具有抗血管生成和基質金屬蛋白酶抑制活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物的制作方法

專利名稱：具有抗血管生成和基質金屬蛋白酶抑制活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物的制作方法
背景技術：
(a)發明領域本發明涉及一種包含蜂花屬植物葉提取物的組合物，其具有對血管生成和基質金屬蛋白酶的抑制活性。
詳細地，本發明涉及包含蜂花屬植物葉提取物作為活性成分的組合物，其可被用作藥品，食品或化妝品來治療或預防血管生成-和/或MMP-依賴性的疾病。
(b)相關技術的描述蜂花屬植物(蜜蜂花)，一種唇形科植物，作為常用名和俗名，也被稱為密里薩香草(lemon balm)，香蜂草(balm)或水腫植物(dropsy plant)。
蜜蜂花的主要成分是揮發性油(香葉醛，橙花醛，香茅，里哪醇，香葉醇，牻牛兒乙酸酯，香茅甲酯(methyl citronellate)，反式-β-羅勒烯，大根香葉烯(germacren)，丁子香酚)，咖啡酸衍生物，類黃酮類，三萜烯類，兒茶酸類和單寧類。迷迭香酸，咖啡酸的一種衍生物，是蜂花屬植物葉提取物的最豐富的成分(約4.7％)，已知其具有抗炎的活性。
蜂花屬植物是可食用和藥用的。新鮮的葉子可加到色拉中和用于制作魚、家禽和豬肉調味料。干燥的或新鮮的全植物用來使飲料涼爽提神或溫熱令人放松的茶葉(relaxing tea)，其對發熱，感冒和頭痛是有效的。作為一種備選藥物，它適于鎮靜神經，緩解痛經、失眠、抑郁、甲狀腺機能亢進、肚子痛和嬰兒疝痛。它是抗菌藥，解痙藥，抗病毒藥，驅風劑，發汗劑，助消化劑，通經藥，退熱藥，鎮靜劑和補藥。近來，蜂花屬植物的葉提取物已包含于血液循環活化劑，其有助于外周血管的擴張。新鮮的碾碎葉涂敷到傷口和昆蟲叮咬處。蜂花屬植物的油通常加到皮膚制劑和香料中。精油通常在香料按摩中使用(Cohen RA，Kucera LS，Herrmann EC Jr.，Proc Soc Exp Biol Med 117，431-434，1964；Kucera LS，Cohen RA和Herrmann EC Jr，Ann.NYAcad Sci 130，474-82，1965)。
血管生成是產生新的微血管的過程。這是由于被活化的預先存在的內皮細胞增殖產生的。血管再生被嚴格地調節，并且活化僅在胚胎發育、組織重新再造，傷口愈合和產生黃體的循環周期中發生(Folkman和Cotran，Relation of vascular proliferation to tumor growth，Int Rev Exp Pathol 16 207-248，1976)。
與身體中的其它類型細胞相比，內皮細胞生長非常緩慢。然而，如果這些細胞的增殖被對血管生成的無效調節所誘導，則產生某些病理狀況(Timar，J Pathol Oncol Res 6，85-94，2001)。在很多疾病中涉及病理的血管生成。例如，心血管疾病如血管瘤，血管纖維瘤，血管畸形，動脈粥樣硬化，粘連和edemic硬化；和眼科疾病如角膜植入后的血管再生，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，糖尿病性視網膜病，血管原性角膜疾病，黃斑變性，翼狀胬肉，視網膜變性，晶體后纖維組織增生，和顆粒性結膜炎涉及血管生成。慢性炎癥疾病如關節炎；皮膚病如牛皮癬，毛細管擴張，膿性肉芽腫，皮脂溢性皮炎和痤瘡也是血管生成依賴性的。
特別地，血管生成對于癌癥的轉移和生長是必需的(D’Amato RJ和Adamis AP，Ophthalmol 102，1261-1262，1995；Arbiser JL，J Am Acad Derm34，486-497，1996；O’Brien K.D.等.Circulation 93，672-682，1996；HanahanD和Folkman J，Cell 86，353-364，1996)。新血管不僅對快速生長的癌細胞提供營養素和氧氣，而且提供進入血流導致轉移的通路(Polverini P.J.，Critical Reviews in Oral Biology，6，230-247，1995)。目前，大量的化學療法和免疫療法用于治療癌癥，但由于缺乏抗轉移作用，治療的效率是有限的，并且沒有療法可以成功地延長癌癥患者的生命。
