體可識別亮氨酸拉鏈的兩個鏈。為了在生物化學測定法中使用，按照制造商建議的方案，使用DELFIA銪-標記試劑盒用銪標記純化的α1β1亮氨酸拉鏈蛋白。標記的α1β1亮氨酸拉鏈蛋白與固定化膠原的結合是利用時間分辨熒光測量的。建立與銪標記的I結構域測定法基本相同的異二聚物測定法，區別在于使用CMF/PBS1mM MgCl2/2％BSA中銪標記的異二聚物替換銪標記的I結構域作為探針。
            
實施例15馮維勒布蘭德因子/gpIb-CHO靜態細胞粘附測定法馮維勒布蘭德因子(vWf)中的A11結構域與在其它蛋白中發現的I結構域同源。為了研究這些分子可進行相似調節的可能性，測試了試驗化合物庫調節vWf與gpIb結合的能力。
            
4℃時，用CMF-PBS中的50μl，1μg/ml牛vWf(bvWf)包被圓底(RB)玻璃平板過夜。對照孔包括用50μl/孔，5μg/ml vWf包被的孔，或用10μg/ml血纖蛋白原包被的孔。第二天早上，用200μl的CMF-PBS洗平板1次，37℃時用200μl的2.5％明膠封閉，并用200μl的CMF-PBS洗3次。
            
用編碼糖蛋白(GP)Ib-IX的DNA轉染的CHO細胞[Cranmer，J.Biol.Chem.2746097-6106(1999)]是在DMEM/F12中生長的，其中所述DMEM/F12含有10％FCS，抗生素，谷氨酸鹽和補充有400μg/mlG418和200μg/ml的zeocin(Invitrogen)的5-羥色胺。用CMF-PBS洗融合細胞1次，用溫的維爾烯在孵育箱中孵育5分鐘。收集細胞，并以2×106個細胞/ml的密度在具有4ml EDTA的Tyrode’s溶液中重懸浮。
            
在Tyrode’s/EDTA中稀釋試驗化合物庫至20μM，向每個孔中加入50μl稀釋化合物至10μM的最終濃度。為了進行對照，將1μl100％DMSO加入到300μl細胞中，DMSO的最終濃度為0.3％。在具有已知vWf抑制劑的對照組中，把金精三羧酸(ATA，Sigma)溶解在100％DMSO中至20mM，用Tyrode’s/EDTA稀釋至20μM，以50μl/孔加至最終濃度10μM。
            
向每個孔加入50μl，密度為105個細胞/孔的細胞，室溫振搖平板40分鐘。吸出未-粘附的細胞，加入200μl CMF-PBS，將平板旋轉，并除去緩沖液。加入鈣黃綠素(50μl/孔2μM原液)，室溫孵育平板1小時，從而標記粘附細胞。用Millipore CytoFluor 2350熒光計測量熒光以量化粘附細胞。鑒定了許多IC50值小于20μM的化合物。
            
實施例16CD11b-介導的嗜中性白細胞與血纖蛋白原的粘附對上述CD18/CD11b-(Mac-1)-介導的HL-60細胞與ICAM-1粘附的粘附測定法進行下列改進。4℃時，用50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的50μl血型糖蛋白(10μg/ml)，血纖蛋白原(5μg/ml)或用抗-CD18單克隆抗體(22F12C，5μg/ml)和抗-CD11b單克隆抗體(44AACB，5μg/ml)包被過夜。用1％人血清白蛋白封閉平板，且其中沒有使用封閉性抗體。嗜中性白細胞是通過密度梯度離心，從新鮮的肝素全人血中分離出來的，并將粘附緩沖液中的100μl細胞(4×106)加入到每個孔中。37℃孵育平板10分鐘。
            
共篩選了超過1000種化合物，很多均具有1μM-40μM的IC50值。有9種化合物的IC50值低于10μM[表2所列的Cmpd S，Cmpd R，Cmpd N，Cmpd O，Cmpd P，Cmpd Q，Cmpd L，Cmpd V，和Cmpd F]。在基于化合物Cmpd S(其最初具有1μM的IC50)的SAR嘗試后，化合物抑制效力提高至小于200nM(相對于Cmpd AA和Cmpd AC而言)，且很多化合物在20μM時都顯示出完全的抑制[化合物Cmpd Z-CmpdAM]。除了Cmpd Z外，所有化合物抑制αEβ7/E-鈣粘著蛋白的能力也可拮抗其它β7整聯蛋白，α4β7。這些化合物對αLβ2，αdβ2和α4β1顯示出極低的抑制活性。且，相對于αEβ7/E-鈣粘著蛋白而言，這些化合物對αMβ2和αVβ3的選擇性有限(小于2倍)。
            
實施例17Rac1鳥嘌呤核苷酸交換反應的抑制劑的開發當與GDP結合時，Rac蛋白是無活性的，但可通過用GTP交換GDP而被活化。把Rac蛋白中的GDP換成GTP是通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)如，Vav1和Tiam1[Aghazden等，Cell 102625(2000)；Worthylake等，Nature 408682(2000)]催化的。由于Rac蛋白在控制細胞增殖方面的重要性，Rac鳥嘌呤核苷酸交換反應的拮抗劑和，特別是在Tiam 1存在情況下，阻礙Rac1中的GDP交換成GTP的小分子是本發明方法和組合物的重要目標。A.Rac1和Tiam 1的克隆和表達Rac1和Tiam1的DH-PH結構域是利用標準重組DNA過程克隆的[Disbury等，J.Biol.Chem.26416378(1989)]。Rac1是按照前述方法，使用載體pGEX2T，在作為GST融合蛋白的大腸桿菌中表達的[Self和Hall，Meth.Enzymol.2563(1995)]。純化的凝血酶裂解Rac1蛋白被用于該測定法中。
            
