黃病毒和瘟病毒衣殼蛋白的組成和使用方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：1162435閱讀：1801來(lái)源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：黃病毒和瘟病毒衣殼蛋白的組成和使用方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明涉及使用西尼羅病毒衣殼蛋白以及包括黃病毒和瘟病毒的其他病毒衣殼蛋白和其它蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，涉及西尼羅病毒及包括黃病毒和瘟病毒的其它病毒感染的疫苗和診斷方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)對(duì)能選擇性抑制病毒衣殼蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的物質(zhì)的鑒定來(lái)篩選抗病毒藥物成分的方法。
            
背景技術(shù)：
             最近，在歐洲和北美洲的溫帶地區(qū)出現(xiàn)西尼羅病毒(WNV)感染，威脅到人類、馬和鳥類的健康。WNV感染最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)為致命的腦炎。WNV是1937年在非洲的烏干達(dá)西尼羅河地區(qū)首次被分離出來(lái)的，它是一種黃病毒，屬于黃病毒族，其大小為40-60nm，有二十面核殼體包膜，含有一條10,000-11,000個(gè)堿基的正義單鏈RNA。有關(guān)WNV最近的綜述見(jiàn)Holloway，沒(méi)有被控制住的2000爆發(fā)。西尼羅病毒引發(fā)了對(duì)公共健康監(jiān)督的重新評(píng)估，科學(xué)美國(guó)，28220-22.(Holloway，2000，Outbreak not contained.West Nile virustriggers a reevaluation of public health surveillance，Sci Am.，28220-22)文獻(xiàn)在此處列出作為參考。對(duì)黃病毒族病毒的綜述可參考下列文獻(xiàn)Neyts等，1999，黃病毒族病毒感染，Verh.K.Acad.Geneeskd.Belg.，61661-697，討論697-699(Neyts et al.，1999，Infections withFlaviviridae，Verh.K.Acad.Geneeskd.Belg.，61661-697，discussion697-699)；Leyssen等，2000，黃病毒族病毒感染的治療觀察，臨床微生物研究，1367-82(Leyssen，et al.，2000，Perspectives for the treatmentof infections with Flaviviridae，Clin.Microbiol.Rev.，1367-82)；Sherlock，1999，肝黃病毒族病毒概要，肝炎病毒雜志，增刊6.11-5(Sherlock，1999，The hepatic Flaviviridaesummary，J.Viral.Hepat.，6 Suppl.11-5)以及Fields，Knipe和Howley編寫，病毒學(xué)領(lǐng)域(第三版)卷I和II，Lippincott Willliams & Wilkins出版社，(1996)(Fields，Knipe，& Howley，eds.，F(xiàn)ields Virology(3rded.)Vols.I & II，LippincottWilliams & Wilkins Pubs.(1996))，文獻(xiàn)在此處列出作為參考。
            
預(yù)防和治療黃病毒和瘟病毒感染的方法改進(jìn)是很需要的。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和治療高度增生細(xì)胞性疾病的方法也需要改進(jìn)。
            

            發(fā)明內(nèi)容
            
本發(fā)明提供誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。這些方法包括用能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的數(shù)量的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段接觸細(xì)胞的步驟。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，黃病毒衣殼蛋白或其功能性片段是西尼羅病毒(WNV)的衣殼蛋白或其功能性片段。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，細(xì)胞與黃病毒和瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段接觸，是為了誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，包含黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段編碼序列的核酸分子被導(dǎo)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)編碼黃病毒或腺病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸序列的表達(dá)，導(dǎo)致黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，編碼黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸序列，要與細(xì)胞內(nèi)序列表達(dá)所必須的調(diào)控元件可實(shí)施地連接起來(lái)。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，所指的核酸分子是DNA。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，所指的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
            
本發(fā)明提供鑒定能抑制黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的復(fù)合物的方法。此方法包括以下步驟a)在被測(cè)組分存在時(shí)，用一個(gè)足以誘導(dǎo)一可測(cè)量到的細(xì)胞凋亡數(shù)量的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段來(lái)接觸細(xì)胞，和b)比較在被測(cè)組分存在和不存在情況下細(xì)胞凋亡發(fā)生的數(shù)量。本發(fā)明涉及一個(gè)鑒定抑制WNV衣殼蛋白或其功能性片段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的物質(zhì)的方法。此方法包括以下步驟a)在被測(cè)組分存在時(shí)，用一個(gè)足以引發(fā)一可測(cè)量的細(xì)胞凋亡數(shù)量的WNV衣殼蛋白或其功能性片段來(lái)接觸細(xì)胞，和b)比較在被測(cè)組分存在和不存在情況下細(xì)胞凋亡發(fā)生的數(shù)量。依照一些具體實(shí)例，此方法的測(cè)定是通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)的指示物的存在量來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些指示物包括細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸鏈(PS)和DNA中的游離3′-羥基末端。
            
本發(fā)明涉及包含一個(gè)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段和一個(gè)可藥用的載體的藥物組合物。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，藥物組合物包含一個(gè)WNV衣殼蛋白或其功能性片段和一個(gè)可藥用的載體。
            
本發(fā)明涉及包括一個(gè)核酸分子和一個(gè)可藥用的載體的藥物組合物，此核酸分子包含一個(gè)編碼黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的序列。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，藥物組合物包括一個(gè)包含編碼黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的序列的核酸分子，并且，此序列要和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)序列所必須的調(diào)控元件可實(shí)施性的連接。本發(fā)明涉及包括一個(gè)核酸分子和一個(gè)可藥用的載體的藥物組合物，此核酸分子包括一個(gè)編碼WNV衣殼蛋白或其功能性片段的序列。依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，藥物組合物包括一個(gè)包含編碼WNV衣殼蛋白或其功能性片段序列的核酸分子，并且，此序列要和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)序列所必須的調(diào)控元件可實(shí)施性的連接。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，藥物組合物中包含的核酸分子是DNA。
            
本發(fā)明涉及對(duì)診斷為或懷疑為患有高度增生細(xì)胞性疾病的個(gè)體使用足以殺死高度增生細(xì)胞的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的給藥步驟和治療方法。本發(fā)明還涉及對(duì)診斷為或懷疑為患有高度增生細(xì)胞性疾病的個(gè)體使用足以殺死高度增生細(xì)胞的WNV衣殼蛋白或其功能性片段的給藥步驟和治療方法。依照一些具體實(shí)例，這些方法包括一個(gè)對(duì)個(gè)體使用有效量的WNV衣殼蛋白或其功能性片段的給藥步驟。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，編碼黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的序列，要與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)序列所必須的調(diào)控元件可實(shí)施性的連接。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，這些方法包括使用有效劑量的核酸分子來(lái)對(duì)這些個(gè)體給藥的步驟，此核酸分子包含一個(gè)能編碼WNV衣殼蛋白或其功能性片段的序列。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，編碼WNV衣殼蛋白或其功能性片段的序列要與細(xì)胞中表達(dá)這些序列所必需的調(diào)控元件可操作性的連接起來(lái)。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，這個(gè)核酸分子是DNA。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，高度增生細(xì)胞性疾病是指癌癥或牛皮癬。
            
本發(fā)明涉及包含一個(gè)免疫有效數(shù)量的WNV或黃病毒或瘟病毒的相關(guān)成員的衣殼蛋白和一個(gè)藥用載體的疫苗組合物。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，疫苗組合物包括一個(gè)可藥用的載體和有效劑量的具有免疫原性的衣殼蛋白片段，此片段來(lái)自于WNV或黃病毒或瘟病毒相關(guān)成員的衣殼蛋白。
            
本發(fā)明涉及包括一個(gè)可藥用載體的疫苗組合物和一個(gè)核酸分子，此核酸分子包含一個(gè)WNV或黃病毒或瘟病毒的相關(guān)成員衣殼蛋白的編碼核酸序列。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，疫苗組合物包括一個(gè)可藥用的載體和一個(gè)核酸分子，此核酸分子包含一個(gè)編碼WNV或黃病毒或瘟病毒相關(guān)成員衣殼蛋白免疫原片段的核酸序列。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，此核酸分子包含一個(gè)編碼來(lái)自于WNV或黃病毒或瘟病毒相關(guān)成員衣殼蛋白免疫原片段的序列，此序列要與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該序列所必須的調(diào)控元件可實(shí)施性的連接。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，疫苗的組合物包含的核酸分子是DNA。按照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，疫苗的組合物包含質(zhì)粒。
            
本發(fā)明涉及使個(gè)體對(duì)WNV或黃病毒或瘟病毒的相關(guān)成員產(chǎn)生免疫的方法。產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可以是預(yù)防性的或者是治療性的。這些方法包括用一些免疫有效劑量的物質(zhì)來(lái)對(duì)個(gè)體給藥，這些物質(zhì)包括WNV，或黃病毒或瘟病毒相關(guān)成員衣殼蛋白，或其具有免疫原性的片段，或能編碼這些衣殼蛋白或免疫原片段的核酸分子。
            
本發(fā)明涉及對(duì)接觸過(guò)WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的個(gè)體的鑒定，通過(guò)用一個(gè)能與WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白特異性結(jié)合的抗體來(lái)檢測(cè)樣品中衣殼蛋白存在的方法，所用抗體最好是單克隆抗體。對(duì)個(gè)體樣本中WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的定量測(cè)定可用作被感染個(gè)體的病征指示。
            
本發(fā)明涉及鑒定接觸過(guò)WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的個(gè)體的試劑盒以及這些試劑盒中所用的試劑。此試劑盒包含兩個(gè)容器，第一個(gè)容器中含有能與WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白特異性結(jié)合的抗體；第二個(gè)容器中含有WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白，所用抗體最好是單克隆抗體。試劑盒可以定量測(cè)定個(gè)體樣品中的WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，這個(gè)數(shù)據(jù)可以用作被感染個(gè)體的病征指示。
            
本發(fā)明涉及對(duì)接觸過(guò)WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒的個(gè)體的鑒定方法，它是通過(guò)使用WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白來(lái)檢測(cè)樣品中抗WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白抗體的存在量的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。樣品中抗WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的抗體量可以用來(lái)診斷被感染的個(gè)體。
            
本發(fā)明涉及檢測(cè)接觸過(guò)WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒的個(gè)體的試劑盒及所用試劑。試劑盒包括兩個(gè)容器，第一個(gè)容器中含有在感染W(wǎng)NV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白時(shí)產(chǎn)生的抗體，第二個(gè)容器含有WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白。試劑盒可以用來(lái)定量測(cè)定個(gè)體樣品中抗WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的抗病毒衣殼蛋白的抗體，這個(gè)數(shù)據(jù)可以用來(lái)診斷被感染的個(gè)體。
            
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
            

            
圖1.圖的上部分為1999年在紐約從人體中分離出的WNV(WNV-HNY1999)病毒的基因結(jié)構(gòu)圖示(GenBank序列號(hào)AF202541，Jia等，1999，Lancet，3541971-1972，文獻(xiàn)在此處列出作為參考)，衣殼蛋白用“Cp.”表示，圖的下部分為所構(gòu)建的WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY和pWNVy-DJY，本文中，這些載體也可能用其它名詞表示，此處的pWNVC-DJY也可能用pWNVCh-DJY或者pWNVCh表示，pWNVy-DJY在此也可以用pWNVCy-DJY或pWNVCy表示。
            
圖2為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY的限制性核酸內(nèi)切酶圖譜。
            
圖3為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY的特征圖譜。
            
圖4為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY的完整的有注釋的雙鏈核苷酸序列，它是5864個(gè)核酸堿基對(duì)的組合物。限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)、特征和部分的構(gòu)建載體表達(dá)蛋白翻譯信息已在注釋中指出。上面的核苷酸鏈?zhǔn)荢EQ IDNO1，N-末端sIgE前導(dǎo)肽的蛋白序列(SEQ ID NO2)出現(xiàn)在其編碼區(qū)917-970位核苷酸下面。表達(dá)蛋白的WNV Cp蛋白部分的序列(SEQ ID NO3)出現(xiàn)在其編碼區(qū)971-1336位核苷酸下面。
            
圖5為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVy-DJY的限制性核酸內(nèi)切酶圖譜。
            
圖6為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVy-DJY的特征圖譜。
            
圖7為WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVy-DJY的完整的有注釋的雙鏈核苷酸系列，它是5864個(gè)核苷酸堿基對(duì)的組合物。限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)、特征和部分的構(gòu)建載體表達(dá)蛋白的翻譯信息已在注釋中指出。上面的核苷酸鏈?zhǔn)荢EQID NO4。N-末端sIgE前導(dǎo)肽的蛋白序列出現(xiàn)在其編碼區(qū)917-970位核苷酸下面。表達(dá)蛋白的WNV Cp蛋白部分的序列出現(xiàn)在其編碼區(qū)971-1336位核苷酸下面。
            
圖8為兩個(gè)不同的WNV衣殼蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY和pWNVy-DJY體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的35S標(biāo)記的表達(dá)物的電泳分離的放射性自顯影免疫沉淀圖象。左邊第一泳道為分子量標(biāo)記物。箭頭指示的是主要的體外翻譯蛋白。該蛋白融合于多組氨酸C末端標(biāo)簽子并用抗組氨酸抗體進(jìn)行免疫沉淀。
            
圖9為WNV Cp蛋白(SEQ ID NO5)的完整的氨基酸序列。本發(fā)明實(shí)施例3中用到的三個(gè)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類限制性抗原決定表位肽WNVC-P1(SEQ ID NO6)、WNVC-P2(SEQ ID NO7)和WNVC-P3(SEQ ID NO8)列在Cp氨基酸序列下面。
            
圖10為采用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA免疫小鼠脾細(xì)胞在體外刺激后細(xì)胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)的結(jié)果。給出的數(shù)值是雙陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比。上面的平板指染色的細(xì)胞是INF-γ和CD44；下面的平板指染色的細(xì)胞是CD4和IFN-γ，上面一行的標(biāo)記指的是用于免疫小鼠的載體加上用于體外重復(fù)刺激脾細(xì)胞的刺激物。能引起免疫的載體是pcDNA3(pcDNA3.1)、pWNVh-DJY(pWNVCh)和pWNVy-DJY(pWNVCy)。“無(wú)Ag”指的是作為體外翻譯的對(duì)照組的溫育的脾細(xì)胞(例3中有描述)，“蛋白”指的是用pWNVy-DJY體外翻譯產(chǎn)生的Cp蛋白來(lái)溫育的脾細(xì)胞。
            
圖11為HeLa細(xì)胞在用增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)載體pEGFP2-N1單獨(dú)轉(zhuǎn)染，或者和pWNVh-DJY或pWNVy-DJY雙重轉(zhuǎn)染后，用膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞分析的結(jié)果。給出的數(shù)值是膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞在EGFP陽(yáng)性細(xì)胞中所占的百分?jǐn)?shù)。
            
圖12A，12B，和12C為免疫后小鼠產(chǎn)生的WNV衣殼蛋白(Cp)特異性抗體反應(yīng)。圖12A在第零周、第四周和第八周用100μg的pCWNVCp表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體進(jìn)行肌肉內(nèi)注射。免疫后的不同時(shí)間收集血清樣品并分別按為150，1 100，1 200和1 400的稀釋度來(lái)檢測(cè)WNV Cp特異性抗體。免疫后五個(gè)月時(shí)檢測(cè)到WNV Cp特異性抗體反應(yīng)，誤差條狀圖代表免疫動(dòng)物結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。圖12BWNV Cp特異性IgG抗體反應(yīng)傳導(dǎo)的IgG亞類分析。圖中給出了免疫五個(gè)月后檢測(cè)的WNV Cp特異性IgG1和IgG2a反應(yīng)以及IgG2a/IgG1的比例。圖12CWNV Cp特異性血清抗體用免疫沉淀印跡/免疫印跡法分析。每一個(gè)固定的膜條用來(lái)自于pCWNVCp(W)或pCDNA3(P)的免疫血清溫育。用抗-6X組氨酸單克隆抗體(+)溫育的膜條作為陽(yáng)性抗體對(duì)照物。
            
圖13為通過(guò)刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ(Th1)，IL-2(Th1)和IL-4(Th2)。如實(shí)施例8中描述的方法免疫小鼠和制備其脾細(xì)胞。分離的淋巴細(xì)胞用WNV Cp多肽庫(kù)刺激三天。收集上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ，IL-2和IL-4情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的條狀圖的誤差代表了標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)值。
            
圖14為通過(guò)刺激T細(xì)胞生產(chǎn)的趨化因子。如實(shí)施例8中描述的方法免疫小鼠和制備其脾細(xì)胞。分離的淋巴細(xì)胞用WNV Cp特異肽庫(kù)刺激三天。收集上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)RANTES和MIP-1β趨化因子情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的條狀圖的誤差代表了標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)值。
            
圖15A和圖15B為陽(yáng)性抗原特異性CTL反應(yīng)的誘導(dǎo)。圖15A用WNV衣殼多肽庫(kù)處理靶細(xì)胞的方法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞的CTL反應(yīng)。圖15B收集用于CTL檢測(cè)的第五天的刺激效應(yīng)細(xì)胞的上清液，并檢測(cè)IFN-γ的產(chǎn)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的條狀圖的誤差代表了標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)值。
            
圖16A，16B和16C為肌肉組織分析。從DNA注射動(dòng)物體制備冷凍肌肉切片，并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。顯示了pCDNA3(對(duì)照)載體免疫的小鼠(圖16A)和pCWNVCp免疫小鼠的肌肉切片(圖16B)的染色圖。圖放大倍率為40X。圖16CpCWNVCp免疫小鼠肌肉滲入細(xì)胞的相同性。按照實(shí)施例11中描述的方法收集細(xì)胞，并用CD4，CD8，Mac3，CD11c，CD86和B220抗體通過(guò)FACS進(jìn)行鑒定。
            
圖17為WNV Cp蛋白序列和其它的黃病毒衣殼蛋白序列部分的序列比對(duì)。上面為Kunjin病毒衣殼蛋白的前123個(gè)氨基酸序列KJV；GenBank系列號(hào)為BAA00176(gi221967)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO9)和WNV Cp蛋白的全部123個(gè)氨基酸序列的比較。中間為日本腦炎病毒衣殼蛋白的前113個(gè)氨基酸序列JEV；GenBank序列號(hào)為NP_059434(gi9626461)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO10)和WNV Cp蛋白的前114個(gè)氨基酸(SEQ ID NO11)序列的比較。下面為登革熱病毒衣殼蛋白內(nèi)部氨基酸序列片段DEN2；GenBank序列號(hào)為AAG30730(gi11119732)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO12)和WNV Cp蛋白的第10到98位氨基酸序列(SEQ ID NO13)的比較。這個(gè)排列需要在DEN2序列LTKR氨基酸延伸中圈出一個(gè)賴氨酸(在排列的上方出現(xiàn)的K)。括號(hào)中的數(shù)字表示相同/同源評(píng)分。序列比較和對(duì)照是用Mac載體進(jìn)行的。
            