關節炎，一種眾所周知的炎性疾病，是作為一種自身免疫性疾病發病的。然而，在滑液腔中血管內皮細胞的生長被炎性細胞因子活化，其最終破壞軟骨的清晰度(Kocb AE，Polverini PJ和Lcibovich SJ，Arth Rheum29，471-479，1986；Stupack DG，Storgard CM和Cheresh DA，Braz J Med BiolRcs 32，578-581，1999；Koch AE，Arthritis Rheum 41，951-962，1998)。
由于各種眼病，全世界有很多人喪失了視力。由于毛細管血細胞滲透到玻璃體液中，很多患者失明(Jeffrey MI和Takayuki A，J Clin Invest103，1231-1236，1999)。
牛皮癬是由于皮膚細胞的極度活性增殖引起的。快速生長的細胞需要充足的血液供應，并且在牛皮癬中血管生成被異常地誘導(Folkman J.，JInvest Dermatol 59，40-48，1972)。
如上所述，血管生成與很多疾病的引發和進展緊密相關。因此，血管生成的抑制劑可以是治療那些疾病的良好的備選物。為了防止和/或治療那些疾病，在開發血管生成抑制劑方面已做了很多努力。
由于組成即使單一腫瘤血管的個體細胞廣泛變化，用各種類型的抗血管生成的治療可提高癌癥治療的功效。對于最佳的抗血管生成治療，制備幾種血管生成抑制劑的混合物是理想的。
誘導血管生成的一個主要事件是在微血管形成前胞外基質的斷裂。基質降解的最重要的酶是基質金屬蛋白質酶(MMP)，一個超過20種酶的家族。MMP是內肽酶，其降解或蛋白酶解(proteolyze)胞外基質的成分例如膠原質，蛋白聚糖，和明膠，并被分為四組膠原酶，明膠酶，溶基質素，和膜-型MMP。MMP家族中的許多酶具有底物特異性。當需要胞外基質的重新再造時，在各種生理環境下誘導MMP的表達。(Curry TEJr，Osteen KG，Biol Repord 64，1285-1296，2001；Damjanovske S，Amano T，Li Q，Ueda S，Shi YB，Ishizuya-Oka A，Ann NYAcad Sci 926，180-191，2000；Ravanti L，Kahari VM，Int JMol Med 6，391-407 2000)在很多生理狀態下觀察到增加的MMP表達或活化，例如動脈粥樣硬化，阿爾茨海默氏病，皮膚老化，皺紋，關節炎，角膜潰瘍，蛋白尿，腹部主動脈瘤，消退的軟骨損傷，有髓神經損傷，肝纖維化，nephrogromerula病，胚膜破裂，炎性腸疾病，齦炎/牙周炎，老年性黃斑變性，視網膜病，斯耶格倫綜合癥，近視，角膜植入的排斥，血管生成和癌轉移(Woessner Jr.，Annals NY Acad Sci，732，11-21，1994；Warner等.，Am J Pathol，158，2139-44，2001；Stetler-Stevenson，Surg Oncol Clin N Am，10，383-92，2001)。
例如，溶基質素是已知斷裂軟骨的主要酶(Murphy，G.等，Biochem J，248，265-268，1987)。膠原酶，明膠酶和溶基質素導致很多視網膜病中胞外基質的降解(Bruns，F.R.等，Invest Opthalmol and Visual Sci，32，1569-1575，1989)。膠原酶和溶基質素是在發炎齒齦的成纖維細胞中被鑒定的，酶的活性依賴于炎癥的程度(Beeley，N.R.A.等，見上文；Overall，C.M.等，J Periodontal Res，22，81-88，1987)。
近來的報道也表明，MMP-1活性在阿爾茨海默氏病中被高度誘導，在疾病的病理生理過程中涉及MMP-2和MMP-3。(Leake A，Morris CM，&Whateley，J Neurosci Lett 291，201-3，2000；Yoshiyama Y，Asahina M，&Hattori T，Acta Neuropathol(berl)，99，91-5，2000)MMP也參與日光UV輻射誘導的皮膚損傷，影響導致過早老化的皮膚顏色和彈性。癥狀其中包括似革的肌理，皺紋，斑狀的色素沉著，松弛和菜色。因此，MMP抑制劑可包含在抗光老化的化妝品中或抗皺紋劑中(Hase T，Shinata K，Murase T，Tokimitsu I，Hattori M，Takimoto R，Tsuboi R和Ogawa H，Br J Dermatol 142，267-273，2000；Fisher GJ，Talwar HS，Lin J，Voorhees JJ，Photochem Photobiol 69，154-157，1999)。
