專利名稱：KahalalideF制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及Kahalalide F--一種從食草類海洋生物，軟體動物紅色海天牛(Elysia rufescens)中分離的肽。
本發明背景kahalalide F是歐洲專利610078的主題。該專利披露了針對人類肺癌A-549和人類結腸癌HT-29的體外細胞培養物的活性。
例如，有關kahalide F的更多的信息可以參見以下文獻kahalalide F的絕對立體化學。Goetz，Gilles；Yoshida，WesleyY.；Scheuer，Paul J.Dep.Chemistry，Univ.Hawaii，Honolulu，HI，USA.Tetrahedron(1999)，55(25)，7739-7746。.Tetrahedron(1999)，55(40)，11957。
kahalalides來自海洋軟體動物紅色海天牛及其藻類食物羽藻(Bryopsissp.)的生物活性肽。Hamann，Mark T.；Otto，CliftonS.；Scheuer，Paul J.；Dunbar，D.Chuck.化學系，University ofHawaii of Manoa，Honolulu，HI，USA.J.Org.Chem.(1996)，61(19)，6594-6600..J.Org.Chem.(1998)，63(14)，4856。
水生環境抗瘧疾藥劑原型的來源。E1 Sayed，Khalid A.；Dunnbar，D.Charles；Goins，D.Keith；Cordova，Cindy R.；Perry，Tony L.；Wesson，Keena J.；Sanders，Sharon C.；Janus，ScottA.；Hamann，Mark T.天然產物開發中心，University Mississippi，Unversity，MS，USA，J.Na t.Toxins(1996)，5(2)，261-285.
作用于細胞溶酶體的抗腫瘤化合物kahalalide F。Garcia-Rocha，Mar；Bonay，Pedro；Avila，Jesus.28049-Madrid，Spain.Cancer Lett.(Shannon，Irel.)(1996)，99(1)，43-50。
kahalalide F來自楯舌類軟體動物紅色海天牛和綠藻羽藻的生物活性縮肽(depsipeptide)。Hamann，Mark T.；Scheuer，Paul J.Dep.Chem.，Univ.Hawaii，Honolulu，HI，USA.J.Am.Chem.Soc.(1993)，115(13)，5825-6。
本發明概述我們提供了kahalalide F的新的制劑和新的用途。
優選實施方案非離子型表面活性劑和有機酸的組合，適合與填充劑一起使用，用于提供適合重構的冷凍干燥形式的kahalalide F。重構優選是用乳化增溶劑鏈烷醇和水的混合物進行的。
所述冷凍干燥的組合物優選主要包括填充劑，如至少90％或至少95％的填充劑。填充劑的例子是眾所周知的，并且包括蔗糖和甘露糖醇。可以使用其他填充劑。
用于所述冷凍干燥組合物中的非離子型表面活性劑優選是脫水山梨糖醇酯，更優選聚乙烯脫水山梨糖醇酯，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇鏈烷酸酯，特別是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，例如，polysorbate80。所述非離子型表面活性劑通常占所述組合物的幾個百分點，如占所述組合物的0-5％，例如占所述組合物的2-3％。
所述冷凍干燥組合物中的有機酸通常是脂族酸，優選羥基羧酸，更優選羥基多羧酸，特別是檸檬酸。所述有機酸通常占所述組合物的幾個百分點，如占所述組合物的0-5％，例如占所述組合物的2-3％。
所述冷凍干燥組合物中kahalalide F的含量通常低于該混合物的1％，或者通常低于0.1％。合適的用量在50-200微克范圍內，例如，每100毫克組合物大約100微克。