圖18為WNV Cp蛋白序列和其它病毒衣殼蛋白序列片段以及和原調(diào)亡蛋白序列片段的比對(duì)。WNV Cp蛋白的全部序列(氨基酸1-123)出現(xiàn)在圖的上面。圖中給出了WNV Cp蛋白和其它6個(gè)病毒蛋白以及其它5個(gè)原調(diào)亡蛋白的比較結(jié)果。用于比較的病毒蛋白序列是1)人體免疫缺乏病毒-1(HIV-1)89.6Vpr蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAA81039(gi1055033)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO27)和WNV Cp蛋白的第68位到第110位氨基酸序列(SEQ ID NO28)；2)單純皰疹病毒主要的衣殼蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAC57106(gi1718277)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO29)和WNVCp蛋白的第8位到第117位氨基酸序列(SEQ ID NO30)；3)埃波拉病毒核酸蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAG40164(gi11761746)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO31)和WNV Cp蛋白的第10位到第117位氨基酸序列(SEQ ID NO32)；4)埃博拉病毒糖蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAA96744(gi1141779)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO33)和WNV Cp蛋白的第4位到第23位氨基酸序列(SEQ ID NO34)；5)埃博拉病毒糖蛋白內(nèi)部的另一個(gè)蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO35)和WNV Cp蛋白的第50位到第73位氨基酸序列(SEQ ID NO36)；和6)風(fēng)疹病毒衣殼蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為GNWVR4(gi74519)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQID NO37)和WNV Cp蛋白的第64位到第114位氨基酸序列(SEQ ID NO38)。用于比較的調(diào)亡蛋白原蛋白序列是1)人BAK蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為Q16611(gi2493274)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO39)和WNV Cp蛋白的第17位到第63位氨基酸序列(SEQ IDNO40)；2)人Bcl-2相關(guān)X蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為XP_009093(gi15304386)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO41)和WNV Cp蛋白的第109位到第123位氨基酸序列(SEQ ID NO42)；3)人BIK蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為XP_015353(gi13655199)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO43)和WNV Cp蛋白的第75位到第118位氨基酸序列(SEQ ID NO44)；4)人BID蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為XP_009825(gi13647251)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO45)和WNV Cp蛋白的第84位到第95位氨基酸序列(SEQ ID NO46)；和5)人Bad蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為CAC22429(gi12309966)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO47)和WNV Cp蛋白的第15位到第23位氨基酸序列(SEQ IDNO48)。括號(hào)中的數(shù)值是相同/同源評(píng)分，最高可能的評(píng)分是590。序列比較和對(duì)照是用Mac載體進(jìn)行的。
            
圖19為HIV-1 89.6Vpr蛋白序列和其它病毒蛋白的蛋白片段序列以及原調(diào)亡蛋白片段序列的序列對(duì)照?qǐng)D。圖的上部分為HIV-1 89.6Vpr蛋白的完整序列(氨基酸1-96)。圖中給出了HIV-1 89.6Vpr蛋白和其它6個(gè)病毒蛋白以及和其它6個(gè)原調(diào)亡蛋白的比較結(jié)果。用于比較的蛋白序列是1)新德畢斯病毒p230非結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為NP_062889(gi9790318)(SEQ ID NO49)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第22位到第59位氨基酸序列(SEQ ID NO50)；2)WNV Cp蛋白的第68位到第110位氨基酸序列(參考上圖18中的描述)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第54位到第95位氨基酸序列(SEQ ID NO51)；3)黃瓜花葉病毒2A蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為CAB75953(gi7105855)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO52)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第77位到第89位氨基酸序列(SEQ ID NO53)；4黃瓜花葉病毒2A蛋白內(nèi)部的另一個(gè)蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO54)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第49位到第67位氨基酸序列(SEQ ID NO55)；5風(fēng)疹病毒衣殼蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO56)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第38位到第47位氨基酸序列(SEQ ID NO57)；6Nipah病毒融合蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為NP_112026(gi13559813)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO58)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第60位到第72位氨基酸序列(SEQ ID NO59)；和7呼腸病毒次核形式Mu2蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAK54467(gi14149150)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO60)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第60位到第72位氨基酸序列(SEQ ID NO61)。用于比較的調(diào)亡蛋白原序列有1)小鼠BIM蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為NP_033884(gi6753192)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO62)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第7位到第74位氨基酸序列(SEQ ID NO63)；2)大鼠BOD蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAC23593(gi3228566)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO64)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第23位到第74位氨基酸序列(SEQ ID NO65)；3)小鼠Mtd蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列GenBank序列號(hào)為AAC53582(gi2689660)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考(SEQ ID NO66)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第16位到第67位氨基酸序列(SEQ ID NO67)；4)人Bcl-2相關(guān)X蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO68)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第18位到第75位氨基酸序列(SEQ ID NO69)；5)人Bcl-2相關(guān)X蛋白內(nèi)部的另一個(gè)蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO70)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第18位到第42位氨基酸序列(SEQ ID NO71)；和6)人Bad蛋白內(nèi)部的蛋白片段氨基酸序列(SEQ IDNO72)和HIV-1 89.6Vpr蛋白的第33位到第44位氨基酸序列(SEQ ID NO73)。括號(hào)中的數(shù)值是同樣/同源性評(píng)分，最高可能的評(píng)分是590。序列比較和對(duì)照是用Mac載體進(jìn)行的。
            
具體實(shí)施例方式
            
首選具體實(shí)例的詳細(xì)描述本發(fā)明起于WNV衣殼蛋白(Cp)具有誘導(dǎo)腫瘤來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的活性的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞中WNV衣殼蛋白的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的誘導(dǎo)，并且最終導(dǎo)致高度增生細(xì)胞的死亡。研究還觀察到WNV Cp蛋白C-末端的22個(gè)氨基酸殘基肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。WNV衣殼蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性使得Cp蛋白和其功能性片段被用于殺死包括癌癥細(xì)胞在內(nèi)的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞以及檢測(cè)抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性組分的篩選系統(tǒng)，這些組分可用來(lái)治療WNV感染。
            
黃病毒族病毒是正義單鏈RNA病毒，分為三個(gè)屬1)瘟病毒，包括牛腹瀉病毒(BVDV)；2)丙型肝炎類似病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)；3)黃病毒。除了未分類的病毒，黃病毒屬還包括至少10個(gè)血清學(xué)決定性亞屬。WNV是蚊生日本腦炎病毒族中的成員，此病毒族也包括與WNV高度相關(guān)的日本腦炎病毒(JEV)和St.Louis腦炎病毒(SLEV)。其它的屬于不同的亞屬族的黃病毒包括黃熱病病毒(YFV)和登革熱病病毒(DENV)。核苷酸和氨基酸序列分析揭示了血清群內(nèi)部和血清群之間的序列的保持性。WNV Cp蛋白也和其它包括哺乳動(dòng)物調(diào)亡蛋白原的非病毒蛋白同源。
            
在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，衣殼蛋白源自于瘟病毒。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的瘟病毒是牛腹瀉病毒(BVDV)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，衣殼蛋白源自于黃病毒。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的黃病毒是日本腦炎病毒(JEV)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的黃病毒是St.Louis腦炎病毒(SLEV)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的黃病毒是黃熱病病毒(YFV)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的黃病毒是登革熱病病毒(DENV)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，獲得衣殼蛋白的黃病毒是西尼羅病毒(WNV)。
            
本發(fā)明提供使用包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白和其它蛋白或其功能性片段誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，在一些具體實(shí)例中，衣殼蛋白或其功能性片段來(lái)源于WNV。本發(fā)明也提供篩選抑制包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的病毒的衣殼蛋白和其它蛋白或其功能性片段的殺死細(xì)胞活性的物質(zhì)組分的方法。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，提供了篩選抑制WNV衣殼蛋白或其功能性片段的殺死細(xì)胞活性的物質(zhì)組分的方法。此外，本發(fā)明還提供了藥物組成，其中包含WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的衣殼蛋白或其它蛋白，或其功能性片段，或編碼這些衣殼蛋白或其它蛋白或功能性片段的核酸；給出了用這些藥物組合物治療已經(jīng)患有細(xì)胞高度增生性疾病的方法。本發(fā)明還提供了疫苗組成，其中包含一個(gè)可藥用載體以及衣殼蛋白或其它蛋白，或其片段，或編碼衣殼蛋白或其它蛋白或其功能性片段的核酸，這些蛋白或其功能性片段來(lái)自于WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒。本發(fā)明還提供了鑒定接觸過(guò)WNV和包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的診斷方法和試劑盒。
            
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明在實(shí)際實(shí)施中，運(yùn)用了傳統(tǒng)的病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)等學(xué)科中的方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的說(shuō)明，例如Sambrook等編輯，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第二版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約州(1989)Sambrook et al.，eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Ausubel等編輯，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley&Sons，紐約市，紐約州(2000)Ausubel etal.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)；Glover編輯，DNA克隆實(shí)用手冊(cè)，卷I和II(Glover，eds.，DNA CloningA Practical Approach，Vol s.I & II)；Colowick和Kaplan編輯，酶學(xué)方法，學(xué)術(shù)出版社(Colowick & Kaplan，eds.，Methodsin Enzymology，Academic Press)；Weir和Blackwell編輯，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，卷I-IV，Blackwell科學(xué)出版社.(1986)Weir & Blackwell，eds.，Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV，Blackwell ScientificPubs.(1986)；Fields，Knipe，Howley編輯，病毒學(xué)領(lǐng)域(第三版)，卷I和II，Lippincott Williams和Wilkins出版社.(1996)Fields，Knipe，& Howley，eds.，F(xiàn)ields Virology(3rded.)Vols.I & II，LippincottWilliams & Wilkins Pubs.(1996)；Coligan等編輯，現(xiàn)代免疫學(xué)方法，JohnWiley & Sons出版社，紐約市，紐約州(2000)Coligan et al.，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)，在此列出的文獻(xiàn)均作為參考。
            
本文中貫穿著各種定義。多數(shù)單詞的意思是由技術(shù)熟悉人員對(duì)這些單詞所賦予的意思。在下面或本文其它地方特別為本發(fā)明定義的單詞，能夠?yàn)槭煜ぴ摷夹g(shù)的人員提供一個(gè)完整的特定的理解。
            
本文中用到的關(guān)于細(xì)胞死亡或凋亡的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”和“產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的”是指導(dǎo)致細(xì)胞死亡事件開(kāi)始的行為，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中的部分步驟并導(dǎo)致細(xì)胞死亡的細(xì)胞活動(dòng)。
            
本文中用到的“凋亡”指的是真核細(xì)胞死亡的一種形式，它與細(xì)胞壞死相區(qū)別，包括細(xì)胞骨架的破裂、細(xì)胞質(zhì)的皺縮和凝聚、細(xì)胞膜外表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)和膜外突出，導(dǎo)致細(xì)胞膜中小囊泡或調(diào)亡小體的形成。關(guān)于細(xì)胞調(diào)亡的綜述可以參考文獻(xiàn)，例如Utz和Anderson，2000，生死抉擇信號(hào)分子蛋白酶解對(duì)調(diào)亡的調(diào)節(jié)，細(xì)胞死亡分化，7589-602(Utz & Anderson，2000，Life and death decisionsregulation of apoptosis by proteolysisof signaling molecules，Cell Death Differ.，7589-602)，此處列出作為參考。
            
本說(shuō)明書和附加的權(quán)利要求書中的單數(shù)詞“一個(gè)”、“這個(gè)”除非有明確的規(guī)定，否則均包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如“一個(gè)細(xì)胞”也包括兩個(gè)或更多的細(xì)胞的混合物。
            
本文中用到的關(guān)于衣殼蛋白或其功能性片段的短語(yǔ)“有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的數(shù)量”和“有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的水平”意思是接觸細(xì)胞的病毒衣殼蛋白或其功能性片段的數(shù)量或細(xì)胞中表達(dá)病毒蛋白或其功能性片段的水平，這個(gè)數(shù)量和水平能有效的觸發(fā)能殺死細(xì)胞的事件的產(chǎn)生。
            
本文中用到的名詞“蛋白”指的是一個(gè)氨基酸殘基的聚合物，并且不限定最短的長(zhǎng)度。這個(gè)定義包括多肽、肽、寡肽、二聚體、多聚體等等。也包括完整長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)和它的片段，以及蛋白質(zhì)表達(dá)后的修飾蛋白，包括(不限于)糖基化、乙酰化和磷酸化作用。
            
本文中用到的關(guān)于病毒衣殼蛋白的短語(yǔ)“其功能性片段”指的是小于完整長(zhǎng)度蛋白的保持病毒衣殼蛋白的功能并能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡的蛋白片段。
            
本文中用到的關(guān)于病毒衣殼蛋白的短語(yǔ)“其免疫原片段”指的是小于完整長(zhǎng)度蛋白的能引起免疫反應(yīng)的蛋白片段。
            
本文中用到的名詞“核酸”包括DNA和RNA，及其修飾形式，包括糖基修飾、殘基修飾或骨架修飾。
            
本文中用到的關(guān)于編碼病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸的短語(yǔ)“完整黃病毒或瘟病毒基因組分離形式”指的是以重組體形式、構(gòu)建載體形式或以其它形式從它在黃病毒或瘟病毒基因組中的自然狀態(tài)下分離出來(lái)的核酸。
            
本文中用到的關(guān)于編碼病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸的短語(yǔ)“完整WNV基因組分離形式”指的是以重組體形式、構(gòu)建載體形式或以其它形式從它在WNV基因組中的自然狀態(tài)下分離出來(lái)的核酸。
            
本文中用到的關(guān)于細(xì)胞凋亡的術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)水平”意思是可以被技術(shù)人員用其技術(shù)檢測(cè)和測(cè)量的能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的臨界的數(shù)量或水平。檢測(cè)技術(shù)依靠測(cè)定細(xì)胞“凋亡指示物”的存在度或增加度來(lái)進(jìn)行。
            
本文中用到的細(xì)胞“凋亡指示物”指的是可以用于指示細(xì)胞凋亡的觸發(fā)和進(jìn)程的細(xì)胞因子或形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞“凋亡指示物”包括(不限于)暴露的細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)、游離的DNA 3’-羥基末端和細(xì)胞質(zhì)核小體。
            
本文中用到的關(guān)于WNA或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的衣殼蛋白或其它蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的抑制劑的“復(fù)合物”指的是包括(不限于)任何可以識(shí)別的化學(xué)試劑或分子，包括小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸或核酸。這些物質(zhì)可以是自然狀態(tài)的也可以是合成的。
            
本文用到的關(guān)于WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性中用到的“抑制”指的是任何干擾此活性的事件。例如“抑制”包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的消除和減弱。對(duì)病毒衣殼蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的抑制可以通過(guò)多種方式檢測(cè)，包括(不限于)用TUNEL(末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-X平端標(biāo)記)測(cè)定和用膜聯(lián)蛋白V檢測(cè)PS。
            
本文中用到的“可注射的藥物組合物”指的是適合病人使用的藥物組分，它無(wú)菌、無(wú)熱源，也沒(méi)有任何微粒子，參考Remington藥物科學(xué)，第18版，Gennaro等，Mack出版公司，Easton，PA，1990(Remington’s PharmaceuticalSciences，18th Ed.，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990)和美國(guó)專利美國(guó).藥典標(biāo)準(zhǔn)，在此處列出作為參考。
            
本文中用到的“可藥用載體”包括任何不給接受組合物的個(gè)體造成有害影響的載體。例如，“可藥用載體”不應(yīng)引起接受者產(chǎn)生有害抗體。專業(yè)的技術(shù)人員都很熟悉適當(dāng)?shù)摹翱伤幱幂d體”，并且在Remington藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)一書(出處見(jiàn)前)中也有描述。
            
本文中用到的“高度增生細(xì)胞”指的是那些在不適當(dāng)?shù)幕虿徽５臅r(shí)間或地點(diǎn)生長(zhǎng)、分化或增生的細(xì)胞，它包括已經(jīng)結(jié)束細(xì)胞周期的應(yīng)該處于G0期或靜止期的細(xì)胞。例如，腫瘤細(xì)胞就包括在“高度增生細(xì)胞”里。以“高度增生細(xì)胞”為特征或與之相關(guān)的疾病包括癌癥、自身免疫疾病、非惡性生長(zhǎng)以及牛皮癬。
            
本文針對(duì)患有以“高度增生細(xì)胞”為特征或與之相關(guān)的疾病或癥狀的以及暴露于和/或感染W(wǎng)NV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的個(gè)體中用到的名詞“治療”指的是對(duì)疾病或癥狀的改良和/或消除。
            
本文在治療患疾病或癥狀的個(gè)體中用到的短語(yǔ)“有效的數(shù)量”或“有效量”指的是足夠完成治療和改善和/或消除這種疾病或癥狀的數(shù)量。
            
本文在疫苗組合物中用到的短語(yǔ)“免疫有效量”指的是足夠誘導(dǎo)一個(gè)治療的或預(yù)防性的免疫反應(yīng)的數(shù)量。
            
本文在治療個(gè)體防止病毒感染時(shí)用到的短語(yǔ)“預(yù)防性免疫反應(yīng)”指的是個(gè)體的免疫反應(yīng)是預(yù)防性的，保護(hù)個(gè)體免受病毒感染。
            
本文在治療感染病毒的個(gè)體時(shí)中到的短語(yǔ)“治療性免疫反應(yīng)”指的是改善和/或消除病毒感染的免疫反應(yīng)。
            
本文在給個(gè)體用疫苗藥物的數(shù)量時(shí)用到的短語(yǔ)“治療有效劑量”指的是足夠引起個(gè)體治療性免疫反應(yīng)的量。
            
本文在給個(gè)體用疫苗藥物的數(shù)量時(shí)用到的短語(yǔ)“預(yù)防有效劑量”指的是足夠引起個(gè)體預(yù)防性免疫反應(yīng)的量。
            
本文用到的“個(gè)體”指的是能用本發(fā)明中的藥物組合物和疫苗組合物來(lái)治療的人和非人類的動(dòng)物。
            
本文中用到的“給藥”包括(不限于)腫瘤內(nèi)部注射、皮膚接種、腸胃外給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、口服和局部傳送。
            
本文在給藥時(shí)用到的“腫瘤內(nèi)部注射”指的是藥物成分直接注射入腫瘤部位。
            
本發(fā)明的多個(gè)方面涉及WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的衣殼蛋白或其功能性片段所具有的抑制細(xì)胞增殖的能力。本發(fā)明的多個(gè)方面也涉及包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒的其它蛋白或其功能性片段所具有的抑制細(xì)胞增殖的能力。這些病毒衣殼蛋白或其它蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些具體實(shí)例中，WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白，或其功能性片段，和/或編碼這些衣殼蛋白或片段的核酸分子被用于藥物組合物來(lái)治療患以不良細(xì)胞、尤其是高度增生細(xì)胞性如癌癥或與之相關(guān)的疾病的個(gè)體。WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白提供一個(gè)靶標(biāo)能阻斷活病毒的功能。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面就是可以通過(guò)鑒定抑制WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白，或其功能性片段的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性的鑒別復(fù)合物來(lái)鑒定抗-WNV和/或抗-黃病毒或抗-瘟病毒的組分。
            
本發(fā)明也涉及WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白的功能性片段，和/或編碼這些片段或蛋白的核酸來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性的使用，以及組成包括WNV和包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的病毒衣殼蛋白或其它蛋白功能性片段，和/或編碼這些片段或蛋白的核酸的藥物。在這里用到的“WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白”的“功能性片段”指的是WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的保持了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的蛋白片段。在這里用到的“WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白”的“功能性片段”指的是WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白的保持了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的蛋白片段。WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白的功能性片段至少含有10個(gè)來(lái)自于WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白的氨基酸，它也可以包含不來(lái)自于WNV或包括黃病毒或瘟病毒在內(nèi)的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白的氨基酸序列。
            
