逆轉錄病毒免疫療法的制作方法

專利名稱：逆轉錄病毒免疫療法的制作方法
技術領域：
本發明提供一種治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的方法。更具體地講，本發明提供一種治療引起人類患者免疫缺陷相關疾病的逆轉錄病毒感染的方法。
背景技術：
人免疫缺陷病毒(HIV)誘發在大多數情況下可以導致發生獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的持續進行性感染。至少存在兩種不同類型的HIVHIV-1和HIV-2。在人類中，HIV感染最終導致免疫機能不全、機會性感染、神經性機能障礙、腫瘤生長，最終導致死亡。
HIV是逆轉錄病毒慢病毒科中的一員。逆轉錄病毒是含單鏈RNA基因組的小包膜病毒，并且通過將由病毒編碼的逆轉錄酶產生的DNA中間體插入到宿主DNA中而進行復制。其它逆轉錄病毒包括例如致癌病毒例如人T細胞白血病病毒(HTLV-I、HTLV-II、HTLV-III)、貓白血病病毒和小鼠丙型逆轉錄病毒。
HIV病毒顆粒組成包括病毒核心(部分由稱為p24和p18的衣殼蛋白組成)以及病毒RNA基因組和早期復制事件所需的酶。肉豆蔻化gag蛋白構成圍繞病毒核心的病毒外殼，它進而被來源于感染細胞膜的脂膜包膜所包圍。HIV包膜表面糖蛋白作為單一160千道爾頓前體蛋白合成，然后在病毒出芽期間被細胞蛋白酶切割成兩種糖蛋白gp41和gp120。gp41是一種跨膜糖蛋白，而gp120是一種仍與gp41非共價連接、可能以三聚體或多聚體形式存在的胞外糖蛋白。
HIV感染是廣泛流行性的并且HIV相關性疾病是一個重大的世界健康問題。雖然已經投入相當大的努力用以設計有效的治療藥，但是目前仍然沒有研制出有療效的抗逆轉錄病毒藥或抗AIDS療法。為了開發這類藥物，考慮了將HIV生活周期的若干階段作為治療性干擾的靶(Mitsuya等，1991)。
值得注意的是開發用于治療HIV感染的疫苗。已經顯示HIV-1包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)是AIDS患者體內存在的抗HIV抗體的主要抗原(Barin等，1985)。因此，迄今為止，這些蛋白似乎是用作抗原用于抗HIV疫苗開發最具前景的候選物。多個研究小組已經開始應用gp160、gp120和/或gp41的各個部分作為宿主免疫系統的免疫原性靶(US 5,141,867；WO 92/22654；WO 91/09872；WO 90/07119；US6,090,392)。盡管進行了這些努力，但是尚未開發出用于治療HIV感染的有效疫苗策略。
本發明提供一種用于治療逆轉錄病毒感染的替代免疫療法。
發明概述本發明人注意到在對感染哺乳動物的逆轉錄病毒應答中產生至少兩種免疫細胞群體。更具體地講，感染逆轉錄病毒的哺乳動物免疫系統能夠通過一組在本文中統稱為“效應細胞”的細胞建立針對所述病毒的免疫應答，然而也產生了可調節所述“效應細胞”、有限制哺乳動物有效控制或根除所述逆轉錄病毒感染能力、在本文中統稱為“調節細胞”的第二種細胞群體。
雖然不希望受理論的限制，但是已提出人類含有許多作為穩定遺傳元件、與逆轉錄病毒序列同源或幾乎同源、在整個人類基因組中片段化的序列。因此，由這些序列編碼的蛋白可以在發生免疫應答期間被識別為“自身”的。然后，逆轉錄病毒的后續感染也可以被部分識別為“自身”的，從而限制免疫系統建立成功免疫應答的能力。這一建議可以至少部分解釋為何迄今為止難以開發出抵抗HIV的有效疫苗。
這一假說得到Rakowicz Szulczynska及其同事的支持(1998和2000)，他們已經表明某些與乳腺癌相關的抗原在分子水平和免疫學上與由HIV-1編碼的蛋白類似。其它癌癥獲得了相似的觀測結果。另外，Coll等(1995)報道了結合自身免疫病例如斯耶格倫綜合征(Sjogren′ssyndrome)和系統性紅斑狼瘡患者體內HIV-1的抗體。此外，BLAST搜索人類基因組數據庫與人免疫缺陷病毒基因組序列表明，在這兩種基因組中有許多顯著同一性的區。
也注意到在對抗原應答時，在調節細胞擴充之前有相當數目的效應細胞得到擴充。這提供防止“調節細胞”產生或破壞所述“調節細胞”而同時保留“效應細胞”的機會。
因此，在第一個方面，本發明提供一種治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的方法，所述方法包括給予所述患者一種增加針對所述逆轉錄病毒的效應細胞的數目和/或激活所述效應細胞的組合物，隨后給予所述患者一種抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物，其中選擇使得所述效應細胞的活性不被顯著降低的時間給予所述藥物。
