胸腺刺激用于免疫改善的制作方法

專利名稱：胸腺刺激用于免疫改善的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物的免疫應答領域，尤其是通過胸腺刺激改善免疫應答的領域。
與本發明相關的背景技術免疫系統免疫系統的主要功能是區分“外來”和“自身”抗原，并且做出相應地應答以保護機體免受感染。這個定義也可稱作區分“好的”和“壞的”分子。在正常免疫應答中，事件的序列涉及專門的抗原呈遞細胞(APC)俘獲外來抗原，并且將其加工成小肽片段，其在APC表面呈現為主要組織相容性復合物(MHC)分子的裂片。MHC分子可以是在所有的有核細胞上進行表達的I類分子(被細胞毒性T淋巴細胞(Tc)識別)，或者是主要由免疫系統細胞進行表達的II類分子(被輔助T淋巴細胞(Th)識別)。
靜息APC用來俘獲抗原，并將其加工成肽片段，然后被表達在表面的MHC分子。這些更加活化的APC隨后變得更容易刺激T細胞，而不是俘獲和加工另外的抗原。Th細胞識別APC上的MHCII/肽復合物，并作出應答。
存在兩種類型的Th細胞，通過它們產生的不同類型的可溶性調節因子加以區別。Th1細胞主要產生IL2和γ干擾素(IFNγ)，后者如果出現在幼稚T細胞與抗原初始接觸時，則可促進細胞介導免疫力(主要是Tc)的優先激活。Th2細胞表達一種不同類型的細胞因子，尤其是IL4、5、和10，其通過對于特定抗原有效的可產生抗體的B細胞誘導體液免疫。在某些情況下這可通過產生IgE而導致不適當的過敏應答。
Th細胞在事實上所有免疫應答中的重要性在HIV/AIDS中得到最好體現，在艾滋病患者體內的Th細胞被病毒破壞消失引起嚴重的免疫缺陷，最終導致死亡。由于它們作為免疫調節細胞的重要性，Th1和Th2細胞之間的平衡對免疫應答的本質具有深刻影響。這種失衡可以通過在免疫應答起始時發育異常或不適當的激活而產生。這可導致多種疾病，例如過敏癥、癌癥、和自身免疫性病癥。
胸腺有人認為胸腺是免疫系統的主要器官，因其是產生T淋巴細胞的主要部位。其作用是從血液中吸引適當的來源于骨髓的前體細胞，并且誘導其對T細胞譜系的支持，包括產生抗原的T細胞受體(TCR)所必需的基因重排。與此相關的是程度顯著的細胞分裂以使T細胞數量增加，從而提高識別和清除所用外來抗原的可能性。這一巨大的潛在的相異性意味著對于身體可能遇到的任一抗原、多種淋巴細胞可以用不同程度的結合強度(親和力)對其進行識別，并做出不同程度的應答。然而，與B細胞不同的是，T細胞識別抗原的一個奇怪特征是TCR只識別與MHC分子物理上相聯系的肽片段；正常情況下這是自身的MHC，而且這一能力只有胸腺才有。這一過程稱為正性選擇，并且是皮質上皮細胞獨有的特征。如果TCR無法與自身的MHC/肽復合物結合，T細胞會因為“忽略”而死亡。T細胞的繼續成熟需要某種程度的經由TCR的信號傳導。
經過皮質的選擇，發育中的胸腺細胞獲得功能上的成熟和遷移能力，并且進入血流，成為幼稚(還未與抗原接觸的)T細胞。它們在淋巴和血液之間游走，尋覓抗原。如果3-4周后，它們還沒有被刺激，它們便容易被其他新近從胸腺遷移出的細胞從外周T細胞庫中清除出去。這一胸腺輸出和外周T細胞替換系統提供了T細胞質量的持續補充，將穩態保持在適當水平。
雖然胸腺對于一個功能性的免疫系統來說是不可缺少的，它每天將T細胞容量的1％釋放到血流中，但是哺乳動物的一個很明顯的異常現象是由于性類固醇產生，胸腺發生嚴重的萎縮。這甚至在兒童時期就可開始，但在青春期開始愈發嚴重。對于健康個體來說，產生和釋放新T細胞這一功能的喪失并不總是帶來臨床后果。事實上，即便老年胸腺發生萎縮，僅為年輕胸腺的1％(見下)，它仍然釋放非常少量的新生T細胞入血流。盡管這不足以維持外周T細胞亞群的最適水平，但是胸腺仍不是完全休眠，這使得它有可能成為治療方案的選擇目標。
隨著年齡逐漸增長，胸腺輸出的降低意味著外周T細胞的性質在量和質上都逐漸發生變化。除了血中絕對T細胞數目因其失去刺激而隨年齡逐漸減少之外，每次接觸抗原以后，相關的抗原特異性幼稚T細胞(那些尚未接觸抗原的細胞)也被刺激和發生增殖。其中一個亞群會變成效應器細胞，除去病原體，但這些也將通過抗原誘導的細胞死亡而最后死掉。
另一亞群將轉化為記憶細胞，并且為將來與該病原接觸提供長期的保護。因此，幼稚T細胞的水平會降低，結果對抗原的應答能力也降低。衰老也導致Th細胞(通過表達式CD4表征)數量相對于Tc細胞(表達CD8)的選擇性減少，并且Th1與Th2細胞的比值的失衡。其不發生在正常的年輕動物中，是因為，如上所述，年輕動物體內從胸腺不斷輸出新生T細胞，從而持續補充外周幼稚細胞庫。
胸腺萎縮胸腺在很大程度上受其與神經內分泌系統的雙向聯系的影響(Kendall，1988)。尤其重要的是垂體、腎上腺、性腺對胸腺功能的交互影響，其中既包括營養的(促甲狀腺素或TSH，以及生長激素或GH)，和萎縮的影響(促黃體激素或LH、促卵泡激素或FSH、和促腎上腺皮質激素或ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。實際上胸腺生理學的一個重要特征在于其結構和功能的進行性衰退，其與青春期血循環中性類固醇產生的增加成比例。(Hirokawa and Makinodan，1975；Tosi等，1982以及Hirokawa等，1994)。這些激素作用的精確靶位和誘導胸腺萎縮的機制尚未確定。由于胸腺是產生和維持外周T細胞庫的主要部位，因此普遍認為胸腺萎縮是導致老年人以免疫異常為基礎的疾病增多的主要原因。尤其是，以T細胞依賴性免疫功能(如溶細胞T細胞活性和促有絲分裂反應)的降低為代表的免疫系統缺陷，可以從老年時期免疫缺陷、自體免疫病和腫瘤的發病率增高得到反映(Hirokawa，1998)。
胸腺萎縮的影響反映在外周，隨著胸腺對T細胞庫輸入的減少，導致T細胞受體(TCR)免疫細胞庫的多樣性減少。還觀察到改變的細胞因子的改變(profile)(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亞群的改變、以及由幼稚T細胞向記憶細胞的轉變(Mackall等，1995)。此外，胸腺生成的效率隨年齡而下降，以致免疫系統在T細胞衰竭后再生正常數量T細胞的能力最終喪失(Mackall等，1995)。但是，最近由Douek等(1998)所進行的工作顯示，在人類中，胸腺輸出即使在老年也可能發生。TCR基因重排的外切DNA產物被用來證實老年患者HIV感染后循環血中存在重新產生的幼稚T細胞。這一輸出率和隨后出現的外周T細胞庫再生還需要進一步研究，因為經化療的青春期后的患者與青春期前的患者相比，T細胞庫的再生率顯著降低，尤其是CD4+T細胞(Mackall等，1995)。Timm和Thoman的工作進一步證明了這一點(1999)，他們研究顯示雖然CD4+T細胞在老年小鼠骨髓移植(BMT)后再生了，但由于外周微環境的老化，其表現出對記憶細胞的傾向性，胸腺產生幼稚T細胞的能力亦較差。
胸腺主要由正在發育的胸腺細胞組成，其散布在不同的基質細胞(主要是上皮細胞亞群)中，這些基質細胞構成微環境，并且提供T細胞最佳發育所需要的生長因子和細胞間相互作用。胸腺細胞和控制其分化和成熟的上皮細胞亞群之間共生性的發育關系(Boyd等，1993)意味著性類固醇抑制可以發生在任何細胞類型，其隨后影響其他類型細胞的狀態。胸腺細胞本身存在內在缺陷的可能性比較小，因為以往使用輻射嵌合體的研究表明，骨髓(BM)干細胞不受年齡的影響(Hirokawa，1998；Mackall and Gress，1997)，并且與年輕的BM細胞具有相似程度的胸腺再生潛能。此外，老年動物的胸腺細胞至少在某些程度上保留了分化能力(Mackall andGress，1997；George and Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。然而，Aspinall(1997)最近的工作顯示，在前體CD3-CD4-CD8-三陰性(TN)群體中的缺陷發生于TCRγ鏈基因重排階段。
衰老不是導致T細胞喪失的唯一條件，嚴重的T細胞喪失也發生于如HIV/AIDS及隨后的化療或放療。此外，在有活躍胸腺的年輕人中，免疫系統的恢復(通過T細胞介導的免疫的恢復)發生得相對較快(2-3個月)，而青春期后的人由于胸腺萎縮則需要1-2年。
疫苗疫苗可分成兩類提供主動免疫的和提供被動免疫的。被動免疫涉及給患者施用異源抗體來對抗患者體內的外來抗原或患者將要遭遇的抗原。此類免疫通常存在時間短，因為患者自身的免疫系統沒有參與。本發明披露的是主動免疫，即給患者施用抗原，因而患者的免疫系統形成對抗原特異性抗體做出應答。
有幾個參數可影響免疫應答的性質和范圍抗原水平和類型、接種部位、適當APC的有效性、個體健康狀況、以及T細胞和B細胞庫的狀態。其中，T細胞是最脆弱的，因為從青春期開始性類固醇誘導了胸腺輸出的關閉。因此，盡管對于具有代表特異性的主要庫有幼稚T細胞的存在，以及有正常的Th1與Th2細胞和Th與Tc細胞的比值，可能應答的T細胞數量為最佳，任何免疫計劃也應該僅僅在邏輯上進行。細胞因子的水平和種類也要進行調整，使其適合于所需要的應答。
通過抑制性類固醇的分泌，例如在促黃體激素釋放激素(LHRH)向垂體信號傳遞水平，激活萎縮的胸腺，提供了產生具有不同庫的TCR類型的新生幼稚T細胞群體的有效方法。這一過程通過使用導致最優胸腺生成的正常調節因子和通路，將胸腺有效地逆轉至青春期前狀態。