本發(fā)明的特定具體實(shí)例中，我們也可以觀察到一個(gè)來(lái)自于WNV Cp蛋白的C-末端的22個(gè)氨基酸殘基的肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。如圖10所示，此肽(“WNVC-P3”，本文也稱“肽3”)出現(xiàn)在WNV Cp蛋白的90-110位氨基酸殘基中。特別要提出的是，依照本發(fā)明的一些具體實(shí)例，WNV Cp蛋白的功能性片段包括WNVC-P3肽或其片段。WNVC-P3肽的片段包含至少3個(gè)氨基酸，這個(gè)片段可以有3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或21個(gè)氨基酸殘基。WNV Cp蛋白的WNVC-P3肽、其片段、包含WNVC-P3肽或其片段的Cp蛋白片段、Cp蛋白或包含Cp蛋白序列和非Cp蛋白序列的融合蛋白都可以被檢測(cè)，以決定它們是否持有野生Cp蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功  
            
WNV Cp衣殼蛋白與其它病毒，包括但不限于黃病毒家族的病毒和許多其它家族的病毒的衣殼蛋白和其它蛋白也享有同源性。WNV Cp蛋白也與非病毒蛋白，包括哺乳動(dòng)物來(lái)源的原調(diào)亡蛋白享有同源性。WNV Cp和HIV-1 Vpr蛋白(具調(diào)亡活性)、Kunjin病毒Cp蛋白、日本腦炎病毒Cp蛋白、登革熱病毒Cp蛋白、單純皰疹病毒主要衣殼蛋白、埃博拉病毒核蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、風(fēng)疹病毒衣殼蛋白和下列非病毒原調(diào)亡蛋白人BAK蛋白、人Bcl-2相關(guān)X蛋白、人BIK蛋白、人BID蛋白和人Bad蛋白之間已鑒定了同源/相同的區(qū)域。此外同源/相同區(qū)域在HIV-1 Vpr蛋白和新德畢斯病毒p230非結(jié)構(gòu)蛋白、黃瓜花葉病毒2A蛋白、風(fēng)疹病毒衣殼蛋白、Nipah病毒融合蛋白、呼腸病毒次核形式Mu2蛋白，和下列原調(diào)亡蛋白鼠BIM蛋白、大鼠BOD蛋白、鼠Mtd蛋白、人Bcl-2相關(guān)X蛋白和人Bad蛋白之間被鑒定到。
            
通過(guò)檢測(cè)一個(gè)蛋白和肽的序列和測(cè)試其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員不需要過(guò)多實(shí)驗(yàn)就可以很容易的測(cè)定一個(gè)WNV的或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白片段是否具有活性功能?？s短了的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白可以用常規(guī)方法和很容易得到的實(shí)驗(yàn)材料制備和檢測(cè)。此處使用的術(shù)語(yǔ)“功能性片段”指的是肽、多肽和以非肽鍵連接的氨基酸序列、或者包含與至少部分的WNV衣殼病毒或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白氨基酸序列完全相同或本質(zhì)同源的氨基酸序列的蛋白，而且它有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。此處的“本質(zhì)同源”指的是一個(gè)保守替代的氨基酸序列。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員用本發(fā)明中提供的公開(kāi)說(shuō)明和已有的公開(kāi)技術(shù)，就可以制造WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的功能性片段。因此，不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)我們就可以用已鑒定的功能性片段取代完整長(zhǎng)度的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的使用和配制。
            
本發(fā)明也涉及了疫苗組合物，這種疫苗包含了WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的免疫原片段，和/或編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的免疫原片段的核酸，以誘導(dǎo)個(gè)體中預(yù)防性或治療性免疫反應(yīng)。此處使用的“WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白”的“免疫原片段”指的是具有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)能力的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的片段。WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的免疫原片段至少含有10個(gè)來(lái)自于WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的氨基酸，也可以包含不來(lái)自于WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的氨基酸序列。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通過(guò)用傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)來(lái)篩選一個(gè)蛋白和肽免疫響應(yīng)產(chǎn)生的抗體，而不需要過(guò)多實(shí)驗(yàn)就可以很容易的測(cè)定一個(gè)WNV的或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白片段是否具有免疫原性。例如，這些實(shí)驗(yàn)包括，1)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，2)淋巴器官細(xì)胞增生測(cè)定，3)細(xì)胞對(duì)給定抗原所產(chǎn)生的抗體數(shù)量的測(cè)定。這些標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法的詳細(xì)描述可以在Weir和Blackwell，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，Supra和Coligan編寫，免疫學(xué)通用方法(Weir & Blackwell，eds.，Handbook of Experimental Immunology，supra and Coligan et al.，eds.，Current Protocols in Immunology)等有關(guān)免疫學(xué)手冊(cè)中找到。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以按照本發(fā)明提供的公開(kāi)說(shuō)明和已有的廣為人知的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)和鑒定WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的免疫原片段。因此，不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)我們就可以用已鑒定的免疫原片段取代完整長(zhǎng)度的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的使用和配制。
            
本發(fā)明在治療方面的應(yīng)用包括在藥物組合物中使用WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、WNV的或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的功能性片段、編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的核酸分子、或者編碼WNV的或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的功能性片段的核酸分子，和對(duì)患有癌癥或牛皮癬等高度增生細(xì)胞性或相關(guān)疾病的治療。
            
本發(fā)明的一個(gè)方面是將WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、或編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸分子用于藥物組合物中來(lái)治療以不良細(xì)胞為特征的疾病，這些疾病包括(不限于)那些以高度增生細(xì)胞為特征的疾病，如癌癥或牛皮癬。按照本發(fā)明，提供的藥物組合物包含WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、或由包含編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白及其功能性片段的DNA或RNA核酸序列。
            
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、和/或編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸分子和一個(gè)可藥用的載體或稀釋劑的藥物組合物，包含WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、和/或編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸分子的藥物組合物對(duì)治療具有高度增生細(xì)胞性疾病和癥狀的病人是有用的。如此處所述，由于WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段的定義就是能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子，對(duì)以不良細(xì)胞(如高度增生細(xì)胞)為特征的疾病的有效藥物組合物就可包括WNV和相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、和/或編碼黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白及其功能性片段的核酸分子。本發(fā)明中藥物組合物對(duì)以腫瘤為特征的癌癥具有特異性的作用。刺激高度增生細(xì)胞凋亡的能力提供了一種破壞高度增生細(xì)胞的方式，從而使腫瘤縮小。對(duì)諸如癌癥和牛皮癬等以不適當(dāng)高度增生細(xì)胞為特征的疾病，本藥物組合物通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，來(lái)阻滯高度增生細(xì)胞，從而達(dá)到對(duì)疾病的治療。
            
如前所述，本發(fā)明的另一個(gè)方面是對(duì)患有與高度增生細(xì)胞有關(guān)疾病的個(gè)體的治療方法，它包含一個(gè)對(duì)所說(shuō)的個(gè)體的給藥步驟，所用的藥中含有足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞凋亡數(shù)量的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、和/或編碼這些蛋白和片段的核酸分子。
            
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一個(gè)治療患有不良細(xì)胞相關(guān)疾病如自身免疫疾病的個(gè)體的方法，這個(gè)方法包含一個(gè)對(duì)所述個(gè)體的給藥步驟，所用的藥中含有足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞凋亡的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段、和/或編碼這些蛋白或片段的核酸分子。
            
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及疫苗組合物，它包含WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其免疫原片段、和/或編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段的核酸分子，和一個(gè)可藥用的載體或稀釋劑。由WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或它們的免疫原片段組合物的疫苗成分能使個(gè)體對(duì)WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒產(chǎn)生免疫。這個(gè)免疫可以是預(yù)防性的(防止感染)或治療性的(治療感染)。預(yù)防性免疫能保護(hù)個(gè)體不受病毒的侵?jǐn)_，治療性免疫能治療個(gè)體當(dāng)前所受的病毒性感染。
            
如前所述，本發(fā)明的一個(gè)方面是一個(gè)治療感染W(wǎng)NV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒個(gè)體的方法，它包含一個(gè)對(duì)所述個(gè)體的給藥步驟，所用藥物含有足以誘導(dǎo)一個(gè)治療性免疫反應(yīng)的數(shù)量的WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或其免疫原片段組合物。
            
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一個(gè)防止個(gè)體感染W(wǎng)NV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的方法。這個(gè)方法包含給所述個(gè)體用藥的步驟，所用藥物含有足夠誘導(dǎo)一個(gè)預(yù)防性免疫反應(yīng)的WNV或一個(gè)相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或它們的免疫原片段組合物。
            
當(dāng)WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或其功能性片段作為疫苗組分被用于個(gè)體時(shí)(不論在疫苗中是以直接的蛋白形式或者是以核酸序列表達(dá)的形式被使用)，衣殼蛋白或其免疫原片段成為一個(gè)誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的靶點(diǎn)，防御個(gè)體不受感染(預(yù)防性)或者治療個(gè)體的感染(治療性)。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這個(gè)免疫反應(yīng)可以同時(shí)是治療性的和預(yù)防性的，因?yàn)樵谝粋€(gè)治療性的醫(yī)療后，此個(gè)體可被保護(hù)以免被病毒進(jìn)一步感染。
            
病毒衣殼蛋白如上所述，WNV衣殼蛋白或其功能性片段可以用易得的原料和常規(guī)方法來(lái)生產(chǎn)。我們已經(jīng)知道編碼WNV衣殼蛋白的核酸序列和氨基酸序列。許多WNV分離株的完整基因組已經(jīng)公布并可以在基因庫(kù)(GenBank)中得到，包括2741號(hào)分離株(序列為AF206518)、NY99-火烈鳥382-99毒株(序列號(hào)為AF196835)、毒株HNY1999的完整的聚蛋白基因(序列號(hào)為AF202541)和序列號(hào)為M12294的分離株，在此列出作為參考。有許多涉及WNV基因組的序列信息的文章，它們的引文都與GenBank中的序列信息有關(guān)，在這里列出的每個(gè)參考文獻(xiàn)，包括公開(kāi)的可利用的序列信息，都作為參考。
            
其它黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白和核酸的序列信息在GenBank中也可以找到。例如(不限于)GenBank所提供的毒株和分離株的完整基因組序列包括JEV(序列號(hào)為M18370，D90194和D90195)，SLEV(序列號(hào)為M16614)，YFV(序列號(hào)為AF094612，U17067，U17066，U54798，U21055，U21056和X03700)，DENV(序列號(hào)為M23027，U88535，U88536和U88537)以及BVDV(序列號(hào)為M31182)，此處列出作為參考。
            
提供一段編碼所需蛋白的合適DNA序列可以采用已知的重組技術(shù)進(jìn)行蛋白生產(chǎn)。比如，編碼序列可以采用PCR引物從被感染的細(xì)胞中克隆得到，所用的PCR引物可以以公開(kāi)的可利用的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。DNA序列也可以用DNA合成儀化學(xué)合成。當(dāng)編碼序列采用化學(xué)合成時(shí)，可以利用該DNA表達(dá)的宿主細(xì)胞的已知密碼子偏好性的優(yōu)點(diǎn)。另外還可改變編碼序列，比如點(diǎn)突變，插入或缺失，來(lái)產(chǎn)生對(duì)照體和衣殼蛋白其他的修改型。
            
本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，使用已知的技術(shù)能夠得到編碼WNV或一個(gè)相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的DNA分子，并且將該DNA分子插入到一個(gè)可利用的商業(yè)化表達(dá)載體使用在眾所周知的的表達(dá)系統(tǒng)中。例如，商業(yè)化的質(zhì)粒pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)可以用于大腸桿菌生產(chǎn)衣殼蛋白。商業(yè)化的質(zhì)粒pYES2(Invitrogen，San Diego，CA)可以用于酵母細(xì)胞如釀酒酵母生產(chǎn)衣殼蛋白。商業(yè)化的MaxBac 2.0Kit(Invitrogen，San Diego，CA)，帶有pBlueBac4載體，是一個(gè)完整的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，可以用于昆蟲細(xì)胞如Sf9細(xì)胞生產(chǎn)衣殼蛋白。商業(yè)化的pcDNA I(Invitrogen，San Diego，CA)可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞中生產(chǎn)衣殼蛋白。
            
本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，采用常規(guī)技術(shù)和易得的起始原料，就能夠使用這些商業(yè)化的表達(dá)載體系統(tǒng)或其他系統(tǒng)生產(chǎn)WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白。
            
本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，可以使用其他商業(yè)化的表達(dá)載體和系統(tǒng)，或者使用已知方法和易得起始原料來(lái)構(gòu)建載體。包含必須的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)，最好包含增強(qiáng)子的表達(dá)系統(tǒng)很容易得到并被用于廣泛的宿主中。例如，參見(jiàn)Ausubel等編寫的分子生物學(xué)通用方法(Current Protocolsin Molecular Biology)一書。
            
因此，所需蛋白可在原核和真核系統(tǒng)中生產(chǎn)，并會(huì)產(chǎn)生一系列的蛋白加工形式。
            
盡管能夠使用諸如枯草芽胞桿菌、假單胞菌的其他表達(dá)系統(tǒng)，最普遍使用的原核表達(dá)系統(tǒng)仍然是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。原核系統(tǒng)合適的調(diào)控序列包括組合物型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但這些啟動(dòng)子包括(不限于)lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子、λ噬菌體P1啟動(dòng)子。一般而言，在這些宿主中外源蛋白可以以融合蛋白或完整蛋白形式生產(chǎn)。當(dāng)所需蛋白以完整蛋白形式生產(chǎn)時(shí)，生成的序列前面可能會(huì)有一個(gè)甲硫氨酸，這個(gè)甲硫氨酸不必被有效去除。因此，在此所要求的多肽和蛋白在細(xì)菌中生產(chǎn)時(shí)其N末端可能會(huì)有甲硫氨酸。而且，可以構(gòu)建在肽鏈編碼序列前加上一個(gè)可操作的信號(hào)肽從而導(dǎo)致蛋白分泌表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)。在原核宿主中以這種方式表達(dá)時(shí)，信號(hào)序列在蛋白分泌時(shí)被切除。
            
現(xiàn)在，許多真核宿主也被用來(lái)生產(chǎn)重組外源蛋白。盡管在細(xì)菌中，原核宿主在被表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后能直接產(chǎn)生所需蛋白，但更普遍采用的是用信號(hào)肽序列來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白的分泌表達(dá)。真核系統(tǒng)有個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)，能夠加工內(nèi)含子，內(nèi)含子可能在編碼高等生物體蛋白的基因組序列中存在。真核系統(tǒng)還提供許多加工機(jī)制，例如這些加工機(jī)制可以產(chǎn)生糖基化、羧基端酰胺化、某些氨基酸殘基的氧化或衍生化、構(gòu)象調(diào)節(jié)等。
            
一般使用的真核體系包括(不限于)酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥細(xì)胞和高等植物細(xì)胞。類型的宿主細(xì)胞，都有與之相適應(yīng)的合適的啟動(dòng)子。另外，還有相應(yīng)的終止序列和增強(qiáng)子，如桿狀病毒多角體增強(qiáng)子。如上所述，啟動(dòng)子可以是組合物型的或誘導(dǎo)型的。例如，在哺乳動(dòng)物體表達(dá)系統(tǒng)中，小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子被重金屬離子誘導(dǎo)。
            
適合所需宿主的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建細(xì)節(jié)對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。對(duì)于蛋白的重組生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，將編碼蛋白的DNA序列合適地連接到所選的表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化合適地宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)表達(dá)蛋白。從該培養(yǎng)物中，通過(guò)裂解細(xì)胞或從培養(yǎng)基中分離得到本發(fā)明的蛋白，這些對(duì)技術(shù)熟悉人員來(lái)說(shuō)是已知的。
            
一個(gè)具有普通技術(shù)的技術(shù)熟練人員，可以采用已知的技術(shù)分離得到用這些表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白。
            
除了通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這些蛋白外，多肽合成也可用于WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能片段的生產(chǎn)。需要注意地是如果蛋白是化學(xué)合成的，氨基酸可以由不能被基因編碼的氨基酸取代。例如，可選的氨基酸殘基分子式為H2N(CH2)nCOOH的氨基酸，其中n為2～6。這些都是中性非極性氨基酸；肌氨酸(Sar)、叔丁基丙氨酸(t-BuAla)、叔丁基甘氨酸(t-BuGly)，N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)、正亮氨酸(Nleu)也屬于這類氨基酸。例如，芳香族中性氨基酸苯基甘氨酸能夠取代色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸；瓜氨酸(Cit)和蛋氨酸亞砜(MSO)為極性的中性氨基酸，環(huán)己基丙氨酸為非極性中性氨基酸，磺丙氨酸(Cya)為酸性氨基酸，鳥氨酸(Orn)為堿性氨基酸。如果一個(gè)或更多的脯氨酸殘基被羥脯氨酸所取代，可得到脯氨酸殘基所具有的構(gòu)象特性。
            
本發(fā)明公開(kāi)的部分涉及藥物組合物，公開(kāi)的另外部分涉及治療性或預(yù)防性的疫苗組合物。本發(fā)明的藥物組合物對(duì)個(gè)體給藥以殺死細(xì)胞，本發(fā)明的疫苗組合物對(duì)個(gè)體給藥是為了誘導(dǎo)預(yù)防性或治療性的抗病毒免疫反應(yīng)。本發(fā)明的藥物組合物是以有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和殺死細(xì)胞的數(shù)量給藥。本發(fā)明的疫苗組合物是以有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的數(shù)量給藥。
            
無(wú)論組分被制備成藥物或是疫苗，組合物成分的很多方面、配方、劑量、藥物和疫苗的給藥都是相關(guān)的，而且可以是完全相同的，這些很容易被熟悉的技術(shù)人員所理解。例如，本發(fā)明的藥物組分和疫苗兩者都可能包含WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或相關(guān)的片段。在藥物組合物中衣殼蛋白或相關(guān)片段將在細(xì)胞凋亡方面起作用，而在疫苗當(dāng)中衣殼蛋白或相關(guān)片段是作為免疫原的。本發(fā)明的相關(guān)方面被認(rèn)為與藥物組分和疫苗都有關(guān)。
            
根據(jù)選用的給藥方式而確定的藥物組合物，技術(shù)熟練的技術(shù)人員可配制藥物組合物。該藥物成分被用于治療以高度增生的細(xì)胞為特征的疾病。該藥物成分包含有WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段，和一個(gè)可藥用的載體或稀釋劑?？伤幱玫妮d體描述見(jiàn)Remington藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)一書，該書為該領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考書。
            
對(duì)所有給藥途徑的共同要求是有效性和容易實(shí)施性。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，藥物組分通過(guò)注射給藥。在一個(gè)首選的具體實(shí)例方案中，藥物給藥采用腫瘤內(nèi)注射。其他的給藥方式包括(不限于)皮膚給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、粘膜給藥或一般的持續(xù)給藥。
            
例如，對(duì)腸胃外給藥，WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段與合適的腸胃外載體可被配制為溶液、懸浮液、乳劑或凍干粉。這樣的載體例子有水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水性載體如不揮發(fā)油。載體或凍干粉可包含維持等滲性的添加劑(如氯化鈉，D-甘露醇)和保持化學(xué)穩(wěn)定的添加劑(如緩沖劑和防腐劑)。制劑通過(guò)普遍使用的技術(shù)滅菌。例如，適用于注射給藥的腸胃外的藥物可按1.5％的活性成分重量比用0.9％氯化鈉溶液配制。
            