由于MMP和血管生成抑制劑可用于治療許多疾病，期待開發血管生成抑制劑作為新的藥物。理想的抑制劑應不具有毒性或副作用，具有良好的患者順應性，因為抑制劑需要長時間的給藥。
因此，本發明提供了一種抗血管生成組合物，其包含作為活性成分的蜂花屬植物葉提取物，還包含或不含其它活性成分。
更具體地，本發明提供了一種用于藥物或飲食的抗血管生成組合物。
因此，本發明的組合物可用于治療或預防衍生自血管生成的疾病。
另外，本發明提供了一種抑制MMP的組合物，其包含作為活性成分的蜂花屬植物葉提取物，還包含或不含其它活性成分。
更具體地，本發明提供了一種用于藥物，飲食或化妝品的抑制MMP的組合物。
因此，本發明的組合物可用于治療或預防衍生自MMP的疾病。
圖2是顯示用25μg/ml的蜂花屬植物葉提取物處理的HUVEC圖片。
圖3是顯示在小鼠Matrigel模型中，蜂花屬植物葉提取物對血管生成的作用的圖。
圖4是顯示在小鼠Matrigel模型中，口服給藥蜂花屬植物葉提取物對血管生成的抑制的圖表。
圖5是顯示在絨膜尿囊膜試驗中，蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成作用的圖片(a對照，b處理)。
圖6是顯示蜂花屬植物葉提取物對MMP-1活性的抑制的圖。
圖7是顯示蜂花屬植物葉提取物對MMP-2活性的抑制的圖。
圖8是顯示蜂花屬植物葉提取物對MMP-9活性的抑制的圖。
本發明的詳述在下文中，將詳細解釋本發明。
本發明人已發現，本發明的蜂花屬植物葉提取物不僅在管形成試驗中，而且在CAM試驗和小鼠Matrigel模型中抑制血管生成。當口服給藥蜂花屬植物葉提取物時，它還抑制血管生成。
管道形成試驗是一種體外試驗方法，其與體內功效緊密相關，該試驗研究對形成微脈管網絡的人內皮細胞的移行和分化的影響。盡管CAM試驗是利用受精卵的體內試驗，但在小鼠Matrigel模型中，可定量測量血管生成。
另外，本發明人已發現蜂花屬葉提取物抑制MMP，一類血管生成和癌癥轉移的必需酶家族。當用MMP-1，MMP-2和MMP-9來研究蜂花屬植物葉提取物對MMP的作用時，它強烈地抑制所有這三種酶的活性。然而，蜂花屬植物葉提取物對MMP的抑制作用不局限于這三種酶。
因此清楚地，本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物以藥物或飲食應用，用作治療或預防依賴血管生成的疾病的抗血管生成劑。
因此同樣是清楚地，本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物以藥物、飲食或化妝品應用，用作MMP-抑制劑來治療或預防MMP-相關的疾病。
在本發明中使用的蜂花屬植物葉提取物可商購或用常規方法制備。也可使用商購的蜂花屬植物葉提取物。常規提取方法的實例如下。
簡單地說，向1kg的干蜂花屬植物葉中加入10-20L的含水醇(例如，甲醇，乙醇，丁醇等)或丙酮。在60-80℃的溫度下，提取該混合物30分鐘-2小時。可用其它溶劑(氯仿，乙酸乙酯，酮等)重復該提取過程2-3次。濃縮獲得的提取物以獲得蜂花屬植物葉提取物。
如上所述，本發明的蜂花屬植物葉提取物具有對血管生成和MMP活性的抑制作用。盡管MMP是導致血管生成的酶，但蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成活性不局限于MMP抑制活性。即，盡管MMP是誘導血管生成的一個因素，但蜂花屬植物葉提取物可抑制血管生成的其它因素。而且，蜂花屬植物葉提取物對MMP的抑制活性不局限于抑制血管生成。
本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它血管生成抑制劑的成分，例如噻氯匹定，葡糖胺(2-氨基-2-脫氧-D-guco吡喃糖)，七葉樹屬植物提取物和銀杏提取物，來治療和/或預防血管生成-和MMP-依賴性的疾病。我們先前已報道了商購的藥物組合物抑制血管生成，所述商購藥物組合物如七葉樹屬植物提取物(KR10-2001-66246)，葡糖胺和它的鹽(KR-10-2001-18675)，銀杏提取物(KR10-2000-45265)和噻氯匹定(KR10-2000-43589)。