發明簡述本發明披露了有關改善動物對接種的免疫應答的方法。這是通過定量和定性地恢復外周T細胞庫，尤其是通過提高幼稚T細胞水平來實現的。這些幼稚T細胞隨后能以更大的程度對呈遞的外來抗原作出應答。
本發明的方法依賴于阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號。在優選實施例中，使用化學閹割。在另一實施例中使用外科閹割。將胸腺逆轉至青春期前狀態，從而重新激活它。
在另一特殊實施例中，傳向胸腺的性類固醇介導的的信號的阻斷通過給予LHRH的激動劑或拮抗劑、抗雌激素抗體、抗雄性激素抗體、被動(抗體)或主動(抗原)的抗LHRH接種疫苗、或其組合(“阻斷劑”)。
在優選的實施例中，阻斷劑是以肽緩釋配方的形式給予的。肽緩釋配方的例子參見WO98/08533，其全部內容結合于此作為參考。
附圖簡要描述

圖1A和B閹割前和閹割后胸腺細胞數目的變化。胸腺萎縮導致胸腺細胞數隨年齡顯著減少。閹割2周后，細胞數目增加到年輕成年體水平。閹割3周后，數目從這一水平顯著增加，到閹割后4周時細胞數目穩定下來。***＝與年輕成年體(2個月)胸腺相比顯著不同，P＜0.001。
圖2A-C(A)脾細胞數目不受年齡以及閹割影響。外周B∶T細胞比值仍保持恒定(B)，然而，CD4∶CD8比值隨年齡顯著降低，(P＜0.001)，并閹割4周后恢復到正常年輕水平。
圖3熒光激活的細胞分揀器(FACS)圖，顯示年齡和閹割對CD4與CD8胸腺細胞數目的影響。每個象限的百分比示于圖上。胸腺細胞亞群不隨著年齡發生變化，并且閹割后胸腺細胞呈同步擴增。
圖4通過結合BrdU脈沖所檢測到的胸腺細胞增殖。增殖的胸腺細胞的比例不隨年齡和閹割發生變化。
圖5A-D年齡和閹割對胸腺細胞亞群增殖的影響。(A)構成整體增殖細胞群的每一亞群的比例增殖細胞中CD8+T細胞的比例顯著增加。(B)每個正在增殖的亞群的百分數TN和CD8亞群在2歲時比在2個月時增殖顯著減少。閹割2周后，TN群已恢復到正常年輕時的增殖水平，而CD8亞群顯著增殖。閹割4周后，其水平等于正常年輕的水平。(C)整體TN增殖情況不隨年齡和閹割而變化。然而(D)TN1亞群增殖隨年齡而顯著降低，閹割4周后仍未恢復到正常水平。***＝高度顯著，P＜0.001，**＝顯著，P＜0.01。
圖6小鼠胸腺內注射異硫氰熒光素(FITC)。在注射24小時后計算外周中FITC+細胞數量。雖然最新胸腺遷移的比例保持恒定，占胸腺細胞數目的1％左右，但在閹割2周后顯著降低，RTE細胞數量隨年齡顯著減少(P＜0.01)。閹割2周后，這些值雖然上升，但仍顯著低于閹割2周時年輕小鼠的水平。隨年齡增長，CD4+與CD8+RTE比值顯著上升，閹割1周后就會恢復正常。
圖7A-C用一種化療試劑環磷酰胺治療后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數目的變化。注意治療后1周和2周后，閹割動物的胸腺與未閹割組動物(只用環磷酰胺治療)相比，胸腺快速擴增。此外，閹割組的脾和淋巴結數目與只用環磷酰胺組相比也明顯增加。4周后，細胞數目正常。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。
圖8A-C外科閹割一周后用輻輻照(625拉德)后，胸腺(A)、脾(B)和淋巴結(C)細胞數目的變化。注意在治療后1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅采用輻照)相胸腺發生快速擴增。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。
圖9A-C同一天進行輻照和閹割后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數目的變化。注意治療2周后閹割組與未閹割組相比胸腺的快速擴增。然而，所觀察到的差別不如治療前1周小鼠進行閹割時那么顯著(圖7)(每個治療組和時間點的n＝3-4)。
圖10同一天用一種化療劑環磷酰胺以及外科或化學閹割治療后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數目的變化。注意治療1和2周后閹割組動物與未閹割組動物(只用環磷酰胺)相比胸腺的快速擴增。此外，閹割組的脾和淋巴結數目與只用環磷酰胺組相比也明顯增加。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。在環磷酰胺治療后免疫系統的再生中，化學閹割的效果可以與外科閹割相比。
圖11用I型單純性皰疹病毒(HSV-1)進行足墊免疫后淋巴結細胞構成。注意老年閹割組與老年未閹割組相比細胞數目的增多。下圖顯示了通過FACS就CD25對CD8細胞進行門化的總激活的細胞數。
圖12A-C接種HSV-1后，激活LN(淋巴結)中，Vβ10在細胞毒性T淋巴細胞(CTL)上的表達。注意老年小鼠中克隆反應減少，以及閹割后所預期反應的恢復。
圖13A-C閹割恢復對HSV-1免疫的反應。(a)與年輕和閹割后小鼠相比，老年小鼠在感染后表現出淋巴結總細胞數的顯著降低。(b)HSV-1感染小鼠的LN中激活的(CD8+CD25+)細胞的典型的FACS圖。隨著年齡或閹割后激活CTL的比例未見差別。(c)通過激活CTL數目的顯著減少反映了老年小鼠的淋巴結細胞數目的下降。老年小鼠閹割后可恢復對HSV-1的免疫應答，并且CTL數目與年輕小鼠相當。結果用8-12只小鼠的均值±1SD(標準偏差)表示。**＝與年輕(2個月)小鼠相比，P≤0.01；^＝與老年(未閹割)小鼠相比，P≤0.01。
圖14除去用HSV-1進行免疫的小鼠的腘窩淋巴結，并培養3天。用未經免疫的小鼠進行CTL試驗，以作為裂解的背景水平的對照(測定51Cr-釋放)。結果用8只小鼠的平均值3次測量值±1SD(標準偏差)來表示。在E∶T比值為10∶1和3∶1下，老年小鼠均顯示CTL活性的顯著降低(p≤0.01，*)，這顯示淋巴結內存在的特異性CTL的百分數的降低。老年小鼠閹割后CTL反應恢復到年輕成年小鼠的水平。
圖15A和B分析CD4+T輔助細胞輔助和VβTCR對HSV-1感染的反應。從HSV-1感染后的D5(第5天)除去腘窩淋巴結，并在體外分析(a)CD25、CD28、和特異性TCRVβ標記物和(b)CD4/CD8T細胞的表達。(a)表達Vβ10或Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+T細胞的百分率，用每組8只小鼠的均值±1SD來表示。結果不隨年齡或是否閹割而變化。(b)在靜息LN群中CD4/CD8比值隨年齡增長而降低。閹割后恢復。結果用每組8只小鼠的均值±1SD來表示。***＝與年輕和閹割小鼠相比p≤0.001。
圖16A-DLy5同種小鼠骨髓移植后，胸腺(A)、脾(B)、淋巴結(C)、和骨髓(D)中細胞數目的變化。注意在治療后所有時間點，閹割動物與未閹割動物相比胸腺的快速擴增。此外，閹割組的脾和淋巴結數目與只用環磷酰胺組相比顯著增加。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。閹割小鼠與未閹割動物相比同種細胞(Ly5.2)顯著增加(沒有顯示數據)。
圖17A和B胎兒肝重建后閹割和未閹割小鼠中胸腺細胞數目的變化。(每個測試組的n＝3-4)。(A)2周時，閹割小鼠的胸腺細胞數目處于正常水平，顯著高于未閹割小鼠(*p≤0.05)。4周后閹割小鼠的胸腺呈肥大。未非閹割小鼠的細胞數目保持在對照水平以下。(B)CD45.2+細胞CD45.2+細胞是顯示供體來源的標記物。重建2周后，閹割和未閹割的小鼠都出現源于供體的細胞。治療4周后，閹割小鼠胸腺中大約85％的細胞是來源于供體的。未閹割小鼠胸腺中未見來源于供體的細胞。
圖18致死量輻照和胎兒肝臟重建后、以及其后的外科閹割以后，CD4與CD8供體來源的胸腺細胞群的FACS圖。每個象限的百分比示于圖右方。年齡匹配的對照圖是8個月大的Ly5.1同種小鼠的胸腺。閹割和未閹割的小鼠用在CD45.2+細胞門化，只顯示來源于供體的細胞。重建2周后，閹割和未閹割小鼠的胸腺細胞亞群未見區別。
圖19A和B在致死量輻照、胎兒肝臟重建和外科閹割以后，骨髓性和淋巴樣樹突狀細胞(DC)的數目。(每一測試組的n＝3-4)后面圖中對照(在其上劃斜線)條圖是基于未處理的年齡匹配的小鼠中發現的樹突狀細胞正常數目。(A)來源于供體的樹突狀骨髓性細胞重建2周后，DC在非閹割小鼠中呈正常水平。同一時間點，在閹割小鼠中DC顯著較多。(*p≤0.05)。4周時，閹割小鼠的DC數仍高于對照水平。(B)來源于供體的淋巴樣樹突狀細胞重建2周后，閹割小鼠的DC數目是未閹割鼠的2倍。治療4周后，DC數目仍高于對照水平。
圖20A和B胎兒肝臟重建后，閹割和未閹割小鼠中總細胞數和CD45.2+骨髓細胞數的改變。每一測試組有3-4只小鼠。(A)總細胞數重建2周后，骨髓細胞數恢復正常。閹割和未閹割小鼠的細胞數目未見明顯不同。重建4周后，在閹割與未閹割小鼠之間細胞數目有明顯區別(*p≤0.05)。(B)CD45.2+細胞數重建2周后，在閹割和未閹割小鼠骨髓中的CD45.2+細胞數之間未見明顯不同。4周時，CD45.2+細胞數在閹割小鼠中仍較高。同一時間點未閹割小鼠中沒有任何來源于供體的細胞。