盡管個(gè)體的需要會(huì)有變化，最佳的藥物有效劑量范圍可用一定的技術(shù)方法確定。根據(jù)動(dòng)物研究，很容易推斷出人類的劑量，見(jiàn)Katocs等，Remington藥物科學(xué)，第18版，第27章，Gennaro編寫，Mack出版公司，Easton，PA，1990(Katocs et al.，Chapter 27 InRemington’s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990)。一般來(lái)說(shuō)，藥物劑量要求提供有效的藥物量，這個(gè)劑量可由熟知該領(lǐng)域的人員進(jìn)行調(diào)整，它根據(jù)幾個(gè)因素而變化，包括年齡、健康、身體情況、體重、受體疾病的類型和程度、治療頻率、同時(shí)治療的特性(如果需要)、和預(yù)期效應(yīng)的性質(zhì)和范圍，見(jiàn)Nies等，Goodman和Gilman治療藥物基礎(chǔ)，第9版，第三章，Hardman編寫，McGraw-Hill，紐約市，紐約州，1996(Nies et al.，Chapter3InGoodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics.9thEd.，Hardman et al.，eds.，McGraw-Hill，New York，NY，1996)。通常，WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的每日劑量大約為1μg 100mg/kg體重。為了有效的達(dá)到預(yù)期效果，一般劑量為每天0.5mg 50mg/kg體重，更合適的劑量為每天1mg-10mg/kg體重，每天分1-6次或以持續(xù)釋放形式給藥。
            
根據(jù)本發(fā)明藥物組分可以單劑量或多劑量給藥。本發(fā)明藥物組分可以單一治療制劑或聯(lián)合其他治療制劑進(jìn)行給藥。本發(fā)明的治療可以結(jié)合常規(guī)療法，可順序或同時(shí)給藥。
            
任何能夠使活性成分達(dá)到受體體內(nèi)的作用位點(diǎn)的給藥方式都可以用于包含WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段或衍生物的藥物的給藥。由于蛋白通過(guò)口服給藥會(huì)被消化，一般使用腸胃外給藥如靜脈、皮下、肌肉給藥來(lái)優(yōu)化吸收。另外，本發(fā)明藥物可以在細(xì)胞高度增生部位或附近位點(diǎn)注射。例如，給藥可以直接對(duì)腫瘤硬塊注射或注射在直接與之相鄰的組織中。如果要治療患有牛皮癬的個(gè)體，WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或功能性片段可用合適的外用載體配制成霜?jiǎng)⑾匆?、軟膏外用給藥。
            
根據(jù)所選用的給藥方式確定的藥物組合物，技術(shù)人員可制備疫苗制劑。該疫苗用于預(yù)防或治療WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒對(duì)個(gè)體的感染。該疫苗成分包含有WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段，還包含合適的藥物載體或稀釋劑。合適的藥物載體描述見(jiàn)Remington藥物科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)一書，該書為該領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考書?？伤幱玫妮d體也包括其它任何不會(huì)對(duì)受體產(chǎn)生有害抗體的載體。適用的載體包括代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂質(zhì)聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)。這些載體都為對(duì)該領(lǐng)域熟悉的人員所知。另外，這些載體可作為免疫刺激試劑(佐劑)。此外，抗原還可以連接到一個(gè)細(xì)菌類毒素上，如白喉或破傷風(fēng)的類毒素。
            
可以和本發(fā)明疫苗同時(shí)使用的佐劑包括(不限于)(1)鋁鹽，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳化制劑，如(a)合成佐劑(SAF)，Chiron公司(Emeryville，CA)，(b)Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)(Corixa，Seattle，WA)，該佐劑包含去毒內(nèi)毒素和分支桿菌細(xì)胞壁成分和2％角鯊?fù)椋?3)水包油乳化制劑，如TiterMax，CytRx公司(Norcross，GA)；(4)皂角佐劑，如Stimulon(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或能產(chǎn)生免疫刺激復(fù)合物的顆粒；(4)弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)；(5)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL-1，IL-2等)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)能夠作為免疫刺激試劑提高疫苗成分免疫效果的其他物質(zhì)。
            
典型的本發(fā)明的疫苗包含稀釋劑如水、鹽、甘油、乙醇等。另外，輔助物質(zhì)如保濕劑或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)等類物質(zhì)可以存在于載體中。
            
典型的本發(fā)明的疫苗是被制備成溶液或懸浮液形式的血管注射劑。也可以被制備成適合于溶解或懸浮的固體制劑，在注射前用液體載體溶解和懸浮。如上面在可藥用的載體中所述那樣，為了加強(qiáng)佐劑效果，制劑也可被乳化或包在脂質(zhì)體中。
            
本發(fā)明疫苗組合物包含有效數(shù)量的WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段或衍生物。任何能使受體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫反應(yīng)的給藥方式都可用于該疫苗的給藥。WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段或衍生物的免疫有效劑量是對(duì)個(gè)體的給藥量，給藥無(wú)論以單劑量或作為系列給藥的一部分進(jìn)行，對(duì)個(gè)體預(yù)防或治療都是有效的。用量隨以下條件不同而不同被治療個(gè)體的健康和身體情況、被治療個(gè)體的分類(如非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物、靈長(zhǎng)目動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、需保護(hù)的程度、疫苗的配方、藥學(xué)情況的醫(yī)師評(píng)價(jià)及其它相關(guān)因素。我們期望藥物用量落在一個(gè)比較寬的能通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的范圍內(nèi)。
            
對(duì)任何給藥途徑的一個(gè)共同要求是有效性和容易實(shí)施性。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，疫苗通過(guò)腸道外給藥如注射，可以是皮下注射或肌肉注射。其他的給藥方式包括(不限于)皮膚給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、粘膜給藥或一般的持續(xù)給藥。劑量處理可以是單劑量或多劑量方案。疫苗可以與其它免疫調(diào)節(jié)因子和/或其它疫苗聯(lián)合給藥。
            
核酸本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的核酸分子及可藥用的載體或稀釋劑的藥物構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明，編碼WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的遺傳物質(zhì)以一種能表達(dá)的形式導(dǎo)入個(gè)體中。遺傳物質(zhì)DNA或RNA被個(gè)體細(xì)胞攝取并表達(dá)。由此生成的WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段能誘導(dǎo)高度增生細(xì)胞的凋亡。因此，含有編碼WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段遺傳物質(zhì)的藥物和含有WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的藥物一樣有用用于治療以高度增生細(xì)胞為特征的或與之相關(guān)的病狀的個(gè)體。本發(fā)明藥物構(gòu)成對(duì)治療以硬腫瘤為特征的癌癥特別有用。
            
本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及治療患有與高度細(xì)胞增生有關(guān)疾病的個(gè)體的治療方法。治療方法包含將一定量的核酸分子給所述個(gè)體給藥，核酸分子包含編碼WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的核酸序列，并且要可執(zhí)行的連接到表達(dá)這些序列所必須的調(diào)控元件上。
            
本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼來(lái)自于WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒的衣殼蛋白，或其免疫原片段的核酸分子及可藥用的載體或稀釋劑的疫苗。根據(jù)本發(fā)明，編碼衣殼蛋白或其免疫原片段的遺傳物質(zhì)以一種能表達(dá)的形式導(dǎo)入個(gè)體中。遺傳物質(zhì)DNA或RNA被個(gè)體細(xì)胞攝取并表達(dá)。由此生成的衣殼蛋白，或其免疫原片段用來(lái)誘導(dǎo)個(gè)體的免疫反應(yīng)。因此，含有編碼WNV或相關(guān)的黃病毒、瘟病毒來(lái)源的衣殼蛋白，或其免疫原片段的遺傳物質(zhì)的疫苗和衣殼蛋白的疫苗一樣可以免疫個(gè)體。如果個(gè)體未受感染，免疫是預(yù)防性的；如果個(gè)體已被感染，免疫是治療性的。因此，本發(fā)明更深的方面是關(guān)于防止感染或治療感染個(gè)體的方法。
            
編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或其功能性片段的核苷酸序列，與個(gè)體細(xì)胞中表達(dá)所必需的調(diào)控元件可實(shí)施性的連接，可以被作為藥物組分使用基因治療策略來(lái)遞送，這些策略包括(不限于)使用病毒載體如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或直接的核酸轉(zhuǎn)染。用病毒載體傳送感興趣的蛋白的編碼核酸的方法已經(jīng)有廣泛的報(bào)道。用常規(guī)方法從起始原料中可以得到一個(gè)重組病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒或腺關(guān)聯(lián)病毒載體。重組病毒載體包含一個(gè)編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。這個(gè)載體與可藥用的載體或稀釋劑結(jié)合，得到的藥物制劑可以給個(gè)體用藥。一旦個(gè)體感染病毒載體，被感染的細(xì)胞中就會(huì)產(chǎn)生WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白、或其功能性片段。
            
編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段的核苷酸序列，與個(gè)體細(xì)胞中表達(dá)所必需的調(diào)控元件可執(zhí)行性的連接，可以被作為疫苗組分應(yīng)用，疫苗組分包含病毒載體，例如腺病毒，腺相關(guān)病毒，痘苗病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，或細(xì)菌或分支桿菌載體。此外，核苷酸序列也可以與活的和/或減毒的疫苗聯(lián)合使用。
            
另一個(gè)選擇，一個(gè)包含編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性或免疫性片段的核酸序列的分子，可以通過(guò)直接核酸轉(zhuǎn)移被作為藥物組分或疫苗給藥，而不使用感染性載體。此核酸分子可以是DNA或RNA，最好是DNA。此DNA分子可以是線性的也可以是環(huán)狀的，最好是質(zhì)粒。此核酸分子可與一個(gè)可藥用的載體或稀釋劑合用。
            
如上所述，本發(fā)明的藥學(xué)成分和疫苗的組成、配方、劑量和給藥的許多方面是相關(guān)的，并且可以是相同的。例如本發(fā)明中的藥物組合物和疫苗都可包含一個(gè)編碼WNV和相關(guān)黃病毒和瘟病毒衣殼蛋白或其片段的核酸。藥物組合物中的編碼衣殼蛋白或其片段的功能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，而疫苗中編碼的衣殼蛋白或其片段是作為免疫原。相關(guān)方面的公開(kāi)部分被認(rèn)為與藥物組合物和疫苗兩部分都有關(guān)聯(lián)。
            
重要的是，在藥物組合物中，核酸的用量必須足以表達(dá)出足夠的產(chǎn)物來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。如果核酸編碼的是片段，則此片段必須是功能性片段。免疫原性不是藥物組合物相關(guān)的特征，然而，在疫苗組合物中，免疫原性是決定性的。疫苗的基本活性是誘導(dǎo)一個(gè)預(yù)防性的或治療性的免疫反應(yīng)。如果核酸編碼的是一個(gè)片段，則此片段必須是免疫原片段。
            
按照本發(fā)明，包含一個(gè)編碼WNV或一個(gè)相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，或其功能性片段的藥物成分或疫苗可以直接用于個(gè)體給藥。遺傳物質(zhì)被引進(jìn)個(gè)體的體細(xì)胞內(nèi)。首選的給藥路線包括肌肉注射、腹膜內(nèi)給藥、真皮內(nèi)給藥的以及皮下給藥。另一種選擇，就是將藥物成分通過(guò)不同的方法引入從個(gè)體中取出的細(xì)胞中。例如，這些方法包括轉(zhuǎn)染、電穿孔和微粒轟擊。細(xì)胞吸收核酸分子后，將細(xì)胞重新植入個(gè)體中。期望的是即使此處用的預(yù)防接種疫苗的細(xì)胞最初來(lái)自于另一個(gè)個(gè)體，這個(gè)帶有遺傳重組體的非免疫原細(xì)胞也可以被植入到其他個(gè)體中。
            
遺傳重組體可以通過(guò)很多工具來(lái)給藥，包括但不限于傳統(tǒng)的注射器、無(wú)針注射設(shè)備或“微粒轟擊基因槍”。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例，遺傳重組體是用無(wú)針注射設(shè)備對(duì)個(gè)體給藥。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例，遺傳重組物是采用無(wú)針注射設(shè)備同時(shí)對(duì)個(gè)體的真皮、皮下和肌肉給藥。無(wú)針注射設(shè)備是很熟悉的和被廣泛使用的一種設(shè)備，一般技術(shù)人員按照本文的指導(dǎo)，就可以用無(wú)針注射設(shè)備來(lái)給個(gè)體的細(xì)胞導(dǎo)入遺傳物質(zhì)。無(wú)針注射設(shè)備非常適合對(duì)所有組織導(dǎo)入遺傳物質(zhì)。他們特別適合將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入皮膚和肌肉細(xì)胞。在一些具體實(shí)例中，一個(gè)無(wú)針注射設(shè)備可以被用來(lái)注射包含DNA分子的液體進(jìn)入個(gè)體皮膚表面，液體以一種足夠的速度沖擊皮膚，使液體能滲透皮膚的表面，透入其下的皮膚和肌肉組織，因此，遺傳物質(zhì)能同時(shí)對(duì)真皮、皮下和肌肉給藥。在一些具體實(shí)例中，為了給某個(gè)器官的細(xì)胞導(dǎo)入核酸分子，可以使用一個(gè)無(wú)針注射設(shè)備來(lái)給這個(gè)器官的組織傳送遺傳物質(zhì)。
            
按照本發(fā)明，基因疫苗可以被直接給藥于個(gè)體中使其具有免疫性，或?qū)⒁呙鐚?dǎo)入從個(gè)體中取出的細(xì)胞中，再將細(xì)胞重新植入個(gè)體。通過(guò)以上的任何一種途徑，都可將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入個(gè)體的體細(xì)胞中，給藥途徑包括但不限于肌肉給藥、腹膜內(nèi)給藥、真皮內(nèi)給藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥和口服以及皮膚穿透給藥(皮下穿刺)，或通過(guò)吸入劑或栓劑。首選的給藥途徑包括肌肉給藥、腹膜給藥、真皮內(nèi)給藥和皮下注射。
            
按照本發(fā)明，藥物組合物或疫苗組合物包含約1納克(ng)到約2000微克(μg)的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約5ng到約1000μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約10ng到800μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約0.1到500μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約1到350μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約25到250μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物或疫苗組合物包含約100到200μg的DNA。
            
本發(fā)明的藥物或疫苗組合物的配方是按照所使用的給藥方式來(lái)確定的。藥物或疫苗組合物是血管注射劑時(shí)，它們是無(wú)菌、無(wú)熱源和無(wú)微粒子的。最好使用一個(gè)等滲的配方。通常，維持等滲性的添加劑可以包括NaCl、葡萄糖、D-甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況下，最好用等滲溶液例如磷酸緩沖鹽溶液。穩(wěn)定劑包括凝膠和白蛋白。在一些具體實(shí)例中，在配方中要加入一個(gè)血管收縮劑。
            
在一些具體實(shí)例中，核酸分子與一個(gè)多聚核苷酸功能增強(qiáng)子或“基因疫苗助長(zhǎng)因子”(GVF)聯(lián)合用藥被導(dǎo)入細(xì)胞。多聚核苷酸功能增強(qiáng)子在下列的美國(guó)專利中有描述，美國(guó)專利號(hào)(U.S.Patent No.)為5,593,972和5,981,505，及國(guó)際申請(qǐng)序列號(hào)(International Application Serial Number)為PCT/US94/00899，1994年1月26日存檔。此處列出作為參考。GVF因子在下列的美國(guó)專利中亦有描述，專利號(hào)(U.S.Patent No.)為5,739,118和5,837,533以及國(guó)際申請(qǐng)專利序列號(hào)(International Application SerialNumber)為PCT/US99/04332，國(guó)際存檔日期為1999年2月26日，此處列出作為參考。
            
與核酸分子聯(lián)合給藥的聯(lián)合因子可以與核酸分子混合后給藥，或者與核酸分子分開(kāi)、同時(shí)、或在核酸分子給藥之前或之后給藥。另外，其它具有轉(zhuǎn)染因子和/或復(fù)制因子和/或刺激性因子功能的因子，并且它們可以與GVF一起或不與其一起聯(lián)合給藥，這些因子包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及淋巴因子如α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，表面活性劑如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)，弗氏不完全佐劑，脂多糖(LPS)類似物包括單磷脂A(MPL)、胞壁酰肽、苯醌類似物、小囊泡、角鯊烯和鯊烯和透明質(zhì)酸。在一些具體實(shí)例中，一個(gè)免疫調(diào)節(jié)蛋白被作為GVF使用。
            
按照本發(fā)明，導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子，被作為一個(gè)遺傳模板，使細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生預(yù)防性和/或治療性免疫的功能的蛋白。在首選的具體實(shí)例中，核酸分子包含動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼區(qū)所必需的調(diào)整序列。
            
本發(fā)明涉及改良的減毒活疫苗和使用重組載體導(dǎo)入編碼抗原的外源基因的改良疫苗，減毒活疫苗和那些用重組載體來(lái)導(dǎo)入外源抗原的疫苗例子在下列美國(guó)專利中有描述美國(guó)專利號(hào)為4,722,848；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；和5,482,713，每個(gè)在此列出的文獻(xiàn)均作為參考?；蛑亟M子提供了可執(zhí)行性的和在疫苗中具有有效表達(dá)功能的調(diào)節(jié)序列連接的編碼病毒衣殼蛋白的核苷酸序列。按照本發(fā)明，基因重組子是用減毒活疫苗和重組疫苗來(lái)產(chǎn)生疫苗的。
            
按照本發(fā)明中藥物和疫苗組合物方面的描述，藥物和疫苗組合物包含約0.1μg到約1000μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物和疫苗組合物中包含約1μg到約500μg的DNA。在一些首選的具體實(shí)例中，藥物和疫苗組合物中包含約25μg到約250μg的DNA。最佳的藥物和疫苗組合物中DNA的含量約為100μg。
            
按照本發(fā)明中藥物和疫苗組合物方面的描述，如前討論，藥物和疫苗組合物的配方按照所使用的給藥方式來(lái)確定，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以很容易的給出一個(gè)編碼WNV或相關(guān)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核酸分子的配方。在選擇肌內(nèi)注射方式給藥的情況下，要使用一個(gè)等滲的配方。一般來(lái)說(shuō)，維持等滲性的添加劑可以包括NaCl、葡萄糖、D-甘露醇、山梨醇和乳糖。也可以使用等滲溶液如磷酸緩沖鹽溶液。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在疫苗組合物中，加入佐劑或免疫刺激劑可以更理想。
            
凋亡試驗(yàn)本發(fā)明另一個(gè)方面描述了鑒定能抑制WNV Cp或衣殼蛋白，或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的其它蛋白，或其功能性片段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的組合物的方法，該方法包括的步驟為在待測(cè)組合物存在的情況下，將足夠誘導(dǎo)出可檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的定量WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白或其它蛋白，或其功能性片段與上述細(xì)胞進(jìn)行首先接觸；再對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行觀察以鑒定待測(cè)組合物存在時(shí)是否發(fā)生凋亡。能干擾WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白或其它蛋白，或其功能性片段的凋亡誘導(dǎo)活性的組合物可用作抵抗病毒和治療WNV和包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒感染的藥物。
            
本發(fā)明這個(gè)方面可用于鑒定能對(duì)WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段的誘導(dǎo)擴(kuò)增細(xì)胞凋亡活性起抑制作用的組合物。本發(fā)明并提供了一種分析方法用來(lái)比較待測(cè)組合物存在或不存在時(shí)，WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用。用該分析方法可鑒定出能抑制WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段的凋亡誘導(dǎo)活性的組合物。該組合物可用于抗WNV和/或抗黃病毒或抗瘟病毒的治療。
            