這些商購藥物可與本發明的蜂花屬植物葉提取物共處理，以發揮組合物的作用。
具體地，用銀杏提取物或噻氯匹定聯合處理的蜂花屬植物葉提取物可用作轉移抑制劑。
本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它抗癌，抗炎和抗老化試劑的成分，如洋甘草(Glycyrrhiza glabra)，中國肉桂，槐(Sophora japonica)，關蒼術，茅蒼術(Atracylodes lancea)，茵陳蒿，桑(Morus alba)，蕺菜(Houttuynia cordata)，忍冬，旋復花(Inulajaponica)，歐亞旋復花，Paeonia albiflora，山芍藥(Paeonia japonica)，草芍藥(Paeonia obovata)，姜科(Curcuma domestica)，姜黃(Curcuma longa)，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀(Melilotus officinalis)，Agelicagigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬(Liriope Platyphylla)，姜，Ulmuscavidiana，大果榆(Ulmus macrocarpa)，山茶和葡萄。上述組合物可加到用于抗血管生成目的的藥物，準藥物，食品或飲料中。
上述成分的抗血管生成活性也被如先前提及的HUVEC的管道形成所證實。與非處理的對照HUVEC相比，50μg/ml的每種組合物對管道形成的抑制是30-100％。例如百分比抑制分別是中國肉桂100％，關蒼術51.7％，茵陳蒿53％，桑53％，黑果越桔40％，蕺菜30％，和山芍藥(Paeoniajaponica)38％。
包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的稀釋劑，所述稀釋劑包括葡萄糖，麥芽糖糊精，鹽水，緩沖的鹽水，水，甘油，和乙醇，但不限制稀釋劑。適當的稀釋劑列于Remington’s Pharmaceutical Science的書面正文中(Mack Publishing co，Easton PA)。
可以任何形式制備包含蜂花屬植物葉提取物的制劑。該制劑可被制成可注射的制劑(純溶液，混懸液或乳濁液)，和優選口服劑型(片劑，膠囊，軟膠囊，含水內服藥，丸劑，顆粒)和局部制劑(油膏，帖片，噴霧劑，溶液等)。
本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物可通過各種途徑給藥。給藥的途徑包括口服，靜脈內，腹膜內，皮下內，肌肉，動脈內，透皮，直腸，鼻，眼睛和局部施用。
可按照疾病和給藥途徑不同地施用本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物。可以理解活性成分的量由各種因素所決定。這些因素包括患者癥狀的嚴重程度，其它共同施用的藥物(如化學治療劑)，年齡，性別，個體患者的體重，食品，劑量給藥時間，給藥的選擇途徑，和組合物的比率。
蜂花屬植物葉提取物的日劑量優選5mg-2g，最優選10-1000mg。通常，可以每天單一劑量或2-3分開劑量的形式給藥0.1-200mg/kg蜂花屬植物葉提取物。
包含本發明蜂花屬植物葉提取物的化妝品組合物可用于治療光老化或皺紋。
下述實施例是意圖進一步解釋本發明。然而，所說明的這些實施例僅是為了更好地理解本發明，而不是限制它的范圍。<實施例1>
蜂花屬植物葉提取物購自Emil Flachsmann AG，用于下述實施例。<試驗1>蜂花屬植物葉提取物對HUVEC的管道形成的影響在體外，用人內皮細胞研究蜂花屬植物葉提取物對血管生成的影響。
為進行管道形成試驗，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)分離自剖腹產術后新鮮獲得的臍帶。培養細胞，并通過用抗因子VIII抗體染色的免疫細胞化學鑒定。用25μg/ml的實施例1的上述蜂花屬植物葉提取物(EmilFlachsmann AG)處理與Matrigel(BD Bioscience，Bedford，MA，美國)一同生長的HUVEC，并在37℃進一步孵育8-16小時。作為對照，不用蜂花屬植物葉提取物重復該程序。