圖21A-C胎兒肝臟重建后，在閹割和未閹割小鼠骨髓中T細胞、來源于骨髓和淋巴的樹突狀細胞(DC)的改變。(每一測試組有3-4只小鼠)圖中對照(在其上劃斜線)條圖是基于未處理的年齡匹配的小鼠的T細胞和樹突狀細胞正常數目。(A)T細胞數閹割和未閹割小鼠重建2和4周后數目都有所降低。(B)來源于供體的骨髓性樹突狀細胞閹割和未閹割小鼠重建2周后數目都正常。這一時間點，在閹割和未閹割小鼠的細胞數之間未見明顯不同。(C)來源于供體的淋巴樣樹突狀細胞重建2和4周后數目都在正常水平。2周時，在閹割和未閹割鼠之間的細胞數未見明顯不同。
圖22A和B胎兒肝臟重建后，閹割和未閹割小鼠中總細胞數、和供體(CD45.2+)脾細胞數的改變。(每一測試組有3-4只小鼠)(A)總細胞數重建2周后，細胞數目降低，并且在閹割和未閹割小鼠之間的細胞數未見明顯不同。重建4周后，閹割小鼠的細胞數目接近正常水平。(B)CD45.2+細胞數重建2周后，在閹割和未閹割小鼠脾中的CD45.2+細胞數之間未見明顯不同。4周時閹割小鼠的CD45.2+細胞數仍較高。在同一時間點，未閹割小鼠中沒有來源于供體的細胞。
圖23A-C胎兒肝臟重建后，脾T細胞及來源于骨髓和淋巴的樹突狀細胞(DC)(每一測試組有3-4只小鼠)。圖中對照(在其上劃斜線)條圖是基于未處理的年齡匹配的鼠的T細胞和樹突狀細胞正常數目。(A)T細胞閹割和未閹割小鼠重建2和4周后數目都有所降低。(B)來源于供體的(CD45.2+)骨髓性樹突狀細胞重建2和4周后，閹割和未閹割小鼠的DC數目都正常。重建2周時，在閹割和未閹割小鼠的細胞數之間處于正常水平。(C)來源于供體的(CD45.2+)淋巴樣樹突狀細胞重建2和4周后數目處于正常水平。2周時，在閹割和未閹割小鼠的細胞數之間未見明顯不同。
圖24A和B胎兒肝臟重建后，閹割和未閹割小鼠總細胞數、和供體(CD45.2+)淋巴結細胞數的改變。(每一測試組有3-4只小鼠)(A)總細胞數重建2周后，細胞數處于正常水平，并且在閹割和未閹割小鼠之間未見明顯不同。重建4周后，閹割小鼠的細胞數目處于正常水平。(B)CD45.2+細胞數重建2周后，淋巴結供體CD45.2+細胞數在閹割和未閹割小鼠之間未見明顯不同。4周時閹割小鼠的CD45.2+細胞數仍較高。在同一時間點，未閹割小鼠中沒有來源于供體的細胞。
圖25A-C胎兒肝臟重建后，在閹割和未閹割小鼠的腸系膜淋巴結中，T細胞、來源于骨髓和淋巴的樹突狀細胞(DC)的改變。(每一測試組有3-4只小鼠)圖中對照(在其上劃斜線)條圖是基于未處理的年齡匹配的鼠的T細胞和樹突狀細胞正常數目。(A)重建2和4周后，閹割和非閹割小鼠中的T細胞數目都有所降低。(B)在閹割鼠和未閹割小鼠中，來源于供體的骨髓性樹突狀細胞都正常。4周時，它們都減少。在2周時，在閹割和未閹割小鼠的細胞數之間未見明顯不同。(C)來源于供體的淋巴樣樹突狀細胞重建2和4周后數目處于正常水平。2周時，在閹割和未閹割小鼠的細胞數之間未見明顯不同。
圖26對患者(全部超過60歲)的外周血淋巴細胞表型組成進行了分析，這些患者接受了前列腺癌的LHRH激動劑治療。在LHRH激動劑治療前和開始治療4個月后，對患者樣品進行分析。治療前，在所有病人中，每毫升血中總淋巴細胞數在對照值的最低水平。治療后，6/9的病人總淋巴細胞計數顯著上升(有些病例的總淋巴細胞數翻番)。與此對應的是6/9的患者總T細胞數量的上升。在CD4+亞群中，這一升高甚至更為顯著，8/9的患者表現出CD4T細胞水平升高。另一不太明顯的趨勢是4/9患者CD8+亞群水平有所升高，雖然一般來說其升高的程度小于CD4+T細胞。
圖27對患者血在LHRH激動劑治療前和治療后進行分析顯示，T細胞、CD4或CD8T細胞的總體比例上并無顯著改變，治療后CD4∶CD8比值上有不定的變化。這顯示治療對T細胞亞群的內環境穩定的維持具有最小的治療作用，雖然治療使得總T細胞數目顯著上升。所有值均與對照值有可比性。
圖28對進行LHRH激動劑治療的患者外周血中B細胞和髓樣細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例進行分析，顯示不同亞群內的變化程度有所差別。雖然在治療后NK、NKT、和巨噬細胞的比例保持相對恒定，但是B細胞的比例在4/9的病人中有所降低。
圖29對治療后外周血中B細胞和骨髓性細胞總數進行分析顯示，NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬細胞(3/9患者)數量在治療后明顯上升。B細胞數目未見明顯趨勢2/9患者的水平上升，4/9患者不變，3/9患者的水平降低。
圖30A和BLHRH激動劑治療后所見到的主要變化在外周血的T細胞群體中。尤其是幼稚(CD45RA+)CD4+細胞的比例選擇性增高，CD4+T細胞亞群中幼稚(CD45RA+)與記憶(CD45RO+)的比例在6/9患者中有所上升。
圖31使用各種激光脈沖能量使皮膚的阻礙效應降低。當使用擬合的曲線來內推數值時，能量低至10mJ輔照皮膚就能使皮膚阻礙效應降低。
圖32藥物對皮膚的通透。使用胰島素做樣本藥物，經激光輔照使皮膚通透性顯著增強。
圖33給皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和單個短暫短暫脈沖后，皮膚熒光隨時間的變化。強度峰值出現在大約640nm處，并在治療210分鐘后最高(虛線)。
圖34不加短暫脈沖，只加入5-氨基乙酰丙酸(ALA)后，皮膚熒光隨時間的變化。在各個時間點的強度幾乎沒有變化。
圖35在各種峰值應力下，給皮膚加入5-氨基乙酰丙酸(ALA)和單一短暫脈沖后，比較皮膚熒光的變化。角質層的通透程度取決于峰值應力。
發明詳述本發明涉及在患者體內改善免疫應答的方法。該方法通過定量地和定性地恢復外周T細胞庫，尤其是幼稚T細胞的水平來加以完成。幼稚T細胞是那些尚未與抗原接觸的細胞，因而具有廣泛的特異性，即能與多種抗原中的任一種發生反應。作為本發明方法的結果，可以得到一個大的幼稚T細胞庫，以對疫苗中的施加的抗原發生應答。
在優選實施例中，傳向胸腺的性類固醇介導的信號被阻斷，通過萎縮的胸腺被重新激活，從而產生這一幼稚T細胞庫。該阻斷過程使患者的激素狀態發生逆轉。優選的產生阻斷的方法是閹割。閹割方法包括但不限于化學閹割和外科閹割。
重新激活胸腺的優選方法是通過阻斷LHRH對垂體的刺激效應，導致促性腺激素FSH和LH的喪失。這些促性腺激素通常作用于性腺，使其釋放性激素，尤其是女性的雌激素和男性的睪丸酮。FSH和LH的喪失導致性類固醇釋放的阻斷。其直接后果是血漿性類固醇水平的迅速降低，從而，逐漸釋放對胸腺的抑制信號。胸腺再生的程度和動力可以通過注射CD34+造血細胞(理想的是自體或同源的)來加以增強。
本發明可以用于任何具有性類固醇驅動的成熟和免疫系統的動物(包括人類)，例如哺乳動物和有袋動物，更好為大型哺乳動物，最好為人類。
術語“再生”、“重新激活”、和“重建”、以及他們的派生詞在此交替使用，并指萎縮的胸腺恢復到其活性狀態。
本文所使用的“閹割”是指體內的性類固醇的產生和分布的急劇和消失。胸腺完全行使功能時，就可以有效地將患者恢復到青春期前的狀態。外科閹割除去患者的性腺。
較少永久性的閹割方式是在一段時間內使用化學試劑，本文稱為“化學閹割”。多種化學試劑可以這種方式作用。在施用過程中以及施用后一段時間，患者的激素分泌被關閉。優選地，當化學試劑停用后閹割作用就被逆轉。
本發明用于多種情況。例如，在較長時間以后，免疫系統實際上缺乏幼稚細胞。隨著這些細胞的減少，對疫苗中的抗原的應答也降低，因為沒有足夠數量的幼稚細胞來產生這些應答。胸腺的重新激活產生大的幼稚細胞庫能夠對疫苗作出適當的應答。
此外，患有可誘導長時間的免疫應答的疾病或病癥，例如癌癥的患者，可能患有抗原特異性“克隆耗損”。雖然病人的幼稚T細胞起初可以對腫瘤上的外源抗原作出適當應答，因而可以產生各種細胞克隆，持續產生針對外來抗原的抗體，在較長一段時間以后，這些克隆將失去它們的生產能力。當患者的胸腺已經萎縮時，能夠繼續免疫應答的幼稚T細胞庫很可能已經相當少，甚至不存在，因此免疫應答實際上已經停止，或者在無法使患者消除腫瘤的水平上運行。重新激活胸腺將產生大的能夠對外來腫瘤抗原產生反應的幼稚T細胞庫，以防止或減輕“克隆耗損”。
阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的的信號很容易理解，傳向胸腺的性類固醇介導的信號可以用本領域熟知的多種方法被阻斷，其中有些在本發明加以描述。例如，抑制性類固醇的產生或者阻斷一種或多種胸腺內性類固醇受體，都可以實現所需的阻斷。也可以施用性類固醇激動劑或拮抗劑、或主動(抗原)或被動(抗體)的抗激素接種疫苗。性類固醇的抑制也可以通過使用一種或多種性類固醇類似物而達到。在有些臨床病例中，通過物理閹割永久性地除去性腺可能是適合的。