本發(fā)明中提供的方法包括的步驟有，在待測(cè)組合物存在的情況下，細(xì)胞與WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段進(jìn)行接觸；觀察這些細(xì)胞以鑒定WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段是否能誘導(dǎo)凋亡；將待測(cè)組合物不存在時(shí)，細(xì)胞與WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段進(jìn)行接觸的試驗(yàn)作為對(duì)照；將不存在WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段時(shí)，細(xì)胞與待測(cè)組合物進(jìn)行接觸的試驗(yàn)作為另一對(duì)照。如果當(dāng)待測(cè)組合物存在時(shí)，與WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段進(jìn)行接觸的細(xì)胞不發(fā)生凋亡，則表明待測(cè)組合物具有抗凋亡的活性。該活性可通過(guò)待測(cè)組合物不存在時(shí)與WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段進(jìn)行接觸的細(xì)胞發(fā)生可檢測(cè)的凋亡，而當(dāng)不存在WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段時(shí)，細(xì)胞與待測(cè)組合物接觸后不發(fā)生凋亡這兩種情況來(lái)證實(shí)。
            
優(yōu)選以溶液形式提供該待測(cè)組合物，系列稀釋待測(cè)組合物后可用于一系列的分析試驗(yàn)，待測(cè)組合物的濃度可從0.01μM增加到1M。待測(cè)組合物最終優(yōu)選濃度范圍為10μM到100μM。
            
WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段可以多種方式加入到試驗(yàn)中。在本發(fā)明的一些具體實(shí)例中，它是作為蛋白與細(xì)胞結(jié)合。WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段可直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中?？捎萌缜八龅囊阎募夹g(shù)從廣泛使用的起始材料中生產(chǎn)WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段。使用WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段的優(yōu)選濃度范圍為1μg/ml到1mg/ml。
            
在本發(fā)明的其它具體具體實(shí)例中，分析試驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)的WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段是由核苷酸表達(dá)。在一個(gè)不限制的實(shí)例中，試驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)的WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段可在能誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制下由核苷酸表達(dá)。
            
細(xì)胞凋亡可通過(guò)檢測(cè)特征性的細(xì)胞變化或“凋亡標(biāo)志物”的方法來(lái)進(jìn)行觀察。比如，在凋亡早期、最終的細(xì)胞死亡之前，細(xì)胞膜的變化會(huì)導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜中向外突出。凋亡過(guò)程中PS的持續(xù)暴露使之成為一個(gè)有用的“凋亡標(biāo)志物”和各種檢測(cè)技術(shù)的具吸引力的靶目標(biāo)。膜聯(lián)蛋白V是一種人內(nèi)源性蛋白，它與PS有很高的親和性，可作為檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)入凋亡的便利的反應(yīng)物。熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V可用于組織學(xué)的和細(xì)胞分類研究中對(duì)凋亡細(xì)胞的鑒定。比如，膜聯(lián)蛋白V可與藻紅蛋白(PE)連接，PE為含25個(gè)氟的大分子，是當(dāng)今使用的最亮的染色劑之一。PE可購(gòu)買，也可用已知的分離方法從藻類中分離。結(jié)合技術(shù)是專業(yè)人士知道的，并且結(jié)合試劑盒也能購(gòu)買，如ProZyme，Inc(San Leandro，CA)。關(guān)于可用于流式血球計(jì)數(shù)儀和其它應(yīng)用使用的熒光蛋白結(jié)合的細(xì)節(jié)和方案可見(jiàn)Hardy，R.，流式細(xì)胞儀使用的熒光蛋白的純化和偶聯(lián)，第四版.實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，Weir，Herzenbery，和Herzenbery編寫，Blackwell科學(xué)出版社，波士頓，1986(Hardy，R.，Purification and coupling of fluorescent proteins for use in flowcytometry，4th Ed.Handbook of Experimental Immunology，Weir，Herzenbery，& Herzenbery，eds.，Blackwell Scientific Pubs.，Boston，1986)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考。此外，放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V可用于體內(nèi)腫瘤中凋亡細(xì)胞的放射性藥物成像。
            
游離3′-羥基DNA末端也是一種“凋亡標(biāo)記物”，它是由選擇性活化的DNases內(nèi)引起的細(xì)胞DNA的核小體內(nèi)片段化產(chǎn)生的。這些游離3′-羥基DNA并不在健康細(xì)胞的完整的基因組DNA中存在，也不存在于由壞死導(dǎo)致的死亡細(xì)胞中。與凋亡相關(guān)的游離3′-羥基DNA可通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP平端標(biāo)記試驗(yàn)(TUNEL)被原位檢測(cè)。有關(guān)DNA分子在細(xì)胞凋亡時(shí)被切段的檢測(cè)技術(shù)的文獻(xiàn)綜述見(jiàn)Kaufmann等，2000，酶分子方法學(xué)，3223-15(Kaufmannet al.，2000，Methods Enzymol.，3223-15)。
            
凋亡相關(guān)的核小體內(nèi)片段化也可通過(guò)夾心式免疫反應(yīng)檢測(cè)，該反應(yīng)使用了一對(duì)核小體兩個(gè)表位特異的單克隆抗體以捕捉和檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(ELLSA)平板上的細(xì)胞質(zhì)核小體，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)Salgame等，1997，核酸研究，25680-6814(Salgame，et al.，1997，Nucleic Acids Res.，25680-6814)。該試驗(yàn)也可用于組織培養(yǎng)細(xì)胞的大規(guī)模篩選。
            
檢測(cè)凋亡的試驗(yàn)可通過(guò)使用許多不同類型的細(xì)胞和用各種方式傳送的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段來(lái)實(shí)行。在這方面有基本技能的人按照說(shuō)明書的指導(dǎo)就可容易地用多種方法來(lái)付諸實(shí)施。在本發(fā)明優(yōu)選的具體具體實(shí)例中，試驗(yàn)可使用腫瘤衍生的細(xì)胞，如腺癌衍生的HeLa細(xì)胞系和橫紋肌肉瘤衍生的RD細(xì)胞系，或者使用轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如腺病毒DNA轉(zhuǎn)化的293腎細(xì)胞系。
            
本發(fā)明進(jìn)一步描述了將以上方法用于試劑盒來(lái)鑒定能抑制WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段的誘導(dǎo)凋亡的活性的組合物。本發(fā)明描述的試劑盒由一個(gè)裝有WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的衣殼蛋白，或其功能性片段的容器，和以下中至少一項(xiàng)組合物說(shuō)明書，對(duì)照，照片或描述數(shù)據(jù)的圖形。此外，試劑盒可包括含第二個(gè)裝有檢測(cè)凋亡試劑的容器，如藻紅蛋白(PE)結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V。此外，說(shuō)明書能指導(dǎo)試劑盒的使用者使用多種已知的檢測(cè)凋亡標(biāo)記物的方法。這個(gè)試劑盒也可提供使用者用于試驗(yàn)的細(xì)胞。比如，試劑盒中可包含一瓶深低溫保存的腫瘤細(xì)胞。
            
診斷建立檢測(cè)WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒蛋白抗體存在的診斷試劑是非常需要的。
            
本發(fā)明描述了用于鑒定待測(cè)樣本中WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白的存在和/或含量的診斷檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了識(shí)別WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白的抗衣殼蛋白抗體。個(gè)體的待測(cè)樣本中存在的衣殼蛋白可能是已被感染的良好標(biāo)志。
            
本發(fā)明描述了通過(guò)檢測(cè)樣本中衣殼蛋白的存在來(lái)鑒定受到WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒感染的個(gè)體的方法?？贵w優(yōu)選單克隆抗體，最好是采用人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的衣殼蛋白作為抗原所獲得的抗體。對(duì)個(gè)體樣本中存在的衣殼蛋白進(jìn)行定量可用于決定感染個(gè)體的病情預(yù)斷。
            
本發(fā)明描述了與WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白特異性結(jié)合的抗體，抗體優(yōu)選單克隆抗體，最好是采用人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的衣殼蛋白作為抗原所獲得的抗體。
            
本發(fā)明描述了鑒定受WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒感染的個(gè)體的試劑盒，包括第一個(gè)裝有特異結(jié)合WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白的抗體的容器和第二個(gè)裝有作為正對(duì)照的衣殼蛋白的容器?？贵w優(yōu)選單克隆抗體，最好是采用人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的衣殼蛋白作為抗原所獲得的抗體。該試劑盒可用于個(gè)體樣本中存在的衣殼蛋白的含量鑒定。
            
本發(fā)明的另一方面描述了鑒定待測(cè)樣本中抗WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白抗體的存在和/或含量的診斷方法。在本發(fā)明的診斷方法中，個(gè)體待測(cè)樣本中抗衣殼蛋白抗體的存在是感染發(fā)生的標(biāo)示。
            
本發(fā)明描述了用衣殼蛋白檢測(cè)樣本中抗WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白抗體的存在來(lái)鑒定受到WNV或相關(guān)的黃病毒或瘟病毒感染的個(gè)體的方法。衣殼蛋白優(yōu)選在人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的。個(gè)體樣本中衣殼蛋白的定量可用于決定感染個(gè)體的病情預(yù)斷。
            
本發(fā)明描述了分離的衣殼蛋白。該衣殼蛋白優(yōu)選在人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞生產(chǎn)的。
            
本發(fā)明描述了用于鑒定受WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒感染的個(gè)體的試劑盒，該試劑盒包括第一個(gè)裝有與特異結(jié)合WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白的抗體的容器和第二個(gè)裝有衣殼蛋白的容器。該衣殼蛋白優(yōu)選在人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的。該抗體優(yōu)選可封閉衣殼蛋白的，在人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)的抗體。該試劑盒可用于對(duì)個(gè)體樣本中的抗衣殼蛋白抗體的含量鑒定。這些信息可用于決定感染個(gè)體的病情預(yù)斷。
            
檢測(cè)WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白和抗WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白抗體的試劑盒對(duì)研究、診斷和病情預(yù)斷都是有用的。
            
檢測(cè)待測(cè)樣本中蛋白或抗體的存在的方法是常規(guī)的，一個(gè)具有普通技能的技術(shù)人員可使用已知的方法檢測(cè)蛋白或抗體的存在與否。一個(gè)已知的檢測(cè)蛋白或抗體存在的方法是結(jié)合試驗(yàn)。一個(gè)具普通技能的技術(shù)人員能輕松的用多種方式來(lái)實(shí)施檢測(cè)蛋白或抗體存在的結(jié)合試驗(yàn)。比如，抗體可用于檢測(cè)或定量特異蛋白的免疫試驗(yàn)?？乖部捎糜跈z測(cè)或定量特異抗體的免疫試驗(yàn)。一些免疫試驗(yàn)包括使待測(cè)樣本中的蛋白與一個(gè)固相支持結(jié)合或與固定于固相支持上的抗體結(jié)合。再加入能選擇性的結(jié)合目的蛋白或者非組合的抗體的可檢測(cè)抗體。檢測(cè)可檢測(cè)抗體的結(jié)果表明如果可檢測(cè)抗體是特異于蛋白的，則目的蛋白的存在；如果可檢測(cè)抗體是特異于非組合的抗體，則不含目的蛋白。一些免疫試驗(yàn)包括使待測(cè)樣本中的抗體結(jié)合于固定在固相支持中的抗原，并使用能特異結(jié)合于目的抗體或抗原的抗體檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。多種免疫試驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)80年代免疫試驗(yàn)，A.Voller等編寫，Park大學(xué)(1981)Immunoassaysfor the 80’s，A.Voller et al.，eds，.University Park(1981)，文獻(xiàn)在此處列出作為參考。
            
待測(cè)樣本與固相支持接觸時(shí)可發(fā)生簡(jiǎn)單結(jié)合試驗(yàn)，任何結(jié)合到固相支持上的待測(cè)樣本中存在的蛋白都能被一特異的可檢測(cè)抗體制備物檢測(cè)。這種技術(shù)是點(diǎn)雜交，western雜交和其它類似試驗(yàn)的本質(zhì)。待測(cè)樣本中存在的特異抗體也能用類似的方式檢測(cè)。特異抗體結(jié)合的靶蛋白與待測(cè)樣本接觸，然后與其抗體結(jié)合，如果待測(cè)樣本存在這種結(jié)合，專業(yè)人士可用多種已知的方法對(duì)靶蛋白進(jìn)行分析。任何存在于待測(cè)樣本中的抗體與固相支持結(jié)合，并用可檢測(cè)抗原和特異的可檢測(cè)抗體制備物進(jìn)行檢測(cè)。
            
其它免疫試驗(yàn)可以是更加復(fù)雜的但能準(zhǔn)確提供好結(jié)果的。典型的和優(yōu)選的免疫測(cè)定試驗(yàn)包括檢測(cè)蛋白的“前項(xiàng)”試驗(yàn)，其中結(jié)合在固相支持上第一個(gè)抗蛋白抗體與待測(cè)樣本進(jìn)行接觸。經(jīng)過(guò)合適的溫育期后，清洗固相支持以除去未結(jié)合蛋白。再加入第二個(gè)特異于特定蛋白的部分區(qū)域而，該區(qū)域并不被第一抗體識(shí)別的直接抗蛋白抗體。第二抗體優(yōu)選為可檢測(cè)的。第二次溫育使可檢測(cè)抗體與通過(guò)第一抗體結(jié)合到固相支持上的特異蛋白形成復(fù)合物。第二次清洗固相支持以除去未結(jié)合的可檢測(cè)抗體。或者，第二抗體可是不可檢測(cè)的。在這種情況下，在該體系加入能與第二抗體結(jié)合的第三可檢測(cè)抗體，這種“前項(xiàng)夾心式”試驗(yàn)可以是一種決定結(jié)合是否發(fā)生的簡(jiǎn)單的是或否的試驗(yàn)，或者是一種通過(guò)比較可檢測(cè)抗體的測(cè)量值和從對(duì)照中獲得的測(cè)量值來(lái)定量的試驗(yàn)。這種“雙位點(diǎn)”或“夾心”試驗(yàn)見(jiàn)參考文獻(xiàn)Wide，放射免疫分析方法，Kirkham編寫，E.和S.Livingstone，Edinburgh(1970)199-206頁(yè)Wide，Radioimmune Assay Method，Kirkham，ed.，E & S.Livingstone，Edinburgh(1970)pp.199-206。
            
“前項(xiàng)”試驗(yàn)可應(yīng)用于存在于待測(cè)樣本中的抗體，以后可稱為“樣本抗體”的檢測(cè)。樣本抗體結(jié)合的特異靶蛋白結(jié)合在固相支持上，并且與待測(cè)樣本進(jìn)行接觸。經(jīng)過(guò)一段合適的溫育期后，清洗固相支持以除去未結(jié)合的樣本抗體。加入能結(jié)合樣本抗體Fc區(qū)域的第一抗體。這個(gè)第一抗體優(yōu)選可檢測(cè)的?；蛘?，在第一抗體是不可檢測(cè)的情況下，必須用與第一抗體結(jié)合的第二抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合。經(jīng)過(guò)第二個(gè)合適的、使可檢測(cè)的抗體與結(jié)合在靶蛋白/固相支持上的樣本抗體形成復(fù)合物的溫育期后，清洗固相支持以除去未結(jié)合的可檢測(cè)的抗體。這種“前項(xiàng)夾心”試驗(yàn)也可是一種決定結(jié)合是否發(fā)生的簡(jiǎn)單的是或否的試驗(yàn)，也可以是通過(guò)比較可檢測(cè)抗體的測(cè)量值和從對(duì)照中獲得的測(cè)量值來(lái)進(jìn)行定量的試驗(yàn)。
            
其它免疫測(cè)定試驗(yàn)類型是所謂的“同時(shí)的”或“反向”試驗(yàn)。同時(shí)的試驗(yàn)包括一次溫育步驟使第一抗體與固相支持結(jié)合，同時(shí)加入可檢測(cè)的第二抗體和待測(cè)樣本。當(dāng)溫育結(jié)束后，清洗固相支持以除去未結(jié)合的蛋白。結(jié)合于固相支持相可檢測(cè)抗體存在的檢測(cè)方法同傳統(tǒng)的“前項(xiàng)夾心式”試驗(yàn)一樣。這種同時(shí)的試驗(yàn)可適用于檢測(cè)待測(cè)樣本中抗體的類似方式。
            
“反向”試驗(yàn)包括逐步的，向待測(cè)樣本中加入可檢測(cè)抗體的溶液進(jìn)行溫育，再加入結(jié)合于固相支持的抗體再進(jìn)行一次溫育。用傳統(tǒng)的方式清洗固相支持以除去未結(jié)合的蛋白/抗體復(fù)合物和未反應(yīng)的可檢測(cè)的抗體。然后，和在“同時(shí)的”和“反向”試驗(yàn)進(jìn)行判定一樣，對(duì)聯(lián)系在固相支持上的可檢測(cè)的抗體進(jìn)行判定。反向試驗(yàn)也可適用于檢測(cè)待測(cè)樣本抗體的類似方式。
            
免疫測(cè)定試驗(yàn)的第一個(gè)組合物可以加在能固定蛋白的尼龍膜或其它固相支持上。鑒定待測(cè)樣本中WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白存在的第一個(gè)組合物為抗衣殼蛋白抗體，而檢測(cè)待測(cè)樣本中抗衣殼蛋白抗體存在的第一個(gè)組合物是衣殼蛋白?！肮滔嘀С帧被颉爸С帧笔侵溉魏慰梢越Y(jié)合蛋白的材料。已知的固相支持包括玻璃片、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然的或修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。天然的支持物既能是在一定程度上是可溶的，也可針對(duì)本發(fā)明的目的是不可溶的。支持物的形狀可為球形，如圓珠形或圓柱形，也可如試管的內(nèi)表面形或桿的外表面形。或者表面為扁平的，比如薄層或檢測(cè)條等形狀。專業(yè)人士了解許多其它適合的用于蛋白結(jié)合的固相支持，或者能通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)的使用對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)。一個(gè)優(yōu)選的固相支持為96孔微孔板。
            
在這種情況下，為了檢測(cè)蛋白的存在，可使用衣殼蛋白或者抗衣殼蛋白抗體，可檢測(cè)抗體如抗衣殼蛋白抗體或者抗人抗體。已有一些檢測(cè)抗體的已知的方法。
            
檢測(cè)抗體的一個(gè)方法是將抗體與一個(gè)酶連接，繼而在酶免疫測(cè)定(EIA)或者酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，如捕獲性ELISA中使用該抗體。然后加入酶的底物，酶與底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)能用分光光度計(jì)測(cè)量法，熒光測(cè)定法或肉眼觀察的等方式檢測(cè)的化合物。用于抗體可檢測(cè)的標(biāo)記的酶可以是蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-類固醇異構(gòu)酶，酵母乙醇脫氫酶，α-甘油磷酸脫氫酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，天冬酰氨酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，尿素酶，過(guò)氧化氫酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的酶。
            
另一個(gè)抗體能被檢測(cè)的方法是將抗體與放射性同位素連接后用于放射免疫測(cè)定(RIA)見(jiàn)參考文獻(xiàn)，如，Work，T.S.等，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物化學(xué).North Holland出版社公司，紐約(1978)Work，T.S.et al.，Laboratory Techniques and Biochemisty in Molecular Biology.NortbHolland Publishing Co.，NY(1978)。放射性同位素可用γ計(jì)數(shù)器或閃爍掃描計(jì)數(shù)器等方式進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)本發(fā)明特別有用的同位素是3H，125I，131I，35S和14C。優(yōu)選的同位素是125I。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的放射性同位素。
            