用于所述重構藥劑的乳化增溶劑優選包括聚乙二醇酯，特別是脂肪酸的酯，更優選PEG油酸酯，如PEG-35油酸酯。所述乳化增溶劑宜占所述重構藥劑的0-10％，通常為大約3-7％，例如大約5％。所述鏈烷醇通常是乙醇，并且以占重構藥劑的0-10％為宜，通常為大約3-7％，例如大約5％。所述重構藥劑的其余部分是水，并且提供了適合靜脈內注射的重構溶液。
用0.9％的鹽水制備的重構溶液的進一步的稀釋液可能適合kahalalide F的輸注。
在特別優選的實施方案中，所述冷凍干燥的組合物含有100微克kahalalide F；75-125毫克，特別是100毫克填充劑，1-3毫克，特別是大約2毫克酸；以及1-3毫克，特別是大約2毫克非離子型表面活性劑。
所述優選的重構藥劑含有2-7％，例如大約5％乳化增溶劑，2-7％，例如大約5％醇；以及，其余部分是水。
本發明還提供了包括分別裝有冷凍干燥的組合物和重構藥劑的獨立的容器的試劑盒。還提供了重構方法。
本發明還提供了治療患有癌癥的任何哺乳動物，特別是人類的方法，該方法包括給所述患病個體服用治療有效量的、通過重構本發明的冷凍干燥組合物制備的藥用組合物。本發明特別適用于治療患有頑固性癌癥的患者，這種癌癥對其他治療沒有積極響應。特別是，在業已嘗試過其他化療方法并且不起作用的時候就可以采用本發明的組合物。
在一種實施方案中，制備所述重構溶液用于輸注，并且以高達大約20或25微克/毫升，通常高達15微克/毫升的濃度用3個小時時間輸注使用。合適的輸注設備優選包括玻璃容器，而不是聚乙烯容器。輸注管優選是硅氧烷的。
本發明的另一方面涉及kahalalide F的新的用途。特別是，我們預計可將其用于治療前列腺癌，特別是雄激素不依賴型前列腺癌，乳腺癌，結腸癌，非小細胞肺癌，卵巢癌，并且用于治療成神經細胞瘤。kahalalide F還可用于抗脫分化的和間葉細胞軟骨肉瘤(chodrosarcomas)和骨肉瘤。由本發明所提供的新型重構的制劑可用于該新用途，盡管其他組合物是可能的。
藥用組合物的例子包括具有合適組成的任何固體(片劑、丸劑、膠囊、顆粒等)或液體(溶液、懸浮液或乳液)，可以口服，局部使用或腸胃外使用，并且，它們可以含有純的化合物或與任何載體或其他具有藥理學活性的化合物組合。在通過腸胃外途徑服用時，所述組合物必須是無菌的。
本發明的化合物或組合物可以用任何合適的方法施用，如靜脈內輸注，口服制劑，腹膜內和靜脈內施用。我們優選使用長達24小時的輸注時間，并且更優選使用2-12小時的輸注時間，最優選使用2-6小時的輸注時間。特別理想的是短時間輸注，這樣能夠不必在醫院里停留過夜進行治療。不過，如果必要的話，輸注時間可以為12-24小時或更長。能夠以合適的時間間隔例如2-4周輸注。在另一種用藥方案中，每3周連續施用kahalalide F 5天，每次大約1小時。還可以設計出其他不同的用藥方案。
含有本發明化合物的藥用組合物可以通過脂質體或納米球膠囊化輸送，以緩釋制劑形式或通過其他標準輸送方法輸送。
所述化合物的合適劑量可以根據具體制劑，使用模式，接受治療的特定部位、宿主和腫瘤而改變。還應當考慮其他因素，如年齡、體重、性別、飲食、服用時間、排泄速度、宿主狀態、藥物組合、反應敏感性和疾病的嚴重程度。給藥可以在最大耐受劑量內連續進行或定期進行。
本發明的化合物和組合物可以與其他藥物一起使用，以提供聯合治療。其他藥物可以作為所述同一組合物的組成部分，或者作為獨立的組合物提供，用于在同一時間或不同時間服用。所述其他藥物的類型沒有特別限制，并且合適的候選藥物包括a)具有抗有絲分裂作用的藥物，特別是針對細胞骨架元素的藥物，包括微管調節劑，如taxane藥物(如紫杉醇、paclitaxel、taxotere、docetaxel)，podophylotoxins或yinca生物堿(長春新堿、長春堿)；b)抗代謝藥物，如5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，吉西他濱(gemcitabine)，嘌呤類似物，如噴司他丁，氨甲蝶呤)；c)烷基化劑，如氮芥(如環磷酰胺或異環磷酰胺)；d)針對DNA的藥物，如antracycline藥物阿霉素(adriamycin)，多柔比星(doxorubicin)，pharmorubicin或表柔比星(epirubicin)；e)針對拓撲異構酶的藥物，如依托泊苷(etoposide)；f)激素和激素激動劑或拮抗劑，如雌激素，抗雌激素(他莫昔芬和相關的化合物)和雄激素，氟他胺，亮丙瑞林，戈舍瑞林(goserelin)，環丙孕酮(cyprotrone)或奧曲肽(octreotide)；g)針對腫瘤細胞中信息傳導的藥物，包括抗體衍生物，如herceptin；