在優選實施例中，傳向胸腺的性類固醇介導的的信號是通過使用性類固醇類似物而阻斷，優選促黃體激素釋放激素(LHRH)類似物。性類固醇類似物和它們在治療和化學閹割上的應用已為人們所熟知。這種類似物包括但不限于，如下的LHRH受體(LHRH-R)激動劑布舍瑞林(Hoechst)、Cystorelin(Hoechst)、達必佳(商品名Debiopharm；Ipsen/Beaufour)、地洛瑞林(BalancePharmaceuticals)、戈那瑞林(Ayerst)、戈舍瑞林(商品名Zoladex；Zeneca)、組氨瑞林(Ortho)、亮丙立德(商品名Lupron；Abbott/TAP)、亮丙瑞林(Plosker et al)、黃體瑞林(Wyeth)、美替瑞林(WO9118016)、那法瑞林(Syntex)、和曲普瑞林(美國專利第4,010,125號)。LHRH類似物也包括但不限于如下LHRH-R的拮抗劑阿巴瑞克(商品名Plenaxis；Praecis)、西曲瑞克(商品名；Zentaris)。還包括激動劑的組合、拮抗劑的組合、激動劑與拮抗劑的組合。上述參考文獻所披露的內容結合于此作為參考。目前優選的類似物是地洛瑞林(描述于美國專利第4,218,439號)。更完整的目錄參見Vickery等，1984。
在一優選實施例中，給予患者LHRH受體(LHRH-R)拮抗劑，隨后給予LHRH-R激動劑。這一方法消除或限制在性類固醇分泌降低之前可能出現的任何性類固醇高峰，性類固醇分泌降低可因給予激動劑而引起。在另一實施例中，使用了只產生很少或沒有性類固醇分泌高峰的LHRH-R激動劑，此前可使用或不使用LHRH-R拮抗劑。
盡管對胸腺激活的刺激主要基于對性類固醇效應的抑制和/或LHRH類似物的直接效果，但包括其他可以協同增強胸腺效應的物質是有用的。這類化合物可以包括但不限于白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-15(IL-15)，上皮和成纖維細胞生長因子家族的成員、干細胞因子、粒細胞集落刺激因子(GCSF)和角質化細胞生長因子(KGF)。目前認為其他化合物只在最初使用LHRH類似物之前使用一次。但是，這些物質中的一種或其組合也可以在任何時候加用，以進一步刺激胸腺。此外，可能靶向于胸腺特異性的類固醇受體基調節劑也可被開發和使用。
藥物組合物本發明所用的化合物可在任何藥學上可接受的載體中或無需載體而使用。載體的例子包括生理上可接受的包衣、溶劑和稀釋劑。對于經胃腸外、皮下、靜脈、和肌肉給藥來說，組合物可以用膠囊加以保護。可以替換地，組合物可以與保護活性成分的載體一起使用，同時這種載體可以使活性成分緩慢釋放。本技術領域已知多種用于制備緩釋制劑的聚合物和共聚物，例如各種乳酸/乙醇酸共聚物。實施例參見美國專利第5,410,016號，其中使用聚乙二醇(PEG)的改性聚合物作為生物可降解的包衣。
口服制劑可以制備成液體、膠囊、片劑及其類似物。這些組合物可以包括賦形劑、稀釋劑、和/或防止活性成分降解的覆蓋物。這些配方都是已知的。
在任何配方中，只要不對LHRH類似物的活性產生負面影響的化合物都可以使用。這里描述了各種生長因子和其他細胞因子的實施例。
劑量LHRH類似物可以以一次劑量使用，這一劑量將持續一段時間。優選地，該配方的效果將持續1-2個月。標準劑量隨所用類似物的種類不同而不同。一般來說，劑量在大約0.01μg/kg至10mg/kg之間，優選在大約0.01mg/kg至5mg/kg之間。劑量隨所用LHRH類似物或疫苗不同而不同。在優選實施例中，劑量的持續時間為流行病持續的時間。例如，“流感季節”一般出現在冬季的幾個月。LHRH類似物的配方可以在流感季節開始時配制并按照本文所描述的方法施用，以提供患者2個或更多個月的保護，以后每兩個或更多個月施用一次，直到感染的危險減退或消失。
該配方可以用來增強免疫系統。可替換地，該配方可以用來在增強免疫系統的同時特異性阻擋流感病毒的感染。后一配方可以包括GM細胞，該細胞已被加工，可產生對流感病毒的抵抗作用(見下文)。GM細胞可與LHRH類似物配方一起使用或分開使用，即在空間和/或時間上分開使用。正如非GM細胞來說，可以在一段時間內給病人多次使用，以在整個流感季節產生保護、防止流感病毒感染。
化學閹割試劑的使用本發明的化合物的施用可以用本領域熟知的多種方法來完成。使用化學抑制劑來抑制傳向胸腺的性類固醇介導的信號的一個標準方法是使用單一劑量的LHRH激動劑，其療效可維持三個月。對此，簡單的一次靜脈內或肌肉注射將是不夠的，因為三個月時間還沒有到，激動劑就將從患者體內清除出去。相反，應該使用貯存式注射或植入法，或其他任何可以使抑制劑緩慢釋放的方法。同樣也可以使用延長抑制劑在體內半衰期的方法，例如對化學藥品進行改性同時保持此處所需功能。
更有用的給藥機制包括但不限于，用激光照射皮膚、以及在皮膚上產生高壓短暫短暫脈沖(也稱應力波或短暫短暫脈沖)，每種方法實施的同時或之后，將有或無載體的化合物放置在同一部位。優選的方法是放置一塊膠布，在治療期間一直貼在皮膚上。
一種給藥方法是使用激光束，尤其是聚焦激光束，以合適波長發射激光，在患者皮膚上產生小面積的穿孔或蝕變。參見美國專利第4,775,361號、第5,643,252號、第5,839,446號、和第6,056,738號，所有這些專利結合于此作為參考。在優選實施例中，激光束波長在0.2～10微米之間，更好為波長在1.5～3.0微米之間，最好為波長約2.94微米。在一個實施例中，激光束用透鏡聚焦，穿透表皮在皮膚上產生一輻照斑。在另一實施例中，激光束聚焦后僅穿透角質層產生一輻照斑。
在此，“消融”和“穿孔”指在皮膚上形成孔。孔的深度可以各異；例如，可僅穿透角質層，也可穿入皮膚的毛細血管層，或在終止于兩層之間任何位置。在此，所用“蝕變”指的是皮膚結構的變化，不產生孔，增加皮膚的通透性。與穿孔一樣，皮膚可在任何深度上被蝕變。
可以用幾個因素來定義激光束，包括波長、能注量、脈沖時間寬度和輻照斑大小。在優選實施例中，能注量在0.03～100,000J/cm2范圍內。更優選地，能注量在0.03～9.6J/cm2范圍內。光束波長部分依賴于激光材料，例如，鉺(Er):釔鋁石榴石(YAG)。例如，脈沖時間寬度是由一系列電容器、閃光燈、以及激光棒材料所產生的脈沖寬度決定的。脈沖寬度優選1fs(微毫秒)～1000μs。
根據該方法，激光所產生的孔或蝕變不一定由來自激光的單一脈沖所產生。在一個優選實施例中，透過角質層的穿孔或蝕變是由多個激光脈沖產生的，每一個僅穿孔或蝕變靶組織厚度的一部分。
最后，可以粗略估計多個脈沖穿孔或蝕變角質層所需要的能量，即取單一脈沖的能量，除以所需脈沖的數量。例如，如果一個特定大小的點需要1J的能量來穿孔或蝕變整個角質層，那么我們可以使用10次脈沖，每次用1/10的能量，產生從定性上來說基本相似的穿孔或蝕變效果。由于需要患者在輻射期間不移動靶組織(人體反應時間在100ms左右)，并且每次脈沖所產生的熱不顯著擴散，在一優選實施例中激光器的脈沖重復率應如此，以使得整個穿孔過程在少于100ms的時間段內完成。可替換地，靶組織和激光的定位可以機械固定，使得在較長的輻射時間內靶組織位置不發生移動。
為了在穿透皮膚時少流血或不流血，可以在皮膚的外表(例如角質層)完成穿孔或蝕變，但不深入毛細血管層。激光束精確地聚焦于皮膚，在皮膚上產生的光束直徑大約為0.5μm～5.0cm。任選地，光斑可以是裂隙狀的，寬約0.05～0.5mm，長為2.5mm。寬度可以任意大小，由輻照部位的解剖以及所要除去的液體或施用的藥物的所需通透率決定。聚焦透鏡的焦距可以任意長，但在一個實施例中為30mm。
通過調整波長、脈沖長度、能注量(是激光輸出能量(J)和焦點光束大小(cm2)的函數)和輻照光斑大小，可以在消融(穿孔)和非消融性調整(蝕變)之間，改變對角質層的影響。角質層的消融和非消融蝕變都可導致隨后使用的藥物的通透性增高。
例如，通過降低脈沖能量而保持其他參量恒定，可以在消融和非消融的組織效應間進行轉換。使用脈沖長度約300μs的鉺(Er):釔鋁石榴石(YAG)激光器，采用單一脈沖或輻射能，并在皮膚上輻照2mm大小的光斑，超過大約100mJ的脈沖能量產生部分或完全消融，而任何低于100mJ的脈沖能量則導致角質層的部分消融或非消融性改變。任選地，通過使用多個脈沖，體液或施用的藥物的通透性所需的閾脈沖能量降低，其數值約等于脈沖的數量。
可替換地，通過將光斑縮小而保持其他參量恒定，也可以在消融和非消融性組織效應之間進行轉換。例如，將光斑面積減半，導致相同效應所需的能量也會減半。可以得到低至0.5微米的輻照，例如，可以通過將激光器的輻射輸出耦合于顯微鏡的多個物鏡(如購自Nikon公司，Melville，紐約)。這種情況下，可以將光束聚焦到顯微鏡分辨率的極限等級的光斑，其也許在0.5微米的等級上。事實上，如果光束特性是高斯分布的，受影響的輻照面積的大小可以小于所測量的光束大小，而超過顯微鏡的成像分辨率。在這種情況下為了無消融地蝕變組織，使用3.2J/cm2的能注量可能是合適的，其對0.5微米的光斑大小來說，需要脈沖能量約5nJ。這么低的脈沖能量容易從二極管激光獲得，也可以獲得，例如，通過吸收濾片(如玻璃)衰減的鉺(Er):釔鋁石榴石(YAG)。
任選地，通過改變輻射能量的波長而保持其他參數恒定，可以在消融和非消融性組織效應間進行轉換。例如，使用Ho:YAG(鈥:釔鋁石榴石；2.127μm)而不是Er:YAG(鉺:釔鋁石榴石；2.94μm)激光器，可以使組織對能量的吸收更少，使穿孔或蝕變更少。
激光器所產生的微微秒和毫微微秒脈沖也可用于產生皮膚蝕變或消融。這可以通過調制的二極管或相關微芯片激光器完成，其可以在1fs-1ms的時間寬度發射單一脈沖。(參見D.Stern等，“用在532nm和625nm處的毫微秒、微微秒、毫微微秒激光進行角膜消融”(“Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，andFemtosecond Lasers at 532 and 625nm”)《角膜激光消融》(CornealLaser Ablation)，第107卷，587-592頁(1989)，其結合于此作為參考，其披露了低至1毫微微秒脈沖長度的使用)。