也可能用熒光化合物來(lái)標(biāo)記抗體。當(dāng)適合波長(zhǎng)的光線照射熒光標(biāo)記的抗體時(shí)，通過(guò)檢測(cè)其發(fā)出的熒光可檢測(cè)它的存在。最通用的熒光標(biāo)記化合物為異硫氰酸熒光系，羅丹明，藻紅蛋白，藻青蛋白，別藻藍(lán)蛋白，臨苯二醛和熒光胺。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的熒光化合物。
            
標(biāo)記有熒光發(fā)射金屬如152Eu或其它稀土屬金屬的抗體也是可檢測(cè)的。這些金屬通過(guò)使用金屬螯合基團(tuán)如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)而粘附上特異蛋白的抗體。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的熒光發(fā)射金屬和其它可使用的金屬螯合基團(tuán)。
            
標(biāo)記有化學(xué)發(fā)光化合物的抗體也是可檢測(cè)的?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體的存在可通過(guò)檢測(cè)一系列化學(xué)反應(yīng)中發(fā)出的冷光的存在進(jìn)行鑒定。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物如氨基苯二酰肼，異氨基苯二酰肼，吖啶酯，咪唑，吖啶鹽和草酸脂。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的化學(xué)發(fā)光化合物。
            
同樣，一些生物發(fā)光物質(zhì)也可用于標(biāo)記抗體。生物光物質(zhì)是一種在生物系統(tǒng)中找到的活性發(fā)光物質(zhì)，在該系統(tǒng)中催化蛋白能增加活性發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可通過(guò)檢測(cè)冷光的存在來(lái)鑒定?？捎糜跇?biāo)記的重要生物發(fā)光物質(zhì)為熒光素，熒光素酶和鈣敏感蛋白。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的生物發(fā)光物質(zhì)。
            
如果可檢測(cè)標(biāo)記為放射性γ發(fā)射物時(shí)，蛋白特異的抗體、抗體片段或衍生物可通過(guò)閃爍掃描計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)?；蛘撸绻麡?biāo)記物為一熒光物質(zhì)時(shí)，可通過(guò)熒光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。在用酶進(jìn)行標(biāo)記的情況下，使用酶的底物，并用比色計(jì)的方法進(jìn)行檢測(cè)。也可參照類似的已設(shè)標(biāo)準(zhǔn)肉眼比較底物的酶促反應(yīng)程度。專業(yè)人士能容易的識(shí)別其它也可用的、適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。
            
可根據(jù)已知的方法鑒定一給定的大量抗體的結(jié)合活性。專業(yè)人士能通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)容易的鑒定各種鑒定試驗(yàn)的操作和優(yōu)化試驗(yàn)條件。
            
在試驗(yàn)中需分別加入含已知量的蛋白的正對(duì)照和沒(méi)有蛋白的負(fù)對(duì)照。專業(yè)人士應(yīng)該有必要的使用適合的對(duì)照的知識(shí)。為了鑒定待測(cè)樣本中衣殼蛋白或抗衣殼蛋白抗體的量，需將待測(cè)樣本中檢測(cè)的蛋白量與正對(duì)照中檢測(cè)的蛋白量進(jìn)行比較。根據(jù)正對(duì)照的值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣本的蛋白量可從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷而得。專業(yè)人士應(yīng)該具有構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線和推斷待測(cè)樣本值的知識(shí)。
            
待測(cè)樣本包括那些從懷疑感染W(wǎng)NV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒的個(gè)體中得到的樣本，可由血液，大腦腦髓液，羊水，淋巴液，精液，陰道的液體或其它體液組合物。待測(cè)樣本也可包括實(shí)驗(yàn)室制備的，如那些用于研究目的的樣本。如果存在細(xì)胞，可用離心或裂解的方法除去。專業(yè)人士能容易的鑒別多種用于檢測(cè)衣殼蛋白或抗衣殼蛋白抗體的待測(cè)樣本。待測(cè)樣本可通過(guò)用注射針或棉簽取出體液等方法獲得。專業(yè)人士能容易的鑒別其它獲得待測(cè)樣本的方法。
            
抗體組合物是指檢測(cè)蛋白所需的一種或多種抗體。比如，用于檢測(cè)待測(cè)樣本中衣殼蛋白的抗體組合物包括結(jié)合衣殼蛋白的第一抗體和分別結(jié)合第一抗體或第二抗體的第二或第三可檢測(cè)的抗體。
            
用標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣本中抗衣殼蛋白抗體的存在。在一定體積的緩沖液中的10-15μg/ml的衣殼蛋白被加入到固相支持，如96孔微孔板上，每孔加入50μl。溫育固相支持足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間后，磷酸緩沖液(PBS)清洗以除去未結(jié)合的衣殼蛋白。比如，適合的溫育時(shí)間為室溫下2小時(shí)或4℃過(guò)夜。固相支持再用含BSA的PBS溶液封閉以防止待測(cè)樣本中的蛋白非特異的結(jié)合在固相支持上。固相支持中加入系列稀釋的待測(cè)樣本后再溫育一段足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間。PBS清洗固相支持以除去未結(jié)合的蛋白。再在固相支持混合物中加入識(shí)別人抗體Fc區(qū)域的標(biāo)記抗人抗體。溫育平板足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間后用PBS清洗以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗人抗體。結(jié)合的標(biāo)記抗人抗體的量既而通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定?？谷丝贵w可用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗體，按使用說(shuō)明以1 12,000的比例使用。
            
用如以下所述的標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定試驗(yàn)來(lái)檢查待測(cè)樣本中衣殼蛋白的存在。識(shí)別衣殼蛋白特異部位的，在一定體積的緩沖液中的第一抗衣殼蛋白抗體被加入到96孔微孔板上。溫育平板足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間后，PBS清洗以除去未結(jié)合的抗衣殼蛋白抗體。再用含BSA的PBS溶液封閉平板以防止待測(cè)樣本中的蛋白非特異的結(jié)合在微孔板上。每孔加入系列稀釋的待測(cè)樣本后溫育平板一段足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間。PBS清洗每個(gè)孔以除去未結(jié)合的蛋白。在每孔中加入識(shí)別衣殼蛋白的區(qū)域而并不被第一抗衣殼蛋白抗體識(shí)別的標(biāo)記的抗衣殼蛋白抗體。溫育平板足夠結(jié)合發(fā)生的時(shí)間后用PBS清洗以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗衣殼蛋白抗體。結(jié)合的標(biāo)記抗衣殼蛋白抗體的量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。以11000的比例使用識(shí)別衣殼蛋白的兔抗衣殼蛋白抗體。適合的溫育條件的例子為室溫下2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
            
用于檢測(cè)待測(cè)樣本中衣殼蛋白的試劑盒包括固相支持，正對(duì)照和負(fù)對(duì)照，緩沖液，適合的抗衣殼蛋白抗體和同前所述的實(shí)施捕獲性ELLSA的說(shuō)明書。用于檢測(cè)待測(cè)樣本中抗衣殼蛋白抗體的試劑盒包括固相支持，正對(duì)照和負(fù)對(duì)照，緩沖液，衣殼蛋白和同前所述的實(shí)施捕獲性ELLSA的說(shuō)明書。
            
盡管公開(kāi)的關(guān)于藥物成分和方法的部分主要是描述治療人的藥物和方法，但本發(fā)明的成分和方法也能當(dāng)作獸藥使用。治療非人類動(dòng)物的方法和治療人的一樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明描述了治療所有動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物如人，牛，羊，豬，馬，狗和貓的方法。
            
本發(fā)明進(jìn)一步用一些試圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明的例子進(jìn)行舉例說(shuō)明。這些例子和對(duì)它們的解釋并不是用于限制本發(fā)明的范圍。很清楚，本發(fā)明還可應(yīng)用于除了以下描述的特例外的其它方面。各種本發(fā)明的修改和變更都可能參考本文的各種條款，因此它們都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
            
實(shí)施例1構(gòu)建衣殼蛋白的表達(dá)根據(jù)紐約1999病毒人體提取物(WNV-HNY1999)中報(bào)道的多聚蛋白基因序列(GenBank序列號(hào)AF202541，Jia et al，.1999，Lancet，3541971-1972)，構(gòu)建了兩個(gè)WNV衣殼蛋白(Cp)的表達(dá)載體(pWNVh-DJY和pWNVy-DJY)。WNV-HNY1999的基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1的上半部分。載體構(gòu)建的框架見(jiàn)圖1的下半部分。每個(gè)構(gòu)建載體都含Cp蛋白開(kāi)放閱讀框及其前面所融合的來(lái)源于人IgE(sIgE)的信號(hào)肽(前導(dǎo)序列)編碼序列，并去掉了Cp蛋白的第一個(gè)氨基酸的編碼序列(去掉了第一個(gè)氨基酸(met))。用含三次分別PCR擴(kuò)增反應(yīng)的重疊PCR的方法構(gòu)建重組克隆，并使用設(shè)計(jì)的，使在最終的構(gòu)建載體序列引入物種優(yōu)化密碼子的引物對(duì)Kim等，1997，基因，199293-301(Kim et al，，1997，Gene，199293-301)。pWNVh-DJY含有整個(gè)融合sIgE信號(hào)肽/Cp蛋白編碼序列的人優(yōu)化密碼子。pWNVy-DJY含有整個(gè)信號(hào)肽/Cp蛋白前6個(gè)氨基酸(由于除去了第一個(gè)氨基酸，所以為Cp蛋白氨基酸殘基2-7)的酵母優(yōu)化密碼子和剩余Cp蛋白編碼序列的人優(yōu)化密碼子。此外，使用PCR引物，在信號(hào)肽編碼序列的上游引入了一適合的Kozak序列。每個(gè)編碼序列都克隆進(jìn)入pcDNA3.1/V5-HisC表達(dá)載體(Invitrogen，San Diego，CA)的HindIII和NotI多克隆位點(diǎn)之間以形成表達(dá)載體，該載體在CMV啟動(dòng)子的控制下的表達(dá)Cp-His融合蛋白。每個(gè)構(gòu)建載體表達(dá)相同的蛋白序列，包括融合于WNV的Cp蛋白2-123氨基酸及其之前的氨基端sIgE前導(dǎo)肽和之后的V5表位序列和多聚組氨酸的羧基端。
            
以下為重疊PCR構(gòu)建過(guò)程中所使用的10個(gè)引物引物1.sIgh-VChU1+(90堿基)ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCCGCCACCCGCGTGCACAGCTCTAAGAAACCAGGAGGCCCCGGCAAGAGCCGCGCC(SEQ ID NO14).  
            
引物2.sIgy-VCyU1.1+(90堿基)ATGGATTGGACTTGGATCTTATTTTTAGTTGCTGCTGCTACTAGAGTTCATTCTTCTAAAAAACCAGGTGGCCCCGGCAAGAGCCGCGCC(SEQ ID NO15).  
            
引物3.sIgh-VChL1-(88堿基)GGCTCAGCATGGCGCGCTTCAGGCCAATCAGGCTCAGCACGCGGGGCATGCCGCGCTTCAGCATGTTCACGGCGCGGCTCTTGCCGGG(SEQ ID NO16).  
            
引物4.sIgh-VChU2+(90堿基)GGCCTGAAGCGCGCCATGCTGAGCCTGATCGACGGCAAGGGCCCCATACGCTTCGTGCTGGCCCTGCTGGCCTTCTTCCGCTTCACCGCC(SEQ ID NO17).  
            
引物5.sIgh-VChL2-(89堿基)GGTGCTTCATGGCGGTCTGCTTGTTCACGCCGCGCCAGCGGTCCAGCACGGCGCGGGTGGGGGCAATGGCGGTGAAGCGGAAGAAGGCC(SEQ ID NO18).  
            
引物6.sIgh-VChU3+(89堿基)CCGCCATGAAGCACCTGCTGAGCTTCAAGAAGGAGCTGGGCACCCTGACCAGCGCCATCAACCGCCGCAGCAGCAAGCAGAAGAAGCGC(SEQ ID NO19).  
            
引物7.sIgh-VChL3-(81堿基)CGCGCCCACGCTGGCGATCAGGCCAATCATCACGGCAATGCCGGTCTTGCCGCCGCGCTTCTTCTGCTTGCTGCTGCGGCG(SEQ ID NO20).  
            
引物8.sIgh-VChFS1+(39堿基)  
            
CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATCCTG(SEQ ID NO21).  
            
引物9.sIgy-VCyFS1.1+(33堿基)CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGACTTGG(SEQ ID NO22).  
            
引物10.sIgh-VChFAS2-(37堿基)ATAGTTTAGCGGCCGCGCCCACGCTGGCGATCAGGCC(SEQ ID NO23).  
            
三套PCR擴(kuò)增引物按以下順序配對(duì)以產(chǎn)生三個(gè)重疊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物1和3(對(duì)pWNVh-DJY進(jìn)行擴(kuò)增)或引物2和3(對(duì)pWNVy-DJY進(jìn)行擴(kuò)增)，引物4和5，引物6和7。每套引物都使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行自退火和延伸。最后的全長(zhǎng)的插入片段用含引物8和10的引物對(duì)(產(chǎn)生pWNVh-DJY的插入片段)或用含引物9和10的引物對(duì)(產(chǎn)生pWNVy-DJY的插入片段)進(jìn)行擴(kuò)增，并隨之帶有HindIII(5′端)和NotI(3′端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些最終的插入片段用HindIII和NotI進(jìn)行酶切后，克隆進(jìn)入HindIII/NotI雙酶切的pcDNA3.1/V5-HisC載體。產(chǎn)生的重組載體(pWNVh-DJY和pWNVy-DJY)都需經(jīng)測(cè)序證實(shí)。圖2和圖5分別描述了pWNVh-DJY和pWNVy-DJY的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖3和圖6分別描述了pWNVh-DJY和pWNVy-DJY的特征圖譜。圖4和圖7分別描述了pWNVh-DJY和pWNVy-DJY全長(zhǎng)的和注釋的核苷酸序列。
            
實(shí)施例2由pWNVh-DJY和pWNVy-DJY表達(dá)的WNV衣殼蛋白的生物性質(zhì)在組織培養(yǎng)的細(xì)胞中由pWNVh-DJY and pWNVy-DJY表達(dá)的Cp蛋白磷酸鈣沉淀法將2μg純化的質(zhì)粒DNA(pWNVh-DJY或pWNVy-DJY)轉(zhuǎn)染接種于雙槽載波片上的HeLa，RD或293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，固定細(xì)胞并與鼠抗His抗體溫育后再與FITC偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體溫育。紫外顯微鏡檢測(cè)基因的表達(dá)。Cp蛋白的表達(dá)均可在三種含pWNVh-DJY和pWNVy-DJY的細(xì)胞系中獲得，并且蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。使用FITC濾光片進(jìn)行的轉(zhuǎn)染pWNVh-DJY的RD細(xì)胞Cp蛋白表達(dá)的免疫熒光分析揭示代表Cp蛋白定位的綠色熒光。FITC和羅丹明雙濾光片可捕獲以區(qū)分特異的和背景信號(hào)的圖像。在雙濾光片下的綠色熒光證實(shí)了Cp蛋白的存在。DAPI濾光片可用于顯示DAPI(4′，6-二乙?；?2-苯基吲哚)染色的細(xì)胞核，并且在光域下DAPI濾光片捕獲的圖像揭示了細(xì)胞的形態(tài)。
            
WNV衣殼蛋白的體外翻譯使用TNT-T7偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)制備35S標(biāo)記的蛋白產(chǎn)物。加入10μl放射性標(biāo)記的蛋白樣品和1μl抗His(C末端)抗體(Invitrogen，San Diego，CA)到300μl RIPA緩沖液中并輕柔的混勻。4℃溫育90min后，在蛋白-抗體復(fù)合物中加入終濃度為5μg每管的蛋白A-瓊脂糖微珠(LKB-Pharmacia Biotech)，樣品在旋轉(zhuǎn)搖床上4℃溫育90min。RIPA緩沖液清洗微珠3次，懸浮微珠于2xSDS樣品緩沖液中。簡(jiǎn)單煮沸以從瓊脂糖微珠中洗脫免疫沉淀蛋白復(fù)合物，并在15％的SDS-PAGE上進(jìn)行分析。比較蛋白樣品與商業(yè)用的14C-甲基化分子量標(biāo)記(Sigma)的遷移率。用1M水楊酸鈉短暫處理凝膠后，用凝膠干燥儀干燥使凝膠得以固定。干膠過(guò)夜在X光片(Kodak)上曝光。體外翻譯的蛋白的分子量為21.5kDa(見(jiàn)圖8)。
            
實(shí)施例3表達(dá)于pWNVh-DJY和pWNVy-DJY的WNV衣殼蛋白的免疫反應(yīng)評(píng)估多肽通過(guò)能夠預(yù)測(cè)抗原決定區(qū)域和親水區(qū)域的MacVector軟件選擇得到了三個(gè)WNV Cp蛋白的氨基酸序列的組織相容性(MHC)II分子限制表位。使用標(biāo)準(zhǔn)多肽合成法合成這些多肽，請(qǐng)序列如下多肽名稱  WNV Cp蛋白殘基數(shù)氨基酸序列 序列號(hào)WNVC-P1 2-23 SKKPGGPGKSRAVNMLKRGMPRSEQ ID NO6WNVC-P231-49 KRAMLSLIDGKGPIRFVLA   SEQ ID NO7WNVC-P3   90-111 TLTSAINRRSSKQKKRGGKTGISEQ ID NO8圖8描述這些多肽在WNV Cp蛋白中的排布。
            
體外翻譯的蛋白使用不含放射性成分的TNT-T7偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)，按實(shí)施例2所述的方法也可產(chǎn)生非放射性的體外翻譯的Cp蛋白。使用體外翻譯試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)中不含表達(dá)插入片段的pcDNA3.1載體作為體外翻譯的對(duì)照。
            
小鼠的DNA接種為了估量針對(duì)WNV Cp基因產(chǎn)物的T細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，建立了一套小鼠體內(nèi)試驗(yàn)。在6周或8周齡的雌性BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)的四頭肌內(nèi)注射100μg在PBS中的pWNVh-DJY，pWNVy-DJY或者pcDNA3.1(無(wú)插入片段)和0.25％鹽酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)。兩周后，小鼠接受另一次100μg DNA的放大注射。放大注射13天后，殺死小鼠收集脾臟，分離淋巴細(xì)胞以用于細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)。
            
淋巴增值試驗(yàn)每組免疫小組取兩只小鼠收集脾臟淋巴細(xì)胞并按5×106細(xì)胞/ml的濃度懸浮。立即在96孔平底微孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入含5×105細(xì)胞的100μl懸浮液。在各孔內(nèi)加入終濃度為5μg/ml和1μg/ml的重組多肽、體外翻譯蛋白或體外翻譯對(duì)照(體外翻譯蛋白和體外翻譯對(duì)照蛋白的終濃度為0.5μg/ml)。用伴刀豆球蛋白A(Con A)作為正增值對(duì)照。設(shè)立三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)條件。細(xì)胞在37℃，5％CO2中溫育3天。每孔中加入1μCi的3H胸苷，37℃溫育細(xì)胞18h。收集平板中的細(xì)胞后在Beta平板測(cè)量?jī)x上測(cè)量3H參入量(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。通過(guò)以下公司鑒定刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)＝(試驗(yàn)發(fā)生的計(jì)數(shù)/自然發(fā)生的計(jì)數(shù))自然發(fā)生的計(jì)數(shù)小孔包含作為不相關(guān)的蛋白對(duì)照的5％的胎牛血清。結(jié)果見(jiàn)表1。
            