圖1表示當它們在Matrigel上生長時，作為血管再生過程，形成管狀網絡。然而，如圖2所示，在Matrigel上HUVEC的微脈管網絡被蜂花屬植物葉提取物斷開。
圖2是用25μg/ml的蜂花屬植物葉提取物處理的，在Matrigel上生長的HUVEC，其表示微脈管網絡被斷開。
用圖象分析程序Image-Pro Plus(Media Cybemetics，美國)確定管道的面積，并歸納于表1。與未處理的對照相比，用蜂花屬植物葉提取物處理后管道形成被抑制約66％。
(表1)
<試驗2>血管生成的動物試驗(小鼠Matrigel模型)
在小鼠Matrigel模型中定量研究蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成活性。
將0.4ml與每個50ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和50單位/ml肝素混合的Matrigel通過皮下注射植入6-8周齡的C57BL/6雌性小鼠。3-5天后，從每只小鼠的離體皮膚去除Matrigel，用Drabkin試劑盒(Sigma Chemical Co.，St.Louise，MI，美國，目錄號525)，一種測定血液中總血色素的試劑，測量Matrigel中血色素(Hb)的水平。
用含實施例1的蜂花屬植物葉提取物(0.5mg)的Matrigel進行相同的試驗，并將處理組的血色素含量與對照組的血色素含量相比較。如圖3和表2所示，與對照組相比，處理組的血色素含量明顯降低。因此，血管生成被抑制約99％。
(表2)
為了測試口服給藥蜂花屬植物葉提取物對血管生成的活性，進行下述試驗。
將0.4ml含50ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和50單位/ml肝素的Matrigel通過皮下注射植入，并且每只鼠每天兩次口服給藥0.6mg蜂花屬植物葉提取物，給藥4天。在第5天，去除Matrigel，并確定Matrigel中的血色素量。
如圖4和表3所示，蜂花屬植物葉提取物處理的組顯示在Matrigel更低水平的血色素，約為對照組的71％。因此，當口服給藥時，蜂花屬植物葉提取物也顯示抗血管生成活性。
(表3)
<試驗3>用絨膜尿囊膜試驗(CAM試驗)進行血管生成分析將受精的雞蛋放置在37℃濕潤的孵育箱中。孵育3天后，用26-規格針頭的注射器從雞蛋中抽出2-3ml的白蛋白，并用透明帶密封雞蛋。在雞蛋的末端打一個小孔的窗戶。兩天后，將溶解在15μl鹽水中的50μg蜂花屬植物葉提取物的等分試樣施用到滅菌的Thermanox圓盤(MilesScientific)上，并空氣干燥。通過窗戶將圓盤施用到絨膜尿囊膜表面，并用透明膠帶封口。在濕潤的孵育箱中37℃將雞胚繼續孵育三天。用26-規格的針向胚絨膜尿囊中注入適當體積的類脂乳劑，使絨膜尿囊膜的血管網絡在白色的類脂背景下顯現出來。作為對照，用15μl的生理鹽水代替蜂花屬植物葉提取物施用到圓盤上，接著重復上述相同的程序。觀察得到的血管，并與處理的雞蛋相比較。
在對照組(n＝20)，在90％的胚胎中，毛細血管的形成不受影響(圖5a)，而在用蜂花屬植物葉提取物處理的圓盤(圖片中較亮的部分)中，血管形成的抑制是明顯的，在所用處理雞蛋中觀察絨膜尿囊的血管形成的抑制(n＝15，100％，圖5b)。<試驗4>蜂花屬植物葉提取物與銀杏提取物聯合處理對血管生成抑制的影響小鼠在Matrigel模型中研究蜂花屬植物葉提取物與其它組合物共處理對血管生成抑制的影響。
將0.4ml含50ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和50單位/ml肝素的Matrigel通過皮下注射植入，并且每天兩次口服給藥1.0mg蜂花屬植物葉提取物和0.5mg銀杏提取物，給藥4天。
在另一組中，對小鼠給藥較低劑量的蜂花屬植物葉提取物和銀杏提取物的合并組合物，所述劑量為先前合并組合物(0.2mg的蜂花屬植物和0.1mg的銀杏)劑量的1/5。
確定Matrigel中血色素的量，并將結果與未處理對照組相比較。如同表4中所歸納的，處理組Matrigel中總的血色素水平的平均值約為對照組的10-18％。合并處理的血管生成的百分比抑制為82-90％，其比單獨的蜂花屬植物葉提取物的百分比抑制高。
(表4)