有多種可以增加針對逆轉錄病毒的效應細胞的數目和/或活性的方式。在某些情況下，見于疏忽性逆轉錄病毒感染，例如被帶有所述病毒的注射器針頭刺傷。眾所周知，健康工作者和研究人員存在針頭刺傷而感染病毒之風險。同樣，普通群眾也會由于接觸廢棄注射器而遇到這種危險，特別是在沙灘上和用這類注射器搶劫時。因此，當懷疑接觸了逆轉錄病毒、特別是HIV時，哺乳動物患者可以使用本發明的方法。
本發明的方法也可以用來治療感染逆轉錄病毒有一段時間的哺乳動物患者。盡管這種患者的免疫系統已經接觸了所述逆轉錄病毒，但是加入其它逆轉錄病毒抗原可以導致其它效應細胞應答，隨后可能消除這些新效應細胞的調節細胞。
感染逆轉錄病毒的患者可以用抗逆轉錄病毒藥進行治療，以保持低的病毒負荷。也可以將所述組合物給予這樣的患者，以引發新的效應細胞免疫應答，隨后給予所述藥物消除調節細胞。
在第一個方面的一個優選實施方案中，大約在對所述組合物給予作出反應的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時，給予所述藥物。
此外，最好是大約在給予所述組合物后，當病毒顆粒數目開始穩定或增加時，給予所述藥物。
在第一個方面的再一個優選實施方案中，感染哺乳動物患者體內效應細胞的再刺激可以通過包含逆轉錄病毒抗原多肽的組合物得以實現。優選通過給予一種包含所述逆轉錄病毒抗原多肽和藥學上可接受的載體的疫苗，使所述抗原多肽提供給所述患者。更優選所述疫苗還包含佐劑。
在另一個實施方案中，通過給予編碼所述逆轉錄病毒抗原多肽的DNA疫苗，使所述抗原多肽提供給所述患者。
在再一個實施方案中，通過食用表達所述逆轉錄病毒抗原多肽的轉基因植物，使所述抗原多肽提供給所述患者。
停止抗逆轉錄病毒治療在受感染患者體內常常引起針對重新出現的病毒的效應細胞的快速再擴充。因此，可以在適當時間給予所述藥物以消除所述調節細胞，而不需要給予如本文定義的組合物。
因此，在第二個方面，本發明提供一種治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的方法，所述方法包括使所述患者接受抗逆轉錄病毒藥物療法，隨后給予所述患者一種抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物，其中所述藥物在結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法之后給予，并且在逆轉錄病毒數目方面所產生的擴充導致針對所述逆轉錄病毒的效應細胞數目增加和/或激活所述效應細胞，其中選擇使得所述效應細胞的活性不被顯著降低的時間給予所述藥物。
在第二個方面的一個優選實施方案中，大約在對結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法作出反應的CD8+CD4-T細胞數目達到峰值時，給予所述藥物。
當停止抗逆轉錄病毒藥物療法后，病毒負荷會增加(例如參見Daar等，1998)。這導致針對逆轉錄病毒的效應細胞的擴充和/或活化，開始穩定所述病毒負荷。應該大約在所述逆轉錄病毒數目達到峰值或者在該峰值之后開始減少時給予所述藥物。
因此，在第二個方面的再一個優選實施方案中，大約在結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法影響下所述病毒顆粒數目達到峰值或者在該峰值之后開始減少，給予所述藥物。
在調節細胞消除中所用的藥物最好選自抗增殖藥物、放射療法和與CD4+T細胞特異性結合的抗體。所述抗增殖藥物最好選自長春堿和脫水長春堿。
所述逆轉錄病毒最好選自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
本領域技術人員將會容易認識到，本發明的方法可以重復進行，以提供更加完全的治療。
所述哺乳動物患者最好是人類。
在第三個方面，本發明提供抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物在生產用于治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的藥物中的應用。
在第三個方面的一個優選實施方案中，所述藥物最好選自抗增殖藥物和與CD4+T細胞特異性結合的抗體。
在以上概述的各個方面，“調節”細胞群體的消除使得“效應”細胞群體可以減少或根除所述逆轉錄病毒負荷，因為效應細胞的任何負調節(由于自身耐受機制所致)已被除去。