另一種給藥方法使用高壓短暫脈沖，以在皮膚上產生通透性。參見美國專利第5,614,502號、和第5,658,892號，兩者結合于此作為參考。高壓短暫脈沖，例如，應力波(如激光產生時的激光應力波(LSW))具有特定的上升時間和峰值應力，可以安全和有效地影響化合物的傳遞，如本發明的化合物，使其通過上皮組織層，例如角質層和粘膜。這些方法可以用來傳遞各種大小的化合物而無需考慮其凈電荷。此外，本發明方法的短暫脈沖可以避免組織損傷。
在暴露于短暫脈沖之前，上皮組織層，例如角質層很可能對外來化合物不通透；這可以防止化合物向上皮層下面的細胞擴散。將上皮層暴露于短暫脈沖下，可使化合物擴散入上皮層。一般而言，擴散過程取決于短暫脈沖的性質和運輸的化合物的大小。
通過特定上皮組織層的穿透率，例如皮膚角質層的穿透率也取決于其他幾個因素，包括pH值、皮膚基質組織的代謝、角質層內外區域的壓力差、以及解剖部位和皮膚的理條件。此外，皮膚的生理條件取決于健康狀況、年齡、性別、種族、皮膚護理和病史。例如，先前接觸有機溶劑或表面活性劑可以影響皮膚的生理狀況。
經上皮組織層傳遞的化合物的量也取決于上皮層保持通透的時間長短，以及變得通透的上皮層表面積的大小。
短暫脈沖的特性是由產生它們的能量源所控制的。參見WO98/23325，起結合于此作為參考。然而，它們的特性是由它們在其中擴散的偶聯介質的線性和非線性特性所調節。偶聯介質所引起的線性衰減主要使短暫脈沖中的高頻成分得以衰減。這使得帶寬隨著短暫脈沖相應的上升時間的增加而減少。另一方面，偶聯介質的非線性特性使得上升時間減少。上升時間的減少是聲音和粒子速度對應力依賴的結果。應力增加，聲音和粒子速度也增加。這導致短暫脈沖的前沿變得更陡。線性衰減、非線性系數和峰值應力的相對強度決定了波需傳播多遠，才能使上升時間的陡度增加變得顯著。
選擇上升時間、強度和短暫脈沖的持續時間，以產生的非毀滅性的(即非休克波)短暫脈沖，這可以暫時提高上皮組織層的通透性。一般而言上升時間至少1ns，更優選約10ns。
短暫脈沖的峰值應力或壓力隨不同的上皮組織或細胞層而有所不同。例如，對于傳送化合物通過角質層來說，短暫脈沖的峰值應力或壓力應設至至少400巴；更優選至少1,000巴，但不高于約2,000巴。
對上皮粘膜層來說，峰值壓力應設至300～800巴，優選300～600巴。
短暫脈沖優選的持續時間為幾十個毫微秒(ns)，因此僅在短時間內與上皮組織相互作用。
與短暫脈沖接觸之后，上皮組織并不受到永久損傷，但在約三分鐘內保持通透。
此外，本發明的新方法涉及僅給患者施用數個彼此孤立的高強度脈沖。給予患者的短暫脈沖的數量一般少于100，更優選少于50，最優選少于10。當使用多個適當脈沖以產生短暫脈沖時，相鄰脈沖之間的時間間隔應為10～120秒，其足夠長以防止對上皮組織的永久損害。
使用本技術領域的標準方法對短暫脈沖的特性進行測量。例如，峰值應力或壓力、和上升時間可以用聚偏氟乙烯(PVDF)轉換器方法(描述于Doukas等，Ultrasound Med.Biol.，21961(1995))進行測定。
短暫脈沖可用各種能量源產生。能夠產生短暫脈沖的物理現象一般來自三種不同的機制(1)熱彈性生成；(2)光學擊穿；或(3)消融。
例如，該短暫脈沖可以通過使用高能激光源使一靶材料產生消融而發生，然后通過一偶聯介質將短暫脈沖與上皮組織或細胞層耦合。該偶聯介質可以為，例如，液體或膠質，只要其是非線性的。
因此，水、油(例如蓖麻油)等、滲介質如磷酸緩沖鹽水(PBS)、或膠質(如膠原蛋白膠)都可以用作偶聯介質。
此外，該偶聯介質也可以包括增強傳導的表面活性劑，例如，在短暫脈沖產生之后，延長角質層對化合物的通透時間。表面活性劑可以是，例如，離子洗滌劑或非離子洗滌劑，因此可以包括例如十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨，和月桂基二甲基氨基氧化物。
吸收性靶材料起到光學觸發的轉換器的作用。光被吸收以后，靶材料進行快速傳熱膨脹或被消融，以產生短暫脈沖。一般來說，金屬和聚合物膜在可見和紫外光譜區具有高吸收系數。
許多類型的材料可以與激光束一起作為靶材料，只要它們在所用激光波長內可完全吸收光。靶材料可由金屬組成，例如鋁或銅；塑料，例如聚苯乙烯，如黑色聚苯乙烯；陶瓷；或高度濃縮的燃料溶液。靶材料的大小必須大于所施用的激光能的截面積。此外，靶材料必須厚于光學穿透深度，這樣激光就不會打到皮膚表面。靶材料還必須足夠厚，以提供機械支撐。當靶材料為金屬時，標準厚度為1/32～1/16英寸(0.79375～1.5875mm)。塑料靶材料的厚度為1/16～1/8英寸(1.5875～3.175mm)。
還可以使用限制性消融來加強短暫脈沖。在限制性消融中，激光束透明材料，例如石英光學窗，被放置在靶材料旁邊。通過使用透明材料使靶材料消融，而使血漿限制，以使耦合系數在數量級上增長(Fabro等，J.Appl.Phys，68775，1990)。該透明材料可以是石英、玻璃或透明塑料。
由于靶材料與限制性透明材料之間的空隙使血漿膨脹，因此降低了到達靶上的動量，透明材料最好用液體粘附劑(例如含碳的環氧物質)固定在靶材料上，以避免上述空隙。
激光束可由本技術領域熟知的標準光學調制技術加以產生，例如使用Q-開關的或模式鎖定激光器，如電或聲-光設備。可在紅外光、可見光、和/或紅外光譜區以脈沖模式操作的標準商售激光器包括Nd:YAG激光器、Nd:YLF激光器、CO2激光器、激態原子激光器、染料激光器、Ti:藍寶石激光器，二極管激光器，鈥(和其他稀土元素)激光器、以及金屬蒸氣激光器。這些光源的脈沖寬度可調，并且可在幾十微微秒(PS)至幾百微秒之間變化。在本發明的應用中，光脈沖寬度可在100ps～約200ns之間，優選大約在500ps～40ns之間。
短暫脈沖也可用體外碎石機(一個實例參見Coleman等，Ultrasound Med.Biol.，15213-227，1989)產生。這些短暫脈沖的上升時間為30～450ns，長于激光產生的短暫脈沖。為了使用體外碎石機用新方法形成具有合適上升時間的短暫脈沖，短暫脈沖在非線性偶聯介質(如水)中擴散，擴散距離有上述公式(1)決定。例如，當使用碎石機產生上升時間為100ns和峰值壓力為500巴的短暫脈沖時，短暫脈沖在接觸上皮細胞層前應在偶聯介質中通過的距離約為5mm。
用碎石機產生短暫脈沖的另一個好處在于波的拉伸成分被擴展并衰減，這是其在非線性偶聯介質擴散的結果。這一擴散距離可以加以調整，使得短暫脈沖的拉伸成分的壓力僅占波的壓縮成分的峰值壓力的約5～10％。因此，形成的短暫脈沖將不會損傷組織。
碎石機的類型并不是關鍵。無論電液、電磁還是壓電碎石機都可以使用。
短暫脈沖也可以用換能器產生，例如壓電換能器。優選地，換能器與偶聯介質直接接觸，在施加光場、熱場、或電場后快速位移，以產生短暫脈沖。例如，可使用電解質擊穿，并且一般由高壓火花或壓電換能器誘導(在某些體外碎石機中所使用的類似，Coleman等，Ultrasound Med.Biol.，15213-227，1989)。在使用壓電換能器時，換能器在施加電場后迅速膨脹，導致偶聯介質發生快速位移。
此外，可以使用纖維光學幫助短暫脈沖的產生。纖維光學傳導系統很容易操作，并且可以用來輻照位于上皮組織層附近的靶材料，以在難以到達的區域產生短暫脈沖。當與激光器發生光耦合時，這類傳導系統是優選的，因為它們可被整合入導管和相關的柔軟器械內，并用于輻照人體內的大部分器官。此外，為了產生具有所需上升時間和峰值壓力的短暫脈沖，光源的波長很容易整形，以在特殊的靶材料中產生合適的吸收。
可以替換地，一種高能材料可以通過對爆炸脈沖的反應而產生短暫脈沖。爆炸物可以通過產生放電或電火花而使高能材料爆炸。
流體靜壓可以與短暫脈沖一起使用可用來增強化合物經上皮組織層的運輸。由于短暫脈沖所誘發的效應持續幾分鐘，藥物沿濃度梯度經上皮細胞層被動擴散的運輸速度可以通過在施加短暫脈沖后，在上皮組織層(例如皮膚角質層)表面施加流體靜壓而得到提高。
疫苗應答的改善通過在此描述的方法，在所有目前可確定的術語中，性類固醇誘導的萎縮胸腺可以在結構上和功能上顯著地恢復到其最優的青春期前水平。這包括所有T細胞亞群的數量、種類和比例。也包括復雜的基質細胞和它們的三維結構，它們構成了產生T細胞所需要的胸腺微環境。新生成的T細胞從胸腺移出，恢復外周T細胞水平和功能。
通過在胸腺開始再生前或再生時加入CD34+造血干細胞(HSC)和/或上皮干細胞，可以對胸腺的重新激活稍微進行補充。這些細胞最好是自體或同源的，在胸腺重新激活前取自患者或雙胞胎。HSC可以通過從患者血和/或骨髓分揀CD34+細胞而得到。可以用幾種方法提高HSC數量，包括(但不限于)在收集細胞前給病人施用G-CSF(Neupogen，Amgen)，在干細胞生長因子中培養收集到的細胞，和/或在補充CD34+細胞后給患者施用G-CSF。可以選擇地，如果通過事先給患者注射G-CSF以使CD34+細胞數量增多，就不需要再從血或骨髓中分揀CD34+細胞。