h)烷基化藥物，如鉑類藥物(順鉑、卡鉑(carbonplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、paraplatin)或亞硝基脲；i)能有效影響腫瘤轉移的藥物，如間質金屬蛋白酶抑制劑；j)基因治療和反義藥劑；k)抗體治療劑；1)來自海洋的其他生物活性化合物，特別是didemnins，如aplidine，或ecteinascidins，如Et743。
本發明的實施例在下面的實施例中將披露支持本發明的實驗工作。
例1kahalalide F，KF的冷凍干燥的腸胃外藥用制劑的開發本研究的目的是開發一種KF的穩定的腸胃外用制劑，用于早期臨床研究。
方法。在實驗設計方法中，根據polysorbate80(P80；0.1-0.5％w/v)和一水合檸檬酸(CA；5-15mM)濃度的變化研究KF的溶解度和穩定性。在+5℃和+30℃下，在黑暗中研究含有結晶(甘露糖醇)或非結晶(蔗糖)填充劑的KF冷凍干燥制品的穩定性。通過紅外線(IR)光譜分析和示差掃描熱值分析，鑒定冷凍干燥產品。在重構KP冷凍產品并進一步用輸注流體稀釋之后進行回收研究，以便選擇最佳重構媒介物。
結果。發現P80和CA的組合是溶解KF所必需的。隨著P80和CA濃度的提高，冷凍干燥產品的穩定性顯著降低，以P80濃度為主要影響因子。選擇0.1％w/vP80和5mM CA的組合作進一步的研究。與含有甘露糖醇的產品相比，含有蔗糖作為填充劑的冷凍干燥產品更穩定。測定基于蔗糖的產品的玻璃化轉變溫度為+46℃。通過IR分析證實了這種產品的非晶狀態。由Cremophor EL乙醇和水組成的用于注射的溶液(5/5/90％v/v/v CEW)在重構之后將KF保持在溶液中，并且用0.9％氯化鈉(生理鹽水)進一步稀釋到0.5微克/毫升)。
結論。提供了一種穩定的冷凍干燥制劑，它包括100微克kahalalide F，100毫克蔗糖，2.1毫克CA和2毫克P80，用由5/5/90％v/v/v CEW組成的媒介物重構，并且用生理鹽水進一步稀釋。
例2kahalalide F在輸注裝置中的相容性和穩定性kahalalide F是作為冷凍干燥的產品進行藥物學配制的，每個劑量單位含有50-150微克活性物質。在靜脈內注射使用之前，用由Cremophor EL、無水乙醇和水組成的溶液進行重構(CEW，5/5/90％v/v/v)用于注射，用0.9％w/v氯化鈉溶液進一步稀釋用于輸注。本研究的目的是在開始臨床實驗之前，研究kahalalide F與不同輸注系統的相容性和穩定性。由于Cremophor EL在輸注溶液中的存在，會出現鄰苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexlphthalate)從聚氯乙烯輸注容器(PVC，Add-a-Flex)中浸出。在使用由低密度聚乙烯組成的輸注容器(LD-PE，Miniflac)時，發現了由于與接觸表面的吸附而導致的kahalalide F的損失。我們認為kahalalide F必須以0.5-14.7微克/毫升的濃度用3小時的輸注時間施用，使用由玻璃容器和硅氧烷管組成的給藥裝置。用5/5/90％v/v/v CEW重構的用于輸注的kahalalide F 150微克瓶裝粉末在室溫下(+20-25℃)，在環境光照條件下，在原始容器中至少能穩定存在24小時。在制備之后，保存在玻璃輸注容器中的輸注溶液在室溫下(+20-25℃，遮光)或在冷藏條件下(+2-8℃，遮光)下至少能穩定保存5天。