在本發明的說明書中，用語“包含”或諸如“包括”的變化用語，應該理解為包括所述整數(integer)或步驟要素(step)或者成組的整數或步驟要素，但不排除任何其它整數或步驟要素或者成組的整數或步驟要素。
下文將通過以下非限制性附圖和實施例來描述本發明。
附圖簡述

圖1MAIDS在感染LP-BM5的B6小鼠中的時程。
圖2單劑量的長春堿(6mg/kg i.p.)對感染后10周MAIDS進程的影響。
圖3感染后10周，長春堿治療小鼠的脾組織學。
圖4感染后20周，長春堿治療后對MAIDS的防治作用。n＝5。
圖5在保護性長春堿療法后再用MAIDS病毒攻擊。n＝5。
圖6第14天長春堿對MAIDS感染小鼠(MAIDS+)和對照小鼠(MAIDS-)的脾細胞百分率的影響。n＝3。
圖7脾轉移實驗方案。
圖8從MAIDS感染供體小鼠轉移脾細胞。n＝7。
圖9體內耗竭實驗方案。
圖10.感染后第14天CD4+或CD8+細胞的體內耗竭。n＝5。
發明詳述對逆轉錄病毒感染的免疫應答本文所用的術語“治療”是指實現逆轉錄病毒負荷的降低。最優選完全根除所述逆轉錄病毒負荷。
盡管尚未確定“調節細胞”的準確性質，但是已經認定這些細胞包括CD4+細胞亞群。
CD4+細胞表達本領域稱為CD4的標記。通常，本文所用的術語“CD4+T細胞”不是指也表達CD8的細胞。然而，該術語可以包括也表達其它抗原標記例如CD25的T細胞。
盡管尚未確定“效應細胞”的準確性質，但是已知這些細胞包括被稱為CD8+細胞的T細胞群體。
本文所用的術語“消除”，當涉及使所述“調節細胞”暴露于所述藥物時，是指調節細胞的數目和/或活性被所述藥物負調節。最優選調節細胞的數目和/或活性被所述藥物完全消除。抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物所述藥物可以是選擇性或非選擇性導致破壞調節細胞或抑制所述調節細胞產生的任何因子或療法。例如，可以用CD4+特異性抗體特異性地靶向CD4+T細胞。然而，在某些情況下，可以使用非選擇性藥物，例如抗增殖藥物或放射療法，這兩種療法都可以破壞分裂細胞。
術語“抗增殖藥物”是本領域眾所周知的術語，是指任何破壞分裂細胞或抑制所述細胞進一步增殖的化合物。抗增殖藥物包括氮芥、環磷酰胺、異環磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、六甲基-三聚氰胺、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈佐星、達卡巴嗪、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁、長春堿、脫水長春堿、長春新堿、依托泊苷、替尼泊苷、放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、普卡霉素、絲裂霉素、L-門冬酰胺酶、順鉑、米托蒽醌、羥基脲、丙卡巴肼、米托坦、氨魯米特、潑尼松、己酸羥孕酮、醋酸美屈孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚、炔雌醇、他莫昔芬、丙酸睪酮、放射性同位素、蓖麻毒蛋白A鏈、紫杉醇、白喉毒素和假單胞菌外毒素A。使所述患者接受所述藥物的時間選擇如上所述，本發明依賴于這樣的觀測結果效應細胞的相對數目在對抗原應答時在調節細胞之前得到擴充。因此，本文所用的術語“效應細胞的活性未被顯著降低”是指選擇給予所述藥物的時間使得所述藥物對調節細胞的效應成倍高于對效應細胞的效應。顯然所述藥物最好在其對調節細胞的效應與對效應細胞的效應之比為最大時給予。
據報道在進行抗病毒治療后病毒負荷開始下降后，例如感染HIV的患者，當停止治療后病毒負荷會增加，隨后刺激對病毒負荷增加的免疫應答(Oritz等，1999；Kilby等，2000；Lifson等，2000)。因此，可以采用先使所述患者接受抗病毒療法，然后停止所述療法，以增加針對逆轉錄病毒的效應細胞的數目和/或激活所述效應細胞，使靶向調節細胞擴充。
給予所述藥物的恰當時間的一個實例可以參考Daar等(1998)所述來確定。該文件提供來源于停止高度積極的抗病毒療法(也稱為HAART)的患者的病毒負荷以及CD8+和CD4+T細胞水平。在病毒負荷開始上升后，當CD8+T細胞達到最大數目時發生病毒負荷降低(肩峰(Shoulder)大約在第225天)，因此可發揮作用(參見Daar等(1998)的圖1)。緊接該時間點(幾天后，CD8+T細胞開始下降，而在所述下降之后病毒負荷開始穩定。該點(峰值)可以用作參比點，以預測后續調節細胞的克隆擴充，因此是調節細胞消除的干涉點。正是由于病毒負荷停止下降，調節細胞才負調節效應細胞，因而在該點之前應該應用所述藥物，即當大多數調節細胞正處于克隆擴充(有絲分裂)時應用所述藥物。