從pWNVy-DJY或pWNVh-DJY(“H”或“Y”)免疫小鼠中分離的脾細(xì)胞與WNVC-P3(“多肽3”)或三個(gè)全部的Cp多肽混合物(“多肽123”)進(jìn)行溫育后所得到的SI值比從基本載體pcDNA3.1免疫的小鼠小組分離的脾細(xì)胞所得的SI值高的多。
            
表1  
            
     
            
表1陳述了淋巴增值試驗(yàn)的結(jié)果。每個(gè)條件下所述的值均為三個(gè)小孔的平均刺激指數(shù)值。針對(duì)每個(gè)免疫待測(cè)小組，脾細(xì)胞是從小組內(nèi)的兩只小鼠中收集來(lái)的?！癏”是指從pWNVh-DJY免疫小組中提取的脾細(xì)胞?！癥”是指從pWNVy-DJY免疫小組中提取的脾細(xì)胞。“pcDNA3.1”是指從pcDNA3.1免疫小組中提取的脾細(xì)胞。多肽1，2和3是指上面描述的WNVC-P1，WNVC-P2和WNVC-P3多肽?！岸嚯?23”是指多肽1，2和3的混合物?！癥蛋白”是指pWNVy-DJY重組子體外翻譯的Cp蛋白。“對(duì)照蛋白”是指如上所述的，由不含表達(dá)插入片段的pcDNA3.1載體的體外表達(dá)對(duì)照。
            
流式血球技術(shù)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)γ-干擾素的檢測(cè)在圓底96孔平板的每個(gè)小孔中加入100μl添加了5％小牛血清(FBS)的，含50U/ml重組人白介素2(rHuIL-2)(Intergen，Purchase，NY)，10μg/ml布雷菲德菌素A(BD PharMingen，San Diego，CA)，100ng/ml乙酸豆塞外佛波酯(PMA)(Sigma，St，Louis，MO)，和1μg/ml離子霉素(Sigma)的RPMI-1640溶液(R5培養(yǎng)基)。體外翻譯的Cp蛋白或?qū)φ盏鞍装?μg/ml的濃度加入到50μl的R5培養(yǎng)基中。加入蛋白抗原(Ag)以后，每孔加入50μl含1×106個(gè)提取的脾細(xì)胞的R5培養(yǎng)基。為了補(bǔ)償流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，從天然小鼠中提取的脾細(xì)胞只與白介素2和布雷菲德菌素A溫育。平板在37℃，5％CO2孵箱中溫育5-6小時(shí)。不含抗原溫育的脾細(xì)胞作為對(duì)照。溫育后，平板在1200rpm離心5min，除去上清。每孔的細(xì)胞用200μl添加1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS懸浮，冰上放置15min后1200rpm離心，用50μl含0.1μg PE結(jié)合的抗CD4抗體和0.1μg CyC結(jié)合的CD44抗體(均來(lái)自BD PharMingen，SanDiego，CA)的PBS/1％BSA重懸。4℃溫育30min后，用PBS/1％ BSA清洗細(xì)胞兩次，吸取細(xì)胞并用100μl Cytofix/Cytoperm溶液(BD PharMingen，SanDiego，CA)重懸，4℃溫育20min。用一倍的Perm/Wash(BD PharMingen，SanDiego，CA)清洗細(xì)胞2次，再用50μl含0.1μg每個(gè)樣品的濃度的藻膽蛋白(APC)結(jié)合的抗γ-干擾素抗體(BD PharMingen，San Diego，CA)的Perm/Wash溶液懸浮細(xì)胞。4℃溫育30min后，用一倍的Perm/Wash溶液清洗細(xì)胞兩次，多聚甲醛固定后4℃保存直到用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析。
            
CD44的表達(dá)可作為活化標(biāo)記。CD44是廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞中的一種細(xì)胞粘連受體。BALB/c小鼠含相對(duì)較多的CD44H+T細(xì)胞子集。在外圍，CD44表達(dá)水平隨著B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和記憶細(xì)胞的活化而增加，這種細(xì)胞可通過(guò)其CD44hi表型(CD44H異型的高效表達(dá))進(jìn)行鑒定。
            
CD4+T細(xì)胞依賴性IFN-γ的產(chǎn)生可通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行定量。圖11陳述的結(jié)果表明了對(duì)從基本載體pcDNA3.1或者Cp蛋白表達(dá)載體pWNVh-DJY或pWNVy-DJY免疫的小鼠中提取的脾細(xì)胞的抗原特異的IFN-γ反應(yīng)的結(jié)果，從pWNVy-DJY免疫小鼠中提取的脾細(xì)胞比起從pWNVh-DJY免疫小鼠中提取的脾細(xì)胞，在體外翻譯的Cp蛋白的刺激下能表達(dá)更高水平的IFN-γ。
            
實(shí)施例4TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)凋亡在HeLa細(xì)胞，RD細(xì)胞和293細(xì)胞三個(gè)不同的細(xì)胞系中，個(gè)體細(xì)胞的凋亡可通過(guò)TUNEL試驗(yàn)鑒定。pWNVh-DJY或pWNVy-DJY構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可用TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)其凋亡。在三個(gè)細(xì)胞系中兩種構(gòu)建載體都能誘導(dǎo)凋亡。
            
TUNEL試驗(yàn)可使用“原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒，熒光素”(Roche MolecularBiochemicals，Indianapoils，IN)，按照使用說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)。DNA的切割都可由末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)通過(guò)熒光素-dUTP標(biāo)記的基因組DNA的游離3′-羥基端進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞固定后，用添加0.1％Triton-X，0.1％檸檬酸鈉的PBS進(jìn)行滲透，然后細(xì)胞與含TdT和熒光素-dUTP的“TUNEL反應(yīng)混合物”一起溫育。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)摻入的熒光素偶聯(lián)的dUTP。
            
使用不同的顯微鏡濾光片獲得數(shù)據(jù)以鑒定特異信號(hào)。由FITC濾光片顯示的綠色的信號(hào)代表凋亡細(xì)胞中摻入的熒光素。用FITC和羅丹名雙濾光片捕獲圖象以區(qū)別特異的凋亡信號(hào)和背景信號(hào)。在雙濾光片下的綠色熒光反映了摻入的熒光素-dUTP的真實(shí)熒光信號(hào)。DAPI濾光片顯示了細(xì)胞中被DAPI染色的核苷酸。并不是所有細(xì)胞都是TUNEL陽(yáng)性。在光域中DAPI濾光片捕獲的圖像揭示了細(xì)胞的形態(tài)，表明發(fā)生凋亡的細(xì)胞的核已經(jīng)收縮。
            
類似的結(jié)果可在含pWNVy-DJY構(gòu)建載體的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤(ATCC #CRL-2266)中獲得。
            
實(shí)施例5膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析用含增強(qiáng)的熒光蛋白(EGFP)的pEGFP2-N1(Clontech)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞為轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)，或者用pEGFP2-N1與pWNVh-DJY或pWNVy-DJY的重組載體共同轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染兩天后，細(xì)胞用藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V進(jìn)行染色。染色的細(xì)胞用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析。膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的細(xì)胞群體可從EGFP陽(yáng)性事件的門檻值開(kāi)始進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用CellQuest軟件獲得所需數(shù)據(jù)。用WNV-Cp處理的細(xì)胞所發(fā)生的凋亡相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的提高了10倍(見(jiàn)圖13)。
            
實(shí)施例6WNV Cp蛋白凋亡誘導(dǎo)區(qū)域的分析實(shí)施例3和圖11中所描述的多肽WNVC-P3被用于檢測(cè)其誘導(dǎo)培養(yǎng)中的細(xì)胞凋亡的能力。多肽WNVC-P3與SH-SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC；Manassas，VA)按10μg多肽每1×105細(xì)胞的濃度進(jìn)行溫育。24小時(shí)后，用TUNEL試驗(yàn)進(jìn)行分析。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞可從用WNVC-P3處理的細(xì)胞中鑒定，而不能從胰腺特異性抗原(PSA)的對(duì)照多肽處理的細(xì)胞中鑒定。
            
實(shí)施例7pCWNVCp免疫誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)為調(diào)查DNA疫苗產(chǎn)生的體內(nèi)免疫反應(yīng)水平，用pCWNVCp或?qū)φ召|(zhì)粒pCDNA3肌內(nèi)注射免疫小鼠。在0，4和8周時(shí)，向6-8星期母BALB/c小鼠(HarlanSprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)的四頭肌中注射含每種100μg目的DNA重組載體的磷酸緩沖液(PBS)和0.25％布比卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)。在注射前和注射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，小鼠進(jìn)行眼眶取血，收集血清以用于以后的分析。收集的血清樣品按1 100，1 400，1 800和1 1600的比例稀釋，用ELLSA分析反應(yīng)于Cp多肽(WNVC-P3TLTSAINRRSSKQKKRGGKTGI)的特異性抗體。按前所述的，參考文獻(xiàn)Kim等，1988，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞通過(guò)趨化因子的表達(dá)控制抗原特異性免疫反應(yīng)，臨床調(diào)查雜志，1021112-1124(Kim et al.，1998，CD8 positive T cells controlsantigen-specific immune responses through the expression of chemokines.J.Clin.Invest.，1021112-1124)的方法，將以10μg/ml濃度稀釋于PBS中的50μl WNVC-P3加入微孔板的微孔中4℃過(guò)夜。PBS-0.05％Tween-20清洗平板，并用含3％BSA的PBS-Tween-20 37℃封閉1小時(shí)。鼠抗血清用0.05％Tween進(jìn)行稀釋，并在37℃溫育1小時(shí)，再用HRP-偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)進(jìn)行溫育。清洗平板后，用3’3’5’5’TMD(Sigma)緩沖液顯色。
            
注射前血清(0天收集的)并不表現(xiàn)任何的Cp特異性抗體反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。用pCDNA3對(duì)照免疫的小鼠不表現(xiàn)Cp特異抗體反應(yīng)，但用pCWNVCp免疫的小鼠中可檢測(cè)到有效的抗體反應(yīng)(圖12A)。值得注意的是，DNA免疫產(chǎn)生的Cp特異抗體反應(yīng)水平比從ATCC(Manassas，VA)獲得的陽(yáng)性超免疫小鼠血清的Cp特異抗體反應(yīng)水平更有效。
            
此外，DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的WNVCp特異IgGs的亞族是可鑒定的。據(jù)報(bào)道，IgG1同種型由Th2性細(xì)胞因子誘導(dǎo)，而IgG2a同種型由Th1型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)見(jiàn)參考文獻(xiàn)Finkelman等，1990，淋巴因子控制的體內(nèi)免疫球蛋白同種型選擇，免疫綜述年鑒，8303-333(Finkelman et al.，1990，Lymphokinecontrol of in vivo immunoglobulin isotype selection，Ann.Rev.Immunol.，8303-333)。為了鑒定Cp特異IgG亞族的相對(duì)水平，用HRP偶聯(lián)的抗鼠IgG1和IgG2a(Zymed，San Francisco，CA)替換抗鼠IgG-HRP。接著再加入ABTS底物溶液(Chemicon，Temecula，CA)。在每步中，平板用清洗緩沖液(PBS+0.05％Tween-20)清洗3次。平板用Dynatech MR5000平板讀數(shù)儀讀取450nm的光密度。如圖12B所示，大多數(shù)用pCWNVCp進(jìn)行DNA免疫產(chǎn)生的IgG反應(yīng)是IgG2a同種型反應(yīng)。這種強(qiáng)烈的Th1型偏差可通過(guò)IgG2a的放大和IgG2a與IgG1的相對(duì)比例來(lái)鑒定。
            
WNVCp-特異血清抗體可通過(guò)免疫沉淀/Western雜交分析進(jìn)行鑒定。體外翻譯的不帶放射性同位素的WNVCp蛋白可用抗6組氨酸(C末端)多克隆抗體(MBL，Nagoya，Japan)進(jìn)行免疫沉淀，并在15％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到切成小條的PDVF膜(Millipore)上。每條與pCWNVCp或pCDNA3免疫小鼠的小鼠免疫血清(1 100稀釋)進(jìn)行溫育，并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的抗鼠IgG以1 2000的濃度進(jìn)行雜交。在浸潤(rùn)后，膜條用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Amersham)進(jìn)行顯色(圖12C)。
            
實(shí)施例8pCWNVCp免疫誘導(dǎo)有效的抗原特異Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子水平反映了免疫反應(yīng)的指示和放大。刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的Th1(IFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4)型細(xì)胞因子水平是可檢測(cè)的。IFN-γ作為原型Th1型細(xì)胞因子主要由CD4+Th1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生。刺激T細(xì)胞表達(dá)的IFN-γ水平反映了T細(xì)胞反應(yīng)的放大。IL-2是主要由外界刺激活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的Th1型細(xì)胞因子；它對(duì)抗原特異的T細(xì)胞的增殖和克隆擴(kuò)增是很關(guān)鍵的見(jiàn)參考文獻(xiàn)Morgan等，1976，正常人骨髓T淋巴細(xì)胞的選擇性體外生長(zhǎng)，科學(xué)，1931007-1008(Morgan et al.，1976，Selective invitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrwos，Science，1931007-1008)。另一方面，IL-4是一種在B細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)中起支配性作用的原型Th2型細(xì)胞因子見(jiàn)參考文獻(xiàn)Seder和Paul，1994，通過(guò)CD4+T細(xì)胞獲得的淋巴因子產(chǎn)生表型，免疫綜述年鑒，12635-673 Seder & Paul，1994，Acquisition of lymphokine-producing phenotype by CD4+T cell.Annul.Rev.mmunol.，12635-673)。
            
免疫后CD4+T幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)水平也是可檢測(cè)的。每?jī)芍芊謩e向小鼠進(jìn)行兩次DNA免疫(每次100μg)。第二次注射后一星期時(shí)，殺死小鼠，收集脾臟。從脾臟中收集淋巴細(xì)胞，并通過(guò)除去紅細(xì)胞和用新鮮培養(yǎng)基清洗三次來(lái)制備效應(yīng)細(xì)胞，見(jiàn)參考文獻(xiàn)Kim等，1997，通過(guò)共刺激分子基因共傳遞的DNA免疫的體內(nèi)免疫反應(yīng)，自然生物技術(shù)，15641-646(Kim et al.，1997，Engineering of in vivo immune responses to DNA immunization viaco-delivery of costimulatory molecule genes，Nat.Biotechnol.，15641-646)。分離的懸浮細(xì)胞以5×106細(xì)胞/ml的濃度重懸。吸取100μl含5×105細(xì)胞的重懸液立即加入到96孔平底微孔板的每個(gè)小孔中。WNV衣殼蛋白特異多肽庫(kù)(WNVC-P1SKKPGGPGKSRAVNMLKRGMPR；WNVC-P2KRAMLSLIDGKGPIRFVLA；WNVC-P3TLTSAINRRSSKQKKRGGKTGI)以終濃度為5μg/ml的濃度一式三份加入到小孔中。在5％CO2，37℃下溫育細(xì)胞4天。在第四天收集細(xì)胞上清并用于使用ELISA試劑盒(Biosource，Camarillo，CA；R&DSystems，Minneapolis，MN)的細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)IFN-γ，IL-2或IL-4的釋放。
            
如圖13所示，在pCWNVCp免疫小鼠中可觀察到有效表達(dá)水平的IFN-γ和IL-2，而對(duì)照免疫小鼠中只觀察到背景水平。另一方面，所有免疫小組的IL-4釋放水平是類似的。這些結(jié)果表明DNA疫苗會(huì)導(dǎo)致在免疫小鼠中誘導(dǎo)特異的和有效的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。
            
實(shí)施例9用pCWNVCp免疫誘導(dǎo)趨化因子MIP-1β和RANTES的抗原特異性產(chǎn)生通過(guò)檢測(cè)刺激T細(xì)胞β-趨化因子(MIP-1β和RANTES)的表達(dá)情況可延伸疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的性質(zhì)。趨化因子對(duì)免疫和感染反應(yīng)起重要的調(diào)節(jié)作用。它們對(duì)于淋巴細(xì)胞從導(dǎo)管運(yùn)輸?shù)剿拗鞯挚沟耐獠课稽c(diǎn)的分子調(diào)節(jié)起特別重要的作用。已有報(bào)道T細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子對(duì)細(xì)胞免疫擴(kuò)大起關(guān)鍵作用見(jiàn)上面的Kim等1998，臨床研究雜志，(Kim et al.，1998，J.Clin.Invest.，supra)；和參考文獻(xiàn)Kim等，2000，巨細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)能體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，吸引樹(shù)突細(xì)胞，人類基因治療，11305-321(Kim et al.，2000，Macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) can modulate immuneresponses and attract dendritic cells in vivo，Human Gene Therapy，11305-321)。因此，由刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子水平能提供額外的對(duì)抗原特異細(xì)胞免疫反應(yīng)水平和質(zhì)量的洞察。按實(shí)施例8中描述的方法刺激的T細(xì)胞的上清可用于用ELISA試劑盒(Biosource，Camarillo，CA；R&D Systems，Minneapolis，MN)檢測(cè)β-趨化因子MIP-1β和RANTES的釋放情況。用pCWNVCp疫苗免疫比用對(duì)照載體免疫能顯著地誘導(dǎo)更高水平的MIP-1β和RANTES(圖14)。這些pCWNVC免疫動(dòng)物的pMIP-1β和RANTES水平的增加更加支持上述的pCWNVCp免疫誘導(dǎo)抗原特異T細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)論。
            
實(shí)施例10pCWNVCp免疫誘導(dǎo)一抗原特異的CTL反應(yīng)免疫后抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的水平也是可檢測(cè)的。如前Kim等，1997，自然生物技術(shù)，上面(Kim et al.，Nat.Biotechnol.，supra)所述的方法實(shí)行5小時(shí)51Cr釋放體積CTL分析實(shí)驗(yàn)，并在測(cè)量特異和非特異多肽處理目標(biāo)所釋放的Cr之前對(duì)效應(yīng)脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激。在CTL培養(yǎng)基中的含5×106細(xì)胞/ml的效應(yīng)脾細(xì)胞可用WNV衣殼多肽庫(kù)(KGPIRFVL(SEQID NO24)，GGPGKSRA(SEQ IN NO25)和IAPTRAVL(SEQ ID NO26))以10μg/ml的濃度進(jìn)行體外刺激5天。CTL培養(yǎng)基包括RPMI 1640(Gibco-BRL，GrandIsland，NY)，10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％無(wú)Con A的RAT-T-STIM(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)。多肽處理目標(biāo)可用與10μg/ml濃度的多肽庫(kù)溫育的P815鼠肥大細(xì)胞瘤(ATCC，Manassas，VA)制備。靶細(xì)胞用100μCi/ml Na251CrO4標(biāo)記120min，再與刺激效應(yīng)脾細(xì)胞在37℃溫育6h。CTL裂解在效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞(ET)為100 1和50 1比例下測(cè)定。特異裂解的百分比可按公式測(cè)定100×(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)最大釋放可由含1％Triton X-100培養(yǎng)基中靶細(xì)胞的裂解來(lái)測(cè)定。如果“自發(fā)釋放”計(jì)數(shù)值超過(guò)“最大釋放”的20％，該分析實(shí)驗(yàn)認(rèn)為是無(wú)效的。特異殺死的背景水平可從用pCDNA3免疫的對(duì)照動(dòng)物中觀察到。然而，在效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞(ET)為100 1和50 1時(shí)，用pCWNVCp免疫動(dòng)物表明陽(yáng)性CTL活性(圖15A)。此外，用于CTL分析實(shí)驗(yàn)體外刺激效應(yīng)細(xì)胞的上清的分析證實(shí)了pCWNVCp免疫小鼠中IFN-γ水平的增加(圖15B)。
            