羅斯曼和Campbell，Meth.Enzymol.32525(2000)描述了利用質粒pET28a，將Tiam1 DH-PH結構域表達為含有羧基末端6Xhis標記物的融合蛋白。B.鳥嘌呤核苷酸交換測定法Tiam1催化的，Rac1中GDP到GTP的交換基本上是按照Crompton等，J.Biol.Chem.275(33)25751(2000)描述的過程進行的。結合GDP的Rac1是用[α32P]-標記的GTP，在有Tiam1存在的情況下孵育的，而核苷酸交換是通過與Rac1結合的放射性的增加監測的。游離放射性是通過將反應混合物放在96孔平板的孔中，過濾掉沒有與Rac1結合的[α32P]GTP部分而除去的。在篩選核苷酸交換拮抗劑的過程中，化合物是以10μM的濃度使用的。下面進一步描述通過篩選方法分析的化合物。C.細胞增殖測定法為了測試Rac1鳥嘌呤核苷酸交換抑制劑對細胞增殖的作用，分別將大鼠胚胎成纖維細胞(REF)和Jurkat細胞選作成纖維細胞和T細胞的代表。在培養基RPMI(“REF-R細胞培養物”)中培養的REF是按照Nobes，Meth.Enzymol.325441(2000)所述獲得的。將完全RPMI和10％胎牛血清(FBS)中的REF-R或Jurkat細胞一式兩份，以10×103個細胞/孔平板接種到96孔平板中。21小時(對于Jurkat而言)，和45小時(對于REF-R而言)后，加入AlamarBlue(Serotec)，并將細胞放回到孵育箱(37℃，5％CO2)中再孵育3小時。結果是利用SpectraMaxGEMIN(Molecular Devices)得到的。
            
得到了可以對照組的至少50％的水平抑制Rac1鳥嘌呤核苷酸交換反應的化合物。多數化合物的IC50值是在有Tiam1存在的情況下，相對于Rac1的鳥嘌呤核苷酸交換反應測定的。表8給出的5種結構代表了最有效的抑制劑，其中還包括了這些化合物對于鳥嘌呤核苷酸交換反應的IC50值。
            
表8   實施例18細菌蛋白的抑制將3種含有羅斯曼折疊結構的微生物酶定為篩選試驗化合物庫的候選者。選擇基于(i)存在羅斯曼結構；(ii)原核及真核細胞中的表達模式；(iii)臨床價值；和(iv)對細菌生長和存活的功能性價值。所選蛋白中有兩種，即二氫吡啶二羧酸還原酶(DHPR或DapB)和烯酰-acp還原酶(ENR)可催化電子從NADH到底物的轉移，且對于賴氨酸合成及脂肪酸合成的生物合成途徑而言是必需的。第三和第四種蛋白，大腸桿菌ras樣GTP酶(ERA-GTA酶)和yihA(也是一種GTP酶)涉及翻譯和細胞周期的調節。
            
DapB活性的調節是利用光學測定法評估的，其涉及二氫吡啶二羧酸自天冬氨酸鹽半醛的合成。該測定法利用二氫吡啶二羧酸合成酶(DapA)首先合成二氫吡啶二羧酸，接著加入NADH和DapB。偶聯反應是必需的，這是因為二氫吡啶二羧酸是一種不穩定的化合物。在有和沒有試驗化合物存在情況下的吸光度的改變是在340nm處監測的，其中NADH轉化成NAD+。
            
ENR調節劑的鑒定是在相似方式，但單一步驟的反應中進行的。簡單地說，首先孵育NADH和ENR，接著加入底物，(巴豆酰基-CoA或巴豆酰基-ACP)。另外，在340nm處監測有和沒有試驗化合物存在情況下的吸光度的改變，其中NADH轉化成NAD+。
            
鑒于光學測定法需要大量底物，即巴豆酰基CoA的事實，及很多試驗化合物均是在與NADH相同波長下吸收的事實，設計了選擇性的薄層色譜法(TLC)和平板測定法，從而利用放射性標記的NADH鑒定ENR的調節劑。
            
TCL方法可在有氯化鋰存在的情況下，測量32P-NADH到NAD+的轉化，其在5-10分鐘的顯影時間后，在PEI膜上引起兩種sates的分離。放射性標記的斑點是在Storm Phosphoimager上測量的，并計算了NAD-到NADH的比例。在有試驗化合物存在的情況下，NADH到NAD-比例的增加表明轉化的抑制。優化對照反應以測量線性范圍內的轉化。這種測定法的實踐應用是利用市售的酶抑制劑加以證實的。TLC方法特別適于小規模篩選。
            
對于大規模篩選而言，將平板測定法設計成使用相同的試劑。該測定法利用NADH和NAD+之間的電荷差異而分離。正電荷的DEAE纖維素膜被用于選擇性捕獲32P-NADH，32P-NADH具有比NAD+更多的凈負電荷。利用閃爍計數檢測捕獲的NADH，在有試驗化合物存在的情況下，信號增加表明酶的抑制。
            
對于ERA-GTP酶而言，進行了單一步驟的測定法以鑒定調節劑。在GTP到GDP的轉化中，標記磷的轉移是在有和沒有試驗化合物存在的情況下測量的，所述標記是利用本領域通常使用的測定法，在閃爍記數中檢測的。ERA GTP酶測定法的條件也可用于篩選yihA調節劑。
            
