專利名稱：塵螨屬2組的變應原性蛋白質的變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及螨的歐洲屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)種變應原的新變體。
更具體地，本發明涉及變應原Der p 2的低變應原性變體的氨基酸序列，其通過將編碼所述變應原的核苷酸序列進行位點專一誘變而獲得。該低變應原性變體可用于由塵螨引起的變應性病理現象的特異性免疫治療。
背景技術：
變態反應為接觸變應原后由產生的IgE類抗體而引起的速發型超敏反應。IgE與位于效應細胞(嗜堿性粒細胞和肥大細胞)表面的特異性受體結合，并且當再次暴露于該變應原時，它們誘導所述細胞脫顆粒，釋放介質(如組胺和白三烯)，引起下列公知的變態反應癥狀鼻炎、結膜炎、特應性皮炎和哮喘。
塵螨屬的歐洲屋塵螨和美洲屋塵螨(Dermatophagoides farinae)為存在于室塵中的兩種相似的螨。來自這些節肢動物的變應原在臨床上具有顯著的重要性。
至今已鑒定出了九種不同類型的螨變應原，其中主要的兩類為Der p 1(Der f 1)和Der p 2(Der f 2)，它們中的每一種均與約80％變應性受試者的IgE發生免疫反應。
變應原Der p 2(其核苷酸序列在GenBank中的存取代碼為AF276239)為由129個氨基酸殘基組成的分子量為約14kD的蛋白質，其含有為免疫原性所必需的三個二硫鍵[1，2]。它與除Derf2(GenBank存取代碼D10449)外的任一其它已知蛋白質無序列同源性。
變態反應的唯一病原學治療表現為特異性脫敏免疫治療(SIT)。該治療在于將引起變態反應的物質施用漸增的劑量，由此在患者體內對該物質誘導逐漸的脫敏反應(3)。
雖然免疫治療構成了對變態反應的一種已建立的治療方案，但它并非完全沒有危險(4)。
由于在此類治療期間可發生更為嚴重的副作用，研究人員正著重研究應用非注射途徑(經口/舌下途徑)來施用疫苗以及產生蛋白質的用作疫苗的低變應原性變體，其中所述低變應原性變體是通過化學處理或位點專一誘變來改變變應原而獲得的[5]。
詳細公開編碼歐洲屋塵螨的主要變應原Der p 2的新cDNA已通過RT-PCR分離，其核苷酸序列在SEQ ID N.1報導。它在8個位置處不同于GenBank中的序列。分離的克隆所編碼的在SEQ ID N.3中報導的蛋白質有兩個殘基Ala16和Ser63不同于變應原Der p 2。
現在已發現成熟蛋白質Der p 2的變應性效應可通過在存在賴氨酸殘基的下列位置至少之一處進行氨基酸序列的改變而減弱33、48、82、96、100、126，其中所述成熟蛋白質Der p 2通過從SEQ ID N.3去除殘基1-16而產生。
此處“改變”是指在特定位置處替換一個或多個殘基，優選地用中性和極性氨基酸替換，或者刪除存在于天然形式中的一個或多個Lys殘基，或者同時替換和刪除兩個或多個殘基。
替換所致突變在上述6個位置處的每一位置導入了丙氨酸殘基。最優選的變體是在SEQ ID N.4中所示的6處替換同時存在。
本發明也包含蛋白質Der p 2的變體，其與Der p 2的同源性大于85％，該變體在其氨基酸序列的相應位置處具有如上所述的針對Der p 2的相同替換/刪除模式，該變體尤其是蛋白質Der f 2。
本發明還包含來自Der p 2的氨基酸序列或來自其同源序列并含有至少一個上述替換/刪除的免疫活性肽。
在進一步的方面，本發明涉及編碼如上所述的Der p 2突變變體的核酸分子、編碼其同源變體的核酸分子、或編碼來自于它們的肽的核酸分子。
本發明的序列變體易于從成熟Der p 2的cDNA或其同源變體的cDNA開始制備，在序列變體中編碼信號肽的區域缺失且已導入目標突變。
編碼具6處替換的優選變體(SEQ ID N.4)的cDNA序列(誘變處理的堿基用黑體表示)在SEQ ID N.2中報導。
對歐洲屋塵螨產生變應性的受試者血清中，本發明所產生的重組蛋白質具有減輕的IgE反應性。特別是使用對螨產生變應性且具有RAST 4+反應性的受試者的合并血清進行蛋白質印跡試驗表明與在大腸桿菌(Escherichia coli)中產生的正常蛋白質相比，SEQ ID N.4中所報導變體的IgE反應性平均降低了約90％[
圖1]。該結果用可確定天然構象中蛋白質表位包括構象性表位的ELISA試驗證實[圖2]。
本發明還涉及這樣的表達載體，其包含編碼任一以上定義的低變應原性變體的核酸分子。
所述載體可為基因工程中常用的質粒、粘粒、病毒、噬菌體或任一其它載體，并且除了本發明的核酸分子外，還可包括用于調控表達的真核或原核元件，如起始和終止轉錄的調節序列、增強子、啟動子、信號序列等。
而且，本發明包含轉化入本發明的載體或用本發明的載體轉染的原核或真核宿主細胞。大體而言，將用原核細胞如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，或者用真核細胞如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來克隆載體并表達cDNA。
本發明的蛋白質變體可如原樣產生或以融合蛋白產生。
由于降低的IgE反應性，所述變體可用來制備疫苗，用于免疫治療由塵螨引起的變態反應的治療目的。
本發明進一步的方面因此涉及這樣的藥物組合物，其包含有效量的本發明的低變應原性變體，任選地與塵螨屬或相似屬的螨的其它天然或改變了的變應原組合，并包含可藥用賦形劑。
在一個優選的實施方案中，所述藥物組合物為用于預防性或治療性處理變應性疾病如支氣管哮喘、變應性鼻炎、變應性皮炎、變應性結膜炎的疫苗。疫苗接種的原則和操作過程為本領域技術人員熟知并在如(7)和(8)進行了描述。
下列實施例更詳細地闡述了本發明。