在刺激免疫應答之后，可以用本領域已知的技術監測調節細胞生長群。
可以收集系列血樣，通過FACS分析定量篩選所有CD4+亞群。必需保持這種FACS監測，直到調節細胞在對所述刺激應答中開始克隆擴充。在大多數情況下，該時間點在患者不同感染階段憑經驗確定，因為其免疫應答動力學可能有所變化。其它可能的測定包括淋巴細胞增殖/活化測定和各種細胞因子水平測定(例如IL-6的測定)。
確定給予所述藥物的時間點的另一種方法是監測刺激免疫應答后的病毒負荷。設想病毒負荷由于效應細胞的活性而降低，然而，調節細胞的后續增加將會負調節所述效應細胞，從而導致病毒負荷下降減慢。因此，所述藥物可以在病毒負荷下降減慢之前給予。可以用本領域已知的技術例如RT-PCR來監測這些情況下的病毒負荷。
監測可能必須是經常性的，例如每幾個小時，以確保選出給予所述藥物的準確時間點。
監測最好連續進行，以確定所述藥物的作用。在例如大約治療7天內，調節細胞不完全消除、再次出現或病毒負荷增加意味著應該重復本發明的方法。治療的這種重復循環可以產生免疫記憶。因此可能重復模式使用的本發明可以提供某些預防性保護效應。抗原多肽本文所用的“抗原”多肽是任何含有能夠產生針對所述逆轉錄病毒的免疫應答的表位的多肽。通常，所述抗原多肽將包含在大多數逆轉錄病毒分離物中高度保守的序列。然而，設想可以表征感染個體的特定逆轉錄病毒，然后產生匹配所述分離物序列的抗原多肽，使有效免疫應答最大化。
有關HIV抗原例如gp120和其它候選物的信息可以在Stott等(1998)中找到。
可以以本領域已知的產生免疫應答的任何方式提供所述抗原多肽。抗原多肽可以是例如天然、重組或合成抗原多肽。這樣的抗原多肽包括但不限于負責附著細胞表面受體以起始感染過程的病毒蛋白例如包膜糖蛋白。
天然抗原多肽可以例如通過提供減毒逆轉錄病毒、熱滅活逆轉錄病毒或任何其它滅活逆轉錄病毒來制備。
所述抗原多肽可以作為疫苗組合物中的分離多肽來提供。在這種情況下，所述多肽可以從逆轉錄病毒感染的細胞中純化出來、可以由重組細胞表達和從重組細胞中分離出來或者用肽合成儀合成生產。
除非另有說明，否則本發明中所用的重組DNA技術都是本領域技術人員熟知的標準技術。這類技術在以下來源的文獻中有介紹和解釋例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(編著)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，第1卷和第2卷，IRLPress(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(編著)，DNA CloningAPractical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)和FM.Ausubel等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associatesand Wiley-Interscience(1988，包括迄今為止所有的最新資料)，所述文獻通過引用結合到本文中。疫苗疫苗可以用一種或多種逆轉錄病毒多肽來制備。含有抗原多肽的疫苗制備是本領域技術人員已知的。通常，這樣的疫苗制備為注射用制劑或口服制劑，或者為液體溶液劑或者為混懸劑；也可以制備為在注射或口服之前適合于溶于或懸浮于液體的固體形式。也可以將所述制劑乳化，或者使所述蛋白質包囊在脂質體中。通常將所述抗原多肽與藥學上可接受的且與所述有效成分相容的載體/賦形劑混合。合適的載體/賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物。
另外，如有需要，所述疫苗可以含有少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑和增強所述疫苗作用的佐劑。