實施例19HPPK拮抗劑的鑒定6-羥甲基-7，8-二氫喋呤焦磷酸激酶(HPPK)是葉酸從頭生物合成級聯的一部分，并可催化焦磷酸從ATP到6-羥基-7，8-二氫喋呤(HMDP)的轉移[Richey等，J.Biol.Chem.2441582-1592(1969)]。HPPK可在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，真菌和原生動物中表達，但不在高級真核生物中表達。因此，HPPK代表了一種新的，研究具有抗-葉酸活性的抗生素的目標。1.大腸桿菌HPPK基因的分離大腸桿菌HPPK基因是使用下列對HPPK基因5’(SEQ ID NO28)和3’(SEQ ID NO29)末端具有特異性的寡核苷酸引物，通過PCR擴增大腸桿菌的基因組DNA而分離的5’EcHPPK5’-GTAGATGACAGTGGCGTATATT-3’ SEQ ID NO283’EcHPPK5’-GCCTTACCATTTGTTTAATTTGT-3’SEQ ID NO29PCR是標準條件下，在Perkin Elmer Cetus(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)DNA熱循環儀中進行的。通常見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.3，p.15.1.1-p.15.1.15(1999)。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，以測定PCP產物的大概大小，并按照預期的，檢測了一個大約487bp的單一DNA片段。
            
按照制造商的方案，把HPPK PCR產物與載體pCRII-TOPO(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)連接。按照制造商的建議，用連接反應的等分試樣轉化大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，分離出單一的細菌菌落，并使其在含有100μg/ml羧芐青霉素的LBM培養基中生長過夜。
            
利用Wizard Plus Miniprep試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)從2ml單一集落的培養物中分離出質粒DNA。經檢測，質粒pCRII-TOPO/EcHPPK中大腸桿菌HPPK PCR產物的DNA序列是正確的，并具有SEQ ID NO30所列的氨基酸序列。2.His(6)-HPPK表達構建體的產生為了促進大腸桿菌HPPK的純化和檢測，在隨后的PCR擴增過程中，對大腸桿菌HPPK編碼序列進行了下列改變1.)修飾HPPK的氨基末端，以插入一個額外的6組氨酸殘基，和2.)將單獨的限制位點加入到編碼區的5’和3’末端，以促進PCR片段亞克隆到表達載體pBAR5中。將類似的PCR片段亞克隆到表達載體中的方法先前已經在1998年12月8日提交的美國專利申請US5,847,088中描述，其實施例8引入此處作為參考。5’PCR引物含有一個NcoI限制位點，接著是如下所示編碼額外氨基酸殘基的序列“MGHHHHHHGG”(SEQ ID NO31)5’EcHisHPPK   SEQ ID NO325’-CGCCATGGGCCACCACCACCACCACCACGGCGGCATGACAGTGGCGTATATT-3’3’PCR引物含有一個XhoI限制位點，其如下所示3’EcXhoHPPK   SEQ ID NO335’-CGGCTCGAGTTACCATTTGTTTAATTTGT-3’利用這些引物，在標準PCR擴增反應中，擴增487bp的HPPK PCR產物，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應的等分試樣。檢測到一個與預期大小相符的大約519bp的單一帶。PCR擴增產物是利用QIAquick PCRPurification試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)純化的，并用限制酶NcoI和XhoI消化。把消化的PCR產物連接到NcoI-和XhoI-消化的質粒pBAR5中，連接反應的等分試樣用于按照制造商(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)的方案轉化TOP10細菌。在含有羧芐青霉素的LBM瓊脂平板上接種之后，分離單一的集落。很多單一的集落都是在2ml含有羧芐青霉素的LBM培養物中生長過夜的，并分離質粒DNA用于按照前面所述進行DNA測序。質粒pBAR5/HisHPPK含有一個編碼His(6)-HPPK基因的可讀框，其具有下列SEQ ID NO34中所列的氨基酸序列。3.HisHPPK的表達利用標準方法，使用質粒pBAR5/HisHPPK轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen Inc.，Madison，WI)。在含有氯霉素和羧芐青霉素的LBM平板上接種之后，選擇轉化體，從而分別選擇質粒pLysS和pBAR5/HisHPPK。質粒pLys是一種編碼T7 lysozome的質粒。Lysozome的存在可在凍-熔循環之后幫助細胞溶解。
            
為了開始大規模的HisHPPK表達，30℃時，邊振搖邊使50ml含有pBAR5/HisHPPK的BL21(DE3)pLysS培養物在含有羧芐青霉素和氯霉素的LBM中過夜生長。第二天，將10ml過夜培養物用于接種2升含有500ml LBM的燒瓶，其中所述LBM補充有羧芐青霉素和氯霉素。37℃時，振搖培養燒瓶，直到細菌培養物達到約0.6的OD600。
            
質粒pBAR5/HisHPPK含有HisHPPK基因的阿拉伯糖-誘導型啟動子上游。一旦培養物達到適宜的密度，就將阿拉伯糖加入到培養物中至0.1％的最終濃度，以誘導HisHPPK表達，37℃時，振搖培養燒瓶2.5小時。然后離心采集細菌，并將從1升細菌培養物中的細胞團塊重懸浮在溶解緩沖液[50mM Na2HPO4，pH8，50mM咪唑，10mM β-氫硫基乙醇，0.5M NaCl，和沒有EDTA的蛋白酶抑制劑雞尾酒片(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)]中至35ml的最終體積。將35ml細菌混懸液轉移到50ml聚丙烯管中，在干冰上急速冷凍，然后在-20℃貯存。4.HisHPPK的純化將35ml等分試樣在冰上融化，并在French press中溶解。為了獲得代表可溶蛋白部分的澄明溶菌產物，4℃時，以20,000xg離心溶菌產物30分鐘。HisHPPK是利用兩步過程純化的。
            