實施例如果沒有另外指出，下列實施例中所用的方法為Sambrook，Fritsch ET Maniatis“分子克隆實驗室手冊”(“Molecular cloning.A laboratorymanual”)第二版，1-2-3卷，CSH Lab Press 1989中所述的方法。
實施例1-RT-PCR分離Der p 2的cDNA用歐洲屋塵螨的mRNA通過RT-PCR產生相應的cDNA，該反應的引物為多聚dT寡核苷酸，用反轉錄酶催化該反應。此后，通過PCR(聚合酶鏈反應)選擇性擴增對應于變應原Der p 2的cDNA，使用了兩條特異性引物，每條引物具有15個核苷酸，對應于編碼該蛋白質的基因區的末端。將Der p 2的cDNA克隆入載體(pBluescript-Stratagene)，用于在大腸桿菌細胞中擴增，并用自動測序儀根據Sanger法測序。
實施例2—編碼變應原Der p 2的cDNA的位點專一誘變通過PCR擴增(聚合酶鏈反應)克隆在原核載體(pBluescript)中的同一cDNA來進行編碼變應原Der p 2的cDNA的位點專一誘變。用作PCR反應引物的寡核苷酸具有所需的堿基替換。對每一誘變而言，使用了與兩條DNA鏈的相應區結合的所述寡核苷酸的互補對。擴增后，原始的未改變模板通過用限制性酶Dpn I酶促消化進行選擇性降解。然后用誘變處理過的分子轉化大腸桿菌細胞。從單個的細菌菌落所得的克隆根據Sanger法測序以證實堿基的正確改變且不存在cDNA的非特異性突變。
實施例3—蛋白質Der p 2和其變體的產生當來自Der p 2的正常cDNA以及對應于SEQ ID N.2的誘變處理過的cDNA克隆入表達載體(pCALn-Stratagene)后，按照標準方法于大腸桿菌細胞中表達，其為當培養物處于指數生長(O.D.600nm＝0.6)時，向其中加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導cDNA表達。誘導蛋白質合成2小時后通過超聲裂解細菌細胞和通過離心去除細胞微粒來分離重組蛋白質。通過親和層析從上清中純化蛋白質，所使用的柱中基質與鈣調蛋白結合，其中的鈣調蛋白與融合至變應原的CBP部分(鈣調蛋白結合蛋白)相互作用。
實施例4—Der p 2變體變應原性的蛋白質印跡試驗根據Towbin所述的技術(6)，將等量的正常重組變應原和SEQ ID N.4所示的誘變處理過的變體通過聚丙酰胺凝膠電泳并隨后通過電印跡轉移至硝酸纖維素膜上進行分析。
將膜在含5％奶粉的TBS(飽和緩沖液)中孵育1小時，然后與一種對螨產生變應性且具有反應性RAST 4+的患者血清過夜孵育。用含0.05％吐溫-20的TBS洗三次后，將膜與過氧化物酶連接的抗人IgE抗血清孵育1小時、進一步漂洗、并用檢測系統檢測與膜結合的IgE抗體，其中所述檢測系統基于使用含H2O2的DAB(二氨基聯苯胺)溶液作為過氧化物酶的底物。
實施例5—ELISA檢測Der p 2變體對IgE的反應性將在碳酸鹽/碳酸氫鹽50mM緩沖液，pH9.6中的等量(0.1μg)正常變應原和其誘變處理過的變體于4℃孵育16小時而吸附于聚苯乙烯板的孔中，用于ELISA試驗。然后用洗滌液(含0.05％吐溫-20的60mM磷酸鹽緩沖液pH6.5)洗抗原，并用稀釋液(在磷酸鹽緩沖液150mM pH7.4中的25％馬血清、EDTA 1mM、0.05％吐溫20、0.01％硫柳汞)飽和游離位點。具有RAST4+反應性的人合并血清以1∶2的比率在稀釋緩沖液中系列稀釋制備。將等量(100μl)的多個血清稀釋液加至每一樣本并在25℃孵育2小時。漂洗三次后，加入在稀釋緩沖液中1∶1500稀釋的過氧化物酶連接的抗人IgE抗血清，在25℃孵育1.5小時。漂洗三次后，加入100μl Ultra Blu試劑(Intergen，Milford，Mass.)并在25℃孵育15分鐘進行顯色反應。該反應通過加入100μl 1N HCl終止，并于450nm處用分光光度計評估。
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8)Cryz，S.J.(1991)，“免疫治療和疫苗”(″Immunotherapy andVaccines″)，VCH Verlagsgesellschaft。
序列表<110>國家研究委員會(CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE)<120>塵螨屬2組的變應原性蛋白質的變體<130>Cons Naz Ric<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>444<212>DNA<213>歐洲屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)<400>1aaaatgatgt acaaaatttt gtgtctttca ttgttggtcg cagccgttgc cgctgatcaa 60gtcgatgtca aagattgtgc caatcatgaa atcaaaaaag ttttggtacc aggatgccat 120ggttcagaac catgtatcat tcatcgtggt aaaccattcc aattggaagc cgttttcgaa 180gccaaccaaa actcaaaaac cgctaaaatt gaaatcaaag cttcaatcga tggtttagaa 240gttgatgttc ccggtatcga tccaaatgca tgccattata tgaaatgtcc attggttaaa 300ggacaacaat atgatattaa atatacatgg aatgttccga aaattgcacc aaaatctgaa 