本文所用的術語“佐劑”是指非特異性地增強針對抗原多肽的免疫應答的物質。可能有效的佐劑的實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，RIBI含有用2％鯊烯/Tween 80乳劑從細菌中提取的三種組分單磷酰脂質A、二分枝菌酸海藻糖(trehalose dimycolate)和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的進一步實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀(明礬)、細菌內毒素、脂質X、小棒桿菌(Corynebacterium parvum)(瘡皰丙酸桿菌(Propionobacterium acnes))、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、多核糖核苷酸、藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、皂苷、脂質體、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐劑。這類佐劑可商業性得自各種來源，例如Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。
抗原多肽和佐劑的比例可以在寬范圍內變動，只要這兩種成分以有效量存在即可。例如，氫氧化鋁的存在量可以約為所述疫苗混合物的0.5％(以Al2O3濃度計)。傳統上，配制所述疫苗以含有抗原多肽的終濃度在0.2-200μg/ml的范圍內、優選5-50μg/ml、最優選15μg/ml。
配制后，可以將所述疫苗裝在一個無菌容器中，然后密封，低溫貯藏，例如貯藏于4℃，或者可以將其凍干。凍干法使其以穩定形式長期貯藏。
所述疫苗可以通過注射例如或者皮下或者肌內注射常規胃腸外給予。適合于其它給藥模式的其它制劑包括栓劑，在某些情況下為口服制劑。對于栓劑而言，傳統的粘合劑和載體可以包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；這樣的栓劑可以用含有0.5％-10％、最好是1％-2％范圍有效成分的混合物來制備。口服制劑包括這樣的常用賦形劑，例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可為溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑形式，并且含有10％-95％有效成分、最好是25％-70％有效成分。在所述疫苗組合物被凍干的情況下，凍干物質可以在給藥前重建為例如混懸劑。重建最好在緩沖液中實現。
用于口服給予患者的膠囊劑、片劑和丸劑可以腸溶包衣，所述腸溶包衣包含例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素或羥丙基甲基纖維素。DNA疫苗接種DNA疫苗接種包括將編碼抗原的DNA直接體內引入患者的組織中，供由患者組織的細胞表達所述抗原。這類疫苗在本文中被稱為“DNA疫苗”或“核酸型疫苗”。DNA疫苗描述于US 5,939,400、US6,110,898、WO 95/20660和WO 93/19183，所述專利的公開內容通過引用全部結合到本文中。直接注射編碼抗原的DNA以誘發保護性免疫應答的能力在多個實驗系統中已得到證實(參見例如Conry等，1994；Cardoso等，1996；Cox等，1993；Davis等，1993；Sedegah等，1994；Montgomery等，1993；Ulmer等，1993；Wang等，1993；Xiang等，1994；Yang等，1997)。
迄今為止，哺乳動物系統中的大多數DNA疫苗依賴于來源于巨細胞病毒(CMV)的病毒啟動子。這些疫苗在各種各樣的哺乳動物種類中在肌肉和皮膚接種時有良好的功效。一種已知影響DNA免疫誘發的免疫應答的因素是給予DNA的方法，例如胃腸外途徑可使基因轉移的速率低且產生基因表達的相當大的變異性(Montgomery等，1993)。運用基因槍高速接種質粒可增強小鼠的免疫應答(Fynan等，1993；Eisenbraun等，1993)，推定可能是因為DNA轉染的效率更高，通過樹突細胞呈遞抗原的效率更高。含有本發明核酸型疫苗的載體也可通過本領域已知的其它方法導入所需宿主中，所述方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉染(溶酶體融合)或DNA載體轉運蛋白。來源于轉基因植物的疫苗采用本領域眾所周知的方法，可以構建生產逆轉錄病毒抗原多肽的轉基因植物。目前已經對動物和人類病原體開發出許多植物源性可食用疫苗(Hood和Jilka，1999)。用產生病毒樣顆粒(VLP)或表現出抗原表位的嵌合植物病毒的轉基因植物口服免疫也可以產生免疫應答(Mason等，1996；Modelska等，1998；Kapustra等，1999；Brennan等，1999)。已經提出，這些VLP或嵌合病毒的顆粒形式可以導致所述抗原在胃腸中更高的穩定性，從而有效增加可從腸中攝入的抗原量(Mason等1996，Modelska等1998)。
實施例為了說明本發明，使用一種小鼠AIDS模型。