首先，通過用NTA瓊脂糖培養澄明的溶菌產物而除去非特異性結合Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)的細菌蛋白，其中所述NTA瓊脂糖事先已經用EDTA處理過以除去結合的Ni2+陽離子。4℃時，用1ml NTA瓊脂糖分批培養35ml澄明的溶菌產物約1小時，之后離心除去NTA樹脂。HisHPPK是按照制造商的方案(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)在Ni-NTA瓊脂糖上純化的。將分離的HisHPPK蛋白在12％ Novex凝膠(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)上分離，固定凝膠，并在標準條件下用考馬斯亮藍染色，而且在HisHPPK制劑中鑒定的唯一蛋白是大約19kD大小的單一種類，其與HisHPPK預期的大小一致。用20mM Tris，pH8透析蛋白，等分，并在-70℃貯存。5.HPPK活性的篩選測定法為了鑒定HPPK的小分子抑制劑，使用了測量從ATP到AMP的HPPK-依賴性轉化的HPPK測定法，AMP是6-羥甲基-7，8-二氫喋呤(HMDP)焦磷酸化的副產物[Shi等，J.Med.Chem.441364-1371(2001)]。在該測定法中，使兩種底物(HMDP和ATP)的濃度升高可減小鑒定底物競爭者的可能性。對該反應進行改進，以便在下面的96-孔V-底聚丙烯平板中使用。
            
制備下列組分的主要混合物，其含有50mM Hepes，pH8.5，100μM HMDP(Schircks Laboratories，Jona，Switzerland)，10mMMgCl2，35μM三磷酸腺苷，和10ng γ-標記的32P-ATP(AmershamPharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)。將主要混合物的等分試樣加入到96-孔測定平板的每個孔中。并將20μM最終篩選濃度的侯選抑制劑化合物以5μl/孔加入到測定平板中。在加入到測定平板中前，先將每個侯選化合物在DMSO中稀釋；最后測定混合物中的DMSO最終濃度為5％。該反應是通過加入100ng純化的HisHPPK開始的，并在37℃進行15分鐘。該反應是通過向每個孔中加入等體積的120mMEDTA終止的。為了分離AMP中放射性標記的ATP，將2μl反應體積點在PEI纖維素平板上，并用0.3M KH2PO4對平板顯影。平板的放射性是使用系統Molecular Dynamics Storm 860 Phosphor圖像儀系統(Molecular Dynamics Storm，Sunnyvate，CA)測量的。化合物存在情況下的HPPK酶活性是由放射性標記的ATP到AMP的轉化百分比推斷的，這種轉化是一式兩份相對于僅有DMSO的對照反應進行的。因為缺少底物的樣品中的非特異性本底少于1％，因此沒有進行校正。篩選了大約2,520種化合物，大約58種化合物可抑制HPPK的活性達55％或更高，命中率2.3％。這些化合物是通過IC50的測定值，按照體外有效性分類的。6.HPPK拮抗劑對大腸桿菌TolC細菌生長的作用為了確定HPPK命中物的體內活性，利用微量滴定板肉湯測定法測量了抑制大大腸桿菌生長所需的最小抑制濃度(MIC)。MIC被定義為與僅有DMSO的對照組相比，減少80％生長所需的最小濃度。更具體而言，這些化合物的有效性是相對于TolC基因中含有突變的大腸桿菌菌株測量的。TolC基因編碼跨周質流出泵，其促進小分子如蛋白毒素和抗生素從細菌胞質溶膠的流出[Andersen等，Curr.Opin.Cell.Biol.13412-416(2001)]。雖然，這種突變對化合物進入到細菌中沒有影響，但某些傾向于通過流出泵消除的化合物可在TolC突變體中達到一個更高的胞內濃度。所有微量滴定板肉湯測定法的那些方案都是由National Committee for Clinical LaboratoryStandards[稀釋需氧生長細菌的抗微生物敏感性試驗的方法；approved standard-5thEdition.Vol.20，No.2.NCCLS Guidelines.Wayne，Pennsylvania(2000)]建立的。
            
微量滴定板肉湯測定法是在Mueller-Hinton肉湯中進行的，其含有較低水平的胸腺嘧啶核苷。細菌培養基中胸腺嘧啶核苷的存在可拮抗抗葉酸三甲氧芐二氨嘧啶和新諾明的活性，且很可能還可以拮抗HPPK抑制劑。
            
在加入到微量稀釋平板中之前，先將化合物在DMSO中連續稀釋2倍。每個平板含有兩個對照連續稀釋的三甲氧芐二氨嘧啶為每個平板提供陽性對照，而含有未接種的Mueller-Hindon肉湯的第二行可作為監測孔間交叉污染的無菌對照。接種物的密度大約為105個細菌/ml，最終體積為100μl。在測量OD600之前，孵育平板16小時。
            