<試驗5>蜂花屬植物葉提取物與其它組合物聯合處理對癌癥轉移的抑制將B16BL6細胞(5×104)通過尾靜脈注入6-7周齡的C57BL/6雄性小鼠。其后，通過口服給藥對小鼠每天給藥0.2ml水或藥物組合物，給藥3周。注射3周后，處死小鼠，并在顯微鏡下計數肺表面腫瘤克隆的數目。處理組小鼠肺中黑素瘤克隆的平均數小于對照小鼠的平均數。單一藥物處理組中，轉移的百分比抑制是37-38％，而在聯合處理組中，轉移的百分比抑制降至50-54％(表5)。
即，蜂花屬植物葉提取物與其它血管生成抑制劑的聯合處理比單獨的蜂花屬植物葉更有效。
(表5)
<實施例2>(1)MMP制劑利用桿狀病毒系統，從昆蟲細胞(Sf21昆蟲細胞)克隆并制備MMP-1，MMP-2和MMP-9。
將MMP-2cDNA(GENEBANK No.XM_048244)克隆到pBlueBac4.5轉移載體(Invitrogen，Cat no.V1995-20)上，然后用Bac-N-Blue轉染試劑盒(Invitrogen，目錄號K855-01)轉染到Sf21細胞中。用含10％胎牛血清的TNM-FH(Sigma，St.Louis，MO，美國)培養基在27℃下孵育Sf21細胞，然后收獲細胞并以107細胞/ml的濃度重新懸浮。室溫下，用含克隆基因的病毒孵育細胞混懸液1小時。被感染的Sf21細胞生長72小時，并回收培養基。從回收的培養基中用明膠-瓊脂糖親和柱純化MMP-2。
如前所述，從相應的基因制備MMP-1(GENEBANK NO.XM 040735)和MMP-9(GENEBANK NO.XM 009491)。用SP-瓊脂糖純化MMP-1，用明膠-瓊脂糖親和層析純化MMP-9。(2)MMP活性的抑制為了研究蜂花屬植物葉提取物對MMP的抑制，用分光熒光測定法(Perkin-Elmer LS50B)分析MMP酶活性。
分析前，用1mM的APMA活化后，純化的MMP-1，MMP-2和MMP-9可被使用。
MMP-1和MMP-9的底物是2，4-二硝基苯基-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-丙氨酸-精氨酸(序列號1)，Mca-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-Dap(Dnp)-丙氨酸-精氨酸-NH2(序列號2BACHEM，目錄號M-1895)用作MMP-2的底物。
作為對照，在2ml試管中，在2ml反應緩沖液(50mM Tricine(pH7.5)，10mM CaCl2，200mM NaCl)中混合10nM MMP-1和1μM底物(序列號1)。在280nm激發波長和360nm發射波長下，用分光熒光計在室溫下，每2分鐘測量熒光強度，測量20分鐘。
將溶解在水和10nM MMP-1中的蜂花屬植物葉提取物(25μg/ml)加到含底物的反應緩沖液中，并以相同的方式測量熒光強度。
同樣分析MMP-2或MMP-9的活性，并如前所述測量熒光強度。
圖6，7和8是MMP-1，MMP-2和MMP-9活性的圖。如圖6所示，蜂花屬植物葉提取物抑制57％的MMP-1活性。蜂花屬植物葉提取物對MMP-2和MMP-9的抑制分別為71％(圖7)和73％(圖8)。
如前所述，本發明的蜂花屬植物葉提取物抑制血管生成和基質金屬蛋白酶活性。基于此，蜂花屬植物葉提取物可用作一種新的治療或預防血管生成-和/或MMP-依賴性疾病的組合物。
序列表<110>血管實驗室公司<120>具有抗血管生成和基質金屬蛋白酶抑制活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物<130>01PP101<150>KR 2000-75488<151>2000-12-12<150>KR 2001-8470<151>2001-02-20<150>KR 2001-77392<151>2001-12-07<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>第1位脯氨酸是2，4-二硝基苯基脯氨酸<400>1Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>第1位脯氨酸是(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基脯氨酸，第4位亮氨酸是N-3-(2，4-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙酰基亮氨酸，第6位精氨酸被胺化。<400>2Pro Leu Gly Leu Ala Arg1 權利要求