在易感小鼠中由LP-BM5小鼠白血病病毒(MuLV)誘發的小鼠AIDS(MAIDS)病理是一種研究逆轉錄病毒誘導的免疫缺陷機制的有效工具。MAIDS動物模型表現出人類AIDS的許多特征。用LP-BM5感染諸如C57BL/6小鼠的易感品系導致慢性脾大、高丙球蛋白血癥且T細胞和B細胞發育免疫缺陷。在體外，存在T-細胞和B-細胞對促有絲分裂或特異性抗原刺激的反應性進行性削弱。在體內，受感染小鼠變得對各種各樣的機會生物的攻擊越來越敏感，并且可發生B-細胞淋巴瘤。在感染后(pi)8-10周首先觀察到死亡，所有小鼠都在24周內死亡(圖1)。在免疫功能方面的這些改變反映出在表型和免疫網絡所有組分功能方面的復雜變化。1.感染后不同時間給予單劑量長春堿的療效在感染后不同時間用單劑量的抗有絲分裂劑長春堿(Vb)進行治療能夠阻止MAIDS的發生/進程。圖2顯示在感染后的各種時間(6小時至28天的范圍內)給予一次6mg/kg i.p.劑量的Vb可影響MAIDS的發生(以感染后10周的平均脾重表示)。顯然，Vb治療是當在感染后6小時或14天時給予時非常好的治療，100％(10/10)小鼠和74％(20/27)小鼠在感染后10周分別顯示無MAIDS發生體征(通過脾重、組織學和FACS分析測定)。在感染后6天治療的部分小鼠中觀察到相似的保護效應(6/13或46％)。雖然沒有第14天治療后觀察到的保護作用顯著，但是仍然觀察到MAIDS發生的中等保護作用。然而，重要的是也注意到，在許多其它時間點例如感染后第2天和第7天進行治療，都導致不阻止MAIDS發生。在感染后6小時給予Vb的小鼠中觀察到MAIDS發生的完全保護并不是意料之外的，因為所述病毒正在有效復制的細胞中復制，所述細胞是抗有絲分裂劑的靶，因此任何感染所述病毒的細胞都將被Vb殺死，從而防止病毒在所述宿主中快速建立感染。然而，在感染后14天用Vb進行一次治療后觀察到的高保護效應是相當顯著的，因為到該階段，病毒感染已很好建立了并且早期發病過程正在進行之中。我們提出這種高療效可能是由于Vb靶向其擴充期的特定免疫調節細胞亞群所致，從而改變針對所述病毒感染的免疫應答。假設免疫效應細胞的負調節被靶向調節細胞的Vb治療除去，則因此允許免疫系統的效應細胞更有效地清除所述病毒，甚至可能完全清除所述病毒。2.第14天療效的進一步表征2.1.感染后10周Vb治療小鼠的脾組織學將來自感染后第14天Vb治療的小鼠以及受感染對照小鼠和未受感染對照小鼠的脾臟稱重，然后進行組織學檢查。如先前報道(Hartley等，1989)，所有受MAIDS感染小鼠的脾結構徹底破壞。相反，正常脾重(低于0.25g)的Vb治療小鼠的脾結構不能與未受感染對照小鼠的脾結構區分開來(圖3)。
支持這一組織學數據的是，在感染后第10周，根據對來自感染后第14天Vb治療小鼠脾細胞FACS分析的初步結果顯示，細胞比例(CD4+、CD8+和B細胞)和分布與正常未受感染小鼠中觀測到一致(數據未顯示)。2.2.Vb療法后長期阻止MAIDS發生為了確定所述受感染小鼠是否完全保護以阻止MAIDS發生或者所述Vb治療是否僅僅是延遲所述疾病的發生和進程，我們在感染后第14天用Vb治療小鼠并且等到感染后20周才檢查小鼠。該實驗結果(圖4)表明，80％(4/5小鼠)在感染后20周防止任何脾大，證明第14天Vb治療方案的作用非常有效。2.3.Vb療法后不保護病毒再攻擊為了確定感染后第14天Vb治療防止MAIDS的小鼠是否產生免疫應答，隨后保護其后續用MAIDS病毒再攻擊，在感染后第14天給予Vb療法的多組小鼠在Vb治療后3周或8周用MAIDS病毒再攻擊。所述小鼠未被保護病毒再攻擊且發生脾大和淋巴結病，表明在20周發生MAIDS(圖5)。這并不是預料之外的結果，因為調節細胞群體的顯性免疫抑制已被恢復，結果是有針對第二次(未治療)感染的免疫效應物應答。3.Vb療法針對CD4+細胞3.1.感染后第14天Vb療法后脾細胞的直接FACS分析對從感染后第14天用Vb治療的小鼠的脾臟制備的CD4+和CD8+T細胞進行FACS分析(圖6)。也檢查了CD25+CD4+T細胞，因為它們最近在小鼠自身免疫病模型和小鼠腫瘤免疫學模型中被鑒定為具有重要的調節功能(Takahashi等，1998；Shimizu等，2000)。有可能這些細胞在調節對MAIDS的免疫應答方面可以起作用。給感染后第14天的小鼠和未受感染的對照小鼠Vb療法，Vb治療后48小時收集脾臟。數據的分析表明，當所有細胞亞群由于Vb療法而降低時，未受感染與受感染小鼠比率的比較顯示，在受MAIDS感染小鼠中Vb治療優先靶向的正是CD4+T細胞和CD25+CD4+T細胞。3.2.脾細胞轉移實驗Vb療法針對CD4+細胞先前的實驗表明，居留在脾臟的主要免疫細胞亞群(CD4+和CD8+細胞)全部受Vb治療的影響，然而，似乎優先靶向CD4+細胞，說明這些細胞亞群可以在感染后第14天進行克隆擴充。圖7所示實驗設計用來確定在感染后第14天給予的單劑量Vb，可消除擴充中的CD4+調節T細胞群體，從而除去負調節而釋放效應細胞且清除宿主的MAIDS病毒。