表9給出在MIC測定法中具有最高活性的4種化合物。這些化合物在大腸桿菌TolC中的最小抑制濃度為0.1-12.5μM。然而，MIC測定法不能區別作用的制菌和殺菌模式，而且也不能確定這些化合物是否可在體內選擇性抑制HPPK。實驗正在進行之中，以確定這些化合物是否具有抗-葉酸的活性并可在體內抑制HPPK。已經確定了傳統抗-葉酸，如三甲氧芐二氨嘧啶和新諾明的活性是通過細菌培養基中胸腺嘧啶核苷的存在而拮抗的[Amyes和Smith，J.Med.Microbiol.7(2)143-153(1973)]。測定單獨的Mueller-Hinton培養基中，或補充有胸腺嘧啶核苷的培養基中，每種化合物MIC。如果二芳基硫化物可體內抑制HPPK，那么它們的活性應當在有葉酸的終產物胸腺嘧啶核苷存在的情況下減弱。選擇性地，還可分析這些化合物與三甲氧芐二氨嘧啶結合時，協同抑制細菌生長的能力。協同作用僅僅發生在二芳基化合物和三甲氧芐二氨嘧啶均作用于同一生物化學途徑的情況下。三甲氧芐二氨嘧啶和試驗化合物的組合分析是在標準的“棋盤”研究中進行的，其中交叉-滴定這些化合物，并按照前面所述分析它們對微量滴定板肉湯測定法中的細菌生長的作用[Eliopoulos和Moellering，Jr.，抗微生物組合，pp.330-393，Antibiotics in LaboratoryMedicine，4thEdition.(V.Lorian de.，1996)]。
            
表9   實施例20鑒定ftsZ抑制劑的測定法FtsZ是細菌必要基因的產物，其涉及細胞的分化。FtsZ結合并水解GTP，且當與GTP結合時，它可形成長的線型聚合物。FtsZ的GTP-依賴性聚合與它在細菌細胞分化方面的功能有關。在分離過程中，ftsZ形成一個環，從而限定了細胞分化的平面。缺少ftsZ的細胞不能經歷分離，不會分化和死亡。FtsZ在細菌界高度保守(大約60％)。因此，ftsZ抑制劑可代表具有新作用機理的廣譜-抗生素。FtsZ的原子結構是通過x-射線衍射確定的，它是一種α/β蛋白[Nogales等，(1998)Nature Structural Biology 5451-458]。與ftsZ最相似的結構是真核蛋白微管蛋白，它是一種GTP-結合及水解蛋白，而且可聚合形成在細胞分化過程中，對細胞器和染色體的分離具有重要作用的微管。
            
鑒定ftsZ抑制劑的聚合測定法可在已經設計的微量滴定板的孔中進行。聚合測定法是微管蛋白聚合測定法的改變[Bollag等，CancerResearch 552325-2333(1995)]，它包括以GTP-依賴性方式可逆地聚合ftsZ。
            
在有GTP和10mM CaCl2存在的情況下，5nm ftsZ線型聚合物聚合成更高等級的聚合物[Yu等，EMBO 165455-5463(1997)]，它大到足以被0.2μm過濾器捕獲。將留在過濾器上的蛋白染色，并在比色測定中檢測。含有通過100μM GTP聚合的300μg/ml ftsZ的反應是相對于10μM侯選ftsZ抑制劑篩選的。
            
還設計了一種可能更靈敏的選擇性測定法。在該測定法中，用0.5μM32P-γ-GTP孵育100μg/ml ftsZ。FtsZ的GTP酶活性可釋放出32PO4。通過使用100mM NaH2PO4中的25mg/ml活性炭終止反應，將產物離心，剩下的32P-γ-GTP被炭捕獲。因此，可測量保留在上清液中的32PO4，從而提供GTP酶抑制的測量值。這種篩選測定法可更好地鑒定ftsZ抑制劑，這是因為它比上述聚合篩選對GDP的抑制更靈敏(8μMvs.250μM的IC50)。
            
實施例21ENR抑制劑的篩選測定法研究了利用非-放射性高純度NADH篩選ENR抑制劑的測定法。ENR的分離由Baldock等，Science2742107(1996)描述。簡單地說，ENR可催化NADH和巴豆酰基-CoA的轉化，形成NAD+和脂肪酰基-CoA，且該測定法可測量第二反應中產生的NAD+量，其中熒光素酶將NAD+轉化成NADH。熒光素酶反應發射的光與在初次反應中產生的NAD+的量成正比。將侯選抑制劑化合物加入到ENR反應中，如果侯選化合物可抑制ENR的活性，則在熒光素酶反應中檢測到的光的量降低。
            
該測定法是如下進行的。向96孔平底光學平板中加入含有6ng/μl ENR或總共120ng/孔的20mM Hepes中的20μl 30μMNADH(Boehringer Manneheim)和DMSO中的20μl 10μM侯選抑制劑化合物。隨后加入20μl 300μM的巴豆酰基-CoA(Sigma，C6146)以開始反應。三氯生被用作對照抑制劑，且它包括在每個平板中以證實抑制。在篩選測定法中，三氯生抑制的IC50大約為1μM。
            
該反應持續大約10分鐘，相當于完成約30％。因此，10分鐘后，NAD+的濃度約為3μM。
            
將30μl 160mM的HCl加入到系統中，使反應混合物的pH低于2，并除去剩余的NADH底物。加入酸后，孵育反應混合物1分鐘，這樣剩余的NADH分解成ADP-核糖和煙酰胺。加入強酸基本上不會影響NAD+。
            