開始阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號3-4周時(約在LHRH治療開始后2-3周)，血流中出現最初的新生T細胞。T細胞庫的完全發育卻要3-4個月的時間。原則上新生成的幼稚細胞一出現便可以開始免疫，然而，最好等到LHRH治療開始4-6周后再開始免疫，此時才會有足夠的新T細胞產生以產生足夠強的應答，并會經歷任何必要的胸腺后成熟過程。
這一過程可與其他任何形式的免疫系統刺激結合，包括佐劑、輔助分子和細胞因子療法。例如，有用的細胞因子包括但不限于作為一般性免疫生長因子的白細胞介素-2(IL2)、用于影響對Th2應答(體液免疫)的IL4、和用于影響對Th1應答的擾素(細胞介導的炎癥應答)。輔助因子包括但不限于CTLA4的抑制劑，它們可以通過促進CD28/B7.1、B7.2刺激通路來增強一般性免疫應答，該通路通常被CTLA4所抑制。
小動物研究材料和方法動物
CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠獲自Monash大學的動物服務中心(Central Animal Services)，并在傳統條件下飼養。年齡在4-6周至26個月，并將在相關處示明。
閹割向動物腹腔內注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(Rompun；BayerAustralia Ltd.，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸酮胺(氯胺酮針劑；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進行麻醉。外科閹割是將陰囊切開、暴露睪丸、用縫線系緊、并與周圍脂肪組織一起除去。
5-溴脫氧尿苷(BrdU)摻入小鼠以4小時的間隔接受兩次腹腔內BrdU注射(Sigma化學公司，圣路易斯，密蘇里州)(100mg/kg體重，在100μl PBS中)。對照小鼠僅接受賦形劑注射。第二次注射后一小時，切下胸腺，或者制備細胞懸液用于FACS分析，或者立刻包埋于Tissue Tek(O.C.T.化合物，邁爾斯公司，印第安納州)，在液氮中快速冷凍并儲存于-70℃待用。
流式細胞計分析用CO2窒息殺死小鼠，取下胸腺、脾和腸系膜淋巴結。器官在冷PBS/1％FCS/0.02％疊氮化物的溶液中，輕柔地通過200μm的濾網、離心(650g，5分鐘，4℃)、并重新懸浮于任何一種PBS/FCS/疊氮化物中。脾細胞在紅細胞裂解緩沖液(8.9g/l氯化銨)中4℃孵育10分鐘，沖洗，并重新懸浮于PBS/FCS/疊氮化物。細胞濃度和存活度采用血球計數儀和溴乙錠/吖啶橙測定兩次，在熒光顯微鏡下觀察(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，德國)。
為進行三色免疫熒光檢測，胸腺細胞例行用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(全部獲自Pharmingen，圣地亞哥，加利福尼亞)進行常規標記，然后進行流式細胞計分析。脾和淋巴結懸液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或B220-B(Sigma)與CD4-PE和CD8-APC進行標記。B220-B用抗生蛋白鏈菌素三色共軛物(購自Caltag實驗室公司，伯林蓋姆，加利福尼亞)顯色。
為進行BrdU檢測，細胞用CD4-PE和CD8-APC進行表面標記，接著進行如前述的固定和通透(Carayon and Bord，1989)。簡而言之，染色的細胞用1％PFA/0.01％吐溫-20在4℃固定O/N。沖洗過的細胞在37℃下，置于500μl DNase中孵育(100孔尼茲單位，Boehringer Mannheim，西德)30分鐘，以使DNA變性。最后，細胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)進行孵育。
為進行四色免疫熒光檢測，胸腺細胞用CD3、CD4、CD8、B220、Mac-1標記，用抗大鼠Ig-Cy5(Amersham，英國)總體檢測，門化的陰性細胞(TN)用于分析。它們繼而用CD25-PE(Pharmingen)和CD44-B(Pharmingen)進行染色、并接著用抗生蛋白鏈菌素-三-色(Caltag，加利福尼亞)顯色，如前所述的檢測(Godfrey and Zlotnik，1993)。然后按如前所述的方法進行BrdU檢測。
樣品用FacsCalibur(Becton-Dickinson)進行分析。存活的淋巴細胞根據0°和90°光散射圖進行門化，并且數據用細胞尋找軟件(Cell quest software)進行分析(Becton-Dickinson)。
免疫組化冰凍胸腺切片(4μm)用冷凍箱(Leica)切片，并迅速用100％的丙酮固定。
為進行雙色免疫熒光檢測，切片用本實驗室生產的一組單克隆抗體進行雙標記MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey等，1990；表1)，并用多價兔抗細胞角蛋白抗體(Dako，Carpinteria，加利福尼亞)對上皮細胞決定簇的共同表達進行檢測。結合的單克隆抗體(mAb)用FITC共軛的綿羊抗大鼠Ig(Silenus實驗室)進行顯色，并且抗細胞角蛋白用異硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)共軛的山羊抗兔免疫球蛋白(Silenus實驗室)顯色。
為進行BrdU檢測，切片用抗細胞角蛋白，再用抗兔TRITC染色，或用特異的mAb染色，然后用抗大鼠免疫球蛋白(Ig)-Cγ3(Amersham)顯色。然后按上述方法進行BrdU檢測(Penit等，1996)。簡而言之，切片用70％乙醇固定30分鐘。半干的切片在4MHCl中孵育，在硼酸緩沖液(Sigma)中沖洗以中和，然后用PBS沖洗兩次。BrdU用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)進行檢測。
為進行三色免疫熒光檢測，切片用特異性MTS單克隆抗體(mAb)與抗細胞角蛋白一起進行標記。然后如上所述方法進行BrdU檢測。
切片用Leica熒光顯微鏡和Nikon共焦顯微鏡進行分析。
遷移研究動物用腹腔注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯酮胺(氯胺酮針劑；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進行麻醉。
胸腺細胞的FITC標記技術與其他文獻的描述類似(Scollay，等，1980；Berzins等，1998)。簡而言之，暴露胸腺葉，每葉用大約10μm(μl)的350μg/ml FITC(在PBS中)進行注射。傷口用外科手術針縫合，保溫小鼠，直至其完全從麻醉中蘇醒。注射后約24小時，用CO2窒息法殺死小鼠，并切下淋巴器官用于分析。
細胞計數以后，樣品用抗CD4-PE和抗CD8-APC進行染色，然后用流式細胞計進行分析。遷移的細胞被認為是表達CD4或CD8的活的門化的(live-gated)FITC+細胞(以排除自身熒光細胞和雙聯體)。加入FITC+CD4和CD8細胞的百分率，各自得到淋巴結和脾的總遷移率。每日輸出率用Berzins等(1998)描述的方法計算。
使用非配對的“t”檢驗或非參量曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗以進行數據分析，以確定對照組和測試組檢驗結果之間的統計顯著性，實驗至少進行三次。實驗值與對照值相比有顯著差別，用下列方式表示*P≤0.05、**P≤0.01、和***P≤0.001。
結果年齡對胸腺細胞群體的影響(i)胸腺重量和胸腺細胞數量隨著年齡的增長，胸腺重量(圖1A)和總胸腺細胞數(圖1B)都有顯著降低(P≤0.0001)。年輕成年鼠的相對胸腺重量(mg胸腺/g體重)平均值為3.34，18-24個月時則降低至0.66(由于脂肪沉積無法精確計算)。胸腺重量的降低可以歸因于總胸腺細胞數量的減少1-2個月的胸腺含有約6.7×107個胸腺細胞，24個月后則降低至約4.5×106個胸腺細胞。閹割使得性類固醇對胸腺的作用消除，于是胸腺再生，閹割4周后，胸腺在重量和細胞構成上都與年輕成年鼠的胸腺相當(圖1A、1B)。有趣的是，閹割2周后，胸腺細胞的數量有明顯增加(P≤0.001)，約為1.2×108個，而在閹割4周后則恢復到正常年輕鼠的水平(圖1B)。
胸腺產生的T細胞的減少并沒有反映在外周中，脾細胞的數量隨年齡增長仍保持恒定(圖2A)。外周的內環境穩定機制是很明顯的，因為脾和淋巴結中B細胞對T細胞的比率并不受年齡以及隨之而來的到達外周的T細胞數量減少的影響(圖2B)。但是，CD4+對CD8+T細胞的比值卻隨年齡顯著降低(P≤0.001)，從2個月時的的2∶1降至2歲時的1∶1(圖2C)。閹割后和隨后到達外周的T細胞數量隨之上升，但外周的T細胞數量未見變化脾T細胞數目和脾、淋巴結中B/T細胞比值在閹割后均無改變(圖2A和B)。外周血CD4∶CD8比值的降低在閹割2周時仍然明顯，但在閹割4周后則完全逆轉(圖2C)。