小鼠用MAIDS感染，感染后第14天接受Vb治療，然后接受來自如圖7所述制備的供體小鼠過繼性轉移的～107脾細胞。對于每個實驗[命名為(I)、(II)和(III)]而言，每組由7只受體小鼠和9只供體小鼠組成。組I小鼠接受來自尚未接受任何Vb治療的受感染小鼠全脾。組II小鼠接受來自受染小鼠的全脾細胞制劑，所述受感染小鼠在用熒光染料標記的抗CD4單克隆抗體染色后，用FACS細胞分選器已耗竭CD4+細胞。細胞分選導致除去所述脾細胞制劑中CD4+細胞的99.5％。組III小鼠接受來自在感染后第14天也接受Vb治療的受感染供體小鼠的全脾。
用來自受MAIDS感染供體的脾細胞灌注Vb治療的受MAIDS感染小鼠完全阻止Vb保護小鼠不發生MAIDS(圖8)。此外，克服Vb保護效應的脾細胞是CD4+細胞，因為當CD4+細胞在轉移前從供體脾細胞中除去時，通過FACS分選法，Vb的保護效應未被克服。另外，用來自在第14天也給予Vb的受MAIDS感染供體小鼠的脾細胞灌注Vb治療的受MAIDS感染小鼠顯示，這些小鼠被完全保護，不發生MAIDS(圖8)。3.3.感染后第14天CD4+細胞的體內耗竭導致阻止MAIDS發生脾轉移結果符合以下解釋在感染后第14天，免疫效應細胞與克隆擴充的調節細胞群體(它們是CD4+)共存并且Vb根據其破壞后者的能力是一種治療藥。因此，在感染后第14天時間點，CD4+細胞的體內耗竭應該模擬Vb的效應。所述實驗的流程圖示于圖9中。5只小鼠為一組的小鼠用MAIDS病毒感染，然后用單克隆抗體治療，以在感染后第14天耗竭宿主的或者CD4+或者CD8+T細胞亞群。從抗體生產雜交瘤細胞系上清液收集單克隆抗體，然后通過硫酸銨沉淀純化。根據一次注射(0.5mg i.p.)適當濃縮的單克隆抗體制劑的體內試驗結果表明，CD4+細胞減少98％，而CD8+細胞減少95％。
顯然，在感染后第14天用抗CD4+單克隆抗體進行治療，導致在受感染小鼠中阻止MAIDS發生，從而模擬在感染后第14天Vb注射的效應(圖10)。相反，在感染后第14天CD8+細胞的體內耗竭并不影響疾病進展。這一結果進一步支持這樣的假說CD4+T細胞群體在功能上負調節響應所述病毒感染的免疫效應細胞。另外，顯性CD4+調節細胞的去除能夠使免疫效應細胞對所述病毒感染的應答更為有效，導致疾病進展減慢許多或者也許完全清除其宿主的MAIDS病毒。4.總結本發明的實施例表明，存在負調節針對MAIDS病毒的免疫應答的“調節”細胞群體，使得所述病毒可以增殖且引起疾病。在感染后適當時間除去所述調節細胞使得效應細胞(例如B細胞和CD8+T細胞)可以更有效地清除所述病毒，從而預防疾病發生。提出這些調節細胞控制諸如CD8+T細胞和B細胞的細胞的活化和/或功能，該細胞可作為效應細胞起作用，以抵抗病毒感染。
Robert North及其同事應用小鼠T細胞淋巴瘤模型先前研究了通過特異性地消除免疫調節細胞群體來調節免疫應答(North和Awwad，1990)。North提出由于CD4+調節T細胞群體負調節免疫應答，因此使免疫原性腫瘤能夠建立和生長。這種調節使得不能在引起腫瘤消退的程度上發生免疫應答。值得注意的是，在腫瘤接種后不同時間用單劑量的長春堿(Vb)進行治療，導致所述腫瘤增加(第10天)或消退(第4、6、13和15天)。North假設所觀測到的消退是由于在該時間點CD4+調節T細胞的消除所致。在一系列涉及選擇性耗竭CD4+和CD8+T細胞的實驗中，所述調節細胞被鑒定為具有CD4+表型。
近交小鼠和野生型小鼠的染色體DNA都含有與MuLV核酸探針反應的多拷貝序列。許多MuLV的完全潛在感染性基因組屬于這樣的序列(Chattopadhyay等，1980)。所有MuLV共享的序列同源性高。我們假設當這些內源MuLV蛋白在發育期間被表達時，它們被免疫系統識別為自身抗原。由于在內源和外源MuLV核酸序列和氨基酸序列之間有高水平的同源性，因此感染MuLV也可以被免疫系統部分識別為自身的，針對所述病毒感染的任何免疫應答都將被負調節，導致缺乏病毒清除且發生疾病。
本領域技術人員將會認識到，在不偏離廣義描述的本發明精神或范圍的情況下，可以對具體實施方案描述的本發明進行多種變化和/或修改。因此認為本發明的實施方案在所有方面都是說明性的而非限制性的。
以上討論的所有出版物通過引用全部結合到本文中。