1分鐘后，向反應化合物中加入110μl的NADH再生/熒光素酶溶液，該溶液含有醇脫氫酶，乙醇，FMN，FMN氧化還原酶，癸醛和細菌熒光素酶。
            
更具體而言，NADH再生/熒光素酶溶液是在110μl的緩沖溶液中制備的，該緩沖溶液含有300mM Tris(使用1M原液，pH7.5的溶液)，0.26重量％的雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(“BMA”)，0.65mM EDTA，和18mM KCl。向此溶液中加入0.67μl癸醛(Sigma，D7384，98％的純度)，使每10ml溶液產生具有約200μM濃度癸醛的終溶液。加入足量的FMN(Sigma F8399)，產生具有約2μM濃度FMN的終溶液。同樣，加入足量的乙醇(200標準強度)，這樣終溶液具有約100μM的乙醇濃度。向溶液中加入所有這些試劑之后，用力旋轉它。
            
每10ml溶液加入1.08μl的NADHFMN氧化還原酶(Roche，476480)，得到具有1.25個單位/升濃度的終溶液。加入細菌熒光素酶(Roche，476498)，得到約4.5μg/ml的溶液。同樣，加入乙醇脫氫酶，得到0.7個單位/ml最終濃度的溶液。加入這些試劑之后，通過翻轉輕輕地混合所述混合物。
            
在該測定法中，鑒定了大約100種抑制ENR活性的化合物。在類放射ENR測定法中，這種化合物中大約有50種顯示出顯著的抑制活性。在該測定法中，用120ngENR/孔和DMSO中的20μl 10μM侯選抑制劑化合物孵育20mM Hepes中的20μl 30μM32P-NADH。隨后加入20μl 300μM巴豆酰基-CoA(Sigma，C6146)以開始反應。反應產物含有32P-NAD。反應物32P-NADH和產物32P-NAD是通過在1M LiCl中的PEI-纖維素薄層色譜彼此分離的，并通過放射自顯影法目測檢驗。反應程度是通過NADH到NAD的轉化測定的。進一步測試了這些化合物對大腸桿菌生長的抑制。
            
將一種滲透性的細菌菌株(AB734 TN10∷tolC)用于篩選方法中，從而使化合物穿過革蘭氏陰性細胞壁的能力達到最大。測定法是按照此處引用的NCCLS方案進行的。
            
確定那些化合物是否具有以ENR-依賴性方式工作的抗微生物活性是又一個目標。構建了2種滲透性的tolC菌株。在第一種菌株中，ENR蛋白是在其自身啟動子的控制之下，在中等拷貝數質粒上超表達的，而第二種菌株則作為僅僅含有質粒的對照。針對ENR的侯選化合物應當比上述第一種菌株的活性更小，這是因為靶基本上被過表達。例如，當對第一種菌株進行試驗時，三氯生的MIC從31變到1000ng/ml。同樣，化合物325084的MIC從25μM變到超過100μM，表明這種化合物通過在細菌生長過程中抑制ENR而發揮了它的抗微生物作用。該結果沒有區別開化合物325084和三氯生在酶的相同或不同位點上對ENR的作用。然而，因為沒有其它化合物顯示出相似的MIC改變，因此據信這些其它的化合物可能通過不同的機理抑制細菌生長。盡管如此，化合物325085和325086具有與化合物325084相似的結構，也證實對ENR具有某些活性。
            
為了確定化合物325084和三氯生是否作用于相同或不同的ENR位點，制造了重組ENR，它(i)在殘基93含有甘氨酸到纈氨酸的取代，(ii)保留了酶活性，和(iii)對三氯生不敏感。然后使用野生型和突變體ENR測定被鑒定為ENR抑制劑的化合物，對突變體ENR形式顯示出很少的或沒有顯示出抑制活性的化合物很可能作用于ENR的活性位點，并可被棄去。選擇性地，抑制突變體酶和野生形式的化合物可能作用于變構位點，并將對其作進一步的研究。
            
已經通過特殊實施方案對本發明進行了描述，應當理解本領域的那些技術人員可對其進行變化和改進。例如，關于此處公開的化合物，應當理解用一種鹵素取代另一種鹵素，不同的鹵素取代基也在本發明的范圍之內。因此，這種限制只能出現在本發明的權利要求書中。
            