例3kahalalide F的體外安全性毒理學我們業已評估了kahalalide F--來自夏威宜軟體動物紅色海天牛的化合物的潛在毒性，發現該化合物對前列腺和neu-1(Hcr2過表達)乳腺腫瘤細胞具有有效的化學毒性作用。
在體外細胞毒性測定中，使用CellTiter96(MTS，Promega)，kahalalide F表現出對心肌(H9C2(2-1))或骨骼肌(L8)細胞具有很小的毒性(分別為LD50＝5mM，0.6mM)。相反，kahalalide F對肝臟(AML-12)具有細胞毒性，并且對腎臟(NRX-52E)細胞具有細胞毒性(分別為LD50＝0.17μM，1.6μM)，并且對骨髓干細胞具有中等毒性(FDC-P1，LD50＝14μM)。以上結果與體內毒性結果十分吻合。
我們業已發現，這種藥物在我們的測定系統中在高濃度下具有神經毒性，并且這一結果與超過最大耐受劑量(MTD)時動物所表現出的神經毒性結果十分吻合。使用熒光生活力染色(fluorescentviability stain)(乙錠均二聚體和calccin AM，分子探針)，同時結合免疫細胞化學，我們確定大約10μM的kahalalide F對中樞神經系統(CNS)神經元(神經絲陽性)有毒性，不過，不損害脊索中的星狀細胞(神經膠質纖維酸性蛋白陽性)以及感覺(物質P表達)和運動原(膽堿乙酰轉移酶陽性)神經元。
我們認為，kahalalide F是有希望的用于治療前列腺癌的藥物，因為在MTD水平或低于該水平下，其神經毒性較低。另外，初步結果表明，kahalalide F可以證明如果可以輸送的話，是用于治療成神經細胞瘤的理想藥物，因為其具有CNS神經元選擇性。
例4kahalalide F的選擇性抗腫瘤活性kahalalide F是一種溶菌酶毒劑，它對激素不依賴型前列腺癌，neu+(Her2過表達)乳腺腫瘤細胞和成神經細胞瘤具有體外選擇性。進一步的MoA包括erbB2的抑制和EGF受體的阻斷，以及TGF基因表達的抑制。用體內模型進行的臨床前實驗業已證實了300微克/kg BW的嚙齒類MTD的激素非依賴型前列腺腫瘤(PC-3和DU-145)的選擇性和敏感性。體外抗增殖研究證實了某些前列腺腫瘤之間的相等的IC50活性(0.27μM PC-3，0.25μM DU-145，0.73μM T-10，0.24μM DHM和0.19μM RB)，但是對激素敏感型LnCAP無活性。其他研究證實了選擇性但是對neu+乳腺腫瘤細胞的稍弱一些的IC50活性(0.25μMSK-BR-3∶2μM BT-474)，以及對成神經細胞瘤細胞系的活性(1μMBE(2)C)。在體外接觸研究中，證實了KF不是時間依賴型的。在大多數情況下，最少接觸1小時就像接觸48小時一樣有效。另外，細胞毒性的即刻和長期影響具有相同的藥效學，并且不會隨著治療的持續而加強。1期實驗采用每周5天的用藥方案，在評估KF之后馬上開始，將它用作抗實體瘤的有效化療劑。
例5研究kahalalide F(PM92102)抗直接取自患者的人類腫瘤樣品的作用。
在體外研究中，業已證實了KF導致細胞膨脹并最終死亡的活性(Garcia-Rocha等，Can Letters 9943-50)。在本研究中，用KF處理新鮮的人類腫瘤樣品，通過人類腫瘤克隆測定確定其活性。用14天時間，用KF處理104份患者腫瘤樣品，連續使用0.01，0.1和1.0μM的濃度。在37℃下，在雙層軟瓊脂克隆系統中培養樣品，并且在第14天取出，進行集落計數，比較在處理過的平板上形成的集落的數量，和未處理過的對照平板上形成的集落的數量，并且計算在每一種濃度下存活的集落百分數。正對照平板含有細胞毒劑原釩酸鈉(200微克/毫升)，在所述樣品中，大約30％可以用合適的負對照和正對照進行評估。在0.01，0.1和1.0μg/M的濃度下，所述樣品分別出現了16％(5/31)，19％(6/31)，和81％(25/31)的體外反應(表現為50％存活率的抑制反應)。在濃度和對KF的反應之間存在正相關，在測試過的較高濃度下具有顯著反應(81％)(1.0＞0.1＞0.01)。在乳腺(100％)，結腸(75％)，非小細胞肺(100％)和卵巢癌樣品(91％)中出現了顯著反應。KF是一種有希望的抗癌藥物，多種腫瘤對它有反應。