1.一種用于抑制血管生成的含有蜂花屬植物葉提取物的組合物。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種選自下述物質的成分銀杏提取物，噻氯匹定，葡糖胺和七葉樹屬植物提取物，洋甘草，中國肉桂，槐，關蒼術，茅蒼術，茵陳蒿，桑，蕺菜，忍冬，旋復花，歐亞旋復花，Paeonia albiflora，山芍藥，草芍藥，姜科，姜黃，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀，Agelica gigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬，姜，Ulmus cavidiana，大果榆，山茶和葡萄。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于抑制血管生成的藥物組合物。
4.根據權利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于抑制血管生成的食品組合物。
5.根據權利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于預防和/或治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥轉移，血管瘤，血管纖維瘤，糖尿病性視網膜病，早產兒視網膜病，新生血管性青光眼，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑，黃斑變性，翼狀胬肉，視網膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結膜炎，牛皮癬，毛細管擴張，膿性肉芽腫，皮脂溢性皮炎和痤瘡和關節炎。
6.一種用于抑制基質金屬蛋白酶活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種選自下述物質的成分銀杏提取物，噻氯匹定，葡糖胺和七葉樹屬植物提取物，洋甘草，中國肉桂，槐，關蒼術，茅蒼術，茵陳蒿，桑，蕺菜，忍冬，旋復花，歐亞旋復花，Paeonia albiflora，山芍藥，草芍藥，姜科，姜黃，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀，Agelica gigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬，姜，Ulmus cavidiana，大果榆，山茶和葡萄。
8.根據權利要求6或7的組合物，抑制基質金屬蛋白酶活性的藥物組合物。
9.根據權利要求6或7的組合物，抑制基質金屬蛋白酶活性的食品組合物。
10.根據權利要求6或7的組合物，抑制基質金屬蛋白酶活性的化妝品組合物。
11.根據權利要求6或7的組合物，其中所述組合物用于治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥轉移，動脈粥樣硬化，再狹窄，MMP依賴性骨病，中樞神經系統的炎癥，阿爾茨海默氏病，皮膚老化，角膜潰瘍，粘連，骨疾病，蛋白尿，腹部主動脈瘤，消退的軟骨損傷，有髓神經損傷，肝纖維化，nephrogromerula病，胚膜破裂，炎性腸疾病，齦炎/牙周炎，老年性黃斑變性，糖尿病性視網膜病，增生性玻璃體視網膜病，未完全發育的視網膜病，眼睛炎癥，圓錐形角膜，斯耶格倫綜合癥，近視，眼腫瘤，角膜植入的排斥，類風濕性關節炎，關節炎或膿毒性關節炎。
全文摘要
本發明涉及包含蜂花屬植物葉提取物的組合物，其抑制血管生成和基質金屬蛋白酶活性。本發明的蜂花屬植物葉提取物抑制血管生成和基質金屬蛋白酶的活性，因此，它可用于治療或預防與血管生成和基質金屬蛋白酶相關的疾病。本發明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它抗血管生成，抗癌，抗炎和抗老化成分的成分。這種包含蜂花屬植物葉提取物的具體組合物可用于藥物，飲食和/或化妝品用途。
文檔編號A61K36/16GK1477967SQ01819488
公開日2004年2月25日 申請日期2001年12月12日 優先權日2000年12月12日
發明者金敏英, 樸秉泳, 文昶喜, 樸殷圭, 金京美 申請人:血管實驗室公司, 金敏英