序列表<110>Staunton等<120>調節含有變構調節位點的α/β蛋白的配體結合/酶活性的物質和方法<130>27866/36470A<140>待確定<141>在此提交<150>US 60/239,750<151>2000-10-12<160>34<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>D156A<400>1cattgccttc ttgattgcgg gctctggtag catc34<210>2<211>34<212>DNA<213>V254A<400>2gcctttaaga tcctagcggt catcacggat ggag34<210>3<211>34<212>DNA<213>Q327A<400>3gaagaccatt cagaacgcgc ttcgggagaa gatc34<210>4<211>32<212>DNA<213>I332A<400>4cagcttcggg agaaggcgtt tgcgatcgag gg  32<210>5<211>32<212>DNA<213>F333A<400>5cttcgggaga agatcgcggc gatcgagggt ac  32<210>6<211>33<212>DNA<213>E336A<400>6gaagatcttt gcgatcgcgg gtactcagac agg 33<210>7<211>30<212>DNA<213>引物<400>7attggatccg ctggcaccga gattgccatc 30<210>8<211>30<212>DNA<213>引物<400>8aatttctcga ggtctccaac cgtgccttcc 30<210>9<211>27<212>PRT<213>氨基酸插入<400>9Pro Lys Gly Arg His Arg Gly Val Thr Val Val Arg Ser His His Gly1   5   10  15Val Leu Ile Cys Ile Gln Val Leu Val Arg Arg20  25<210>10<211>20<212>DNA<213>引物Eo26-H3<400>10gaggggaagc ttagtgggcc20<210>11<211>19<212>DNA<213>引物Eo-24<400>11gaagttggcc tgagcctgg 19<210>12<211>25<212>DNA<213>E-cad 5’#1<400>12ctgcctcgct cgggctcccc ggcca  25<210>13<211>27<212>DNA<213>E-cad 3’#1<400>13ctgcacatgg tctgggccgc ctctctc 27<210>14<211>45<212>DNA<213>引物Ecad5’Kozak<400>14gcgttaaagc ttcacagctc atcaccatgg gcccttggag ccgca 45<210>15<211>33<212>DNA<213>引物Ecad3’(Xho)<400>15aggcgctcga gaatccccag aatggcagga att  33<210>16<211>26<212>DNA<213>引物MAdCAM-1 5’#1<400>16atggatttcg gactggccct cctgct  26<210>17<211>24<212>DNA<213>引物MAdCAM-1 3’#5<400>17ctccaagcca ggcagcctca tcgt24<210>18<211>49<212>DNA<213>引物Mad5’Kozak<400>18gcgttaaagc ttcacagctc atcaccatgg atttcggact ggccctcct 49<210>19<211>57<212>DNA<213>引物Mad 3’#6 Sal<400>19gctagtcgac ggggatggcc tggcggtggc tgagctccaa gcaggcagcc tcatcgt57<210>20<211>28<212>DNA<213>引物Alpha1.5<400>20gactttcagc ggcccggtgg aagacatg28<210>21<211>28<212>DNA<213>引物Alpha1.3<400>21ccagttgagt gctgcattct tgtacagg28<210>22<211>29<212>DNA<213>A1.5Nde<400>22atatcatatg gacatagtca tagtgctgg   29<210>23<211>33<212>DNA<213>A1.3Bam<400>23atatggatcc ctaagacatt tccatttcaa atg  33<210>24<211>29<212>DNA<213>A2.5Nde<400>24atatcatatg gatgttgtgg ttgtgtgtg   29<210>25<211>32<212>DNA<213>A2.3Bam<400>25atatggatcc ctatgacatt tccatctgaa ag   32<210>26<211>28<212>DNA<213>A1.I.Bam<400>26cggatccccc acatttcaag tcgtgaat28<210>27<211>31<212>DNA<213>A1.I.Pst<400>27gctgcagtca tattctttct cccagagttt t31<210>28<211>22<212>DNA<213>5’EcHPPK的特異性引物<400>28gtagatgaca gtggcgtata tt  22<210>29<211>23<212>DNA<213>3’EcHPPK的特異性引物<400>29gccttaccat ttgtttaatt tgt 23<210>30<211>159<212>PRT<213>大腸桿菌HPPK的氨基酸序列<400>30Met Thr Val Ala Tyr Ile Ala Ile Gly Ser Asn Leu Ala Ser Pro Leu1   5   10  15Glu Gln Val Asn Ala Ala Leu Lys Ala Leu Gly Asp Ile Pro Glu Ser20  25  30His Ile Leu Thr Val Ser Ser Phe Tyr Arg Thr Pro Pro Leu Gly Pro35  40  45Gln Asp Gln Pro Asp Tyr Leu Asn Ala Ala Val Ala Leu Glu Thr Ser50  55  60Leu Ala Pro Glu Glu Leu Leu Asn His Thr Gln Arg Ile Glu Leu Gln65  70  75  80Gln Gly Arg Val Arg Lys Ala Glu Arg Trp Gly Pro Arg Thr Leu Asp85  90  95Leu Asp Ile Met Leu Phe Gly Asn Glu Val Ile Asn Thr Glu Arg Leu100 105 110Thr Val Pro His Tyr Asp Met Lys Asn Arg Gly Phe Met Leu Trp Pro115 120 125Leu Phe Glu Ile Ala Pro Glu Leu Val Phe Pro Asp Gly Glu Met Leu130 135 140Arg Gln Ile Leu His Thr Arg Ala Phe Asp Lys Leu Asn Lys Trp145 150 155<210>31<211>10<212>PRT<213>組氨酸標記<400>31Met Gly His His His His His His Gly Gly1   5   10<210>32<211>52<212>DNA<213>5’EcHisHPPK<400>32cgccatgggc caccaccacc accaccacgg cggcatgaca gtggcgtata tt52<210>33<211>29<212>DNA<213>3’EcXhoHPPK<400>33cggctcgagt taccatttgt ttaatttgt  29<210>34<211>169<212>PRT<213>His(6)-HPPK基因的氨基酸序列<400>34Met Gly His His His His His His Gly Gly Met Thr Val Ala Tyr Ile1   5   10  15Ala Ile Gly Ser Asn Leu Ala Set Pro Leu Glu Gln Val Asn Ala Ala20  25  30Leu Lys Ala Leu Gly Asp Ile Pro Glu Ser His Ile Leu Thr Val Ser35  40  45Ser Phe Tyr Arg Thr Pro Pro Leu Gly Pro Gln Asp Gln Pro Asp Tyr50  55  60Leu Asn Ala Ala Val Ala Leu Glu Thr Ser Leu Ala Pro Glu Glu Leu65  70  75  80Leu Asn His Thr Gln Arg Ile Glu Leu Gln Gln Gly Arg Val Arg Lys85  90  95Ala Glu Arg Trp Gly Pro Arg Thr Leu Asp Leu Asp Ile Met Leu Phe100 105 110Gly Asn Glu Val Ile Asn Thr Glu Arg Leu Thr Val Pro His Tyr Asp115  120 125Met Lys Asn Arg Gly Phe Met Leu Trp Pro Leu Phe Glu Ile Ala Pro130 135 140Glu Leu Val Phe Pro Asp Gly Glu Met Leu Arg Gln Ile Leu His Thr145 150 155 160Arg Ala Phe Asp Lys Leu Asn Lys Trp16權利要求
            