實(shí)施例11pCWNVCp免疫誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向免疫動(dòng)物的肌肉內(nèi)滲入HIV和HSV DNA免疫模式中疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的放大與在疫苗注射位點(diǎn)上細(xì)胞滲入的水平有很好的相關(guān)性見(jiàn)上面的Kim等，2000，人類基因治療，(Kim et al.，2000，Human Gene Therapy，supra)；參考文獻(xiàn)Chattergoon等，2000，通過(guò)工程化的Fas介導(dǎo)的調(diào)亡傳遞靶抗原到包括樹(shù)突細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞，自然生物技術(shù)，18974-979(Chattergoon et al.，2000，Targeted antigen delivery to antigen-presenting cells includingdendritic cells by engineered Fas-mediated apoptosis，Nat.Biotechnol.，18974-979)和Agadjanyan等，1999，CD86(B 7-2)能起體內(nèi)驅(qū)動(dòng)MHC限制性抗原特異細(xì)胞殺傷性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)當(dāng)功能，免疫雜志，1623417-3427(Agadjanyan et al.，1999，CD86(B7-2) can function to driveMHC-restricted-antigen-specific cytotoxic T lymphocyte responses invivo，J.Immuol.，1623417-3427)。為進(jìn)一步調(diào)查pCWNVCp免疫誘導(dǎo)的免疫活化的有效性，在注射位點(diǎn)檢測(cè)免疫小鼠肌肉組織的免疫組化。
            
用含100μg pCWNVCp或pCDNA3的磷酸緩沖液(PBS)和0.25％吡比卡因-HCl肌肉內(nèi)注射(進(jìn)入腔骨肌)6至8周的母Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories，Inc.，Wilmington，MA)。轉(zhuǎn)染48h后，收集腔骨肌。再將新鮮的肌肉組織凍于O.C.T.化合物(Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance，CA)中。用Leica 1800冷凍切片機(jī)得到4微米的冷凍切片。為了檢測(cè)肌肉中淋巴細(xì)胞的存在，用蘇木精和曙紅(H&E)染液(Vector Labs)染色切片。在尼康OPTIPHOT熒光顯微鏡(Nikon Inc.，Tokyo，Japan)下用40倍物鏡(Nikon Fluo 40X Ph3d2)觀察切片。切片成像可用尼康UFX-II曝光控制下的尼康照相機(jī)FX35DX和柯達(dá)Ektachrome 160T膠片獲得。圖16B表明免疫細(xì)胞顯著的滲入到pCWNVCp免疫小鼠的肌肉中。
            
通過(guò)FACS分析對(duì)滲入細(xì)胞進(jìn)行定性。按上面的Kim等，2000，人類基因治療，(Kim et al.，2000，Human Gene Therapy，supra)所述的方法，從全腿肌肉中解剖肌肉并機(jī)械切碎，從中收集滲入細(xì)胞。用帶玻璃羊毛塞子的漏斗過(guò)濾回收細(xì)胞。按前面所述的Kim等，2000，人類基因治療，(Kim et al.，2000，Human Gene Therapy，supra)和參考文獻(xiàn)Chattergoon等，1990，免疫學(xué)雜志，1605707-5718(Chattergoon et al.，1990，J.Immunol.，1605707-5718)所述的方法，用CD4，CD8，Mac-3，CD11c，CD86和B220(Pharmingen)抗體通過(guò)FACS鑒定滲入細(xì)胞。樣本通過(guò)Coulter EPICSXL-MCL流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。pCWNVCp免疫小鼠中獲得到滲入細(xì)胞包括T細(xì)胞(CD4+和CD8+)和巨噬細(xì)胞(用抗Mac 3抗體檢測(cè))(圖16C)。免疫肌肉中高水平的CD4+和CD8+T細(xì)胞為高水平T細(xì)胞的活化提供了進(jìn)一步證據(jù)。另一方面，從pCDNA3(對(duì)照)免疫小鼠中獲取得肌肉切片并不表現(xiàn)任何細(xì)胞滲入的跡象?？偠灾?，這些結(jié)果證實(shí)DNA接種能有效的產(chǎn)生抗原特異免疫反應(yīng)。
            
實(shí)施例12WNV衣殼蛋白與其它黃病毒衣殼蛋白的比對(duì)圖17顯示了WNV Cp蛋白與其它黃病毒，包括kunjin病毒(KJV)，日本腦炎病毒(JEV)和登革熱病毒(DEN2)的衣殼蛋白部分的比對(duì)結(jié)果，表明這些蛋白間有很高的相同性。
            
實(shí)施例13WNV Cp蛋白誘導(dǎo)通過(guò)線粒體途徑的體內(nèi)和體外調(diào)亡在不存在其它WNV基因產(chǎn)物時(shí)，西尼羅病毒Cp蛋白在組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)快速的核收縮和細(xì)胞死亡。調(diào)亡是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)的，因?yàn)橛^察到的線粒體膜位變化與Caspase 9活化和下游Caspase 3活化是相伴隨的。此外，通過(guò)消除突變分析鑒定調(diào)亡決定區(qū)域位于WNV Cp蛋白的3’末端。肌肉內(nèi)注射WNVCp表達(dá)盒后，可清楚地觀察到肌肉組織的調(diào)亡。更重要的是，WNV Cp基因向鼠腦的紋狀體內(nèi)的傳遞導(dǎo)致體內(nèi)由衣殼蛋白誘導(dǎo)調(diào)亡引起的細(xì)胞死亡。這些研究表明WNV衣殼蛋白的調(diào)亡級(jí)聯(lián)的誘導(dǎo)作用是造成病毒發(fā)病機(jī)理方面的原因，并且支持抑制這種調(diào)亡功能可用于開(kāi)發(fā)有效的治療WNV感染的治療途徑的想法。此外，WNV衣殼蛋白與一已知的HIV-1 vpr基因產(chǎn)物的調(diào)亡誘導(dǎo)區(qū)域有序列上的相同性/同源性。見(jiàn)參考文獻(xiàn)Ayyavoo等，1997，自然藥物，31117-1123(Ayyavoo et al.，1997，Nat.Med.，31117-1123)；Stwart等，1997，病毒學(xué)雜志，715579-5592(Stwart et al.，1997，J.Virol.，71”5579-5592)(圖18和19)實(shí)施例14WNV Cp蛋白和HIV Vpr蛋白與其它調(diào)亡相關(guān)病毒蛋白的比較  
            
Medline搜查“調(diào)亡”，“腦炎”和“腦膜炎”可得到一系列感染個(gè)體為這種病癥的各種病毒。這些病毒蛋白的氨基酸序列與WNV衣殼蛋白或HIV-189.6Vpr蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較。
            
與WNV衣殼蛋白的比對(duì)(圖19)1.HIV-1-WNV衣殼蛋白和一已知調(diào)亡誘導(dǎo)蛋白HIV-1 Vpr享有的序列同源。
            
2.單純皰疹病毒(HSV)-主要HSV衣殼蛋白部分與WNV Cp蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明可能的調(diào)亡誘導(dǎo)能力。有趣的是，腦炎的破壞已被暗示與疾病的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。
            
3.埃博拉病毒是黃病毒家族黃病毒種中的一員。這種病原體被指出能誘導(dǎo)出血性發(fā)熱。WNV衣殼蛋白和埃博拉病毒核衣殼蛋白的比對(duì)表明在WNV和nef調(diào)亡區(qū)有可檢測(cè)的氨基酸同源性。與WNV衣殼蛋白的糖蛋白比對(duì)也顯示原調(diào)亡區(qū)域同源性。
            
4.風(fēng)診病毒是被膜病毒家族的一員，已被指出在體外標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)誘導(dǎo)調(diào)亡。風(fēng)疹病毒衣殼蛋白的序列比對(duì)表明與WNV衣殼蛋白，還有HIV-1 Vpr蛋白(見(jiàn)圖19)和Tat蛋白的調(diào)亡區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)有同源性。與HIV-1 89.6 Vpr蛋白比對(duì)(圖19)1.新德畢斯病毒-公布數(shù)據(jù)報(bào)告了新德畢斯病毒的調(diào)亡性質(zhì)，特別是引導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡。新德畢斯病毒p230非結(jié)構(gòu)蛋白與HIV-1 Vpr蛋白和與Tat蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)的比對(duì)表明在Bcl-2相關(guān)的調(diào)亡區(qū)域的單獨(dú)同源性。有趣的是，最近公布數(shù)據(jù)暗示通過(guò)Bax新德畢斯調(diào)亡的抑制。
            
2.黃瓜花葉病毒-以期公布報(bào)道已暗示黃瓜花葉病毒能誘導(dǎo)通過(guò)壞死完全的細(xì)胞殺傷。然而，最近的數(shù)據(jù)表明西紅柿中調(diào)亡性質(zhì)與細(xì)胞死亡相關(guān)。有趣的是，我們的Vpr 89.6與CMV 2A蛋白的序列比對(duì)也顯示調(diào)亡區(qū)域的同源性。與Tat HIV基因的比較也認(rèn)為與CMV衣殼蛋白有原調(diào)亡同源性。
            
3.HTLV-比較這種病毒與HIV-1 Tat蛋白為這種病毒的調(diào)亡誘導(dǎo)能力提供了可能的觀點(diǎn)。Tat與HTLV-1 p27蛋白的序列比對(duì)展示了調(diào)亡區(qū)域的序列同源性。
            
4.Nipah病毒-這種病毒是副粘病毒家族的一員，能高效使人致死。最近爆發(fā)是在新加坡，因此增加了轉(zhuǎn)移到美國(guó)的可能性。此外，病毒看起來(lái)與西尼羅病毒和其它目標(biāo)為腦脊髓液，并造成神經(jīng)腦炎的病毒有類似的臨床結(jié)果。比較Nipah病毒融合蛋白與HIV 89.6 Vpr蛋白得到一個(gè)有趣的相關(guān)性。在Nipah融合蛋白的細(xì)胞循環(huán)停滯區(qū)域可見(jiàn)到很強(qiáng)的同源性。這種表面蛋白可是一種強(qiáng)有力的DNA疫苗競(jìng)爭(zhēng)者；所指的意思是它在調(diào)亡發(fā)展中和細(xì)胞周期停滯中起關(guān)鍵作用。
            
5.呼腸病毒-呼腸病毒誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的TRAIL依賴性調(diào)亡和細(xì)胞周期在G2/M期停滯。在呼腸病毒次核形式Mu2蛋白與HIV 89.6 Vpr蛋白之間有同源性。
            
上述實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明，并不是用于限制本發(fā)明的。專業(yè)人士可識(shí)別在本發(fā)明本質(zhì)和范圍內(nèi)的修改。
            
權(quán)利要求
            
1.一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，其中含有下列步驟將分離出來(lái)的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段與細(xì)胞進(jìn)行接觸，上述衣殼蛋白或其功能性片段的使用量能有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；或者在上述細(xì)胞中引入有黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的編碼核苷酸序列的核酸分子，上述核酸分子并不存在于黃病毒或瘟病毒的整個(gè)病毒基因組中，其所含的上述的核苷酸序列在上述細(xì)胞中表達(dá)且其表達(dá)水平能有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
            
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為所用的衣殼蛋白或其功能性片段或核酸分子是從日本腦炎病毒亞屬中的一種病毒中分離出來(lái)的。
            
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為所用的衣殼蛋白或其功能性片段或核酸分子是從西尼羅病毒(WNV)中分離出來(lái)的。
            
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征為所用的功能性片段包含SEQ ID NO8所述的氨基酸序列。
            
5.如權(quán)利要求3所述的方法中，其特征為所用的核酸分子序列所編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO8。
            
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為所用的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
            
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為與細(xì)胞接觸的是黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段。
            
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為被引入所述細(xì)胞的是核酸分子。
            
9.一種鑒定能抑制黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化合物的方法，包括的步驟有a)當(dāng)存在待測(cè)物時(shí)，將細(xì)胞與黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段進(jìn)行接觸，衣殼蛋白或其功能性片段的使用量必須足夠使其誘導(dǎo)死亡的細(xì)胞數(shù)目可被檢測(cè)出；b)將步驟a)所檢測(cè)的細(xì)胞凋亡數(shù)目與不存在上述待測(cè)組合物時(shí)，細(xì)胞與黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段接觸時(shí)所引起的凋亡數(shù)目進(jìn)行比較。
            
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征為與細(xì)胞接觸的是黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白。
            
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征為與細(xì)胞接觸的是黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的功能性片段。
            
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征為所用的功能性片段包含SEQ IDNO8所述的氨基酸序列。
            
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征為所用的細(xì)胞是從含HeLa細(xì)胞，RD細(xì)胞和293細(xì)胞中的一種。
            
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征為所用的檢測(cè)步驟是一種檢測(cè)凋亡標(biāo)記物的分析方法。
            
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征為所用的標(biāo)記物是磷脂酰絲氨酸(PS)或游離3′-羥基DNA末端。
            
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征為所用的檢測(cè)方法是TUNEL法或膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析法。
            
17.一種實(shí)行權(quán)利要求9所述方法的試劑盒，包括a)一個(gè)含黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的容器；和b)使用說(shuō)明書，正對(duì)照，負(fù)對(duì)照，描述數(shù)據(jù)的照片，和數(shù)據(jù)圖中至少一項(xiàng)作為附加成分。
            
18.一個(gè)可注射的藥物組合物，其中包含a)病毒和瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段，或者含有黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的編碼核苷酸序列的核酸分子；和b)一個(gè)可藥用的載體。
            
19.如權(quán)利要求18所述的可注射用的藥物組合物，其中包含a)含有黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的核苷酸序列的核酸分子；和b)一個(gè)可藥用的載體。
            
20.如權(quán)利要求18所述的可注射藥用組合物，其中包含a)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段；和b)一個(gè)可藥用的載體。
            
21.如權(quán)利要求18所述的可注射藥用組合物，其中包含a)WNV衣殼蛋白或其功能性片段；和b)一個(gè)可藥用的載體。
            
22.一種治療已確診的或被懷疑患有以細(xì)胞高度增生為特征的疾病的個(gè)體的方法，其中包括給上述個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求18中所述的可注射藥用組合物。
            
23.一種治療已確診的或被懷疑患有以細(xì)胞高度增生為特征的疾病的個(gè)體的方法，其中包括給上述個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求19中所述的可注射藥用組合物。
            
24.一種治療已確診的或被懷疑患有以細(xì)胞高度增生為特征的疾病的個(gè)體的方法，其中包括給上述個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求20中所述的可注射藥用組合物。
            
25.一種治療已確診的或被懷疑患有具有不希望的細(xì)胞為特征的疾病的方法，其中包括通過(guò)給上述個(gè)體施用有效劑量的權(quán)利要求18所述的可注射藥用組合物來(lái)消除上述不希望的細(xì)胞。
            
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征為所用的衣殼蛋白或其功能性片段是WNV衣殼蛋白或其功能性片段。
            
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征為所指的疾病是癌癥。
            
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征為給藥途徑是在腫瘤內(nèi)注射可注射的藥用組合物。
            
29.一種鑒定感染黃病毒或瘟病毒的個(gè)體的方法，其中包含下列步驟1)將抗黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的抗體與個(gè)體樣本進(jìn)行接觸；2)檢測(cè)上述抗體是否結(jié)合于樣本中的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，其中檢測(cè)到與抗體的結(jié)合的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白是個(gè)體感染黃病毒或瘟病毒的癥狀指示。
            
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征為所述的衣殼蛋白是WNV衣殼蛋白。
            
31.一個(gè)鑒定個(gè)體被黃病毒或瘟病毒感染的試劑盒，其中包含a)第一個(gè)裝有抗黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的特異抗體的容器；和b)第二個(gè)裝有黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其功能性片段的容器。
            
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其特征為所述的第一個(gè)容器中裝有特異于WNV衣殼蛋白的抗體，第二個(gè)容器中裝有WNV衣殼蛋白或其功能性片段。
            
33.一種鑒定個(gè)體是否被黃病毒或瘟病毒感染的方法，包括的步驟有a)將樣本與黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白進(jìn)行接觸；和b)檢測(cè)在上述樣本中的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白是否與抗體結(jié)合。其中檢測(cè)到與黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的結(jié)合抗體是個(gè)體被黃病毒或瘟病毒感染的病征指示。
            
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征為所述的病毒是指WNV，衣殼蛋白是指WNV衣殼蛋白。
            
35.一種鑒定個(gè)體受黃病毒或瘟病毒感染的試劑盒包括a)第一個(gè)裝有黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白的容器；和b)第二個(gè)裝有與黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白特異結(jié)合抗體的容器。
            
36.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其特征為所述的衣殼蛋白是WNV衣殼蛋白。
            
37.一種疫苗組合物，其中包含a)有效免疫劑量的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段；和b)一個(gè)藥用的載體。
            
38.如權(quán)利要求37所述的疫苗，其特征為所述的黃病毒或瘟病毒的衣殼蛋白或其免疫原片段是指WNV的衣殼蛋白或其免疫原片段。
            
39.一種疫苗組合物，其中包含a)黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸；和b)一個(gè)藥用的載體。
            
40.如權(quán)利要求39所述的疫苗，其特征為所述的核苷酸為WNV衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸。
            
41.一種治療感染黃病毒或瘟病毒個(gè)體的方法，其治療方法為施用有治療效果劑量的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段，或黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸。
            
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征為所述的感染個(gè)體的病毒是WNV病毒，所用的衣殼蛋白或其功能性片段，或衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸是從WNV中得到的。
            
43.一種保護(hù)個(gè)體不受黃病毒或瘟病毒感染的方法，該法為施用具有預(yù)防效果的劑量的黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段，或黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸。
            
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征為所述的個(gè)體保護(hù)所抵抗的病毒是WNV，所述的衣殼蛋白或其免疫原片段，或衣殼蛋白或其免疫原片段的編碼核苷酸是來(lái)自WNV。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供一種使用黃病毒或瘟病毒衣殼蛋白，比如西尼羅病毒(WNV)衣殼蛋白，和其功能性片段來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。本發(fā)明也提供通過(guò)施用WNV或其編碼序列藥物組合物治療遭受細(xì)胞擴(kuò)增性疾病的方法。并揭示了鑒定具有抗病毒和/或抗WNV和/或抗黃病毒或抗瘟病毒衣殼蛋白或其它蛋白活性的復(fù)合物的方法。本發(fā)明還提供了包含WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒衣殼蛋白或其它蛋白，或其功能性片段，或者編碼其的核酸分子和一個(gè)藥用載體的疫苗組合物。本發(fā)明也進(jìn)一步提供了鑒定個(gè)體遭受WNV或包括黃病毒或瘟病毒的其它病毒感染的診斷方法和試劑盒。
            
文檔編號(hào)A61P37/02GK1549730SQ01819929 
            
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2001年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月4日
            
發(fā)明者大衛(wèi)·B.·威那, 梁周成, 大衛(wèi) B. 威那 申請(qǐng)人:賓西法尼亞大學(xué)托管人
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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