360aatgttgtcg tcactgttaa agttatgggt gatgatggtg ttttggcctg tgctattgct 420actcatgcta aaatccgcga ttaa444<210>2<211>390<212>DNA<213>歐洲屋塵螨<400>2gatcaagtcg atgtcaaaga ttgtgccaat catgaaatca aaaaagtttt ggtaccagga 60tgccatggtt cagaaccatg tatcattcat cgtggtgcac cattccaatt ggaagccgtt 120ttcgaagcca accaaaactc agcaaccgct aaaattgaaa tcaaagcttc aatcgatggt 180ttagaagttg atgttcccgg tatcgatcca aatgcatgcc attatatgaa atgtccattg 240gttgcaggac aacaatatga tattaaatat acatggaatg ttccggcaat tgcaccagca 300tctgaaaatg ttgtcgtcac tgttaaagtt atgggtgatg atggtgtttt ggcctgtgct 360attgctactc atgctgcaat ccgcgattaa 390<210>3<211>145<212>PRT<213>歐洲屋塵螨<400>3Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Ala Ala1 5 10 15Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val20 25 30Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly35 40 45Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys50 55 60Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp65 70 75 80Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu85 90 95Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys100 105 110Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly115 120 125Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg130 135 140Asp145<210>4<211>129<212>PRT<213>歐洲屋塵螨<400>4Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val1 5 10 15Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly20 25 30Ala Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Ala35 40 45Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp50 55 60Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu65 70 75 80Val Ala Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Ala85 90 95Ile Ala Pro Ala Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly100 105 110Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Ala Ile Arg115 120 125Asp
權利要求
1.Der p 2的天然形式變體，或者為與Der p 2比較序列同一性高于85％的同源形式，其中至少一個存在于Der p 2位置33、44、82、96、100、126處的Lys殘基被替換和/或刪除。
2.如權利要求1中所述的變體，其中所述天然形式選自Der p 2和Derf 2。
3.如權利要求1-2中所述的變體，其中所述殘基用中性或極性氨基酸替換。
4.如權利要求1-3中所述的變體，其中所述殘基用丙氨酸替換。
5.如權利要求1-4中所述的變體，其具有序列SEQ ID N.4。
6.包含權利要求1-5的變體的免疫活性部分的肽，其中存在至少一個如權利要求1中所述的替換/刪除。
7.編碼如權利要求1-5中所述的蛋白質變體的核酸分子，或編碼如權利要求6中所述的肽的核酸分子。
8.如權利要求7中所述的核酸分子，其序列為SEQ ID N.2。
9.包含權利要求7-8的核酸分子的載體。
10.用權利要求9的載體轉導的宿主細胞。
11.藥物組合物，其包含有效量的如權利要求1-5中所述的蛋白質變體或如權利要求6中所述的肽，并包含可藥用賦形劑。
12.如權利要求11中所述的組合物，其為疫苗形式。
全文摘要
歐洲屋塵螨種的變應原變體，其具有降低的變應原性。
文檔編號A61P29/00GK1454213SQ01815422
公開日2003年11月5日 申請日期2001年9月11日 優先權日2000年9月12日
發明者M·斯圖拉羅, A·維奧蒂, P·法拉賈尼, G·米斯特雷洛, D·龍卡羅洛, S·扎諾塔 申請人:國家研究委員會