(ii)αβTCR，、γδTCR、CD4和CD8的表達為了測定胸腺細胞數量隨年齡的減少是否是某種特異性細胞損耗所產生的結果，將胸腺細胞用特定標記物進行標記，以對不同的亞群進行分析。此外，還允許分析閹割后胸腺再生的動力學。將主要胸腺細胞亞群的比例與正常年輕胸腺進行比較(圖3)，發現其雖年齡增長保持恒定。此外，將胸腺細胞按表達αβTCR和γδTCR進行細分，這些群體的比率隨年齡并無變化(數據未顯示)。閹割后2和4周，胸腺細胞亞群維持同一比率，并且由于胸腺細胞數量在閹割后上升了高達100倍，這顯示所有胸腺細胞亞群的同步擴增，而并非進化式的逐步擴增。
老年動物胸腺中細胞數量的減少可能是所有細胞表型均衡降低的結果，未見T細胞群體的顯著變化。胸腺再生以同步方式進行，所有T細胞亞群均同時得到補充，而不是按次序補充。
胸腺細胞的增殖如圖4所示，15-20％的胸腺細胞在年齡為4-6周時開始增殖。其中大部分(約80％)是DP，其次是TN亞群(約6％)(圖5A)。因此，免疫組化所見的細胞分裂大部分發生在被膜下和皮質(數據未顯示)。用FACS分析可在髓質區見到一些細胞分裂，顯示部分SP細胞(9％的CD4T細胞和25％的CD8T細胞)分裂(圖5B)。
雖然老年胸腺中的細胞數量顯著減少，胸腺細胞的增殖仍保持恒定，2歲時降至12-15％(圖4)，其增殖亞群的表型與2個月胸腺類似(圖5A)。免疫組化顯示了1歲時的細胞分裂，反映了年輕成年鼠的狀況；但在2歲時，增殖主要見于外層皮質和維管結構周圍(數據未顯示)。閹割后2周，雖然胸腺細胞數量顯著增加，增殖的胸腺細胞的比率沒有變化，再次顯示細胞的同步擴增(圖4)。免疫組化顯示了胸腺細胞增殖的定位和分裂細胞的范圍類似于2個月胸腺在閹割2周后的狀況(數據未顯示)。分析代表增殖亞群的每一亞群的比率時，CD8T細胞在增殖細胞中的比率有顯著上升(P＜0.001)，(2個月和2歲時為1％，閹割2周后增至約6％)(圖5A)。
圖5B顯示年輕、老年和閹割鼠中每一亞群的增殖情況。DN亞群中增殖呈顯著衰減(P≤0.001)(2個月時的35％到2歲時的4％)。CD8+T細胞的增殖也顯著減少(P≤0.001)，反映了免疫組織學的結果(數據未顯示)，即在老年胸腺的髓質中未見明顯細胞分裂。閹割4周后DN增殖的減少也未恢復到正常年輕水平。但是，閹割2周后CD8+T細胞亞群的增殖顯著增加(P≤0.001)，閹割4周后恢復到正常年輕水平。
使用CD44和CD25標記物進一步對DN亞群中的增殖減少進行分析。DN亞群中除已含胸腺細胞前體外還包含αβTCR+CD4-CD8-胸腺細胞，后者被認為下調向SP細胞轉換的兩種受體(Godfrey & Zlotnik，1993)。通過對這些成熟細胞進行門化(gating)，便可以分析真正的TN區域(CD3-CD4-CD8-)，并且這些隨年齡或閹割在增殖上沒有表現出差別(圖5C)。但是，對表達CD44和CD25的亞群進行分析，顯示在TN1亞群(CD44+CD25-)的增殖上呈明顯降低(P＜0.001)，從正常年輕鼠的20％降至18個月時的約6％(圖5D)，閹割4周后得到恢復。TN1亞群增殖的減少被TN2亞群(CD44+CD25+)增殖的顯著增加(P≤0.001)所彌補，后者在閹割2周之后恢復到正常年輕水平(圖5D)。
年齡對胸腺微環境的影響使用來自MTS系列的單克隆抗體(Mabs)的延伸板，用多克隆抗細胞角蛋白抗體進行雙標記，用免疫熒光法，來檢測胸腺微環境隨年齡的變化。
被這些單克隆抗體所識別的抗原可以分為三組胸腺上皮、血管相關性抗原、和那些存在于基質細胞及胸腺細胞上的抗原。
(i)上皮細胞抗原2歲小鼠胸腺的抗角蛋白染色(泛上皮)，顯示了一般胸腺結構的喪失，伴隨嚴重的上皮細胞無序化，和明顯的皮-髓質連接的喪失。使用單克隆抗體、MTSIO(髓質)、和MTS44(皮質)進行進一步分析發現，皮質大小隨年齡呈明顯的減少現象，而髓質上皮則不呈此顯著減少(數據未顯示)。無上皮細胞區域，或角蛋白陰性區域(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)在老年胸腺中更為明顯，并范圍增大，如抗角蛋白標記所見。老年胸腺中也出現胸腺上皮“囊樣”結構，尤其在髓質區(數據未顯示)。脂肪沉積、胸腺尺寸的嚴重縮小以及皮-髓質連接區無序化均只能用抗細胞角蛋白染色才可見(數據未顯示)。胸腺在閹割2周后開始再生。這表現在胸腺葉的大小、皮質上皮用MTS44顯示的增多以及髓質上皮的定位化。髓質上皮用MTS10檢測，在2周時，仍有用MTS10染色的上皮副囊(subpockets)，分散于皮質中。閹割4周后，便有清楚的髓質、皮質和可分辨的皮質-髓質連接(數據未顯示)。
標記物MTS20和24被認為可用來檢測原生上皮細胞(Godfrey，等，1990)，進一步顯示了老年胸腺的退化。它們在E14時數量很多，可4-6周時檢測到孤立的髓質上皮細胞簇，在老年胸腺中的強度再次增加(數據未顯示)。閹割后，所有這些抗原均以與年輕成年鼠胸腺相當的水平表達(數據未顯示)，MTS20和MTS24恢復到位于皮質-髓質連接區的清晰可見的上皮副囊(subpocket)中。
(ii)血管相關抗原血-胸腺屏障被認為負責T細胞前體向胸腺的遷移，以及成熟T細胞從胸腺向外周的轉移。
單克隆抗體(Mab)MTS15是胸腺血管的內皮特異性的，呈現出顆粒狀、彌散的染色圖像(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS15的表達顯著增加，并反映出血管和血管周圍間隙的增多和尺寸的增大。(數據未顯示)。
胸腺細胞外基質含有重要的結構和細胞粘附分子，例如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維蛋白原，可用單克隆抗體(MAb)MTS16進行檢測。MTS表達在正常年輕胸腺中較分散，而在老年胸腺中變得更為擴散并彼此相連。MTS16的表達在閹割2周后進一步增加，而在閹割4周后時，這一表達反映的狀況與2月齡胸腺類似(數據未顯示)。
(iii)共有抗原用單克隆抗體(MAb)MTS6檢測的正常年輕胸腺中的MHCII表達在皮質上皮中呈強陽性(顆粒)(Godfrey等，1990)，髓質上皮則染色較弱。老年胸腺表現出MHCII表達的降低，閹割2周后表達顯著上升。閹割4周后，表達再次降低，并與2個月時的胸腺類似(數據未顯示)。
胸腺細胞遷移在年輕小鼠每天有大約1％的T細胞從胸腺移出(Scollay等，1980)。14個月的正常年輕小鼠和甚至2歲的小鼠，其遷移細胞的比例幾乎相等(圖5)，雖然其數量顯著減少(P≤0.0001)。最新的從胸腺遷移出的細胞中CD4∶CD8比率有所升高，從2個月時的約3∶1升到26個月時的約7∶1。閹割1周后，遷移到外周的細胞數量顯著上升，而總遷移率仍保持1-1.5％。
實施例下面的實施例提供了本發明方法的特定實施例，但并不構成對本發明的內容限制。為方便起見，這些實施例描述了提供LHRH激動劑，以阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號。但是，并不因此限制發明的范圍。
實施例1性類固醇消融治療通過使用LHRH激動劑來給予患者性類固醇治療。使用Leucrin(貯存式注射，22.5mg)或醋酸性瑞林(植入，10.8mg)，任何一種單次劑量可維持療效3個月。其效果為使性類固醇的水平低至足以重新激活胸腺。有些情況下也需要給予腎上腺產生的性類固醇的抑制劑，例如每天服用一片Cosudex(5mg/天)，在性類固醇消融治療期間使用。腎上腺產生的性類固醇占人體類固醇的約10-15％。
血液中性類固醇降低到最低水平約需1-3周，與此一致的是胸腺的重新激活。有些情況下需要將治療時間延長，進行第二個3個月的注射/植入療程。
實施例2其他給藥方法除了貯存式或植入式使用LHRH激動劑3個月外，也可以使用其他方法。在一個實施例中，患者的皮膚用激光器進行輻照(如鉺:釔鋁石榴石激光器)，使皮膚消融或蝕變，以降低角質層的阻礙效應(impeding effect)。
A.激光消融或蝕變使用固相的、脈沖鉺:釔鋁石榴石激光器形成紅外激光輻射脈沖，該激光器由兩個平面共振腔反射鏡、作為激活介質的鉺:釔鋁石榴石晶體、電源、和一聚焦激光束的裝置構成。激光束的波長為2.94μm。使用單脈沖。
操作參數如下每次脈沖的能量為40、80、或120mJ，焦點位置的光束大小為2mm，產生1.27、2.25、或3.82J/cm2的能注量。脈沖時間寬度為300μs，產生能注量率為0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。
繼而，將LHRH激動劑用于皮膚，涂布于輻照部位。LHRH激動劑可為膏劑形式，這樣可以存留于輻照部位。可選地，在激動劑上蓋上密封貼片，使得其存留于輻照部位。
可選擇地，使用光束分裂器，將激光束分裂，產生多個消融或蝕變位點。這使得LHRH激動劑更快地經皮膚進入血液。位點的數目可以事先確定，使得激動劑在患者系統內保持所需要的大約30天時間。
B.壓力波將一定劑量的LHRH激動劑放在適當容器中，例如一塑料的、柔軟的墊圈(約直徑1英寸(25.4mm)和1/16英寸(1.5875mm)厚)，放在皮膚上將要產生壓力波的位置。該位點隨后用靶材料覆蓋，例如約1mm厚的黑色聚苯乙烯片。使用Q-開關的固態紅寶石激光器(20ns脈沖持續時間，每次脈沖能產生2焦耳)，以產生激光束，光束擊中靶材料，并產生單一短暫脈沖。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光輻射，使得皮膚只暴露于短暫脈沖，而不暴露于激光輻射。這一過程無痛。這一過程可以每日重復，也可按需要多次進行，以維持激動劑的血循環水平。