例6在患有晚期雄激素難治的(androgen refractory)前列腺癌的患者中對kahalalide F進行1期和藥物動力學研究KF在包括乳腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌，特別是前列腺癌在內的各種實體瘤模型中具有體外和體內抗腫瘤活性。根據其選擇性，目前進一步將KF作為抗雄激素不依賴型前列腺腫瘤的潛在抗癌藥物開發。
目的在本I期臨床和藥物動力學(PK)研究中，研究了毒性特征PK和KF的抗腫瘤活性。
方法每3周連續5天每天用1小時給晚期或轉移性雄激素難治的前列腺癌患者靜脈內輸注施用KF。根據在小鼠上確定的MTD值，選擇20微克/m2/天的起始劑量，該劑量相當于100微克/m2的總劑量。在第一階段在血漿中測定KF的PK。通過LC-MS/MS進行KF的生物分析。在本研究期間還評估了每位患者的LDH，AF，特別是PSA含量，以便確定KF的活性。
結果和討論目前，對7位患者進行了登記。這些患者的平均年齡為66歲(在54-75歲之間)。每種劑量水平一個患者，20，40，60，80和160微克/m2/天。由于轉氨酶升高，4位患者采用本劑量水平，320微克/m2/天。本研究的第一位患者重復使用該劑量水平。所出現的副作用是可以迅速恢復的中度頭痛、疲勞、疼痛和局部水腫。迄今為止唯一的與藥物相關的毒性是可迅速恢復的CTC三級ASAT，它出現在320微克/m2/天的水平上。在整個劑量范圍內，PK揭示了劑量和AUC之間的線性相關。總的血漿清除速度為267毫升/分鐘(±115)，并且在所述患者中靜脈注射的KF的最終半衰期為0.46小時(±0.13)。在目前劑量水平上(35-50納克/毫升)所達到的最大血漿濃度在clonogenic腫瘤測定中對前列腺癌非常有效(從15納克/毫升開始有活性)。對目前為止，該方案是有相當好的耐受性的。一位患者出現了與臨床改善(痛苦緩解)相關的PSA水平的顯著降低(大于50％)。另兩位患者出現了PSA的少量降低，有一位患者在經過兩輪之后仍然繼續降低。目前還沒有達到最大耐受劑量，而本研究也在繼續。
例7kahalalide F對脫分化的和間葉軟骨肉瘤，CHSAs和骨肉瘤，OSAs，以及肝細胞和前列腺癌細胞具有細胞毒性。它不能顯著抑制CHSA和OSA細胞的生長，并且即使只短暫接觸細胞10分鐘時間也能誘導細胞毒性作用。
權利要求
1.一種kahalalide F制劑，包括kahalalide F，非離子型表面活性劑，有機酸和填充劑的冷凍干燥混合物。
2.一種試劑盒，包括權利要求1的制劑，以及指導用由乳化增溶劑，鏈烷醇和水的混合物的重構溶液進行稀釋的說明書。
3.如權利要求2的試劑盒，還增加了所述重構溶液。
4.一種用權利要求1的制劑或權利要求2或3的試劑盒制備的重構溶液。
5.如權利要求4的重構溶液，它是由乳化增溶劑，鏈烷醇和水的混合物的重構溶液重構的。
6.一種稀釋過的重構溶液，含有權利要求4或5的重構溶液，它是用0.9％的鹽水稀釋到適合kahalalide F輸注的濃度。
7.將權利要求6的稀釋過的重構溶液用于治療癌癥的用途。
8.將kahalalide F用于抗前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌、卵巢癌，用于治療成神經細胞瘤，或抗脫分化或間葉軟骨肉瘤或骨肉瘤的用途。
9.如權利要求7或8的用途，其中，所述kahalalide F是通過輸注使用的，每3周連續使用5天，每次輸注1小時。
10.如權利要求7、8或9的用途，其中，所述kahalalide F是與另外的藥物組合使用的。
11.如權利要求7-10中任意一項的用途，其中，所述kahalalideF被用于頑固型患者。
全文摘要
提供了kahalalide F的新的制劑和新的用途。
文檔編號A61P35/00GK1568192SQ01818271
公開日2005年1月19日 申請日期2001年10月31日 優先權日2000年10月31日
發明者G·T·費爾克洛思, B·紐延, S·韋曼 申請人:法馬馬有限公司