1.一種調節不是LFA-1或其含I結構域片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
2.一種調節不是LFA-1或其含結構域I片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子含有二芳基化合物，所述二芳基化合物與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
3.一種調節不是LFA-1或其含結構域I片段的第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子含有α/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子選自二芳基硫化物和二芳基酰胺化合物，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
4.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有所述變構調節位點。
            
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以321456或231456方向定位的β折疊鏈。
            
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以3214567方向定位的β折疊鏈。
            
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以32145方向定位的β折疊鏈。
            
8.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述第一分子含有I域結構。
            
9.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述第一分子含有A域結構。
            
10.一種調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
11.一種調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有α/β結構，所述α/β域結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子含有二芳基化合物，所述二芳基化合物與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
12.一種調節第一分子與結合配偶體分子間的結合相互作用的方法，所述第一分子的氨基酸序列與圖1所列LFA-1 I結構域的氨基酸序列的同一性小于約90％，所述第一分子含有c/β域結構，所述α/β結構含有變構調節位點，該方法包括使所述第一分子與變構效應分子接觸的步驟，所述變構效應分子選自二芳基硫化物和二芳基酰胺化合物，所述變構效應分子與所述變構調節位點相互作用，并促進所述α/β結構的配體結合結構域中調節所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
13.根據權利要求10，11，或12所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
14.根據權利要求10，11，或12所述的方法，其中所述第一分子含有羅斯曼折疊結構，所述羅斯曼折疊結構含有變構調節位點。
            
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，該β折疊具有以321456或231456方向定位的β折疊鏈。
            
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，β折疊具有以3214567方向定位的β折疊鏈。
            
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
20.根據權利要求14所述的方法，其中所述第一分子中的羅斯曼折疊結構含有β折疊，β折疊具有以32145方向定位的β折疊鏈。
            
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
22.根據權利要求10，11，或12所述的方法，其中所述第一分子含有I域結構。
            
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
24.根據權利要求10，11，或12所述的方法，其中所述第一分子含有A域結構。
            
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述第一分子的氨基酸序列與LFA-1 I結構域的氨基酸序列的百分比同一性小于約40％，約45％，約50％，約55％，約60％，約65％，約70％，約75％，約80％，約85％，或約90％。
            
26.根據權利要求1-3，5-7，10-12，15-21，23或25中任何一項所述的方法，其中調節劑可促進所述第一分子的配體結合結構域中增加所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
27.根據權利要求26所述的方法，其中第一分子與第二分子間的結合的增加使得第一分子的酶活性增加。
            
28.根據權利要求1-3，5-7，10-12，15-21，23或25中任何一項所述的方法，其中調節劑可促進所述第一分子的配體結合結構域中減小所述第一分子與所述結合配偶體分子間的結合的構像。
            
29.根據權利要求28所述的方法，其中第一分子與第二分子間的結合的減小使得第一分子的酶活性降低。
            
30.根據權利要求1-3，5-7，10-12，15-21，23或25中任何一項所述的方法，其中所述第一分子選自表1所列的蛋白。
            
31.根據權利要求30所述的方法，其中第一分子是一種真核生物的分子。
            
32.根據權利要求30所述的方法，其中第一分子是一種人類的分子。
            
33.根據權利要求30所述的方法，其中第一分子是一種原核生物的分子。
            
34.根據權利要求30所述的方法，其中第一分子是一種細菌的分子。
            
35.根據權利要求30所述的方法，其中第一分子選自αMβ2，補體蛋白C2，補體蛋白B因子，αEβ7，α4β7，αVβ3，α4β1，αdβ2，馮維勒布蘭德因子，Rac-1，HPPK，ftsZ，和ENR。
            
36.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是αMβ2，而結合配偶體蛋白是纖維蛋白原。
            
37.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是αMβ2，而結合配偶體蛋白是iC3b。
            
38.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是αEβ7，而結合配偶體蛋白是E-鈣粘著蛋白。
            
39.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是α4β7，而結合配偶體蛋白是MAdCAM-1。
            
40.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是αVβ3，而結合配偶體蛋白是玻連蛋白。
            
41.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是α4β1，而結合配偶體蛋白是VCAM。
            
42.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是αdβ2，而結合配偶體蛋白是VCAM。
            
43.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是馮維勒布蘭德因子，而結合配偶體蛋白是gpIb。
            
44.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是補體蛋白C2，而結合配偶體蛋白是補體蛋白C4b。
            
45.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是補體蛋白B因子，而結合配偶體蛋白是補體蛋白C3b。
            
46.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是Rac-1，而結合配偶體是GTP。
            
47.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是HPPK，而結合配偶體是ATP或HMDP。
            
48.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是ftsZ，而結合配偶體是GTP。
            
49.根據權利要求35所述的方法，其中第一分子是ENR，而結合配偶體是NADH。
            
全文摘要
            
本發明提供調節α/β蛋白與結合配偶體間的結合的方法，和鑒定調節劑的方法及它們的用途。
            
文檔編號A61P35/00GK1479872SQ01820389 
            
公開日2004年3月3日 申請日期2001年10月12日 優先權日2000年10月12日
            
發明者D·E·斯陶恩頓, D E 斯陶恩頓 申請人:艾科斯有限公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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