實施例3選擇性給予HSC在一個實施例中，給予患者造血干細胞(HSC)以加速胸腺的激活。這些HSC優選是自體或同基因的，但來自錯配供體(異體或異基因)的HSC也可以使用。在實際應用中，患者或供體血中HSC水平可用于給患者或供體注射粒細胞集落刺激因子(G-CSF，10μg/kg，采集細胞前2-5天注射)的方法得以升高。從患者或供體血或骨髓中純化CD34+細胞，優選使用流式細胞儀或免疫磁珠。HSC用流式細胞儀確認為CD34+。可選地，這些HSC用干細胞因子在體外進行擴增。給予LHRH激動劑后大約1-3周，此時胸腺恰巧開始再生，給患者注射HSC，最佳劑量為約2-4×106細胞/kg。可選地，可以給受體注射G-CSF，以協助HSC的擴增。
當HSC來自錯配供體時，可以給受體施用T細胞消融和免疫抑制療法，以防止對外來HSC的排斥。在這種治療的一個例子中，抗T細胞抗體以每日注射15mg/kgAtgam(異抗T細胞球蛋白，Pharmacia Upjohn)的形式施用10天，與T細胞激活的抑制劑環孢菌素A(3mg/kg)共同使用，連續灌注3-4周，隨后視需要每日服片劑9mg/kg。防止T細胞反應性也可以與第二水平信號例如白胞介素或細胞粘附因子的抑制劑共同使用，以增強T細胞消融。這一治療在性類固醇消融治療開始之前或同時使用。
重新激活的胸腺攝取純化的HSC，并將其轉化為新T細胞。在使用非配對供體HSC時，供體的樹突狀細胞將通過細胞死亡誘導缺失，或通過免疫調節細胞誘導耐受性，將對與患者有潛在反應性的任何T細胞產生耐受性。
由于新T細胞中已除去了可能自身反應和宿主反應性的細胞，其已被宿主胸腺上皮正面選擇過，它們能夠通過識別外周的宿主APC所呈遞的可識別肽來對正常感染作出應答。患者和供體的CD34+HSC都發育成樹突狀細胞，并進而進入患者的淋巴系統器官，建立與患者的免疫系統實質上相同的免疫系統，雖然其幼稚T細胞的量增加了。正常的免疫調節機制便會出現。
實施例4胸腺的再生重新激活的胸腺攝取HSC，將其轉化成新T細胞，后者遷移入血流，重建病人的最優外周T細胞庫。新生T細胞的水平和比例尤見顯著上升，大大提高了免疫計劃中應答細胞的數量。Th∶Tc和Th1∶Th2細胞的正確比值保證了應答的最優類型。
當新的一群成熟T細胞開始離開胸腺時，從患者取血，并且檢查T細胞(以及所有血細胞)的情況。尤其要檢查T細胞是Th1或Th2細胞，以及是幼稚細胞或記憶細胞。此外，它們所產生了細胞因子的類型(Th1或Th2)也要進行檢測。
如果由于施用錯配HSC以使免疫抑制治療逐漸減量，以對抗感染，并在沒有排斥反應跡象時完全停用，排斥反應的跡象部分在于在血中有激活的T細胞存在。由于HSC有強的自我更新能力，所形成的造血嵌合體將會很穩定，理論上可以維持患者的一生，就如同未使用錯配HSC時的情形一樣。
實施例5使用LHRH激活劑來重激活人類胸腺為了證明人類胸腺可以用本發明的方法加以重新激活，將這些方法用于因患前列腺癌而曾接受化療的患者。性類固醇消融治療開始前和4個月后對前列腺癌患者進行評估。結果見圖23-27。總的來說，這些數據顯示了T細胞在許多患者身上從定性上和定量上的改善，以及LHRH治療對總淋巴細胞數和T細胞亞群總數的影響。
對患者(全部超過60歲)的外周血淋巴細胞表型組成進行了分析，這些患者接受了前列腺癌的LHRH激動劑治療(圖23)。在LHRH激動劑治療前和開始后4個月對患者樣品進行分析。治療前，在所有患者中，每毫升血中總淋巴細胞數在對照值的低水平。治療后，6/9的患者總淋巴細胞計數顯著上升(有些病例的總淋巴細胞數翻番)。與此對應的是6/9的患者的總T細胞數量的上升。在CD4+亞群中，這一升高甚至更為顯著，8/9的患者表現出CD4+T細胞水平升高。另一不太明顯的趨勢是4/9患者的CD8+亞群水平有所升高，其程度一般小于CD4+T細胞。
LHRH治療對T細胞亞群比例的影響對患者血液在LHRH激動劑治療前和治療后進行分析顯示，在T細胞CD4+或CD8+細胞總體比例上并無顯著改變，在CD4+∶CD8+比例上也無明顯改變(圖24)。這顯示治療對T細胞亞群的內環境穩定的維持上并無影響，雖然治療使得總T細胞數目顯著上升。所有值均與對照值進行比較。
LHRH治療對B細胞和骨髓性細胞比例的影響對進行LHRH激動劑治療的患者外周血中B細胞和骨髓性細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例進行分析，顯示不同亞群內的變化程度有所差別(圖25)。雖然在治療后NK、NKT、和巨噬細胞的比例相對恒定，但B細胞的比例在4/9的患者中有所降低。
LHRH激動劑治療對B細胞和骨髓性細胞總數的影響對治療后外周血中B細胞和骨髓性細胞總數進行分析顯示，NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬細胞(3/9患者)的細胞數量在治療后明顯上升(圖26)。B細胞數目未見明顯變化趨勢2/9患者水平上升，4/9患者不變，3/9患者降低。
LHRH治療對相對于記憶細胞的幼稚細胞水平的影響LHRH激動劑治療后所見到的主要變化在于外周血的T細胞群體。幼稚(CD45RA+)CD4+細胞的比例尤見選擇性增高，同時CD4+T細胞亞群中幼稚細胞(CD45RA+)對記憶細胞(CD45RO+)的比例在6/9患者中有所上升(圖27)。
結論因此可以得出這樣的結論，用LHRH激動劑治療動物(如具有萎縮胸腺的人類)，可以誘導胸腺的重新激活。在接受性類固醇消融治療的前列腺癌患者中，已見到血液T淋巴細胞狀況的顯著改善。雖然很難確定這些細胞是否只來自胸腺，但這似乎是唯一合乎邏輯的結論，因為未見到其他來源的主流(CDαβ鏈)T細胞的描述。胃腸道T細胞主要是TCRγδ或CD8αα鏈。
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權利要求
1.改善免疫的方法，包括重新激活所述患者的胸腺。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述患者的胸腺已經至少部分失活。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述患者是青春期后的。
4.根據權利要求1所述的方法，進一步包括給予所述患者造血干細胞的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述造血干細胞為CD34+。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述造血干細胞是自體或同種同基因的。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述造血干細胞是同種異基因的、或異種異基因的。
8.根據權利要求4所述的方法，其中所述造血干細胞是大約在所述胸腺開始再生時或其后不久給予。
9.根據權利要求4所述的方法，其中所述造血干細胞是在傳向所述胸腺的性類固醇介導的信號開始被阻斷時提供。
10.根據權利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的性類固醇介導的信號的所述方法是通過外科閹割以切除所述患者的性腺。
11.根據權利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導的信號的所述方法是通過給予一種或多種藥物。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述藥物是選自由LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗、及其組合組成的組。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述LHRH激動劑是選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組胺瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林組成的組。
14.根據權利要求1所述的方法，導致所述患者免疫系統產生與青春期前患者的應答可比的疫苗應答。
全文摘要
本發明披露了一種增強患者免疫系統對免疫應答的方法。該方法是通過重新激活胸腺來完成的。可選擇地，輸入自體的、同種同基因的、同種異基因的、或異種異基因的造血干細胞，來增加患者免疫系統重建的速度。在優選的具體實施例中，造血干細胞是CD34+。通過阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號來重新激活患者的胸腺。在優選的具體實施例中，這種阻斷是通過給予LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH受體抗體、抗LHRH疫苗、或其組合來實現。
文檔編號A61K39/00GK1505522SQ01820291
公開日2004年6月16日 申請日期2001年10月12日 優先權日2000年10月13日
發明者理查德·博伊德, 理查德 博伊德 申請人:莫納什大學