在本發明的說明書中所包括的文件、報告、材料、裝置、物品等的任何論述僅用來理解本發明，這并不是承認在本申請每項權利要求的優先權日之前，任何或所有這些主題構成現有技術基礎組成部分或者為本發明相關的領域中、尤其在澳大利亞是眾所周知的知識。
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權利要求
1.一種治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的方法，所述方法包括給予所述患者增加針對所述逆轉錄病毒的效應細胞的數目和/或激活所述效應細胞的組合物，隨后給予所述患者抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物，其中選擇使得所述效應細胞的活性不被顯著降低的時間給予所述藥物。
2.權利要求1的方法，其中大約在給予所述組合物作用下CD8+CD4-T細胞數達到峰值時，給予所述藥物。
3.權利要求1的方法，其中大約在給予所述組合物后病毒顆粒數已經開始穩定或增加時，給予所述藥物。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述組合物包含逆轉錄病毒抗原多肽。
5.權利要求4的方法，其中通過給予包含所述逆轉錄病毒抗原多肽和藥學上可接受的載體的疫苗，使所述逆轉錄病毒抗原多肽提供給所述患者。
6.權利要求5的方法，其中所述疫苗還包含佐劑。
7.權利要求4的方法，其中通過給予編碼所述逆轉錄病毒抗原多肽的DNA疫苗，使所述抗原多肽提供給所述患者。
8.權利要求4的方法，其中通過食用表達所述逆轉錄病毒抗原多肽的轉基因植物，使所述抗原多肽提供給所述患者。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述患者在給予所述組合物之前已接受抗逆轉錄病毒藥物療法。
10.一種治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的方法，所述方法包括使所述患者接受抗逆轉錄病毒藥物療法，隨后給予所述患者抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物，其中在結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法之后給予所述藥物并且在逆轉錄病毒數目方面所產生的擴充已導致針對所述逆轉錄病毒的效應細胞的數目增加和/或激活所述效應細胞，并且其中選擇使得所述效應細胞的活性不被顯著降低的時間給予所述藥物。
11.權利要求10的方法，其中大約在結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法影響下CD8+CD4-T細胞數達到峰值時，給予所述藥物。
12.權利要求10的方法，其中大約在結束所述抗逆轉錄病毒藥物療法影響下病毒顆粒數達到峰值或者在該峰值之后開始減少時，給予所述藥物。
13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述藥物選自抗增殖藥物、放射療法和特異性結合CD4+T細胞的抗體。
14.權利要求13的方法，其中所述抗增殖藥物選自長春堿和脫水長春堿。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中所述逆轉錄病毒選自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述方法至少重復一次。
17.權利要求1-16中任一項的方法，其中所述哺乳動物患者是人類。
18.抑制調節細胞產生和/或破壞所述調節細胞的藥物在生產用于治療哺乳動物患者逆轉錄病毒感染的藥物中的應用。
19.權利要求18的應用，其中所述藥物選自抗增殖藥物和特異性結合CD4+T細胞的抗體。
全文摘要
本發明人注意到在對感染哺乳動物的逆轉錄病毒應答中產生至少兩種免疫細胞群體。更具體地講，感染逆轉錄病毒的哺乳動物免疫系統能夠通過一組在本文中統稱為“效應細胞”的細胞建立針對所述病毒的免疫應答，然而也產生了可調節所述“效應細胞”、能夠限制哺乳動物有效控制或根除所述逆轉錄病毒感染、在本文中統稱為“調節細胞”的第二種細胞群體。因此，本發明運用這些觀測結果來提供用于治療有逆轉錄病毒感染的哺乳動物的方法。
文檔編號A61K39/395GK1469746SQ01817380
公開日2004年1月21日 申請日期2001年8月16日 優先權日2000年8月18日
發明者M·L·阿什當, M L 阿什當 申請人:免疫援助有限公司